Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En metod för att utvärdera Insekts Effekt mot Bed Bug, Published: March 15, 2017 doi: 10.3791/55092
Automatic Translation
1, 2
1Department of Entomology and Nematology, University of Florida, 2Department of Entomology, Virginia Tech

Summary

Insekts utvärderingar ofta riktade mot vuxna insekter, snarare än omogna stadier. Här presenterar vi ett protokoll för utvärdering av insekticider mot sängen bug ägg med en jämförelse med den första nymphal bed bug skede. Dessa protokoll kan justeras för andra insekter för att utvärdera insekts effekt i icke-vuxna levnadsstadier.

Abstract

Standardtoxicitets utvärderingar av insekticider mot skadeinsekter i första hand genomförs på vuxna insekter. Utvärderingarna är baserade på en dos-respons eller koncentration-respons-kurva, där dödligheten ökar allteftersom dosen eller koncentrationen av en insekticid ökas. Standard dödlig koncentration (LC 50) och letal dos (LD 50) tester som resulterar i 50% dödlighet av en testpopulation kan vara en utmaning för utvärdering av toxiciteten av insekticider mot icke-vuxna insektslivsstadier, såsom ägg och tidigt stadiet eller nymphal stadier . Men är denna information som är nödvändig för att förstå insekts effekt i alla bed bug levnadsstadier, vilket påverkar kontroll- och behandlingsarbetet. Detta protokoll använder en standard doppa bioanalys modifierats för säng bug ägg och en kontakt insektsbekämpning analys för behandling av nymphal första instars. Dessa analyser producera en koncentration-svarskurva för att ytterligare kvantifiera LC 50-värden för insekts utvärderingar.

Introduction

Vägglöss är en viktig urban skadedjur som kan orsaka blodförlust, hudirritationer, sömnlöshet, depression och ångest i sina mänskliga värdar 1, 2, 3, 4, 5, 6. Kostnaderna för att eliminera och kontrollera vägglöss är höga och ofta kräver flera besök till ett hem med en skadedjursbekämpning företag 7. Flera besök krävs vanligtvis på grund av den kryptiska beteende vägglöss och de svårigheter som är förknippade med att döda dem. I synnerhet, bed bug ägg är svår att kontrollera på grund av deras ringa storlek och skydd av embryot genom äggskalet.

För närvarande är en vanlig metod för många skadedjursbekämpning företag i hela USA för att behandla ett hem för vägglöss genom kemiska insektsmedel. Det är väl käntatt äggen är svåra att kontrollera, har så många företag genomfört en två veckors tid för upprepade behandlingar 8. Detta tillåter bed bug ägg tillräckligt med tid att kläckas, så att den första instar kommer att dyka upp och purportedly vara lättare att döda med insekticider. Det finns dock en brist på studier som utvärderar effekten av flytande insekticider mot sängen bug ägg och första instars.

Insektägg har dokumenterats att vara den svåraste livsfas att styra i stads skadeinsekter, annat än vägglöss, förutom många skadedjur inom jordbruket. De flesta av dessa svårigheter har tillskrivits äggskal, medan ett fåtal studier har rapporterat insektsresistens. Motstånd i ägget steget har dokumenterats i Triatoma infestans 9, Pediculus humanus capitis 10, Plutella xylostella 11, Rhyzopertha dominica 12, 13, och ett flertal lagrade produkt skalbaggar (dvs sågtandad plattbagge, Tribolium castaneum, cryptolestes ferrugineus och Rhyzopertha dominica). 14 resistensutveckling hos ägget stadiet och omogna stadier, samt komplikationer i samband med insekts penetrering genom äggskal, nödvändiggör behovet av insekts effekt bioanalyser mot dessa livsstadier.

Detta protokoll ger en steg-för-steg metod för att bestämma effekten av insekticider i ägget och första stadiet stadiet av gemensamma vägglöss, lectularius Cimex. Båda dessa protokoll är koncentration-respons-analyser för att medge kvantifiering av LC 50-värden. Koncentration-responsanalyser används ofta för toxikologiska studier, men detta protokoll har anpassats för att enkelt behandla grupper av säng bug ägg och första instars. Dessa analyser kan anpassasför olika insektsarter ägg och omogna stadier i livet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Detta protokoll omfattar två insekts analyser för separat behandling bed bug ägg och första instars. Båda protokollen genomfördes med användning av samma insekticider, hade dock de protokoll som ska anpassas för att säkerställa insekts exponering och enkelt manipulera proverna.

