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Cancer Research

Intracarotidea Cancer Cell iniezione per produrre modelli murini di cervello Metastasi

Published: February 8, 2017 doi: 10.3791/55085

Summary

Cervello metastasi è diventato un bisogno medico non soddisfatto urgente come la sua incidenza è aumentata mentre le opzioni terapeutiche sono rimaste palliative. La creazione di modelli animali sperimentali di metastasi cerebrali tramite iniezione arteriosa intracarotidea delle cellule tumorali facilita gli studi meccanicistici della biologia della malattia e la valutazione dei regimi di intervento innovative.

Abstract

Metastasi, la diffusione e la crescita di cellule maligne nei siti secondari all'interno del corpo di un paziente, rappresenta> 90% della mortalità per cancro. Recentemente, impressionanti progressi nelle nuove terapie hanno notevolmente prolungato la sopravvivenza e una migliore qualità della vita per molti malati di cancro. Purtroppo, l'incidenza di recidive cerebrali metastatici sta rapidamente crescendo, e tutte le terapie attuali sono solo palliativi. Quindi, buoni modelli sperimentali animali sono urgentemente necessari per facilitare studi approfonditi della biologia della malattia e per valutare nuovi regimi terapeutici per la valutazione preclinica. Tuttavia, lo standard di test metastasi vivo tramite coda vena iniezione delle cellule tumorali produce prevalentemente lesioni metastatiche del polmone; animali in genere soccombono alla massa tumorale del polmone prima di qualsiasi conseguenza significativa delle metastasi cerebrali. Intracardiaca iniezione di cellule tumorali produce lesioni metastatiche a più siti di organi compreso il cervello; tuttavia, la variabilità della crescita tumorale prodotto con questo modello è grande, smorzando la sua utilità nella valutazione dell'efficacia terapeutica. Per generare modelli animali affidabili e coerenti per lo studio metastasi cerebrali, qui si descrive una procedura sperimentale per la produzione di metastasi cerebrali in casa del mouse (Mus musculus) tramite iniezione intracarotidea delle cellule tumorali. Questo approccio permette di produrre gran numero di topi di metastasi cerebrali-cuscinetto con simili caratteristiche di crescita e di mortalità, facilitando in tal modo gli sforzi di ricerca per lo studio dei meccanismi biologici fondamentali e per valutare nuovi agenti terapeutici.

Introduction

La metastasi del cancro al sistema nervoso centrale (SNC) è una malattia devastante, e può comportare l'parenchima cerebrale o le leptomeningi ( "metastasi cerebrali" si riferisce sia in questo articolo). E 'il tumore intracranico predominante, superando in numero gliomi primari per> 10: 1 1, 2. Il cancro del polmone, il cancro al seno, e il melanoma sono i primi tre principali malattie neoplastiche che producono alta incidenza di metastasi cerebrali 3, 4. Negli ultimi anni, notevoli progressi nelle nuove terapie per il cancro sono notevolmente prolungato la sopravvivenza e una migliore qualità della vita per molti malati di cancro. Tuttavia, sulla recidiva, l'incidenza di metastasi cerebrali è in rapido aumento. Ad esempio, il trastuzumab anticorpo anti-HER2 (trastuzumab) ha dimostrato notevole efficacia clinica nei pazienti con carcinoma mammario HER2 +; ancora una preoccupante tendenza è emersain questi pazienti: fino a 1/3 di coloro la cui extracranica malattia sistemica inizialmente beneficiato di un trattamento con trastuzumab successivamente sviluppare metastasi cerebrali 5, 6, 7. Purtroppo, i pazienti con metastasi cerebrali sono refrattari a quasi tutte le attuali trattamenti, di solito sperimentare un deterioramento traumatica della qualità della vita, e la loro sopravvivenza a un anno dopo la diagnosi è solo ~ 20% 8. Le attuali terapie per metastasi cerebrali (compresi gli steroidi, la radioterapia cranica, e la resezione chirurgica nei pazienti selezionati) sono solo palliative, non curativo 9. Pertanto, metastasi cerebrali sta emergendo come la prossima sfida imponente in questa epoca di nuove terapie del cancro. Per affrontare la sfida insoddisfatti i pazienti devono affrontare ogni giorno nella clinica, abbiamo urgente bisogno di capire meglio il meccanismo alla base di metastasi cerebrali e usare questa conoscenza per sviluppare nuove terapie.

