Summary
オートファジーの活性化は、多くの疾患の予防に有益です。 生体内でオートファジーを誘導する生理的なアプローチの一つは、物理的な運動です。ここでは、有酸素運動によってオートファジーを活性化し、マウスにおけるオートファジーのレベルを測定する方法を示しています。
Introduction
オートファジーは、飢餓および低酸素1,2のような種々のストレス条件に応答して誘導される進化的に保存された分解経路です。オートファジーの間、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞は、不要なまたは損傷した細胞内のコンポーネントを組み込み、劣化3のためのリソソームにそれらを運びます。基底オートファジーは、細胞機能および生物の開発のために不可欠であり、障害のある基底オートファジーは神経変性、腫瘍形成および2型糖尿病4、5、6を含む多くの疾患に関与しています。
最もよく知られている生理的オートファジー誘導因子が飢餓です。しかし、それは、2つの主要な制限を有します。まず、飢餓は、 例えば 、効果的動物でオートファジーを誘導するために、マウスにおける食物制限の48時間を長い期間を要しますほとんどの臓器インチ第二に、飢餓はほとんど脳内で比較的安定した栄養供給に起因する脳のオートファジーを誘導します。実際には、多くの薬物は、血液脳関門を通過できないように、小分子誘導物質によってオートファジーの誘導を検出することも困難です。このように、より良い疾患の病因におけるオートファジーの活性化の機能を分析するために、我々は最近、運動は時間7、8、9の短い期間でオートファジーを誘導するために、より強力な生理的な方法であることを発見しました。飢餓と比較して、オートファジーを効果的に30分ほど速く実行トレッドミルによって誘導されます。このように、運動は健康上の利点を仲介し、疾患の予防にオートファジーのメカニズムを研究するための便利で強力な生理的なアプローチです。
LC3およびP62を含むオートファジー活性の検出のためのいくつかのタンパク質マーカーがあります。 LC3（微小管結合タンパク質1A / 1B-光Cヘイン3）は、オートファジーの誘導時にPE（ホスファチジルエタノールアミン）に結合しているサイトゾルタンパク質（LC3-I型）です。 PE脂質化LC3（LC3-II型）は、オートファゴソーム膜に動員され、GFPで標識したときオートファゴソームを可視化するために使用することができます。顕微鏡下でオートファゴソームの構造を点状にする細胞質ゾルからの転座は、オートファジー誘導の指標です。 P62は、（例えば、ユビキチン化タンパク質など）オートファジー基板のカーゴ受容体であり、同様にオートファゴソームに組み込まれます。タンパク質は、オートファゴソームとともにリソソームで分解されるので、そのレベルは、オートファジーフラックスを測定するために使用することができます。ここでは、強制運動（トレッドミル）と自発運動（車輪を実行している）などの有酸素運動によって誘発される異なるマウス組織でオートファジーを定量化するために、これらのマーカーを使用する方法を示しています。同じ手順は、他の誘導物質を処理した後、オートファジーのインビボ測定に適用することができます。
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Protocol
動物に関わるすべての手順は、ノースウェスタン大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）により承認ガイドラインに従って行いました。
1.マウスモデル
- 運動トレーニングに8-12週齢のマウスを使用してください。 生体内で行使により誘導されるオートファジーを検出するために、イメージング研究および生化学的分析のためのC57BL / 6マウスのためのGFP-LC3トランスジェニックマウス（C57BL / 6バックグラウンド）を使用します。
2.運動誘発オートファジー
- トレッドミルのセットアップ-強制運動
- 順応し、2日間10℃上り坂オープントレッドミル上でマウスを訓練します。 1日目に8メートル/分で5分間、マウスを行使し、2日目に8 mでは5分間のマウス運動/分10m /分10でさらに5分間続きます。優しい手ナッジによって実行するために、マウスを奨励します。
- 3日目に、マウスが10°上り坂トレッドミル、startiで90分間実行して、単一の試合を受けてみましょう10m /分の速度でngの。 40分後、30分の合計は1メートル/ 10分毎分の速度で、トレッドミルの速度を増加させ、そしてその後17メートル/分に達するまで1メートル/ 5分毎分の速度で速度を増加させます、運動時間の90分と距離を実行しているの1070メートルの合計。