1. Ägg Dipping Insekticid Assay

  1. Dra parat, välnärda vuxna kvinnliga vägglöss från en koloni och placera kvinnor (5-10) i en petriskål med filterpapper. Har minst tio replikat för att säkerställa att det kommer att finnas tillräckligt med ägg för att utrota analysen. Kontrollera om honorna har lagt ägg varje dag.
    1. När de lägger ägg, ta honorna av petriskålen (6 cm x 5 cm) och sätta dem i nya petriskålar med en ny filterpapper dagligen och registrera datum på de gamla och nya petriskålar.
    2. Låt ägg till 4 års ålder till 5 dagar innan analysen. Känslighet för insekticider förändringar under embryonal utveckling, so det är viktigt att kontrollera för ägg ålder. Håll alla livsstadier vid 12:12 L: D fotoperiod, 60% RH och 27 ° C.
  2. När äggen har åldrats på lämpligt sätt, ta bort säng bug äggen försiktigt från filterpapper med användning av mjuk-tip pincett. skrapa försiktigt av ägget fäst filterpapper med hjälp av pincett och sedan försiktigt ta utan att mycket tryck på ägget för att begränsa kasta säng bug ägg.
  3. Placera borttagna bed bug ägg i sina respektive grupper inne i plastpetriskålar. Begränsa statisk elektricitet från kasta bed bug ägg genom att gnugga botten av varje petriskål på utsidan med en sköljmedel ark. Behandla grupper av säng bug ägg (5-10 ägg per grupp) på en gång. Överväga en grupp en kopia och använda åtminstone fem (eller fler) replikat för denna analys.
  4. Förbereda serieutspädningar av insekticider för att få ett område av 5 olika koncentrationer (0,21-21 mikroliter / ml för imidacloprid (0,1%) / β-cyflutrin (0,5%) och en kontrolllösning med lösningsmedel (kranvatten) endast. Gör 20 ml av varje koncentration att ha tillräckligt med volym för dopp analysen.
  5. Cut centrifugrör (50 ml) vid 35 ml linjen medialt med användning av ett roterande verktyg med en kapskiva tillbehöret och sedan skära ett hål i locket av centrifugröret (diameter = 2,54 cm) med användning av samma roterande verktyg med en aluminium oxid slipsten tillbehör. Lämna 5 cm på kanten av locket vid kapning, så att locket kommer säkert skruva in i röret (figur 1).
  6. Skär finmaskigt i rutor som är stora nog att passa in i hylsan (~ 5 cm 2). Skruva nätet tätt, vilket eliminerar eventuella ojämnheter, i centrifugrören med hjälp av centrifugröret locket.
  7. Placera en grupp av bed bug ägg (ett replikat) med användning av en målarpensel på mask insidan av centrifugröret. Doppa den grupp av vägglöss inuti av den skurna centrifugrör i en insekticid koncentration under 5 sekunder.
  8. Ta centrifugröret ur the insekticid lösning. Torka mesh med äggen inuti genom att placera centrifugröret direkt på ett laboratorium vävnad.
  9. Ta bort gruppen av ägg ut ur centrifugröret med hjälp av en liten, fin-borst pensel och placera dem i en ren petriskål med ett rent filterpapper.
  10. Spela ägg dödlighet (underlåtenhet att kläckas) under 14 dagar för att säkerställa att alla ägg har haft tillräckligt med tid att kläckas.
  11. Korrekt för dödlighet i kontroll behandling med Abbotts formel (% prov dödlighet -% kontrollgruppens mortalitet / 100 - kontrollgruppens mortalitet x 100).
  12. Sätt registreras dödligheten med motsvarande koncentrationer i analysprogrammet 15 för att beräkna LC 50-värden.

2. Första Instar Insekts analys

  1. Separera en grupp av välnärda vägglöss (5 vuxna män och 5 vuxna kvinnor), företrädesvis matas en dag före, och placera dem i en petriskål (6 cm x 5 cm) med filterpapper föreskrivs mating och äggläggning. Låt vuxna vägglöss att para sig och lägga ägg i ungefär 7-9 dagar. För utfodring, använda en artificiell utfodring system som cirkulerar varmvatten i glasrör som omger blod 16. För denna studie använda defibronated kaninblod.
  2. Ta bort de vuxna från petriskålar (6 cm x 5 cm) och låta äggen att kläckas i första instars inom petriskålar. Det tar cirka 7-9 dagar för säng bug äggen att kläckas vid rumstemperatur.
  3. Samla unfed första instars i samma ålder med hjälp av en pensel. Ålder kan bestämmas genom att ta bort de första instars dagligen och registrera den dag de kläckts. Placera dem i nya, rena petriskålar tills insekts analysen. Första stadiet nymfer är inte mycket torkmedel resistenta, så insekts analysen bör slutföras så snart som möjligt.
  4. För analysen förbereda serieutspädningar av imidakloprid / β-cyflutrin för att få ett område av 5 olika koncentrationer och ett styrlösningartion med lösningsmedel endast. Formulerade produkter märkta för säng bug kontroll i USA användes för dessa studier, därför lösningsmedlet var vatten (enligt etiketten).
  5. Pipettera 150 | il alikvoter av varje insekticid koncentration och vatten för kontrollgruppen på individuella filterpapper (# 1; 4,2 cm diameter). Fördela insekticid över hela filterpapper med användning av pipett genom att anbringa små droppar runt hela kanten och mitten av filterpapper.
  6. Placera de behandlade filterpapperen individuellt ovanpå enskilda hårdpapp paneler (7 cm 2).
  7. Frisättning grupper av första instars (5 till 10 per grupp) på de enskilda filterpapper medan den fortfarande våta med insekticid och som täcker de första instars med en inverterad botten av en petriskål.
  8. Placera en vikt på toppen av petriskålen för att förhindra de första instar vägglöss från att fly den behandlade ytan.
  9. Rekord dödlighet första stadiet vägglöss efter 24 h exponering för allainsekts koncentrationer.
  10. Korrekt för dödlighet i kontroll behandling med Abbotts formel (% prov dödlighet -% kontrollgruppens mortalitet / 100 - kontrollgruppens mortalitet x 100).
  11. Sätt registreras dödligheten och koncentrationer i analysprogrammet 15 för att beräkna LC 50-värden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Äggen doppades i 5 olika koncentrationer av imidakloprid / β-cyflutrin (| il / ml). De första instars placerades på behandlade ytor av fem olika koncentrationer av imidakloprid / β-cyflutrin (Figur 2).