10, nessuna delle quali si riassume in un ex vivo o in vitro sistema. Quindi, la corretta e fedele a modelli in vivo sono fondamentali per gli studi di metastasi cerebrali. Un convenzionale nel test in vivo metastasi introduce le cellule tumorali mediante iniezione vena della coda, che porta la maggior parte delle cellule di rimanere incastrati nel polmone. Lesioni metastatiche cerebrali sono raramente prodotte in questi modelli animali prima della morte causata da carico tumorale nei polmoni 11. iniezione diretta intracerebrale di cellule tumorali produce escrescenza tumorale consistente nel SNC ed è ampiamente usato in studi di gliomi primari. Tuttavia, siniezione uch compromette la BBB e provoca lesioni traumatiche al sito di iniezione, entrambi i punti principali di preoccupazione per quanto riguarda la rilevanza fisiologica di questo modello. Un altro uso frequente percorso introduzione delle cellule del cancro, iniezione intracardiaca, è facile da amministrare e che produce metastasi sperimentale al sistema nervoso centrale. Tuttavia, le metastasi simultanee a siti di organi diversi da quelli del sistema nervoso centrale sono sempre prodotte e possono causare la mortalità degli animali 11; Pertanto, l'elevato grado di variabilità di questo modello rende appropriati per la valutazione quantitativa dei meccanismi biologici o agenti terapeutici con un numero limitato di animali.

Qui si descrivono le procedure per la produzione sperimentale metastasi cerebrali tramite l'iniezione di cellule tumorali in arteria carotide comune. Abbiamo usato questo approccio per sezionare i contributi singoli geni 'alla cascata metastatica di metastasi cerebrali e per valutare l'efficacia di un intervento terapeuticos 12, 13. I principali vantaggi di questo approccio sono l'elevato grado di riproducibilità e basso grado di variabilità; Lo svantaggio principale è la sofisticazione e la destrezza necessaria per eseguire la microchirurgia.

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Protocol

dichiarazione etica: Tutti gli studi su animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.

1. Preparare cellule tumorali per iniezione

  1. Seme le cellule tumorali uno o due giorni prima dell'iniezione. Utilizzare DMEM / F12 supporti supplementato con 10% FBS, a meno che un mezzo specialità è indicato in letteratura per una particolare linea cellulare.
  2. Il giorno dell'intervento chirurgico, cellule raccolto quando raggiungono 70 - 80% di confluenza dal primo lavaggio con mezzi senza siero volta prima tripsinizzazione (0,25%) per 1 - 2 min a 37 ° C. Aggiungere in cellule 10% FBS contenenti DMEM media / F12 per placare la tripsina 0,25%.
  3. Centrifugare le cellule a 80 g per 3 min. Lavare le cellule in mezzi privi di siero due volte per rimuovere siero residuo, contare le cellule con un emocitometro e risospendere in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 1 - 5 × 10 6 cellule / ml, a seconda della linea cellulare. Tenere in ghiacciofino al momento dell'iniezione.
    NOTA: MDA-MB-231 cellule del cancro al seno e le cellule di melanoma K1735 sono stati utilizzati in questo studio, ed entrambe le linee cellulari sono stati utilizzati a 2 × 10 6 celle concentrazione / ml. Mantenere la durata tripsinizzazione più breve possibile come trattamento eccessivo può influenzare i risultati del test di metastasi.

