Summary
İnsektisit değerlendirmeler genellikle yetişkin böcekler yerine olgunlaşmamış aşamalarında karşı hedeflenir. Burada, ilk nimf yatak böcek aşamasına bir karşılaştırma ile yatak hata yumurta karşı böcek değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu protokoller, yetişkin olmayan yaşam evrelerinde insektisit etkinliğini değerlendirmek için başka böcekler için ayarlanabilir.
Abstract
Böcek zararlılarına karşı böcek standart toksisite değerlendirmeleri öncelikle yetişkin böcekler üzerinde yapılmaktadır. Değerlendirme bir doz veya bir insektisit konsantrasyonu mortalite de artar bir doz-yanıt veya konsantrasyon-tepki eğrisi, dayanmaktadır. Standart öldürücü konsantrasyon (LC 50) ve öldürücü doz (LD 50) bir test nüfusun% 50 mortalite neden testler, yumurta ve erken instar veya nimf evrelerinde olarak yetişkin olmayan böcek yaşam evrelerinde karşı böcek, toksisitesini değerlendirmek için zor olabilir . Ancak bu bilgiler kontrol ve tedavi çalışmalarını etkileyen tüm yatak böcek yaşam evrelerinde insektisit etkinliği, anlamak için çok önemlidir. Bu protokol yatak hata yumurta için modifiye standart daldırma biyoassay ve nimf ilk instars tedavisi için bir temas böcek öldürücü tahlil kullanır. Bu deneyler, daha insektisit değerlendirmeler için LC50 değerlerinin belirlenmesi için, bir konsantrasyon-yanıt eğrisi oluşturur.
Introduction
Yatak hataların insan konaklar 1, 2, 3, 4, 5, 6 kan kaybı, cilt tahrişleri, uykusuzluk, depresyon, ve anksiyete neden olabilir önemli bir kentsel haşere vardır. Yatak hataların ortadan kaldırılması ve kontrol maliyetleri yüksek ve çoğu kez bir haşere kontrol firması 7 tarafından bir eve birden fazla ziyaret gerektirir. Birden fazla ziyaret nedeniyle genellikle yatak hataların şifreli davranış ve onları öldürerek ile ilişkili zorluklar gereklidir. Özellikle, yatak böcek Yumurtalar, küçük boyutları ve yumurta kabuğu embriyo koruma kontrol etmek zordur.
Şu anda, Amerika Birleşik Devletleri boyunca birçok haşere kontrol şirketleri için ortak bir uygulama, bir kimyasal böcek ilacı kullanan yatak böcek için bir ev tedavi etmektir. BilindikYumurta kontrol etmek zor olduğunu, bu nedenle birçok şirket yeniden tedaviler 8 için iki haftalık bir zaman diliminde hayata geçirdik. İlk evre ortaya ve ileri sürülen böcek ile öldürmek daha kolay olacak, böylece bu yatak böcek yumurta yumurtadan için yeterli zaman sağlar. Ancak, yatakta böcek yumurta ve ilk instars karşı sıvı insektisitlerin etkinliğini değerlendiren çalışmalarda bir eksiklik olduğunu.
Böcek yumurtaları birçok tarım zararlılarının yanı sıra, yatak hataların dışında kentsel böcek zararlılarına kontrol edilmesi en zor yaşam evresi olmak belgelenmiştir. birkaç çalışma insektisit direnci rapor ederken, bu zorlukların çoğu, yumurta kabuğu atfedilmiştir. Yumurta aşamasında direnç, Plutella 11 xylostetla 10 capitis Triatoma infestans 9 Pediculus humanus içinde Rhyzopertha Dominica 12 belgelenmiştir
Bu protokol ortak yatak hataların yumurta ve birinci instar aşamasında insektisit etkinliğini belirlemek için bir adım-adım yordam sağlar, Cımex lectularius. Bu protokollerin iki LC50 değerlerinin miktarını belirlemek için konsantrasyon-yanıt deneyleri bulunmaktadır. Konsantrasyon-tepki deneyleri genellikle, ancak bu protokolü kolay yatak böcek yumurta ve birinci instars grupları tedavi etmek için adapte edilmiştir, toksikolojik çalışmalar için kullanılmıştır. Bu deneyler, uyarlanabilirÇeşitli böcek türlerin yumurta ve olgunlaşmamış yaşam evrelerinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol ayrıca yatak böcek yumurta ve ilk instars tedavisi için iki insektisit testlerini içerir. Her iki protokol aynı böcek kullanılarak yapılmıştır, ancak protokoller insektisit pozlama sağlamak ve kolayca örnekleri işlemek için adapte edilmesi gerekiyordu.
