Summary
активация аутофагии является полезным в профилактике целого ряда заболеваний. Одним из физиологических подходов к индукции аутофагии в естественных условиях является физические упражнения. Здесь мы покажем, как активировать аутофагию с помощью аэробных упражнений и измерения уровней аутофагии у мышей.
Introduction
Аутофагия является эволюционно консервативны путь деградации, который индуцируется в ответ на различные стрессовых условиях , таких как голод и гипоксии 1, 2. Во время аутофагии, двойные мембранные везикулы, называемые автофагосомы, включают ненужные или поврежденные субклеточных компонентов и транспортировать их в лизосомы для деградации 3. Базальный аутофагия имеет важное значение для клеточной функции и развития организма, а также ослабленным базальной аутофагии замешан во многих расстройств, в том числе нейродегенерации онкогенеза и диабета 2 -го типа 4, 5, 6.
Наиболее известным физиологическим аутофагия индуктором является голодание. Тем не менее, он имеет два основных ограничения. Во- первых, голодание занимает длительный период , чтобы эффективно вызывать аутофагию у животных, например, 48 часов ограничения пищи у мышейв большинстве органов. Во-вторых, голодание едва индуцирует аутофагию мозга, из-за относительно стабильные поставки питательных веществ в головном мозге. На самом деле, это также трудно обнаружить индукцию аутофагии низкомолекулярных индукторов, поскольку многие лекарства не могут проходить через гематоэнцефалический барьер. Таким образом, чтобы лучше проанализировать функцию активации аутофагии в патогенезе заболевания, мы обнаружили , что в последнее время упражнения является более сильным физиологическим способом , чтобы вызвать автофагию в течение короткого периода времени , 7, 8, 9. По сравнению с голоданием, аутофагия эффективно индуцируется беговой дорожке так быстро, как 30 мин. Таким образом, физические упражнения является удобным и мощным физиологический подход к изучению механизма аутофагии в опосредовании пользы для здоровья и профилактики заболеваний.
Есть несколько белковых маркеров для выявления аутофагии активности, в том числе LC3 и p62. LC3 (микротрубочки белок, ассоциированный с 1A / 1B-C светHain 3) является цитозольного белка (LC3-я форма), который конъюгирован с PE (фосфатидилэтаноламина) при индукции аутофагии. ПЭ-липоилироваться LC3 (LC3-II форма) набирается на autophagosomal мембран и могут быть использованы для визуализации автофагосомы когда метили GFP. Его транслокации из цитозоля в пунктате структуры автофагосомы под микроскопом является показателем индукции аутофагии. p62 является грузовой рецептор аутофагией субстратов (таких как Убиквитинирование белки), и включен в автофагосомы, а также. Так как белок разлагается в лизосомах вместе с автофагосомы, его уровни могут быть использованы для измерения потока аутофагии. Здесь мы покажем, как использовать эти маркеры для количественного определения аутофагию в различных тканях мышей, вызванных аэробных упражнений, включая принудительную упражнения (беговая дорожка) и добровольного упражнения (бег колес). Те же самые процедуры , также могут быть применены для измерения в естественных условиях аутофагии после лечения других индукторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Institutional уходу и использованию животных комитета Северо-западного университета (IACUC) путем.
1. Модели для мышей
- Используйте 8-12-недельных мышей в подготовке упражнений. Для обнаружения осуществляется индуцированной аутофагии в естественных условиях, использовать GFP-LC3 трансгенных мышей (C57BL / 6 фона) для визуализации и исследования мышей C57BL / 6 для биохимических анализов.
2. Упражнение-индуцированной Аутофагия
- Настройка беговой дорожки - принудительное осуществление
- Акклиматизироваться и обучить мышей на 10 ° в гору открытой беговой дорожке в течение 2-х дней. На 1 -й день, упражнения мышей в течение 5 мин при 8 м / мин, а на 2 -й день, упражнения мышей в течение 5 мин при 8 м / мин , а затем еще на 5 мин при 10 м / мин 10. Призовите мышей бежать аккуратным рукой подталкивание.