- 低強度範囲（1.2ヘルツ）で電気刺激を設定し、繰り返し足の衝撃を回避するために実行するためにマウスを奨励します。
- 組織収集のために、運動直後頸椎脱臼が続くイソフルラン吸入によってマウスを安楽死させます。他の承認された安楽死の方法はまた、二酸化炭素または他の麻酔薬のIP注射として使用することができます。オートファジーのレベルは、安楽死の方法によって影響されていないようです。
- 自発運動-車輪のセットアップを実行します
- シングル収容されたマウスでケージの中にマウスランニングホイール（11.4センチメートル直径）を配置します。
- 自転車の走行距離計を使用して、実行中の容量を確認してください。（π* 11.4）358で[ホイールの全回転当たりの距離（mm）]ホイールパラメータを設定します。 24時間後の走行距離を測定します。
- マウスは、走行輪と2週間自主的に実行してみましょう。組織収集のために、実行している期間の後、午前中にマウスを生け贄に捧げます。
3.オートファジーフラックスの評価
- 安静時や運動条件下でのオートファジーフラックスを測定するために、3日間のオートファジー阻害剤クロロキンでマウスを治療し、PBSで処置したマウスと比較します。
- PBSにクロロキンを溶解する（5 mg / mlで）、3日間連続して腹腔内に50mg / kg /日の用量でマウスにクロロキンを注入します。マウスを犠牲にし、組織を最後の注射後3時間を収集します。
- 行使されたマウスは、50 mg / kg /日の用量で2日間連続クロロキンでそれらを前処理。三日目に、後クロロキンの同じ濃度でマウスを注入し、90分彼らは別の90分間のトレッドミル上で実行してみましょう。
- 頸椎脱臼が続くイソフルラン吸入によってマウスを、安楽死させます。クロロキンの総インキュベーション時間は、コントロール（安静時）マウス（3時間）と同じになるように、すぐに実行した後の組織を収集します。
注：別の方法として、マウス組織におけるオートファジーフラックスを決定するためにクロロキンの単回注射を使用します。
4.組織の収穫と固定
- 7.4の最終pHで、PBS中：組織の収穫の前には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、新鮮な4％パラホルムアルデヒド（必要な個人用保護機器PFA、注意を）準備します。 4℃で両方のソリューションを格納します。
- （GFP-LC3マウス用）4％PFAの20ミリリットル - 15と30ミリリットル注射器を埋めます。 20 Gカテーテル針で注射器を接続します。
- 運動後、頸椎脱臼に続いて、イソフルラン吸入によりマウスを安楽死させます。
- そのBAに清潔な作業面に動物を置きますCK。カットし、心臓を露出するために、振動板を切断して胸腔を開きます。
- 肺と肝臓が完全に青ざめるまで、血が出て来るように、カテーテルを介して心臓の右心室にゆっくりと15ミリリットル4％PFAの合計を注入するために肝臓に小さな切開を行います。 90ミリリットル/時の一定流量でシリンジポンプを使用して、すぐに運動セッションの後、マウスを灌流。
- 灌流後、針を除去し、関心の組織（ 例えば脳 11と骨格筋）を収集。骨格筋の場合は、外側広筋を解剖。簡単に言えば、筋肉を露出させる12の大腿四頭筋をローカライズし、大腿骨の上部に接続された外部の筋肉である外側広筋を、ばらばらにするために、後方の脚の皮膚を引っ張ります。
- さらに固定および脱水のために、4℃で24時間、4％PFA中でGFP-LC3マウスの組織を配置し、その後15％に転送4℃でのスクロース-PBSで一晩または組織が安定するまで、その後、一晩4℃で30％のスクロース-PBSまたは長期保存のために。彼らは強い光に敏感であり得るとして、できるだけ多くの暗所でサンプルを保管してください。
- ウェスタンブロット分析のために液体窒素中で直接、C57BL / 6マウスからの組織を凍結し、-80℃で保管しスナップ。
GFP-LC3涙点の5イメージング解析
- 組織のプロセス
- そのような標識された小さなペトリ皿で数分間の「最適切削温度化合物」（10月）などの媒体を埋め込んで組織（以前はPFAで固定し、30％スクロース中に保存されている）を事前扱います。
- 組織をカバーするのに十分な新鮮な10月を含む標識cryomoldに組織を転送します。オリエントcryomold（外側広筋の筋と半脳のための矢状断面のための断面）の底部に向かってセクショニング面。泡の形成を避けます。