1. Yumurta Daldırma Böcek Deneyi
- Bir koloniden evlendirilen, iyi beslenmiş yetişkin dişi yatak hataların çekin ve filtre kağıdı ile bir Petri kabı içine dişileri (5-10) yerleştirin. insektisit tayini için yeterli yumurta var olmasını sağlamak için en az on çoğaltır var. kadın her gün yumurta koydu olmadığını kontrol edin.
- Onlar yumurtalarını sonra, Petri kabı (6 cm x 5 cm) dışında kadın almak ve günlük yeni bir filtre kağıdı ile yeni Petri kapları içine koydu ve eski ve yeni Petri kapları tarih kaydedin.
- Deneye başlamadan önce 5 gün 4 yaşına yumurta izin verin. embriyonik gelişim sırasında insektisitler değişikliklere duyarlılığı, so yumurta yaş için kontrol etmek önemlidir. D fotoperiyot,% 60 RH ve 27 ° C: 12:12 L tüm yaşam evrelerini tutun.
- Yumurta uygun yaş sonra, yumuşak uçlu forseps kullanılarak filtre kağıtları yavaşça yatak böcek yumurta kaldırmak. Yavaşça forseps kullanarak filtre kağıdı bağlı yumurta dibine vurma ve sonra yavaşça atma yatak böcek yumurtalarını sınırlamak için yumurta üzerine fazla baskı uygulamadan yakala.
- içinde plastik Petri yemekleri kendi grupları içinde kaldırılır yatak hata yumurta yerleştirin. Bir kumaş yumuşatıcı levha ile dışarıdan her Petri kabı alt sürterek bed bug yumurta flinging statik elektriği sınırlayın. tek seferde yatak böcek yumurtalarının muamele grupları (grup başına 5-10 yumurta). bir grup bir kopyalayan düşünün ve bu deney için çoğaltır en az beş (veya daha fazla) kullanın.
- 5 farklı konsantrasyonda (bir dizi elde etmek için insektisitlerin seri dilüsyonları Hazırlama 0,21-21 ul / ml imidakloprid (% 0.1) / β-siflutrin (% 0.5) ve kontrol içinÇözücü (musluk suyu) ile çözüm sadece. Daldırma deneyi için yeterli hacim, her bir konsantrasyonun 20 mL sağlayın.
- 35 mL çizgisinde Kesme santrifüj tüpleri (50 ml) medial bir kesme diski aksesuarı ile bir döner alet ve bir santrifüj tüpüne (çap = 2.54 cm) bir alüminyum ile aynı döner alet kap içine bir delik oksit taş aksesuarını taşlama. Kapağı sıkıca boru (Şekil 1) içine vida, böylece keserken kapağın kenarında 5 cm bırakın.
- Kap içine sığacak kadar büyük kareler halinde ince örgü Cut (~ 5 cm 2). santrifüj tüp kapağı kullanılarak santrifüj tüplerine, herhangi bir darbe ortadan kaldırarak, sıkıca örgü vidalayın.
- santrifüj tüpünün içine örgü üzerine boya fırçası kullanarak yatak böcek yumurta bir grup (bir çoğaltma) yerleştirin. 5 saniye boyunca bir insektisit konsantrasyonu içine kesilmiş santrifüj tüpünün içinde yatak hataların grup batırın.
- th dışında santrifüj tüpü çıkarıne insektisit çözüm. içinde bir laboratuvar doku üzerine doğrudan santrifüj tüpü yerleştirerek yumurta ile örgü kurulayın.
