Summary
脳転移は、治療の選択肢が緩和的に残っているが、その発生率が増加しているとして緊急に満たされていない医療ニーズとなっています。癌細胞の頸動脈内動脈注射を介して脳転移の実験動物モデルを作成することは、疾患の生物学および新規介入計画の評価の機構研究を容易にします。
Abstract
転移は、患者の体内の二次部位での広がりと悪性細胞の増殖は、癌関連死亡率の> 90％を占めます。最近、新しい治療法で印象的な進歩は飛躍的に多くの癌患者の生存および生活の質の向上を延長しています。悲しいことに、脳転移再発の発生率が急上昇して、すべての現在の治療は、単なる姑息です。したがって、良好な実験動物モデルが緊急疾患生物学の詳細な研究を容易にし、前臨床評価のための新規な治療法を評価するために必要とされます。しかし、癌細胞の尾静脈注射を介して、 インビボ転移アッセイにおける標準は、主に肺転移病変を生成します。動物は通常、脳転移のいずれかの意味の伸長前に肺腫瘍負荷に屈します。腫瘍細胞の心臓内注射は、脳を含む複数の器官部位への転移病変を生成します。しかし、variabiこのモデルを用いて製造腫瘍増殖のリティは、治療効果を評価する際に、その有用性を減衰大きいです。脳転移の研究のための信頼性と一貫性の動物モデルを生成するには、ここでは、腫瘍細胞の頸動脈内注射を介して家のマウス（ ハツカネズミ ）における実験的脳転移を製造するための手順について説明します。このアプローチは、このように基本的な生物学的メカニズムを研究し、新規治療薬を評価するために研究努力を促進する、いずれかの同様の増殖率および死亡率の特性を有する脳転移担持マウスの大量生産を可能にします。
Introduction
中枢神経系（CNS）への癌の転移は壊滅的な疾患であり、脳実質または軟膜（「脳転移が「この資料の両方を意味する）のいずれかを含むことができます。 1 1、2：それは> 10で一次神経膠腫をより多かっ、支配的な頭蓋内悪性腫瘍です。肺癌、乳癌、および黒色腫は脳転移3,4の高い発生率を生成トップ三大腫瘍性疾患です。近年では、新たな癌治療中の印象的な進歩は劇的に生存を延長し、多くの癌患者の生活の質を改善しています。しかし、再発時に、脳転移の発生率が急速に上昇しています。例えば、抗HER2抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）は、HER2 +乳癌患者で有意な臨床効果を示しました。まだ不穏な傾向が出てきましたこれらの患者における：その頭蓋外全身性疾患最初に、後に脳転移5、6、7を開発トラスツズマブ治療の恩恵を受けたものの1/3まで。悲しいことに、脳転移を有する患者は、通常、生活の質の外傷性劣化を経験し、ほとんどすべての現在の治療に対して難治性であり、診断後の彼らの1年生存率はわずか〜20％8です。 （ステロイド、頭蓋放射線療法、および選択された患者における外科的切除を含む）脳転移のための現在の治療は、単に9治癒的ではなく、姑息されています。そのため、脳転移は、新規癌治療のこの時代の次の印象的な課題として浮上しています。患者が診療所に日々直面している満たされていない課題を解決するために、我々は早急に優れた脳転移の根底にあるメカニズムを理解し、新しい治療法を開発するためにこの知識を使用する必要があります。
ここでは、総頸動脈への癌細胞の注射を介して実験的脳転移を生成する手順を説明します。我々は、脳転移の転移カスケードに個々の遺伝子の貢献を分析し、治療的介入の有効性を評価するために、このアプローチを使用していますS 12、13。このアプローチの主な利点は、再現性の変動の低度の高度です。主な欠点は、顕微手術を実行するために必要な精巧さと器用さです。
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Protocol
倫理の声明：すべての動物実験は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。
1.注射用癌細胞を準備します