- FRE10月が白くなるまで、ドライアイスで満たされた屋根付きの発泡クーラーで数分間cryomoldを配置することによって、サンプルをEZE。 、標識された箔で個々のサンプルを包むビニール袋にそれらを密封し、-80℃で一晩以上保管してください。
- 10μmの厚さでサンプルのセクションを切断し、スライド上のセクションをマウントするクライオスタットを使用してください。 -20℃でスライドを保存し、常に可能な限り光から離れてスライドを保ちます。
- スライドの準備
- 冷凍庫からスライドを外し、室温でそれらを解凍。 DAPIでメディアのマウントの低下と組織切片をカバーしています。上に適切なサイズのカバーガラスを置き、気泡形成を回避します。
- 、カバーガラスの縁をシールマニキュアは、暗所で室温で乾燥させ、その後、4℃で光を通さない容器にスライドを保存する、またはGFP-LC3の涙点の撮像キャプチャを続行するためにマニキュアを使用してください。
- <GFPの強い>定量 - 蛍光顕微鏡によるLC3の斑点
- すべてのサンプルについて同じ条件（露出と設定）で画像をキャプチャ、落射蛍光顕微鏡を実行します。 GFPは、525nmでの発光波長を使用します。 DAPIのために、490nmのを使用しています。外側広筋のための60X目的と脳の前頭皮質領域を用いて、サンプルあたり少なくとも10の画像を取得します。
- 実験群のために盲目に統計分析のために各画像中の2500 平方 μmの組織領域にGFP-LC3の斑点の数を定量化します。 "オブジェクト数"の自動測定機能を用いて、各サンプルの10枚の平均値を計算します。外側広筋の筋肉の設定は次のとおりです。しきい値L = 10、H = 200; 2Xはスムーズ。 1Xきれいな、と脳の前頭皮質の設定は、次のとおりです。しきい値L = 11、H = 200; 2Xはスムーズ。 1Xきれい。
オートファジーマーカー6.ウェスタンブロット分析
- <強い>組織プロセス
- 溶解バッファー準備：50 mMトリス - 塩酸; 150mMのNaCl; 1 mMのEDTA; 1％トリトンX-100。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（新たに追加されました）。
- Cストレージ-80℃からC57BL / 6マウスの組織を削除します。次の工程の前にカミソリの刃で小片に筋肉組織をカット。サンプルに冷溶解緩衝液（外側広筋の場合）（ヘミ脳用）800μlあるいは500μl添加します。中程度の速度でホモジナイザーを用いて4℃でサンプルをホモジナイズします。
- 完全に回転させながら4℃で1時間にさらに30分間均質化混合物を溶解します。
- 、4℃で10分間12,000×gでホモジネートをスピンダウンし、ペレットを廃棄し、新しいチューブに上清を収集します。
- オートファジー分析
- 製造業者の仕様書に従ってBCAタンパク質アッセイキットを使用して、組織溶解物のタンパク質濃度を決定します。各サンプルを正規化同じ濃度に。
- 、1比5 95℃でそれを沸騰- 10分、ならびにP62（抗P62抗体としてオートファジーマーカー13、14、上のウェスタンブロット分析を続行：1で2×Laemmliサンプル緩衝液で試料を結合1：500希釈）およびLC3（抗LC3抗体、1：500希釈）。氷の上でより長いインキュベーションは、LC3の複数の劣化バンドを生成することができるように、すぐにサンプル緩衝液を添加した後、サンプルを沸騰させます。
- ImageJのを使用してデンシトメトリー分析によってP62とLC3のバンドを定量化し、対応するアクチンバンドに値を正規化します。
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Representative Results
このプロトコルは、有酸素運動によるマウス組織におけるオートファジーを誘導するために2つの異なる方法を説明します。順化の2日間進めマルチレーントレッドミル上の強制運動の90分の合計。またはシングル収容されたマウスで使用される走行輪に自発運動の2週間。各運動プロトコルでは、我々は、蛍光顕微鏡および様々な臓器におけるウェスタンブロット分析によってオートファジーフラックスを測定することができます。