- Küçük, ince kıl boya fırçası kullanarak santrifüj tüpünün dışında yumurta grubu kaldırmak ve temiz bir filtre kağıdı ile temiz bir Petri Dish içine koyun.
- Tutanak yumurta ölüm bütün yumurtaları sağlamak için 14 gün boyunca (yumurtadan başarısızlık) yumurtadan için yeterli zaman vardı.
- Abbott formülü (-% kontrol mortalite / 100 - Kontrol ölüm x% 100 test mortalite) kullanarak kontrol tedavisinde mortalite için doğru.
- LC 50 değerleri hesaplamak için analiz yazılımı 15 içine gelen konsantrasyonları ile kaydedilen mortalite yerleştirin.
2. İlk Evre Böcek Deneyi
- tercihen 1 gün önce beslenen, iyi beslenmiş yatak böcek (5 yetişkin erkek ve 5 yetişkin kadın) bir grup ayırın ve matin için sağlanan filtre kağıdı ile bir Petri kabındaki (6 cm x 5 cm) içine koyung ve yumurtlama. yetişkin yatak böcek dostum ve yaklaşık 7-9 gün süreyle yumurtalarını bırakmak için izin verin. Beslenmesi için kan 16 çevreleyen cam tüplerde sıcak su dolaşır bir yapay besleme sistemi kullanın. Bu çalışma için, defibronated tavşan kanı kullanın.
- Petri gelen yetişkin (5 cm x 6 cm) çıkartın ve yumurta Petri içinde ilk instars içine yumurtadan izin verin. yatak hata yumurta, oda sıcaklığında yumurtadan için yaklaşık 7-9 gün sürer.
- Bir boya fırçası kullanılarak aynı yaştaki beslenmemiş ilk instars toplayın. Yaş onlar yumurtadan gün günlük ilk instars kaldırarak ve kayıt ile tespit edilebilir. insektisit tahlil kadar yeni, temiz Petri kapları içine koyun. insektisit tahlil kısa sürede tamamlanması gerektiğini, böylece ilk evre perileri, dayanıklı çok kurutucu değildir.
- Tahlil için, 5 farklı konsantrasyonda ve bir kontrol Solu bir dizi elde etmek için imidakloprid / p-siflutrin seri dilüsyonları hazırlanmasıSolvent yalnızca yon. Amerika Birleşik Devletleri yatak böcek kontrolü için etiketli formüle edilmiş ürünler, bu nedenle bir çözücü (etikete göre olan su) bu çalışmalar için kullanılmıştır.
- Pipet ayrı ayrı filtre kağıtları üzerine, kontrol grubunda her bir insektisit konsantrasyonu ile su ve 150 uL tam bölünen miktarları (# 1, 4.2 cm çapında). filtre kağıdı tüm kenarı ve merkezi etrafında damlacıkları uygulayarak pipetter kullanarak tüm filtre kağıdının üzerine insektisit dağıtın.
- Bireysel sunta paneller (7 cm 2) üstünde ayrı ayrı işlenmiş filtre kağıtları yerleştirin.
- durumdayken insektisit ile ıslak ve bir Petri tabağına ters bir alt birinci instars kapağı ayrı ayrı filtre kağıtları üzerine ilk instars salınımı grupları (grup başına 5 ila 10).
- işlenmiş yüzeyi kaçan ilk evre yatak hataların önlenmesi için Petri kabı üstünde bir ağırlık koyun.
- Tüm 24 saat maruz bırakıldıktan sonra ilk evre yatak hataların rekor ölüminsektisit konsantrasyonları.
- Abbott formülü (-% kontrol mortalite / 100 - Kontrol ölüm x% 100 test mortalite) kullanarak kontrol tedavisinde mortalite için doğru.
- LC 50 değerleri hesaplamak için analiz yazılımı 15 içine kaydedilen mortalite ve konsantrasyonları yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yumurta imidakloprid / p-siflutrin 5 farklı konsantrasyonda (mL / mL) içine daldırılmıştır. İlk instars imidakloprid / p-siflutrin, beş farklı konsantrasyonda (Şekil 2) ile muamele edilen yüzeyler üzerinde yerleştirilmiştir.