2. Preparare topi per tumore delle cellule iniezione

  1. Anestetizzare topi intraperitoneale (ip) iniezione di ketamina / xilazina cocktail (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
  2. Confermare l'anestesia completa pizzicando i piedi degli animali e di osservare la mancanza di risposta.
  3. Posizionare il mouse su una lastra di vetro (utilizzato per la fusione gel proteici), e fissare con elastici.
  4. Se necessario, rimuovere i peli del collo con la rasatura o l'applicazione di una piccola quantità di prodotto di rimozione dei capelli e asciugandosi i capelli fuori con un tovagliolo di carta. NOTA: Se si utilizza topi nudi, saltare questo passaggio in quanto non hanno peli sul corpo.
  5. Pulire la pelle del collo applicandopovidone-iodio e il 70% di alcol.
  6. Posizionare il mouse sul palco del microscopio da dissezione
  7. Fare un'incisione nella pelle ~ 1 cm di lunghezza con un bisturi chirurgico.
  8. Senza mezzi termini sezionare il muscolo con una pinza dentata per esporre la carotide sotto.
  9. Separare l'arteria carotide dal nervo vago adiacente con pinza chirurgica.
  10. Utilizzando pinze chirurgiche, separare un batuffolo di cotone da un batuffolo di cotone, inumidire, e la moda in un batuffolo di cotone più piccola. Inserire questo batuffolo di cotone tampone-idratata sotto la carotide del sito previsto per l'iniezione.
  11. Posizionare un distale e prossimale di sutura per il batuffolo di cotone e fare nodi sciolti. Stringere il nodo prossimale per bloccare il flusso di sangue nel sito di iniezione.
  12. Procedere alla iniezione di cellule di cancro se la carotide sul batuffolo di cotone appare completamente pressurizzato con sangue rosso fresco.

3. Cancer Cell iniezione in carotide

  1. Vortex e disegnare 100 ml ocellule tumorali f nella siringa.
  2. Al microscopio da dissezione, inserire lentamente il 31 ago G (con bisello alto) nel lume dell'arteria carotide seduto sulla cima del batuffolo di cotone.
  3. Iniettare lentamente le cellule dalla siringa nella carotide. iniezione di successo può essere osservata al microscopio dal colore cambiando dei vasi sanguigni vicini e muscolatura quando le cellule tumorali buffered vengono spinti nella circolazione.
  4. Quando l'iniezione dell'intero volume è completa, sollevare l'arteria carotide distale delicatamente per evitare rigurgito.
  5. stringere rapidamente il nodo distale per completare il processo di iniezione.
  6. Dopo aver completato l'iniezione, serrare le legature e tagliare la sutura di seta in eccesso con micro-forbici sotto il microscopio da dissezione. Spostare indietro il muscolo separato per coprire la ferita. Chiudere la pelle con due punti metallici.

4. recupero chirurgico

  1. Spostare l'animale operato su una piastra elettricaper il recupero. Si può prendere 30-60 minuti per gli animali a riprendere conoscenza. Nel frattempo, amministrare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea come analgesia post-chirurgica. Nota: L'analgesia deve essere fornito secondo il vostro IACUC locale approvato protocollo.
  2. Una volta che gli animali si svegliano e riprendono il loro comportamento normale, restituire i topi alla loro posizione abitazioni. Fornire i topi con il cibo in gel per diversi giorni dopo l'intervento chirurgico. Mantenere un record chirurgica e tenerlo nella stanza.

5. non invasiva In Vivo Imaging

  1. Per le cellule marcate con costrutti reporter luciferasi, misurare l'efficienza di iniezione delle cellule tumorali utilizzando in vivo sistema di imaging 14.
    NOTA: Imaging non viene eseguita il giorno di iniezione per evitare eccessive sollecitazioni agli animali di ricerca.

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Representative Results

Ci sono due punti in cui la qualità di iniezione può essere valutata. La prima occasione è per l'osservazione dell'operatore di cambiare i colori dei vasi sanguigni durante l'iniezione. Perdite da iniezioni poveri può essere facilmente osservata al microscopio da dissezione. Il posizionamento stabile e sicuro del corpo del mouse (Figura 1A) e la sua arteria carotidea (Figura 1B) sul batuffolo di cotone di supporto sono fattori critici per iniezione regolare e positivo nella carotide. Il secondo punto di valutare la qualità di iniezione è post-chirurgica imaging non invasivo. A questo scopo, le cellule tumorali sono tipicamente etichettati con un reporter luciferasi ex vivo prima dell'iniezione. Per ridurre al minimo lo stress sugli animali, imaging in vivo viene di solito eseguita dopo l'iniezione 24 ore. Un successo i risultati di iniezione a forte carico delle cellule tumorali intracranici, e la testa del mouse è l'unica regione con s positiviignals (Figura 2A).