私たちは運動1によりオートファジーを監視するためのレポーター系としてGFPタグLC3を発現するトランスジェニックマウスラインを使用しました。オートファジー誘導の際に、LC3は、点状の構造でオートファゴソームに細胞質ゾルから移動します。切片化後、GFP-LC3の斑点の形成が、直接蛍光顕微鏡（ 図1A）によって可視化することができます。また、オートファゴソーム構造はまたのためのLC3抗体によって免疫染色することができますイメージング。トレッドミル運動の90分または自主的なランニングの2週間のいずれかが休止状態（ 図1B）と比較すると、骨格筋（外側広筋）と大脳皮質の両方でGFP-LC3の斑点の数を増加させました。前頭皮質領域がオートファジーが明らかにこれまでのいずれかの方法により誘導される脳内の主要な地域となっていることに留意すべきです。運動はまた、ウェスタンブロット分析（ 図1C）によって検出することができる脂質共役体（LC3-II）のサイトゾル型（LC3-I）からLC3の変換を誘導しました。
（LC3-IIおよびGFP-LC3の斑点によって表される）オートファゴソームの運動誘発性増加はむしろ、そのようなバフィロマイシンA1またはクロロキンのようなリソソーム分解の阻害剤の使用によって評価オートファゴソーム分解のブロック、より高められたオートファジーフラックスに起因しています。ここでは、元のようにオートファジー貨物受容体P62の分解を測定しました十分。運動は（トレッドミルの90分）（ 図2）を行使する前にクロロキンを注射して救助された静止状態、より骨格筋にP62の高い劣化を引き起こしました。同様の結果はまた、車輪を実行することにより、自発的な運動で観察されています。このように、トレッドミルや走行車輪によって有酸素運動は、LC3の定常状態レベルおよびP62の分解によって測定し、 生体内でオートファジーを誘導します。
図1.有酸素運動は、マウス組織におけるオートファジーを誘導します。代表的な画像制御条件（休止）の下でGFP-LC3トランスジェニックマウスの骨格筋（外側広筋）と脳（前頭皮質）におけるGFP-LC3の斑点の（A）及び定量化（B）、強制運動の90分後（トレッドミル）または自発運動（車輪）の2週間後。結果sがマウス当たり10枚の平均値±SEMを表します。 N = 5のマウス。以下の発光波長を使用した：GFP - 525 NMと、 DAPI - 490 nmの。 （C）（トレッドミルによる）休養し、行使されたマウスからの骨格筋（外側広筋）におけるLC3のウエスタンブロット検出。定量データは、アクチン（左）とLC3-I（右）へのLC3-IIの比に正規化LC3-IIのレベルを表します。 N = 3のマウス。統計値は、対照試料にそれぞれの値を比較しています。結果は平均値±s *、P <0.05を意味表します。 **、P <0.01。 ***、P <0.001、t検定。スケールバー、25μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.運動がマウス骨格筋におけるオートファジーフラックスを増加させます。 （A）ウエスタンブロット休息とリソソーム阻害剤のクロロキンの存在下または非存在下でマウスを行使から外側広筋におけるP62の検出。対応するアクチンバンドに正規化P62の（B）（左）定量分析。 （右）P62束はクロロキン処理したP62とは、PBSで処理したP62の正規化された濃度測定値を減算することによって決定されます。結果は、平均±SEM、N = 3マウスを意味する表現します。 *、P <0.05、t検定。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
オートファジーは、エネルギーを提供し、細胞質成分または損傷した細胞小器官のリソソーム分解により細胞毒性を減少させる異化プロセスです。オートファジーの研究は細胞の恒常性の調節およびストレス応答のメカニズムを理解することが重要です。新モデルと方法論は、多くの病理学的プロセス16、17にどのように寄与するかを損なわオートファジー研究し、研究分野15で浮上しています。
栄養欠乏（飢餓）および薬理学的誘導は、一般的に、インビトロおよびインビボでオートファジーを誘導するための方法を使用しています。特に、動物モデルのためのこれらの方法は、全体的な結果に影響を与え得る悪影響を示すことができます。それは飢餓の少なくとも48時間を必要とするため、例えば、オートファジーの検出可能なレベルを誘導するために、動物は、エネルギーは、通常の運動活動、のために必要としていない可能性があります多くのその後の行動研究の結果に影響を与えます。まだ薬理学的誘導物質はまた、オートファジー経路に特異性の欠如に副作用をもたらすことができます。主要なオートファジー誘導因子のラパマイシンおよびその誘導体は、mTOR活性を抑制し、長期治療のための実験設計において考慮されるべきである代謝機能不全及び免疫抑制18、19、20を生じさせます。したがって、我々は、動物モデルにおけるオートファジーの活性化のための複数の生理的かつ堅牢な方法に取り組んできました。