- 1日か2日の注入前に癌細胞をシード。特殊媒体は、特定の細胞株について、文献に示されない限り、10％FBSを補充したDMEM / F12培地は、使用します。
- 37℃で2分 - 1のためのトリプシン処理（0.25％）の前に一回無血清培地との最初の洗浄により80％コンフルエンス - 手術の日に、収穫細胞は、彼らが70に到達したとき。 DMEM / F12培地をFBSを含有する10％が0.25％トリプシンをクエンチするために細胞に加えます。
- 3分間80×gで細胞を遠心分離します。細胞株に応じて、5×10 6細胞/ ml -無血清培地で洗浄細胞を2回1にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で、残存血清を除去し、血球計で細胞を計数し、再懸濁します。氷の上に保管してください注射時まで。
注：MDA-MB-231乳癌細胞およびK1735メラノーマ細胞を本研究に使用した、両方の細胞株は、/ mlの濃度が2×10 6個の細胞で使用しました。過剰治療は転移アッセイの成果に影響を与える可能性があるとして、できるだけ短いトリプシン処理時間をおいてください。
2.腫瘍細胞注射のためにマウスを準備
- 腹腔内ケタミン/キシラジンのカクテルの（IP）注射（ケタミンを100mg / kgを、キシラジン10mg / kgの）によってマウスを麻酔。
- 動物の足をつまんで完全に麻酔を確認し、応答の欠如を観察します。
- （タンパク質ゲルを鋳造するために使用される）ガラス板上にマウスを置き、ゴムバンドで固定します。
- 必要に応じて、シェービングや脱毛製品の少量を適用し、紙タオルで髪を拭き取ることにより、首の毛を取り除きます。注：彼らは体毛を持っていないとして、ヌードマウスを使用している場合は、このステップをスキップします。
- 適用することにより、首の皮膚をきれいにしてくださいポビドンヨードおよび70％のアルコール。
- 解剖顕微鏡のステージ上にマウスを置き、
- 手術用メスで約1センチの皮膚を切開してください。
- ぶっきらぼう下に頸動脈を露出させるために歯付き鉗子で筋肉を解剖。
- 手術用鉗子で隣接する迷走神経から頸動脈を分離します。
- 手術用鉗子を使用して、より小さなコットンボールに、綿球からいくつかの綿を分離湿らせ、そしてファッション。注射の意図された部位の頸動脈の下にこのバッファ湿コットンボールを置きます。
- コットンボールに縫合糸の遠位端と近位を置き、緩い結び目を作ります。注射部位への血流を遮断するために、近位結び目を締めます。
- コットンボールに頚動脈が新鮮な赤い血と完全に加圧された表示された場合は、癌細胞の注射に進みます。
頚動脈に3癌細胞注入
- ボルテックスし、100μlのOを描きますシリンジにF癌細胞。
- 解剖顕微鏡下で、ゆっくりとコットンボールの上に座って頸動脈の内腔に（ベベルを上にして）31 G針を挿入します。
- ゆっくりと頸動脈に注射器から細胞を注入します。緩衝癌細胞が循環中に押し込まれたときに成功した注射は、近くの血管や筋肉組織の変色によって、顕微鏡下で観察することができます。
- ボリューム全体の注入が完了すると、逆流を防止するために穏やかに遠位頚動脈を持ち上げます。
- 素早く注入プロセスを完了するために、遠位の結び目を締めます。
- 注入が完了した後、合字を締めし、解剖顕微鏡下でマイクロはさみで余分な絹縫合糸をトリミング。創傷部位をカバーするために分離された筋肉を戻します。 2つのステープルで皮膚を閉じます。
4.外科回復
- 加熱パッド上に操作動物を移動します回復のため。動物が意識を回復するために60分 - それは30を取ることができます。一方で、術後の鎮痛などの皮下注射を介して、ブプレノルフィン（0.05ミリグラム/キログラム）を管理。注：鎮痛はIACUCプロトコルを承認し、ローカルに応じて提供されるべきです。
- 動物が目覚めると、自分の通常の動作を再開したら、彼らの住宅の場所にマウスを返します。数日後に手術のためのゲル食品でマウスを提供します。外科的な記録を維持し、部屋に保管してください。
5. in vivoイメージング非侵襲的
- ルシフェラーゼレポーター構築物で標識された細胞は、in vivoイメージングシステム14 に用いた癌細胞の注入効率を測定します。
注：イメージングは、研究動物に過度なストレスを回避するために、注射の日に実行されません。
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Representative Results
注射の質を評価することができる2つのポイントがあります。最初の可能性は、注入の間、血管の色を変化させる操作者の観察によるものです。貧しい注射からの漏れが簡単に解剖顕微鏡下で観察することができます。サポートコットンボールにマウス本体（ 図1A）とその頸動脈（ 図1B）の安定的かつ安全な配置は、頸動脈への円滑かつ成功した注射のための重要な要因です。注射の質を評価するための第二の点は、手術後の非侵襲的イメージングです。この目的のために、癌細胞は、典型的には、注射前に、ルシフェラーゼレポーターエクスビボで標識されます。 インビボイメージングにおいて 、動物のストレスを最小限に抑えるために、通常、24時間のポスト噴射を行います。強力な頭蓋内癌細胞の負荷、およびマウスの頭の中で成功した注射の結果が正のsの唯一の地域でありますignals（ 図2A）。
ルシフェラーゼ標識した癌細胞を追跡するために生体内撮像システムに使用して、我々は日後噴射内の信号強度の初期の減少を観察します。まだ、CNSにおける成長の可能な癌細胞は、最終的に分裂し、脳転移が（ 図2B）の開発としてvivoイメージング・システムのシグナルが増加し生産するために管理します。頚動脈内注入は、通常、実験的脳転移を生成するためにこのアプローチを使用することの主な利点は比較的低い変動性で生体内撮像システムの信号一貫した生成します。増殖する腫瘍病変が脳組織を変位されるように、高速進んで脳転移を有する動物のための健康の質は、人間の脳転移患者の臨床症状をミラーリング、急速に劣化することができます。脳転移の重要な存在を示す典型的な症候性行動はの損失を含みます体重、猫背の姿勢、そして絶え間ない周回。実験の終了時点で、動物の脳を生化学的パラメーターの調査または組織学的検査のために抽出することができます。黒色転移病変（ 図3A）を除いて、組織学的評価（ 図3B）の前脳組織の周囲からの腫瘍病巣を区別することは通常困難です。このような場合には、転移性細胞（ 図3C）を単離するの便宜のために蛍光レポーター（ 例えば GFP）で腫瘍細胞を標識することをお勧めします。あるいは、全体の脳は、磁気ビーズ結合抗体によって分離された単一細胞および腫瘍細胞に解離させることができます。
図1：頸動脈注射用製剤。 A）麻酔したマウスは、ガラス板上に置き、RUで固定されていますBBERバンド。サイトと切開の長さは、首に黒い線で標識されています。すべての準備の外科的手順が完了した後B）、露出した頸動脈は、癌細胞の注射の準備ができて、しっかりしたコットンボールにサポートするために配置されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：脳転移の成長のための非侵襲的モニタリング。 A）修飾MDA-MB-231乳癌細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のex vivoで標識しました。 24時間後、頸動脈注射から出発して、脳転移の発達は、 生体内撮像システムの画像（スケールバー= 50 mm）の中で繰り返されることにより、非侵襲的にモニターしました。 B） インビボイメージングシステムIMAの定量にエージングデータは、動物瀕死までの脳転移の指数関数的成長が続く腫瘍負荷後の頸動脈注射の最初の低下を、示しています。エラーバーは、全発光シグナルの平均（SEM）の標準誤差を反映します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：収穫脳転移病変。 A）K1735メラノーマ細胞は大きく、周囲の間質からの脳転移病巣の分離を容易にするが、ある種のメラノーマモデルに限定され同系C3Hマウス脳における黒色脳転移病変を生成します。 B）トランスジェニックMMTV- ノイ / のPten -nullマウスから乳腺腫瘍細胞を解離は明白な脳転移のAFを生成します頸動脈注射を介してター注入。腫瘍/間質マージンは、血管新生、転移性病変の明白な存在にもかかわらず、区別することは困難です。 C）MDA-MB-231乳癌細胞を、外科的切除または細胞選別を介して脳転移病変の抽出を容易にするために、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターエクスビボで予め標識しました。転移病巣の大部分が頸動脈注入が行われる脳の同じ側に集中していることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
癌細胞の成功した頸動脈注射のための最も重要な手順は次のとおりです。手術の準備のために、マウスの1）深い麻酔。 2）綿のサポートの上に頸動脈の安定した配置。成功した注入後の頸動脈の3）タイト結紮。
30分〜の深い麻酔を解剖顕微鏡下での安定した外科的なパフォーマンスのために通常必要です。我々は、マウスの麻酔のために商業的にすぐに使用できるケタミン/キシラジンのカクテルを使用します。麻酔のために使用される音量を調整する際に柔軟性を提供するために生理食塩水で2：1または1：潜在的な過剰摂取を避けるために、ケタミン/キシラジンのカクテルを1に希釈されてもよいです。あるいは、非制御薬物トリブロモエタノールで麻酔薬としても使用され得ます。しかし、我々は分解するトリブロモエタノールの傾向は、ケタミン/キシラジンのカクテルよりも効果的な麻酔薬などの物質が少なく信頼性を向上させていることを発見しました。
A着実に配置され、完全に加圧された頸動脈を大幅に癌細胞の注入を容易に。したがって、我々は非常に慎重に顕微鏡下ではなく次善の条件で注入を進める動脈の位置を準備するために過ごす時間をお勧めします。
複数の癌細胞は、頸動脈注入側の血管系内申し立てるます。両半球が瀕死の動物で転移病巣のかなりの量を負担するために表示されるように時々、転移性細胞のかなりの部分は、脳の反対側に移行することができます。
転移性の病変は実質またはCNSの軟膜のいずれか、または両方の場所に表示されることがあります。これらの生物学的表現型15の根底にあるユニークな腫瘍微小環境の相互作用があるように思われます。新しい細胞株を実験的脳転移を産生する能力について試験する場合したがって、それはnecessありますこのような表現型に特別な注意を払うようにARY。
内部および外部頚動脈はそれぞれ、脳実質と軟膜の中に血液を供給する。従って、実質または軟膜への腫瘍細胞の堆積は、このプロトコルのわずかな改変によって達成することができます。唯一の軟髄膜に細胞を可能にするために、内頸動脈は、腫瘍細胞の注射の前に縫合によって連結することができ、それによって、外頸動脈に細胞を導きます。一方で、注射の前に外頸動脈の結紮は内頸動脈と脳実質への細胞の侵入を許可します。
全体として、頚動脈内注入手法は、尾静脈または心臓内注射と比較して、より高い再現性およびより低い変動性のデータを生成します。それはまた、直接脳内注入法に比べて、注射によって誘発されるCNS炎症を回避することができます。したがって、このアプローチは、現在、最もあり動物の限られた数を使用して統計的に有意な結論を生成することを目的と脳転移の定量的研究における貴重。同時に、すべての実験モデルには限界があります。血行性腫瘍細胞の導入の他の方法と同様に、頚動脈内注入は、循環への癌細胞の播種後転移カスケードの後の工程を再現します。したがって、例えば、血流中に原発性癌細胞の播種を決定する生物学的因子を研究するための適切なモデルではありません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
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