Vi använde tre olika populationer av C. lectularius: Harlan, Richmond, och Epic Center (tabell 1). The Harlan stammen är känslig för pyretroidinsekticider och förvärvades 2005 från Dr. Harold Harlan. Stammarna Richmond och Epic Center är både resistenta mot deltametrin. Richmond stammen samlades in från en äldre gruppbostad i Richmond, VA 2008. Epic Center stammen samlades in 2008 i Cincinnati, OH.

Högre LC 50-värden visade att en högre koncentration krävs för att döda 50% av denTest ägg befolknings från Richmond och Epic Center stammar. Liknar äggen, de första instars från Richmond och Epic Center populationer krävs högre koncentrationer av insekticid för att döda 50% av testpopulationen. LC 50 värden följt av olika bokstäver är signifikant olika.

Figur 1
Figur 1. Fotografi av den modifierade centrifugrör. Ett hål har skurits i locket, så att en fyrkantig bit mesh kan skruvas in i locket. Maskbitar kan kasseras och bytas ut vid användning av olika insekticider. Bed bug äggen placeras direkt på nätet med hjälp av en pensel och sedan nedsänkt i insektslösningar för dopp analysen. Klicka här för att se en större version av denna figure.

figur 2
Figur 2. Representation av en dos-respons kurva. Den procentuella svar (mortalitet) av Harlan stam bed bug ägg för imidakloprid / β-cyflutrin plottas på y-axeln och log koncentration att vägglöss utsattes för representeras på x-axeln. Ägg dödligheten ökade dosen ökas och dödlighet nått 100% vid den högsta testade koncentrationen.

Life Stage / Stam n LC 50 (95% CI) Lutning ± SE X 2 (df)
ägg
Harlan 250 0.41a ( 0,276-0,548) 1,86 ± 0,24 33,42 (23)
Richmond 320 1.23b (0,59-2,10) 1,13 ± 0,14 82,57 (30)
Epic Center 400 2.10b (1,049-4,587) 0,95 ± 0,10 149,91 (38)
första instars
Harlan 150 0.04a (0,030-0,063) 2,16 ± 0,34 38,17 (28)
Richmond 195 4.81b (1,94-10,26) 0,66 ± 0,12 45,87 (37)
Epic Center 190 19.72b (8,18-184,48) 0,75 ± 0,17 45,39 (36)
"> Tabell 1. Jämförelse av säng bug ägg och första stadiet LC 50-värden modifierade från Campbell och Miller 2015 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Molly trofast för utspädning och bekämpningsmedel formulering hjälp. Vi vill också tacka Troy Anderson för probitanalys vägledning och Zachary Adelman för hjälp med experimentell design. Denna forskning har delvis stöd av en Entomological Foundation tilldelning och Virginia växtskydd stipendiefonder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri dishes Fisher Scientific Inc. 08-757-105 Plastic
Filter paper Whatman 1001-042
Featherweight forceps Fisher Scientific Inc. 4750
Temprid SC (imidacloprid/bifenthrin) Bayer CropScience
Transport GHP (acetamiprid/bifenthrin) FMC Corp.
Centrifuge tube 06-443-18 50 mL; flat-top threaded
Fine mesh 7250C
KimWipe 06-666A 11 cm x 21 cm
Small paint brush Any small paint brush
Hardboard panels Composite wood or tile would be sufficient from a home improvement store
Metal weights Any type of metal screw that will hold the weight of the Petri dish down onto a surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
  2. Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
  3. Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
  4. Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
  5. Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
  6. Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
  7. Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
  8. Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
  9. Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
  10. Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
  11. Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
  12. Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
  13. Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
  14. Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
  15. Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
  16. Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
  17. Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
  18. Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
  19. Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).

Tags

Miljövetenskap dödlig koncentration doppa analys nymf koncentrationssvar, Insekts
En metod för att utvärdera Insekts Effekt mot Bed Bug,<em&gt; Cimex lectularius</em&gt;, Ägg och First instars
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, B. E., Miller, D. M. A… More

Campbell, B. E., Miller, D. M. A Method for Evaluating Insecticide Efficacy against Bed Bug, Cimex lectularius, Eggs and First Instars. J. Vis. Exp. (121), e55092, doi:10.3791/55092 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter