Summary
оценки инсектицидами часто направлены против взрослых насекомых, а не незрелых стадий. Здесь мы приводим протокол для оценки инсектицидов против яиц ошибка постели с по сравнению с первым нимф этапе кровать ошибка. Эти протоколы могут быть скорректированы для других насекомых, чтобы оценить эффективность инсектицида в не только на взрослых стадиях жизни.
Abstract
Стандартные оценки токсичности инсектицидов против насекомых-вредителей, в основном проводились на взрослых насекомых. Оценки основаны на зависимости от дозы или кривой концентрация-ответ, где смертность увеличивается в виде дозы или концентрации инсектицида увеличивается. Стандартная летальная концентрация (LC 50) и летальная доза (LD 50) Тесты , которые приводят к 50% смертности населения испытания может быть сложным для оценки токсичности инсектицидов против не только на взрослых насекомых этапах жизни, таких как яйца и раннего возраста или нимфальных этапов , Тем не менее, эта информация имеет важное значение для понимания инсектицид эффективность на всех этапах жизни кровать ошибка, которая влияет на усилия по контролю и лечению. Этот протокол использует стандартный окунания биопробы модифицированный для яиц кровать ошибка и анализа контакта инсектицидный для лечения нимф первых возрастов. Эти анализы производят кривую зависимости ответа от концентрации для дальнейшей количественной оценки LC 50 значений для оценки инсектицидами.
Introduction
Кровать ошибок являются важным городским вредителем , который может привести к потере крови, раздражение кожи, бессонница, депрессия и беспокойство в своих человеческих хостов 1, 2, 3, 4, 5, 6. Затраты на устранение и контроль клопов высоки и часто требуют нескольких визитов в домашних условиях борьбы с вредителями компании 7. Несколько визитов, как правило, требуется из-за загадочного поведения клопов и трудностей, связанных с их убийства. В частности, яйца кровать ошибка трудно контролировать из-за их небольшого размера и защиты эмбриона яичной скорлупы.
В настоящее время обычной практикой для многих компаний по борьбе с вредителями на всей территории Соединенных Штатов для лечения дома для клопов с помощью химического инсектицида. Это хорошо известночто яйца трудно контролировать, поэтому многие компании внедрили временные рамки двухнедельного для повторного лечения 8. Это позволяет яйца кровать ошибка достаточно времени, чтобы люк, так что первый возрастна выйдет и предположительно будет легче убить с инсектицидами. Тем не менее, есть недостаток в исследованиях, оценивающих эффективность жидких инсектицидов против яиц багов слоем и первым возрастах.
Насекомые яйца были зарегистрированы, чтобы быть самым трудным этапом жизни для контроля вредителей в городских насекомых, кроме клопов, помимо многих сельскохозяйственных вредителей. Большинство из этих трудностей были отнесены к яичной скорлупе, в то время как несколько исследований сообщали устойчивость к инсектицидам. Сопротивление в стадии яйца было документально подтверждено в infestans Triatoma 9, Pediculus humanus лишай 10, Plutella xylostella 11, Rhyzopertha Доминику 12,
Этот протокол предусматривает процедуру шаг за шагом для определения эффективности инсектицидов в яйце и личиночных стадии общих клопов, Cimex lectularius. Оба эти протокола являются анализы реакции на концентрацию , чтобы позволить количественное определение значений LC 50. Анализы концентрация-ответ обычно используются для токсикологических исследований, однако этот протокол был адаптирован для легко обрабатывать группы яиц ошибок слоем и первым возрастах. Эти анализы могут быть адаптированыдля яиц различных видов насекомых "и незрелых стадий жизненного цикла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол включает в себя два инсектицидами анализы для раздельного обработки яиц кровать ошибок и первые возрастов. Оба протокола были проведены с использованием тех же инсектициды, однако, протоколы должны были быть приспособлены для обеспечения воздействия инсектицида и легко манипулировать образцов.
1. Яйцо Погружение Инсектицид Анализ
- Потянуть повязана, сытый взрослых самок Клопы из колонии и помещают самок (5-10) в чашку Петри с фильтровальной бумагой. Есть по крайней мере десять повторов, чтобы гарантировать, что будет достаточно яйца для анализа инсектицидов. Проверьте, чтобы увидеть, если самки откладывали яйца каждый день.
- После того, как они откладывают яйца, возьмите самок из чашки Петри (6 см × 5 см) и поместить их в новые чашки Петри с новой фильтровальной бумаги ежедневно и записывать дату на старых и новых чашках Петри.
- Разрешить яйца в возрасте от 4 до 5 дней до начала исследования. Восприимчивость к инсектицидам изменениям во время эмбрионального развития, сO важно контролировать для яиц возраста. Держите все этапы жизни на 12:12 L: D фотопериода, относительной влажности 60%, и 27 ° C.
- После того, как яйца в возрасте соответственно, удалить яйца кровать ошибка аккуратно из фильтровальной бумаги с использованием мягкого наконечника щипцов. Аккуратно очистить нижнюю часть яйца, прикрепленной к бумаге фильтра с помощью пинцета, а затем аккуратно захватить без применения большого давления на яйцо, чтобы ограничить бросание яиц ошибка кровать.
- Поместите удаленные яйца кровать ошибка в их соответствующих групп внутри пластиковых чашек Петри. Ограничить статическое электричество выбрасывая яйца кровать ошибка путем втирания в нижней части каждой чашки Петри на внешней стороне с смягчителя ткани листа. Обходить группы яиц кровать ошибка (5-10 яиц в каждой группе) все сразу. Рассмотрим одну группу с тиражировать и использовать по меньшей мере, пять (или более) размножается для этого анализа.
- Готовят серийные разведения инсектицидов, чтобы получить диапазон 5 различных концентраций (0.21-21 мкл / мл для имидаклоприд (0,1%) / бета-цифлутрин (0,5%) и контроляраствор с растворителем (водопроводной водой) только. Сделать 20 мл каждой концентрации, чтобы иметь достаточный объем для анализа окунания.
- Вырезать центрифужные пробирки (50 мл) на мл линии 35 медиально с помощью ротационного инструмента с колесом аксессуара отрезного и затем вырезать отверстие в крышке центрифуге трубки (диаметр = 2,54 см), используя тот же ротационный инструмент с алюминиевым оксид шлифовальный камень аксессуар. Оставьте на 5 см на кромке крышки при резке, так что крышка будет надежно винт в трубе (рисунок 1).
- Вырезать мелкой сетки на квадраты достаточно большой , чтобы поместиться в крышку (~ 5 см 2). Винт сетки плотно, что исключает любые неровности, в центрифужные пробирки с помощью крышки Центрифуга трубки.
- Поместите группу яиц ошибка кровать (одна реплицировать) с помощью кисти на сетку внутри центрифуги трубы. Dip группу клопов внутри разреза центрифуге трубки в качестве инсектицида концентрации в течение 5 секунд.
- Удалите центрифугу трубку из-йе раствор инсектицида. Сушат сетку с яйцами внутри, помещая центрифужной пробирки непосредственно на лабораторном ткани.
- Удалить группу яиц из центрифужной пробирки с использованием малых, тонкой щетинной кисти и поместить их в чистую чашку Петри с фильтровальной бумагой чистой.
- Запись яйца смертности (неспособность к люку) в течение 14 дней, чтобы гарантировать, что все яйца имели достаточно времени, чтобы люк.
- Корректное смертности в контрольной обработки с использованием формулы Эббота (в% тест смертности - контроль% смертности / 100 - контроль смертности х 100).
- Вставьте записанную смертности с соответствующими концентрациями в программное обеспечение анализа 15 для расчета LC 50 значений.
2. Первый Instar Инсектицид Анализ
- Отдельная группа сытых клопов (5 взрослых самцов и 5 взрослых самок), предпочтительно подают за 1 день до, и поместить их в чашку Петри (6 см × 5 см) с фильтровальной бумагой, предусмотренной Matinг и кладка. Разрешить взрослым клопы в спариваться и откладывать яйца в течение примерно 7-9 дней. Для питания, используйте искусственную систему кормления , которая циркулирует горячая вода в стеклянных трубок , окружающих кровь 16. Для этого исследования используют defibronated крови кролика.
- Удалить взрослых из чашки Петри (6 см х 5 см) и позволяют яйца люк в первых возрастах внутри чашки Петри. Она занимает около 7-9 дней для яиц кровать ошибка в люк при комнатной температуре.
- Соберите ненакормленный первые возрастов одного и того же возраста с помощью кисти. Возраст может быть определено путем удаления первого и ежедневно возрастов записи на следующий день они заштрихованы. Поместите их в новые, чистые чашки Петри, пока анализа инсектицидов. Личиночных нимфы не очень Осушитель устойчивы, поэтому анализ инсектицид должен быть завершен как можно скорее.
- Для анализа готовят серийные разведения имидаклоприд / бета-цифлутрина, чтобы получить диапазон 5 различных концентраций, и контрольной Солуции только с растворителем. Приготовленные продукты помечены для контроля кровать ошибок в Соединенных Штатах были использованы для этих исследований, поэтому в качестве растворителя воды (в соответствии с этикеткой).
- Пипетка по 150 мкл аликвоты каждой концентрации инсектицида и воды для контрольной группы на отдельные фильтровальную бумагу (# 1, диаметр 4,2 см). Распределить инсектицид по всей фильтровальной бумаге, с помощью пипеттором путем нанесения капель по всему краю и в центре фильтровальной бумаги.
- Поместите обработанные фильтровальную бумагу индивидуально поверх отдельных оргалита панелей (7 см 2).
- Релиз группы первых возрастах (от 5 до 10 на группу) на отдельные фильтровальные бумаги еще во влажном состоянии с инсектицидом и покрывает первых возрастов с перевернутой дном чашки Петри.
- Поместите вес на вершине чашки Петри, чтобы предотвратить личиночных клопов побега обработанной поверхности.
- Запись смертности первых ошибок возрастной стадии постели после 24 ч воздействия всехКонцентрации инсектицида.
- Корректное смертности в контрольной обработки с использованием формулы Эббота (в% тест смертности - контроль% смертности / 100 - контроль смертности х 100).
- Вставьте записанную смертности и концентрации в программное обеспечение анализа 15 для расчета LC 50 значений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Яйца погружают в 5 различных концентрациях имидаклоприд / бета-цифлутрин (мкл / мл). Первые были помещены возрастов на обработанные поверхности пяти различных концентраций имидаклоприд / бета-цифлутрина (рисунок 2).
Мы использовали три различных популяций C. lectularius: Харлан, Ричмонд, и Эпическая Center (таблица 1). Штамм Харлан чувствителен к пиретроидов инсектицидов и был приобретен в 2005 году от доктора Гарольда Харлан. Штаммы Ричмонд и Эпическая центр оба устойчивы к дельтаметрину. Штамм Ричмонд был собран из пожилой группы дома в Ричмонде, штат Вирджиния в 2008 году Эпос Center штамм был собран в 2008 году в Цинциннати, штат Огайо.
Более высокая LC 50 значений показал , что более высокая концентрация требовалось , чтобы убить 50% оттест яйца населения из штаммов Ричмонд и Эпическая Center. Подобно яйца, первые из возрастов населения Ричмонд и Эпическая центра требуется более высокие концентрации инсектицида, чтобы убить 50% тестовой популяции. LC 50 Значения следуют разными буквами, существенно различаются.
Рисунок 1. Фотография модифицированной центрифуге трубки. Отверстие было сокращено в крышке, так что квадратный кусок сетки может быть ввинчивается в крышке. Сетчатые части могут быть отброшены и заменены при использовании различных инсектицидов. Яйца кровать ошибок помещаются непосредственно на сетку с помощью кисти, а затем погружают в инсектицидных растворов для анализа окунания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого Figurе.
Рисунок 2. Представление графика доза-реакция. Реакция процента (смертность) штамма Харлан яйца кровать ошибка в имидаклоприд / р-цифлутрина строится на оси у и концентрации журнала, что ошибки кровати подвергавшихся представлена на оси абсцисс. Яичный смертность увеличилась доза увеличилась и смертность достигала 100% при самой высокой концентрации тестируемого.
| Жизнь Стадия / Strain | N | LC 50 (95% ДИ) | Наклон ± SE | X 2 (ДФ) | |
| яйца | |||||
| Харлан | 250 | 0.41a ( 0.276-0.548) | 1,86 ± 0,24 | 33.42 (23) | |
| Ричмонд | 320 | 1.23b (0.59-2.10) | 1.13 ± 0,14 | 82,57 (30) | |
| Эпическая центр | 400 | 2.10b (1.049-4.587) | 0,95 ± 0,10 | 149,91 (38) | |
| Во-первых возрастах | |||||
| Харлан | 150 | 0.04a (0.030-0.063) | 2.16 ± 0.34 | 38,17 (28) | |
| Ричмонд | 195 | 4.81b (1.94-10.26) | 0,66 ± 0,12 | 45,87 (37) | |
| Эпическая центр | 190 | 19.72b (8.18-184.48) | 0,75 ± 0,17 | 45,39 (36) | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Молли тверды для разбавления и пестицида помощи композиции. Мы также благодарим Troy Андерсон для руководства пробит-анализа и Захари Эйдельман за помощью эксперимента. Это исследование было частично поддержана награду энтомологического фонда и стипендиальных фондов Вирджиния борьбы с вредителями.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | Plastic |
| Filter paper | Whatman | 1001-042 | |
| Featherweight forceps | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC (imidacloprid/bifenthrin) | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP (acetamiprid/bifenthrin) | FMC Corp. | ||
| Centrifuge tube | 06-443-18 | 50 mL; flat-top threaded | |
| Fine mesh | 7250C | ||
| KimWipe | 06-666A | 11 cm x 21 cm | |
| Small paint brush | Any small paint brush | ||
| Hardboard panels | Composite wood or tile would be sufficient from a home improvement store | ||
| Metal weights | Any type of metal screw that will hold the weight of the Petri dish down onto a surface |
References
- Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
- Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
- Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
- Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
- Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
- Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
- Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
- Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
- Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
- Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
- Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
- Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
- Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
- Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
- Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
- Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
- Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
- Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
- Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).
