Summary
Insekticid evalueringer er ofte rettet mod voksne insekter, snarere end umodne stadier. Her præsenterer vi en protokol for evaluering insekticider mod bed bug æg med en sammenligning med den første nymphal bed bug scene. Disse protokoller kan modificeres til andre insekter til at evaluere insekticid effekt i ikke-voksne livsstadier.
Abstract
Standard toksicitet evalueringer af insekticider mod skadedyr er primært udført på voksne insekter. Evalueringerne er baseret på en dosis-respons eller koncentration-respons-kurve, hvor dødeligheden stiger, efterhånden som dosis eller koncentration af et insekticid forøges. Standard dødelig koncentration (LC 50) og dødelig dosis (LD 50) test, der resulterer i 50% dødelighed af en test befolkning kan være en udfordring for at vurdere toksiciteten af insekticider mod ikke-voksne insekt livsstadier, såsom æg og tidlige stadiums eller nymfestadier . Men disse oplysninger er afgørende for forståelsen af insekticid effekt i alle bed bug livsstadier, som påvirker kontrol- og behandlingsgruppen indsats. Denne protokol bruger en standard dypning bioassay modificeret til bed bug æg og en kontakt insekticid assay til behandling nymphal første instars. Disse assays producere en koncentration-respons-kurve for yderligere at kvantificere LC 50 værdier for insekticider evalueringer.
Introduction
Væggelus er en væsentlig urban skadedyr, der kan forårsage blodtab, hudirritationer, søvnløshed, depression og angst i deres menneskelige værter 1, 2, 3, 4, 5, 6. Omkostningerne ved at fjerne og kontrollere væggelus er høje og ofte gange kræver flere besøg til et hjem med en skadedyrsbekæmpelse selskab 7. Flere besøg er normalt nødvendig på grund af den kryptiske adfærd væggelus og vanskelighederne forbundet med at dræbe dem. Især bed bug æg er vanskelige at styre på grund af deres lille størrelse og beskyttelse af fostrene ved æggeskallen.
I øjeblikket er en fælles praksis for mange skadedyrsbekæmpelse virksomheder i hele USA er at behandle et hjem for væggelus benytter en kemisk insektmiddel. Det er velkendtat æggene er vanskeligt at kontrollere, har så mange virksomheder implementeret en to-ugers tidsramme for re-behandlinger 8. Dette tillader bed bug æg tilstrækkelig tid til at udklække, således at den første stadiums vil opstå og angiveligt være lettere at dræbe med insekticider. Men der er en mangel i studier, der evaluerer effekten af flydende insekticider mod bed bug æg og første instars.
Insekt æg er blevet dokumenteret at være det vanskeligste livstrin at styre i bymæssige skadelige insekter, bortset væggelus, foruden mange skadedyr i landbruget. De fleste af disse vanskeligheder er blevet tilskrevet æggeskallen, mens nogle få undersøgelser har rapporteret insekticidresistens. Modstand i ægget fase er dokumenteret i Triatoma infestans 9, pediculus human capitis 10, Plutella xylostella 11, Rhyzopertha dominica 12,
Denne protokol giver en trin-for-trin procedure til bestemmelse af effektiviteten af insekticider i ægget og første instar etape af fælles væggelus, Cimex lectularius. Begge disse protokoller er koncentration-respons-assays for at tillade kvantificering af LC 50 værdier. Koncentration-respons-assays er almindeligt anvendt til toksikologiske undersøgelser, men denne protokol er blevet tilpasset til let at behandle grupper af bed bug æg og første instars. Disse assays kan tilpassestil forskellige insektarter 'æg og umodne livsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol omfatter to insekticid analyser til særskilt behandling bed bug æg og første instars. Begge protokoller blev udført ved hjælp af de samme insekticider, dog skulle tilpasses for at sikre, insekticid eksponering og nemt manipulere prøver protokollerne.
1. Egg Dipping Insektmiddel Assay
- Træk parret, velnærede voksne kvindelige væggelus fra en koloni og placere hunnerne (5-10) i en petriskål med filtrerpapir. Have mindst ti gentagelser for at sikre, at der vil være nok æg til insektmidlet analysen. Kontroller, om hunnerne har lagt æg hver dag.
- Når de lægger æg, tage hunnerne ud af petriskålen (6 cm x 5 cm), og sætte dem ind i nye petriskåle med et nyt filter papir dagligt og registrere den dato, de gamle og nye petriskåle.
- Lad æggene til alderen 4 til 5 dage, før du starter analysen. Modtagelighed for insekticider ændringer under fosterudviklingen, so er det vigtigt at kontrollere for æg alder. Hold alle livsstadier på 12:12 L: D fotoperiode, 60% RF, og 27 ° C.
- Når æggene har alderen passende, fjerne bed bug æg forsigtigt fra filterpapir bruger soft-tip pincet. skrabe forsigtigt bunden af ægget fastgjort til filtrerpapiret ved anvendelse af pincet og derefter forsigtigt fat uden at anvende meget pres på ægget at begrænse kaste bed bug æg.
- Placer de fjernede bed bug æg i deres respektive grupper inde for plast petriskåle. Begræns statisk elektricitet fra slynge bed bug æg ved at gnide bunden af hver petriskål på ydersiden med en skyllemiddel ark. Treat grupper af bed bug æg (5-10 æg per gruppe) på en gang. Overvej én gruppe en gengivelse og anvende mindst fem (eller flere) replikater til dette assay.
- Forbered seriefortyndinger af insekticider for at få en række 5 forskellige koncentrationer (0,21-21 uL / mL for imidacloprid (0,1%) / β-cyfluthrin (0,5%) og en kontrolløsning med opløsningsmiddel (postevand) alene. Gør 20 ml af hver koncentration at have nok volumen for dypning assay.
- Cut centrifugerør (50 ml) på 35 ml linjen medialt ved hjælp af et roterende værktøj med en skæreskive tilbehør og derefter skære et hul i låget af centrifugen rør (diameter = 2,54 cm) ved hjælp af samme roterende værktøj med en aluminium oxid slibestenen tilbehør. Lad 5 cm på kanten af hætten, når der skæres, så låget sikkert vil skrue ind i røret (figur 1).
- Skær finmasket i kvadrater store nok til at passe ind i hætten (~ 5 cm 2). Skrue mesh stramt, fjerne eventuelle stød, ind centrifugerørene vha centrifugerørlåg.
- Placer en gruppe af bed bug æg (et replikat) med en pensel på masken indersiden af centrifugerør. Dyp gruppen af væggelus inde af snittet centrifugerør i et insekticid koncentration i 5 sekunder.
- Fjern centrifugerøret ud af the insekticid opløsning. Tør indgreb med æggene inde ved at placere centrifugerøret direkte på et laboratorium væv.
- Fjern gruppen af æg ud af centrifugeglasset med en lille, fin-børstehåret malerpensel og placere dem i en ren petriskål med en ren filtrerpapir.
- Optag æg dødelighed (manglende klække) i 14 dage for at sikre alle æg har haft tilstrækkelig tid til at klække.
- Korrekt for dødelighed i kontrolgruppen behandling med Abbotts formel (% test dødelighed -% kontrol dødelighed / 100 - kontrol dødelighed x 100).
- Indsæt indspillet dødelighed med de tilsvarende koncentrationer i analysen software 15 at beregne LC 50 værdier.
2. Først INSTAR Insektmiddel Assay
- Adskil en gruppe af velnærede væggelus (5 voksne mænd og 5 voksne hunner), helst fodret 1 dag før, og placere dem i en petriskål (6 cm x 5 cm) med filterpapir fastsatte mating og æglægning. Lad voksen væggelus at parre sig og lægge æg i ca. 7-9 dage. For fodring, bruge en kunstig fodring system, der cirkulerer varmt vand i glasrør omkring blod 16. Til denne undersøgelse bruge defibronated kanin blod.
- Fjern voksne fra petriskåle (6 cm x 5 cm), og lad æggene at klække i første instars inden for petriskåle. Det tager ca. 7-9 dage for bed bug æg at klække ved stuetemperatur.
- Indsamle de unfed første instars i samme alder ved anvendelse af en pensel. Alder kan bestemmes ved at fjerne de første instars dagligt og optagelse den dag, de er udklækket. Læg dem i nye, rene petriskåle indtil insektmidlet analysen. Første stadiums nymfer er ikke meget tørremiddel resistente, så insektmidlet analysen bør afsluttes så hurtigt som muligt.
- Til assayet forberede seriefortyndinger af imidacloprid / β-cyfluthrin at få en række 5 forskellige koncentrationer og en kontrolgruppe Solution med kun opløsningsmiddel. Sammensatte produkter mærket til bed bug kontrol i USA, blev anvendt til disse undersøgelser, derfor blev opløsningsmidlet vand (ifølge etiket).
- Pipette 150 pi alikvoter af hver insekticid koncentration og vand til kontrolgruppen på individuelle filterpapir (# 1; 4,2 cm diameter). Fordel insekticid over hele filterpapir ved hjælp af pipette ved anvendelse dråber rundt om hele kanten og midten af filtrerpapiret.
- Placer de behandlede filtrerpapir individuelt på toppen af individuelle fiberplader paneler (7 cm2).
- Release grupper af første instars (5 til 10 per gruppe) på de enkelte filter papirer, mens du stadig våd med insekticid og dækker de første instars med en omvendt bunden af en petriskål.
- Placer en vægt oven af petriskålen for at forhindre de første stadiums væggelus i at undslippe den behandlede overflade.
- Optag dødelighed af første instar væggelus efter 24 timers eksponering for alleinsekticid koncentrationer.
- Korrekt for dødelighed i kontrolgruppen behandling med Abbotts formel (% test dødelighed -% kontrol dødelighed / 100 - kontrol dødelighed x 100).
- Indsæt indspillet dødelighed og koncentrationer i analysen software 15 til at beregne LC 50 værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Æggene blev dyppet i 5 forskellige koncentrationer af imidacloprid / β-cyfluthrin (pl / ml). De første instars blev anbragt på behandlede overflader af fem forskellige koncentrationer af imidacloprid / β-cyfluthrin (figur 2).
Vi brugte tre forskellige populationer af C. lectularius: Harlan, Richmond, og Epic Center (tabel 1). The Harlan stammen er modtagelige for pyrethroid insekticider og blev erhvervet i 2005 fra Dr. Harold Harlan. Richmond og Epic Center-stammer er både modstandsdygtige over for deltamethrin. The Richmond stamme blev indsamlet fra en ældre gruppe hjem i Richmond, VA i 2008. Epic center stamme blev indsamlet i 2008 i Cincinnati, OH.
Højere LC50 værdier indikerede, at en højere koncentration var påkrævet for at dræbe 50% af dentestpopulationen æg fra Richmond og Epic Center-stammer. Svarende til æggene, de første instars fra Richmond og Epic Center-populationer krævede højere koncentrationer af insekticid til at dræbe 50% af testpopulationen. De LC 50 værdier efterfulgt af forskellige bogstaver er signifikant forskellige.
Figur 1. Fotografi af den modificerede centrifugerør. Et hul er blevet skåret i hætten, således at en firkantet stykke mesh kan skrues ind i hætten. Strækmetalstykkerne kan kasseres og erstattes ved brug af forskellige insekticider. De bed bug æg er placeret direkte på nettet ved hjælp af en pensel og derefter nedsænket i insekticid løsninger til dypning analysen. Klik her for at se en større version af denne figure.
Figur 2. Gengivelse af en dosis-respons kurve. Den procentvise respons (dødelighed) af Harlan strain bed bug æg til imidacloprid / β-cyfluthrin plottes på y-aksen, og log-koncentration, at væggelus blev udsat for er repræsenteret på x-aksen. Egg dødeligheden steg som dosis øges og dødelighed nåede 100% ved den højeste testede koncentration.
| Life Stage / Strain | n | LC 50 (95% CI) | Slope ± SE | X2 (df) | |
| æg | |||||
| Harlan | 250 | 0.41a ( 0,276-0,548) | 1,86 ± 0,24 | 33,42 (23) | |
| Richmond | 320 | 1.23b (0,59-2,10) | 1,13 ± 0,14 | 82,57 (30) | |
| Epic center | 400 | 2.10b (1,049-4,587) | 0,95 ± 0,10 | 149,91 (38) | |
| First instars | |||||
| Harlan | 150 | 0.04a (0,030-0,063) | 2,16 ± 0,34 | 38.17 (28) | |
| Richmond | 195 | 4.81b (1,94-10,26) | 0,66 ± 0,12 | 45.87 (37) | |
| Epic center | 190 | 19.72b (8,18 til 184,48) | 0,75 ± 0,17 | 45.39 (36) | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Molly, faste til fortynding og pesticidformulering assistance. Vi takker også Troy Anderson for probit analyse vejledning og Zachary Adelman for hjælp med eksperimentelt design. Denne forskning blev delvist støttet af en Entomologisk Foundation tildeling og ved Virginia Pest Management legat midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | Plastic |
| Filter paper | Whatman | 1001-042 | |
| Featherweight forceps | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC (imidacloprid/bifenthrin) | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP (acetamiprid/bifenthrin) | FMC Corp. | ||
| Centrifuge tube | 06-443-18 | 50 mL; flat-top threaded | |
| Fine mesh | 7250C | ||
| KimWipe | 06-666A | 11 cm x 21 cm | |
| Small paint brush | Any small paint brush | ||
| Hardboard panels | Composite wood or tile would be sufficient from a home improvement store | ||
| Metal weights | Any type of metal screw that will hold the weight of the Petri dish down onto a surface |
References
- Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
- Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
- Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
- Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
- Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
- Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
- Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
- Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
- Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
- Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
- Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
- Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
- Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
- Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
- Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
- Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
- Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
- Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
- Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).
