Summary
Insecticide evaluaties zijn vaak gericht tegen volwassen insecten, in plaats van onvolwassen stadia. Hier presenteren we een protocol voor het evalueren van insecticiden tegen bed bug eieren met een vergelijking met de eerste nimfenstadium bedwants podium. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere insecten insecticide werkzaamheid in niet-volwassen levensstadia evalueren.
Abstract
Standard toxiciteit evaluaties van insecticiden tegen schadelijke insecten worden voornamelijk uitgevoerd op volwassen insecten. Evaluatie op basis van een dosis-respons of concentratie-respons curve, de sterfte toeneemt naarmate de dosis of concentratie van een insecticide wordt verhoogd. Standaard letale concentratie (LC50) en letale dosis (LD50) tests die leiden tot 50% mortaliteit van een testpopulatie kan een uitdaging voor de evaluatie toxiciteit van insecticiden tegen insecten levensstadia niet voor volwassenen, zoals eieren en vroege instar of nimfenstadia . Echter, deze informatie is essentieel voor het begrijpen van insecticide werkzaamheid in alle bed bug levensfasen, die de controle en behandeling inspanningen beïnvloedt. Dit protocol maakt gebruik van een standaard dompelen bioassay aangepast voor bed bug eieren en een contact insecticide-test voor de behandeling van nymphal eerste stadia. Deze assays produceren een concentratie-respons curve verder kwantificeren LC 50 waarden voor insecticide evaluaties.
Introduction
Bed bugs zijn een belangrijke stedelijke plaag die bloedverlies, huidirritaties, slapeloosheid, depressie en angst bij de humane gastheer 1, 2, 3, 4, 5, 6 kunnen veroorzaken. De kosten van de verwijdering en het regelen van bed bugs zijn hoog en vaak vereisen meerdere bezoeken aan een huis door een ongediertebestrijding bedrijf 7. Meerdere bezoeken zijn meestal verplicht vanwege de cryptische gedrag van bed bugs en de problemen in verband met hen te doden. Vooral bed luizeneieren moeilijk te controleren vanwege hun kleine afmetingen en de bescherming van het embryo van de eierschaal.
Momenteel is een gangbare praktijk voor veel ongediertebestrijding bedrijven in de Verenigde Staten is om een huis voor bed bugs met een chemisch insecticide te behandelen. Het is bekenddat de eieren moeilijk te controleren zijn zo veel bedrijven twee weken tijd voor herhalingsbehandelingen 8 uitgevoerd. Hiermee bed luizeneieren voldoende tijd om uit te komen, zodat het eerste instar-stadium zal ontstaan en ogenschijnlijk makkelijker te doden met insecticiden. Er is echter een gebrek aan studies evalueren van de werkzaamheid van insecticiden tegen bedmijt eieren en eerste stadia.
Insecteneieren zijn gedocumenteerd de moeilijkste levensfase te beheersen stedelijke insectenplagen, behalve bed bugs zijn, naast vele landbouwongedierte. De meeste van deze problemen zijn toegeschreven aan de schalen, terwijl een paar studies insecticide resistentie gemeld. De weerstand in het ei stadium is gedocumenteerd in Triatoma infestans 9, Pediculus humanus capitis 10, Plutella xylostella 11, Rhyzopertha Dominica 12,
Dit protocol wordt stap-voor-stap procedure voor het bepalen van de werkzaamheid van insecticiden in het ei en eerste instar fase van het gemeenschappelijk huismijten, Cimex lectularius. Beide protocollen concentratie-respons assays voor kwantificering van LC 50 waarden toe. Concentratie-respons testen worden vaak gebruikt voor toxicologisch onderzoek, maar dit protocol is aangepast voor het eenvoudig te behandelen groepen van bed bug eieren en de eerste stadia. Deze assays kunnen worden aangepastvoor eieren verschillende insectensoorten en onvolwassen levensfasen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Dit protocol omvat twee insecticide assays voor het afzonderlijk behandelen van bed bug eieren en de eerste stadia. Beide protocollen werden uitgevoerd met dezelfde insecticiden had echter de protocollen worden aangepast om blootstelling insecticide waarborgen en gemakkelijk de specimens manipuleren.
1. Egg Dompelen insecticide Assay
- Pull gekoppeld, goed gevoede insecten volwassen vrouwelijke bed uit een kolonie en plaats de vrouwtjes (5-10) in een Petri schaal met filtreerpapier. Ten minste tien herhalingen zodat er genoeg eieren voor de insecticide assay. Controleer of de vrouwtjes eieren elke dag hebben gelegd.
- Zodra ze eieren leggen, nemen de vrouwtjes uit de petrischaal (6 cm x 5 cm) en leg ze in nieuw Petri gerechten met een nieuw filterpapier dagelijks en noteer de datum van de oude en nieuwe Petri gerechten.
- Laat de eieren 4 tot 5 dagen vóór aanvang van de test. Gevoeligheid voor insecticiden veranderingen tijdens embryonale ontwikkeling, so is het belangrijk om te controleren voor eieren leeftijd. Houd alle levensfasen op 12:12 L: D lichtperiode, 60% RH en 27 ° C.
- Zodra de eitjes op de juiste wijze zijn verouderd, verwijder het bed bug eieren voorzichtig uit filter papers met behulp van soft-tip tang. Voorzichtig schrapen de onderkant van het ei aan de filterpapier behulp van de tang en voorzichtig grijpen zonder toepassing van veel druk op het ei gooien bed luizeneieren beperken.
- Plaats de verwijderde bed bug eieren in hun respectievelijke groepen binnenkant van plastic petrischaaltjes. Beperk statische elektriciteit uit wierp bed bug eieren door wrijven de onderkant van elke petrischaal aan de buitenkant met een wasverzachter blad. Treat groepen van bed bug eieren (5-10 eieren per groep) in een keer. Beschouw één groep overgenomen en gebruikt ten minste vijf (of meer) repliceert voor deze test.
- Bereid seriële verdunningen van insecticiden een reeks 5 verschillende concentraties (0,21-21 krijgen ul / ml voor imidacloprid (0,1%) / β-cyfluthrin (0,5%) en een controlegroepoplossing met een oplosmiddel (leidingwater) alleen. Voeg 20 ml elke concentratie om voldoende volume voor het dompelen assay.
- Cut centrifugebuizen (50 ml) bij de 35 ml lijn mediaal met behulp van een draaiend gereedschap met een cut-off wiel accessoire en snijd een gat in de dop van de centrifugebuis (diameter = 2,54 cm) met behulp van dezelfde roterende gereedschap met een aluminium oxide slijpsteen accessoire. Laat 5 cm aan de rand van de dop bij het snijden, zodat de dop goed zal schroef in de buis (figuur 1).
- Snijd fijnmazige vierkant groot genoeg om in de dop (~ 5 cm 2). Schroef het gaas strak, het wegnemen van hobbels, in de centrifuge buizen met behulp van de centrifugebuis dop.
- Plaats een groep van bed bug eieren (een herhaling) met behulp van een penseel op het gaas binnenkant van de centrifuge buis. Dompel de groep van bed bugs binnenkant van de snede centrifugebuis in een insecticide concentratie gedurende 5 seconden.
- Verwijder de centrifugebuis uit the insecticide oplossing. Droog de maas met eieren binnen door het plaatsen van de centrifugebuis direct op een laboratorium tissue.
- Verwijder de groep van eieren uit de centrifuge buis met behulp van een kleine, fijne haren kwast en plaats ze in een schone Petrischaal met een schone papieren filter.
- Record ei mortaliteit (niet uitkomen) gedurende 14 dagen de tijd om alle eieren te verzekeren hebben voldoende tijd om uit te komen hadden.
- Juist voor de sterfte in de controlegroep behandeling met behulp van de formule van Abbott (% test sterfte -% controle sterfte / 100 - sterfte in de controlegroep x 100).
- Plaats opgenomen mortaliteit met de overeenkomstige concentraties in de analysesoftware 15 LC 50 waarden berekend.
2. Eerste Instar insecticide Assay
- Scheid een groep van goed gevoede bed bugs (5 volwassen mannen en 5 volwassen vrouwtjes), bij voorkeur gevoed 1 dag voor, en plaats ze in een petrischaal (6 cm x 5 cm) met filter papier voorzien mating en eileg. Laat de volwassen bed bugs om te paren en eieren leggen gedurende ongeveer 7-9 dagen. Voor voeding, gebruik van een kunstmatige voeding systeem dat warm water in glazen buizen omringende bloed 16 circuleert. Voor dit onderzoek gebruiken defibronated konijn bloed.
- Verwijder de volwassenen uit de petrischaaltjes (6 cm x 5 cm) en laat de eieren uit te broeden in de eerste stadia binnen de petrischaaltjes. Het duurt ongeveer 7-9 dagen voor bed bug te broeden eieren bij kamertemperatuur.
- Verzamel de unfed eerste stadia van dezelfde leeftijd met behulp van een kwast. Leeftijd kan worden bepaald door dagelijkse verwijderen van de eerste stadia en registreren van de dag dat ze uitgebroed. Plaats ze in nieuwe, schone Petrischalen tot de insecticide-test. Eerste instar nimfen niet erg resistent droogmiddel, waardoor de insecticide test zo snel mogelijk worden verstrekt.
- Voor de test bereiden seriële verdunningen van imidacloprid / β-cyfluthrin een reeks van 5 verschillende concentraties en een controle oplos krijgentie met slechts oplosmiddel. Geformuleerde producten gelabeld voor bed bug controle in de Verenigde Staten werden gebruikt voor deze studies, dus het oplosmiddel werd water (volgens het etiket).
- Pipetteer 150 ul aliquots van elke insecticidenconcentratie en water voor de controlegroep op individuele filtreerpapier (# 1, 4,2 cm diameter). Verdeel het insecticide voor de gehele filtreerpapier met de pipet door toepassing van druppels langs de hele rand en het midden van het filterpapier.
- Plaats het behandelde filter papers individueel boven op de losse hardboardpanelen (7 cm 2).
- Afgifte groepen eerste stadia (5-10 per groep) op de individuele filterpapieren ze nog nat met insecticide en bedekken de eerste stadia met een omgekeerde bodem van een petrischaal.
- Plaats een gewicht boven op de petrischaal om te voorkomen dat het eerste instar huismijten ontsnapt het behandelde oppervlak.
- Record mortaliteit van eerste larvestadium bedwantsen na 24 uur blootstelling aan alleinsecticide concentraties.
- Juist voor de sterfte in de controlegroep behandeling met behulp van de formule van Abbott (% test sterfte -% controle sterfte / 100 - sterfte in de controlegroep x 100).
- Invoegen opgenomen mortaliteit en concentraties in de analysesoftware 15 LC 50 waarden berekend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eieren werden ondergedompeld in 5 verschillende concentraties van imidacloprid / β-cyfluthrin (ul / ml). De eerste stadia werden op behandelde oppervlakken van vijf verschillende concentraties van imidacloprid / β-cyfluthrin (Figuur 2) geplaatst.
We gebruikten drie verschillende populaties van C. lectularius: Harlan, Richmond, en epicentrum (tabel 1). The Harlan stam is gevoelig voor pyrethroïde insecticiden en werd in 2005 overgenomen van Dr. Harold Harlan. De Richmond en Epic Center stammen zijn zowel resistent tegen deltamethrin. The Richmond stam werd verzameld van een oudere groep huis in Richmond, VA in 2008. De Epic Center stam werd verzameld in 2008 in Cincinnati, OH.
Hogere LC 50 waarden aangegeven dat een hogere concentratie nodig om 50% doden van detestpopulatie eieren van Richmond en Epic Center stammen. Vergelijkbaar met de eieren, de eerste stadia van de Richmond en epicentrum populaties vereiste hogere concentraties insecticide te doden 50% van de testpopulatie. De LC 50-waarden, gevolgd door verschillende letters zijn significant verschillend.
Figuur 1. Foto van de gemodificeerde centrifugebuis. Een gat is gesneden in de kap, zodat een vierkant stuk gaas kan worden geschroefd in de dop. Het gaas stukken kan worden weggegooid en vervangen bij verschillende insecticiden. Het bed bug eieren worden direct op het gaas geplaatst met behulp van een penseel en vervolgens ondergedompeld in de insecticide oplossingen voor de dompelen test. Klik hier om een grotere versie van deze figur bekijkene.
Figuur 2. Vertegenwoordiging van een dosis-respons grafiek. Het percentage respons (mortaliteit) van Harlan stam bedmijt eieren imidacloprid / β-cyfluthrin is uitgezet op de y-as en de log concentratie die huismijten werden blootgesteld wordt weergegeven op de x-as. Ei sterk verhoogd bij een stijgende dosis en mortaliteit bereikte 100% bij de hoogste geteste concentratie.
| Life Stage / Strain | n | LC 50 (95% CI) | Helling ± SE | X 2 (df) | |
| eieren | |||||
| Harlan | 250 | 0.41a ( 0,276-0,548) | 1,86 ± 0,24 | 33,42 (23) | |
| Richmond | 320 | 1.23b (0,59-2,10) | 1.13 ± 0.14 | 82,57 (30) | |
| Epic Center | 400 | 2.10b (1,049-4,587) | 0.95 ± 0.10 | 149,91 (38) | |
| eerste stadia | |||||
| Harlan | 150 | 0.04a (0,030-0,063) | 2.16 ± 0.34 | 38,17 (28) | |
| Richmond | 195 | 4.81b (1,94-10,26) | 0,66 ± 0,12 | 45,87 (37) | |
| Epic Center | 190 | 19.72b (8,18-184,48) | 0,75 ± 0,17 | 45,39 (36) | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Molly een getrouw voor verdunning en pesticide formulering hulp. We danken ook Troy Anderson probitmethode begeleiding en Zachary Adelman voor hulp bij experimenteel design. Dit onderzoek werd mede ondersteund door een Entomologische Foundation Award en door Virginia gewasbescherming beurs fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | Plastic |
| Filter paper | Whatman | 1001-042 | |
| Featherweight forceps | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC (imidacloprid/bifenthrin) | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP (acetamiprid/bifenthrin) | FMC Corp. | ||
| Centrifuge tube | 06-443-18 | 50 mL; flat-top threaded | |
| Fine mesh | 7250C | ||
| KimWipe | 06-666A | 11 cm x 21 cm | |
| Small paint brush | Any small paint brush | ||
| Hardboard panels | Composite wood or tile would be sufficient from a home improvement store | ||
| Metal weights | Any type of metal screw that will hold the weight of the Petri dish down onto a surface |
References
- Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
- Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
- Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
- Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
- Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
- Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
- Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
- Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
- Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
- Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
- Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
- Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
- Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
- Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
- Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
- Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
- Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
- Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
- Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).