- На 3 - й день, пусть мышей пройти одну схватку работать в течение 90 мин на 10 ° в гору беговой дорожке, ЗАПУСКнг со скоростью 10 м / мин. Через 40 мин, увеличить скорость на беговой дорожке со скоростью 1 м / мин через каждые 10 мин в течение в общей сложности 30 минут, а затем увеличить скорость со скоростью 1 м / мин через каждые 5 мин до тех пор, пока не достигнет 17 м / мин, в общей сложности 90 минут времени тренировки и 1070 метров пробега.
- Установить электрический стимул в диапазоне низкой интенсивности (1,2 Гц), а также поощрять мышей бежать, чтобы избежать повторного ножной шок.
- Для сбора ткани, усыпить мышей путем изофлуран ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков сразу после тренировки. Другие методы, одобренные эвтаназии также могут быть использованы, такие как CO2 или IP-инъекции других анестезирующих средств. Уровень аутофагии, кажется, не будут затронуты методами эвтаназии.
- Запуск установки колеса - добровольное упражнение
- Поместите мышь-ходовое колесо (диаметр 11,4 см) внутри клетки с одним-размещались мыши.
- Проверка выполняется с помощью мощности велосипеда одометр.Настройка параметров колеса [расстояние (в мм) за один полный оборот колеса] на 358 (11,4 * π). Измерьте расстояние пробега после 24 часов.
- Пусть мышь работать добровольно в течение 2-х недель при работающем колеса. Для сбора ткани, пожертвуйте мышь утром после периода эксплуатации.
3. Аутофагия Flux Оценка
- Для измерения аутофагической потока под покоя и нагрузки условий, лечения мышей с ингибитором аутофагии хлорохин в течение трех дней, и сравнить их с мышей, которым вводили PBS.
- Растворите хлорохин в PBS (5 мг / мл), и вводят хлорохин мышам внутрибрюшинно в дозе 50 мг / кг / день в течение трех последовательных дней. Жертвоприношение мышей и собирать тканей 3 ч после последней инъекции.
- Для мышей, осуществляемой, предварительно обработать их с хлорохин в течение двух последовательных дней в дозе 50 мг / кг / день. На третий день, впрыскивать мышей с той же концентрацией хлорохин, и после того, как90 мин пусть они работают на беговой дорожке в течение еще 90 мин.
- Эвтаназии мышей изофлуран ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков. Сбор тканей сразу же после запуска, таким образом, что общее время инкубации хлорохин такой же, как контроль (покоя) у мышей (3 ч).
Примечание: В качестве альтернативы, использовать одну инъекцию хлорохин, чтобы определить поток аутофагии в тканях мыши.
4. Ткань для уборки урожая и фиксация
- До начала сбора ткани готовят забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и свежий 4% параформальдегида (PFA, предостережение: средства индивидуальной защиты требуется) в PBS при конечного рН 7,4. Хранить оба раствора при 4 ° С.
- Наполните 30 мл шприц с 15 - 20 мл 4% PFA (для GFP-LC3 мышей). Соедините шприц с 20 G иглой катетера.
- После физических упражнений, эвтаназии мышей путем изофлуран ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков.
- Поместите животное на чистую рабочую поверхность на ее баск. Вырезать и открыть грудную полость, сокращая диафрагму, чтобы обнажить сердце.
- Сделайте небольшой надрез на печень, чтобы кровь вышла, и ввести в общей сложности 15 мл 4% PFA медленно в правый желудочек сердца через катетер, пока легкие и печень не полностью перевернуть бледно. Заливать мышь сразу же после тренировки, используя шприцевой насос с постоянной скоростью потока 90 мл / ч.