Harlan, Richmond, ve Epic Merkezi (Tablo 1): Biz C. lectularius üç farklı popülasyonlar kullanılır. Harlan suşu piretroid insektisit duyarlı ve Dr. Harold Harlan 2005 yılında satın alındı. Richmond ve Epic Merkezi suşları deltametrin dayanıklı hem de. Richmond suşu 2008. Destanı Merkezi suşu Richmond, VA yaşlı bir grup evden toplandı Cincinnati, OH 2008 yılında toplanmıştır.
Daha yüksek LC50 değerleri daha yüksek bir konsantrasyonu% 50'sini öldürmek için gereken olduğunu göstermiştirRichmond ve Epic Merkezi suşları test nüfus yumurta. yumurta benzer şekilde, Richmond ve epik Merkezi popülasyonlarından ilk instars Test nüfusun% 50'sini öldürmek için insektisit yüksek konsantrasyonlarda gerekli. Farklı harflerle ardından LC 50 değerleri önemli ölçüde farklıdır.
Modifiye santrifüj tüpünün 1. fotoğrafıdır Şekil. mesh kare parça kap içine vidalı böylece bir delik, kap kesilmiştir. örgü parçaları atılır ve farklı böcek kullanırken değiştirilebilir. yatak hata yumurta daldırma testi için insektisit çözümleri içine boya fırçası kullanarak örgü üzerine doğrudan yerleştirilen ve daha sonra batık edilir. Bu figür daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınıze.
Bir doz-yanıt grafiğinin 2. Temsil Şekil. imidakloprid / ß-siflutrin Harlan suşu yatak böcek yumurtalarının yüzde tepkisi (mortalite) y ekseni ve yatak böcek x-ekseni üzerinde temsil edilmektedir maruz kaldıklarını günlük konsantrasyonuna bağlı çizilmiştir. dozun arttırılması ve mortalite test edilen en yüksek konsantrasyonda% 100'e kadar yumurta ölüm artmıştır.
| Yaşam Sahne / Gerilme | n | LC 50 (% 95 CI) | Eğim ± SE | X2 (DF) | |
| Yumurtalar | |||||
| Harlan | 250 | 0.41a ( 0,276-0,548) | 1.86 ± 0.24 | 33.42 (23) | |
| Richmond | 320 | 1.23b (0,59-2,10) | 1.13 ± 0.14 | 82.57 (30) | |
| Epic Merkezi | 400 | 2.10b (1,049-4,587) | 0.95 ± 0.10 | 149,91 (38) | |
| ilk instars | |||||
| Harlan | 150 | 0.04a (0,030-0,063) | 2.16 ± 0.34 | 38.17 (28) | |
| Richmond | 195 | 4.81b (1,94-10,26) | 0.66 ± 0.12 | 45.87 (37) | |
| Epic Merkezi | 190 | 19.72b (8,18-184,48) | 0.75 ± 0.17 | 45.39 (36) | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz seyreltme ve pestisit formülasyonu yardım için Molly stedfast teşekkür ederiz. Biz de deneysel tasarım ile ilgili yardım için probit analizi rehberliği için Troy Anderson ve Zachary Adelman teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Entomoloji Vakfı ödülü ile ve Virginia Zararlı Yönetimi burs fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | Plastic |
| Filter paper | Whatman | 1001-042 | |
| Featherweight forceps | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC (imidacloprid/bifenthrin) | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP (acetamiprid/bifenthrin) | FMC Corp. | ||
| Centrifuge tube | 06-443-18 | 50 mL; flat-top threaded | |
| Fine mesh | 7250C | ||
| KimWipe | 06-666A | 11 cm x 21 cm | |
| Small paint brush | Any small paint brush | ||
| Hardboard panels | Composite wood or tile would be sufficient from a home improvement store | ||
| Metal weights | Any type of metal screw that will hold the weight of the Petri dish down onto a surface |
References
- Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
- Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
- Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
- Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
- Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
- Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
- Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
- Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
- Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
- Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
- Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
- Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
- Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
- Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
- Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
- Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
- Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
- Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
- Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).