L'utilizzo nel sistema di imaging in vivo per monitorare le cellule tumorali luciferasi marcato, si osserva un calo iniziale di intensità del segnale in pochi giorni dopo l'iniezione; tuttavia, le cellule tumorali capaci di escrescenza nel SNC fine riescono a dividersi e produrre aumentando in vivo segnali del sistema di imaging come metastasi cerebrali sviluppano (Figura 2B). Iniezione intracarotidea di solito produce consistente in segnali del sistema di imaging in vivo con relativamente bassa variabilità, che è un grande vantaggio di utilizzare questo approccio per produrre sperimentale metastasi cerebrali. Come crescono le lesioni tumorali spostano tessuti del cervello, la qualità della salute per gli animali con rapida progressione metastasi cerebrali possono deteriorarsi rapidamente, rispecchiando la manifestazione clinica di pazienti metastasi cerebrali umani. comportamenti sintomatici tipici indicativi della significativa presenza di metastasi cerebrali includono la perdita diil peso, la postura ingobbita, e girando incessante. Al punto finale sperimentale, i cervelli animali possono essere estratte per l'esame di parametri biochimici o per esami istologici. Fatta eccezione per lesioni metastatiche melanotiche (Figura 3A), di solito è difficile distinguere la lesione tumorale da tessuti circostanti cervello prima della valutazione istologica (Figura 3B). In tali casi, si consiglia di marcare le cellule tumorali con un reporter fluorescente (GFP esempio) per la convenienza di isolare cellule metastatiche (Figura 3C). In alternativa, l'intero cervello può essere dissociato in singole cellule e cellule tumorali separati da anticorpi branello coniugati magnetici.

Figura 1
Figura 1: Preparazione per l'iniezione carotide. A) Il mouse anestetizzato è posto su una lastra di vetro e fissato con rubande bBER. Il sito e lunghezza dell'incisione è etichettato con una linea nera sul collo. B) Dopo tutti i passaggi chirurgici preparatori sono completi, l'arteria carotide esposto è posto per il supporto su un batuffolo di cotone ferma, pronta per l'iniezione delle cellule tumorali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: il monitoraggio non invasivo per metastasi cerebrali escrescenza. A) modificati MDA-MB-231 cellule di cancro al seno sono stati etichettati con luciferasi gene reporter ex vivo. A partire da iniezione dell'arteria 24 ore post-carotideo, il cervello lo sviluppo di metastasi è stata monitorata in modo non invasivo per ripetute imaging sistema di imaging in vivo (scala bar = 50 mm). B) Quantificazione in vivo sistema di imaging imaging dati indicano un calo iniziale di tumore onere iniezione dell'arteria carotidea post-, seguito da escrescenza esponenziale di metastasi cerebrali fino agonia degli animali. Le barre di errore riflettono l'errore standard della media (SEM) del segnale totale luminescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: la raccolta del cervello Metastasi lesioni. A) le cellule di melanoma K1735 producono melanotici lesioni metastasi cerebrali nel cervello singenici C3H topo, che facilita notevolmente la separazione del cervello lesioni metastatiche dal stroma circostante, ma è limitato ad alcuni modelli di melanoma. B) Dissociato cellule tumorali mammarie dal transgenico MMTV- Neu / Pten del mouse -null produce cervello palese metastasi afl'impianto ter tramite iniezione carotide. Il margine tumorale / stroma è difficile distinguere nonostante l'evidente presenza di lesioni metastatiche angiogenici. C) MDA-MB-231 cellule di cancro al seno sono stati pre-etichettati con una proteina fluorescente (GFP) giornalista verde ex vivo per facilitare l'estrazione delle lesioni metastasi cerebrali tramite resezione chirurgica o l'ordinamento delle cellule. Si noti che la maggior parte delle lesioni metastatiche sono concentrati sullo stesso lato del cervello dove iniezione arteriosa carotidea avviene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le fasi più critiche per successo iniezione arteriosa carotidea delle cellule tumorali sono: 1) anestesia profonda di topo in preparazione per il funzionamento chirurgico; 2) il posizionamento stabile della carotide sulla sommità del supporto di cotone; 3) stretto legatura dell'arteria carotide dopo l'iniezione di successo.