- После перфузии, удалить иглу и собирать тканей интерес (например , мозга 11 и скелетных мышц). Для скелетных мышц, рассекают латеральной широкой. Если коротко, то тянуть кожу ноги назад , чтобы выставить мышцы, локализовать четырехглавой мышцы бедра 12, и рассекать из латеральной широкой, что является внешняя мышца прикрепляется к верхней части бедренной кости.
- Для получения дополнительной фиксации и обезвоживания, поместить в ткани GFP-LC3 мышей в 4% PFA в течение 24 ч при температуре 4 ° С, а затем передавать их на 15%сахароза-PBS, при 4 ° С в течение ночи или до тех пор, пока ткани осели, а затем до 30% сахарозы PBS при 4 ° С в течение ночи или в течение более длительного хранения. Хранить образцы в темноте, как можно больше, как они могут быть чувствительны к сильным светом.
- Для Вестерн-блоттинга оснастке замораживать ткани от мышей C57BL / 6 непосредственно в жидком азоте и хранить их при температуре -80 ° C.
5. Анализ изображений GFP-LC3 Puncta
- процесс ткани
- Предварительная обработка тканей (ранее зафиксированные в PFA и хранятся в 30% сахарозы) в вложение среды, такие как "Оптимальная температуры резания соединения" (ОКТ) в течение нескольких минут в меченым небольшую чашку Петри.
- Передача ткани в маркированный cryomold, содержащей достаточное количество свежей ОКТ, чтобы покрыть ткань. Сориентируйте секционирования поверхности к нижней части cryomold (сечение латеральной широкой мышцы и сагиттальный раздел для полугидрата головного мозга). Избегайте образования пузырьков.
- FreЭз образцы путем размещения cryomold в течение нескольких минут в закрытой пены охладитель, заполненный сухим льдом, пока не Октябре побелеет. Оберните отдельных образцов в маркированных фольги, запечатать их в полиэтиленовый пакет и хранить их при температуре -80 ° С в течение ночи или дольше.
- Используйте криостат вырезать образцы секций при толщине 10 мкм, и смонтировать разделы на слайдах. Храните слайды при температуре -20 ° С, и всегда держать слайды в защищенном от света, когда это возможно.
- подготовка слайдов
- Удалить слайды из морозилки и разморозить их при комнатной температуре. Накройте участок ткани с каплей монтажа сред с DAPI. Поместите покровное соответствующего размера на вершине и избежать образования пузырьков.
- Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края покровного стекла, позволяют лак для ногтей, чтобы высохнуть в темноте при комнатной температуре, а затем хранить слайды в светонепроницаемой таре при температуре 4 ° С, или продолжить захвата изображений из GFP-LC3 Puncta.
- <сильный> Количественное GFP - LC3 Puncta с помощью флуоресцентной микроскопии
- Выполните эпифлуоресцентной микроскопии, захватывая снимки в том же состоянии (экспозиции и настроек) для всех образцов. Для GFP, использовать длину волны излучения 525 нм; для DAPI, используют 490 нм. Приобретать по меньшей мере десять изображений в образце с использованием объектива 60X для латеральной широкой мышце бедра и область лобной коры головного мозга.
- Количественно количество GFP-LC3 Puncta в области тканевого 2500 мкм 2 в каждом изображении для статистического анализа, ослепленный для экспериментальных групп. Вычислить среднее число из 10 изображений каждого образца, используя функцию автоматического измерения "Объекта Count". Установки для латеральной широкой мышцы являются: Порог L = 10, H = 200; 2X гладкие; 1X чистые и настройки для мозга лобной коры являются: Порог L = 11, H = 200; 2X гладкие; 1X чистый.
6. Вестерн-блот-анализ на маркеры Аутофагия
- <сильный> Процесс ткани
- Готовят лизирующий буфер: 50 мМ Трис-HCl; 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА; 1% Тритон Х-100; ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы (свеже добавлен).