最近、我々と他の人が特定した運動効果的な、より速く、より安全なオートファジー誘導因子vivoで 7、8、9インチホイールを実行して、トレッドミルや自発運動による強制運動の両方がオートファジーのAに対する運動の効果を分析するために使用されていますctivation、運動時間と強度21、22の変化と。 5週間-例えば、トレッドミルの時間が実行されている（40メートル/分の最大10メートル/分の速度で開始する）は3月または4に立候補骨格筋21に豊富LC3の脂質化、および長期的な自主的なホイールを誘導しますまた、基底オートファジーを増加させ、骨格筋21,22においてオートファジータンパク質の発現を増強します。
ここでは、説明やマウスを行使するために、2つの方法（トレッドミル、ランニングホイール）を比較し、オートファジー誘導における高効率で短いプロトコルを最適化して提示します。それぞれのアプローチは、長所と短所があります。トレッドミル上の強制運動の90分の単一の試合は、骨格筋と脳にオートファジーを誘導するのに十分です。私たちは、トレッドミル運動7の時間経過を行われ、exerciことを発見しましたここで説明SE条件も他23によって検証されたマウスの骨格筋においてオートファジーの最大レベルを誘導します。これらの条件下では、マウスは、有酸素運動を受けます。以前に報告されたように嫌気条件は筋肉量を増加させるが、必ずしも運動を強化しない高強度の運動の持続時間が短いことにより得られるのに対し、有酸素運動は、長時間のトレッドミル24、25、26上の速度の緩やかな増加に実行することによって誘導されます持久力27、28。さらに、このプロトコルでここに報告走行速度が正に好気性容量29を評価するために間接的な方法により、酸素消費能力と相関します。したがって、トレッドミル上の有酸素運動は、オートファジーを誘導するための迅速かつ効果的な方法です。
しかし、FORCedはマウスにストレスを与える可能性が密閉空間で実行されています。したがって、動物に追加のストレスを与えることを避けるために、私たちの代わりに、実行中のマウスを維持するための方法として、指がnudgesやワイヤータッセル使用ビルトイン電気ショック。トレッドミルと比較して、走行輪の使用は多くの利点を有します。これは、ストレスの少ないあり、研究者の観察時間を必要とせず、オートファジーの活性化の長期的影響を研究するために便利です。しかし、走行輪上の演習では、自発的であり、したがって、異なるマウスまたは異なる日に同じマウスの間の距離と速度を実行しているという点でばらつきが発生します。したがって、個々の変動を最小限にするために（ 例えば 、数週間）長期間車輪にマウスを実行する必要があります。重要なのは、アプローチはまた、マウスが実際に実行されていることを確認するために夜間走行距離計を使用する必要があります。我々は、2週間にわたって、野生型C57BL / 6マウスの平均走行距離を測定し、そしてそれらはapproxi実行することを見出しましたmately 1キロのトレーニング（1日目）の先頭に/夜と8まで実行することができます - それは難しいです、が、全体的に14日目で10キロ/夜は、走行輪は、ほとんどの器官でオートファジーを刺激するための有効な方法でありますトレッドミルを使用する場合と比較して、骨格筋におけるオートファゴソームの蓄積をキャプチャします。その理由は、骨格筋が高いオートファジーフラックスとGFP-LC3の斑点測定によるオートファジーの誘導を検出するために実行した後、即時の組織採取を必要とする高速オートファゴソームの分解速度を、持っていることです。いずれかのプロトコルでは、殺処分後の組織の急速なPFA灌流および固定は、そうでなければ簡単に解剖中に分解されたオートファゴソーム構造を維持する手順の重要なステップです。
このプロトコルは、脳や骨格筋などのマウス組織でオートファジーを刺激するために有酸素運動を使用する方法を示します。これらの方法は、mはオートファジー経路のメカニズムを研究するために使用することができこのようなミトコンドリアのメンテナンス23として組織機能のaintenance、そのようなカンナビノイド9の鎮痛効果を高めるなどの動物疾患モデルの行動や健康の規制上のオートファジー誘導の長期的影響を研究します。どちらのトレッドミルランニングホイール方法は、オートファジーの良好なレベルを誘導します。まだ別の研究目標を達成するための最適なアプローチを選択する場合、その違いを考慮することが重要です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
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