anestesia profonda di ~ 30 minuti è di solito necessario per le prestazioni chirurgiche costante sotto il microscopio da dissezione. Usiamo cocktail di ketamina / xylazina in commercio già pronte per l'uso per l'anestesia del mouse. Per evitare potenziali sovradosaggio, il cocktail di ketamina / xylazina può essere diluito 1: 1 o 1: 2 in soluzione fisiologica per fornire maggiore flessibilità nella regolazione del volume utilizzato per l'anestesia. In alternativa, non controllato tribromoethanol farmaco può anche essere usato come anestetico; Tuttavia, abbiamo trovato che la propensione di tribromoethanol a degradare rende la sostanza meno affidabile come anestetico efficace del cocktail ketamina / xilazina.

UNstabilmente collocato e completamente carotide pressurizzato facilita notevolmente l'iniezione delle cellule tumorali; Pertanto, si consiglia vivamente di trascorrere del tempo per preparare con cura la posizione dell'arteria sotto il microscopio, piuttosto che procedere con l'iniezione in condizioni non ottimali.

Altre cellule tumorali alloggeranno all'interno del sistema vascolare sul lato di iniezione arteriosa carotidea. A volte una porzione significativa delle cellule metastatiche può migrare verso l'altro lato del cervello in modo che entrambi gli emisferi sembrano sopportare significativa quantità di lesioni metastatiche in animali moribondi.

lesioni metastatiche possono comparire sia nel parenchima o le leptomeningi del SNC, o in entrambe le posizioni. Sembra che ci siano interazioni tumore-microambiente unici che sono alla base di questi fenotipi biologici 15. Pertanto, quando una nuova linea cellulare deve essere testato per la sua capacità di produrre sperimentale metastasi cerebrali, è necessARY di prestare particolare attenzione a tali fenotipi.

Le arterie carotidi interne ed esterne forniscono sangue nel parenchima cerebrale e leptomeningi, rispettivamente. Di conseguenza, la deposizione delle cellule tumorali nel parenchima o leptomeningi può essere ottenuto con una leggera modifica di questo protocollo. Per consentire solo celle in leptomeningi, l'arteria carotide interna può essere legata da una sutura prima dell'iniezione delle cellule tumorali, indirizzando così le cellule nella carotide esterna; d'altra parte, la legatura della carotide esterna prima dell'iniezione consentirà entrata cellule solo in arteria carotide interna e parenchima cerebrale.

Nel complesso, l'approccio di iniezione intracarotidea produce dati di una maggiore riproducibilità e la variabilità inferiore rispetto alla vena della coda o intracardiaci iniezioni; evita anche l'iniezione indotta CNS infiammazione rispetto al metodo di iniezione intracerebrale diretta. Pertanto, questo approccio è attualmente il piùprezioso in studi quantitativi di metastasi cerebrali che mirano a generare significative conclusioni statistiche utilizzando un numero limitato di animali. Allo stesso tempo, tutti i modelli sperimentali hanno limitazioni. Simile ad altri metodi di hematogenous introduzione delle cellule tumorali, l'iniezione intracarotidea ricapitola solo passi successivi nella cascata di metastasi dopo la diffusione delle cellule tumorali in circolo. Così, non è un modello appropriato per studiare, per esempio, i fattori biologici che determinano la diffusione delle cellule tumorali primarie nel flusso sanguigno.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution Sigma-Aldrich K113
Routine Stereomicroscope Leica M50 Leica M50 The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements.
Surgical disposable scapel Integra Miltex 4-410 to make skin incisions
Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth Fine Science Tools 11021-12 to bluntly dissect mucles
Dumont #5 - Mirror Finish Forceps Fine Science Tools 11252-23 to separate and prepare the carotid artery for injection
Spring Scissors Fine Science Tools 15025-10 to cut sutures
EZ Clip Kit Stoelting 59020 for wound cloure
BD Insulin Syringe Becton Dickinson 328438 for cell injection
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer 124262

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References

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Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D.More

Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis. J. Vis. Exp. (120), e55085, doi:10.3791/55085 (2017).

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