- Снимите ткань мышей C57BL / 6 от -80 ° C хранения. Обрежьте мышечной ткани на мелкие кусочки с лезвием бритвы до начала следующего процесса. Добавьте 800 мкл (для гемицеллюлозы мозга) или 500 мкл (для латеральной широкой мышце бедра) холодного буфера для лизиса к образцу. Однородный образца при температуре 4 ° С с помощью гомогенизатора при средней скорости.
- Полностью лизировать гомогенизированной смеси в течение еще 30 мин до 1 ч при 4 ° С с вращением.
- Спин вниз гомогената при 12000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С, отбросить осадок, и собирают супернатант в новую пробирку.
- анализ Аутофагия
- Определить концентрацию белка лизатов ткани с использованием набора для анализа BCA Protein в соответствии с техническими требованиями изготовителя. Нормализовать каждый образецв той же концентрации.
- Смешайте образца с буфером для образца 2x Лэммли в соотношении 1: 1, варить при температуре 95 ° С в течение 5 - 10 мин, и продолжить Вестерн - блот - анализа на аутофагией маркеры 13, 14, такие как p62 (анти-p62 антителом, 1: 500 разбавление) и LC3 (анти-LC3 антитела, 1: 500 разбавление). Кипение образцы сразу после добавления буфера выборок, как более инкубирования на льду, может генерировать несколько деградированных полос LC3.
- Количественно P62 и LC3 полос анализа денситометрии с использованием ImageJ, и нормализовать значение соответствующего актина полосе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает два различных метода для индукции аутофагии в тканях мыши с помощью аэробных упражнений: в общей сложности 90 мин принудительного упражнений на многополосной беговой дорожке в протекала на два дня акклиматизации; или две недели добровольного упражнения на беговой колесе используется однослойных размещались мышей. В каждом протоколе упражнений, мы можем измерить поток аутофагии с помощью флуоресцентной микроскопии и Вестерн-блот-анализа в различных органах.
Мы использовали трансгенную линию , выражающую мыши GFP-меченый LC3 в качестве репортерной системы мониторинга аутофагии с помощью физических упражнений 1. При аутофагии индукции, LC3 транслоцируется из цитозоля к аутофагосом в точечными структурах. После того, как секционирование, формирование GFP-LC3 Puncta можно непосредственно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии (рис 1А). В качестве альтернативы аутофагосом структуры могут быть также иммуноокрашиванию с помощью LC3 антитела дляизображений. Либо 90 мин упражнения на беговой дорожке или 2 недели добровольного бега увеличилось число GFP-LC3 Puncta как в скелетных мышцах (латеральной широкой) и коре головного мозга, по сравнению с состоянием покоя (рис 1B). Следует отметить, что лобной области коры головного мозга была основным область в мозге, где аутофагия явно индуцированный любым методом до сих пор. Осуществление также индуцированное преобразование LC3 из цитозольной формы (LC3-I) к липидной-конъюгированной форме (LC3-II), которые могут быть обнаружены с помощью Вестерн - блот - анализа (рис 1C).
Вызванной физической нагрузкой приращение автофагосомы (представленных LC3-II и GFP-LC3 Puncta) обусловлена повышенной аутофагической потока, а не блок в аутофагосом деградации, оцененной с использованием ингибиторов деструкции лизосомальных, таких как bafilomycin A1 или хлорохин , Здесь мы измерили деградацию аутофагической p62 рецептора груза как бывшийобильным. Упражнение (90 мин беговой дорожке) вызвало высокую деградацию p62 в скелетных мышцах , чем состояние покоя, которое было спасено путем инъекции хлорохин перед тренировкой (рисунок 2). Аналогичные результаты наблюдаются и при добровольном порядке осуществления с помощью ходовых колес. Таким образом, аэробные упражнения на беговой дорожке или бег колес вызывает аутофагии в естественных условиях, измеренной по стационарному уровню LC3 и деградации p62.
Рисунок 1. Аэробные упражнения Индуцирует Автофагия у мышей ТКАНЕЙ. Типичные изображения (A) и количественное определение (В) GFP-LC3 Puncta в скелетных мышцах (латеральной широкой) и мозг (лобная кора головного мозга) из GFP-LC3 трансгенных мышей , при условии управления (покоя), через 90 мин принудительного осуществления (беговой дорожке ) или через 2 недели добровольного осуществления (колеса). результатs представляют собой среднее значение ± СЭМ 10 снимков на мышь. N = 5 мышей. Были использованы следующие длины волн излучения: GFP - 525 нм; DAPI - 490 нм. (C) Вестерн - блот обнаружение LC3 в скелетных мышцах (латеральной широкой мышце бедра) из отдохнувшим и осуществляемой (на беговой дорожке) мышей. Данные Количественная представляют уровень LC3-II нормированы к актина (слева) и соотношение LC3-II к LC3-I (справа). N = 3 мыши. Статистика сравнивает каждое значение с контрольным образцом. Результаты представляют среднее ± СКО *, р <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001, т-тест. Шкала бар, 25 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Упражнение увеличивает Аутофагия поток в мыши скелетных мышц. (А) Вестерн - блотобнаружение p62 в латеральной широкой мышце бедра от отдохнувшим и мышей в осуществляемой в присутствии или в отсутствие хлорохина ингибиторов лизосом. (В) (левый) Количественный анализ p62 нормированной к соответствующей актина полосе. (Справа) Поток P62 определяется путем вычитания нормализованного денситометрическую значение PBS-обработанных p62 от хлорохина обработанных p62. Результаты представляют собой среднее значение ± СЭМ N = 3 мышей. * Р <0,05, т-тест. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Аутофагия является катаболический процесс, который дает энергию и уменьшает цитотоксичность лизосомной деградации компонентов цитоплазмы или поврежденных органелл. Изучение аутофагию важно понимать регулирование клеточного гомеостаза и механизмов ответа на стресс. Новые модели и методологии , возникающие в области исследований 15, чтобы изучить , как нарушенная аутофагия способствует многочисленных патологических процессов 16, 17.
Питательные лишение (голодание) и фармакологическая индукция обычно используются подходы для индукции аутофагии в пробирке и в естественных условиях. Эти методы, особенно для моделей на животных, могут показать неблагоприятные последствия, которые могут повлиять на общие результаты. Например, так как он требует, по крайней мере 48 часов голодания, чтобы вызвать выявляемой уровень аутофагии, животные, возможно, не энергия, необходимая для регулярной двигательной активности, котораявлияет на исход многих последующих поведенческих исследований. Тем не менее, фармакологические индукторов может также привести к побочным эффектам из-за их недостаточной специфичности к аутофагии. Главный аутофагия индуктором рапамицин и его производные подавляют активность MTOR и вызывают метаболические нарушения и иммуносупрессии 18, 19, 20, которые должны быть приняты во внимание при экспериментальном проектировании для длительного лечения. Таким образом, мы работаем на более физиологических и надежных способов для активации аутофагии в животных моделях.
В последнее время мы и другие определили упражнения в качестве эффективного, быстрее и безопаснее аутофагия индуктором в естественных условиях 7, 8, 9. Оба вынуждены упражнения на беговой дорожке и добровольным мероприятием, запустив колеса были использованы для анализа влияния физических упражнений на аутофагии аctivation, с вариациями в продолжительности нагрузки и интенсивности 21, 22. Например, час беговой дорожке (начиная со скоростью 10 м / мин до максимум 40 м / мин) вызывает обильные LC3 липидизации в скелетных мышцах 21, а в долгосрочной перспективе добровольное колесо работает в течение 3 -х месяцев или 4 - 5 недель также увеличивает базальный аутофагию и усиливает экспрессию аутофагии белков в скелетных мышцах 21, 22.
Здесь мы описали и сравнили эти два метода (беговой дорожке и ходовое колесо) осуществлять мышей, и представила оптимизированные более короткие протоколы с высокой эффективностью в индукции аутофагии. Каждый подход имеет свои плюсы и минусы. Один бой 90 мин принудительного упражнений на беговой дорожке достаточно, чтобы вызвать аутофагии в скелетных мышцах и головном мозге. Мы сделали временной ход беговой дорожке упражнения 7, и обнаружили , что в exerciусловия как таковые , описанные здесь , вызывают максимальный уровень аутофагией в клетках мышиной скелетных мышц, которая также проверяется с другими 23. В этих условиях, мышей подвергаются аэробикой; как сообщалось ранее, аэробные упражнения индуцируется длительной работы с постепенным повышением скорости на беговой дорожке 24, 25, 26, в то время как состояние анаэробного получается короткий период высокой интенсивности упражнений, что увеличивает мышечную массу , но не обязательно улучшить упражнение выносливость 27, 28. Кроме того, скорость движения сообщили здесь , в этом протоколе положительно коррелирует с объемом потребления кислорода, косвенными методами для оценки аэробной способности 29. Таким образом, аэробные упражнения на беговой дорожке является быстрым и эффективным способом, чтобы вызвать аутофагию.
Тем не менее, НЦВОред работает в замкнутом пространстве может оказывать нагрузку на мышей. Таким образом, чтобы не давать дополнительную нагрузку на животных, мы используем палец подталкивания или провод кисточки в качестве способа держать мышей работает, вместо встроенного удара электрическим током. По сравнению с беговой дорожки, использование ходовое колесо имеет много преимуществ. Это меньше стрессовых ситуаций, не требует времени наблюдения исследователей, и удобно изучать долгосрочные эффекты активации аутофагии. Тем не менее, упражнения на ходовое колесо является добровольным и, таким образом, создает изменчивость с точки зрения расстояния пробега и скорости среди разных мышей или той же мыши в разные дни. Таким образом, необходимо , чтобы запускать мышей на колесе в течение длительного периода времени (например, за несколько недель) , чтобы минимизировать индивидуальную вариабельность. Важно отметить, что подход также требует использования одометр в ночное время, чтобы убедиться, что мышь на самом деле работает. Мы измерили среднюю расстояние пробега 6 мышей дикого типа C57BL / в течение 2-х недель, и обнаружили, что они работают прибли-зительно 1 км / сутки в начале обучения (1-й день) и может работать до 8 - 10 км / сутки в день 14. В целом, ходовое колесо является эффективным методом для стимуляции аутофагии в большинстве органов, хотя, это труднее захватить аутофагосом накопление в скелетных мышцах по сравнению с использованием беговой дорожки. Причина заключается в том, что скелетные мышцы имеет высокую аутофагической поток и скорость деградации быстро аутофагосом, что требует немедленного сбор тканей после запуска для обнаружения индукции аутофагии измерения Puncta GFP-LC3. В любом протоколе, быстрое PFA перфузии и фиксации тканей после эвтаназии животных является важным шагом процедуры для сохранения аутофагосом структуры, которые в противном случае легко разлагаются при рассечении.
Этот протокол показывает, как использовать аэробные упражнения для стимуляции аутофагии в тканях мышей, в том числе головного мозга и скелетных мышц. Эти методы могут быть использованы для изучения механизмов аутофагии в мaintenance функции ткани, такие как митохондриальной обслуживания 23, а также изучить долгосрочные эффекты индукции аутофагии на регуляции поведения и здоровья моделей заболеваний животных, таких как усиление анальгетическое действие каннабиноидов 9. Оба беговой дорожки и ходовое колесо методы вызывают хороший уровень аутофагии; тем не менее важно учитывать их различия при выборе наилучшего подхода для удовлетворения различных целей исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
