Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Aktivera Autophagy av aerob träning hos möss

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/55099

Summary

Autophagy aktivering är fördelaktigt vid förebyggande av ett antal sjukdomar. En av de fysiologiska metoder för att inducera autophagy in vivo är fysisk träning. Här visar vi hur du aktiverar autophagy av aerob träning och mäta autophagy nivåer i möss.

Introduction

Autophagy är en evolutionärt konserverad nedbrytningsväg, som induceras som svar på olika stressförhållanden, såsom svält och hypoxi 1, 2. Under autophagy, dubbel membranvesiklar, som kallas autophagosomes, införliva onödiga eller skadade subcellulära komponenter och transportera dem till lysosomer för nedbrytning 3. Basal autophagy är avgörande för cellulär funktion och organismutveckling, och försämrad basal autophagy är inblandade i många störningar, inklusive neurodegenerering, tumörgenes och typ 2-diabetes 4, 5, 6.

Den mest kända fysiologiska autophagy induceraren är svält. Det har dock två stora begränsningar. Först tar svält en lång tid för att effektivt inducera autophagy i djur, t.ex. 48 timmar av mat begränsning hos mössi de flesta organ. För det andra, svält inducerar knappt hjärn autophagy, på grund av en relativt stabil näringstillförsel i hjärnan. I själva verket är det också svårt att detektera autophagy induktion genom småmolekylära inducerare, eftersom många läkemedel inte kan passera blod-hjärnbarriären. Således, för att bättre analysera funktionen av autophagy aktivering i sjukdoms patogenes, upptäckte vi nyligen att motion är en mer potent fysiologisk metod för att inducera autophagy i en kort tidsperiod 7, 8, 9. Jämfört med svält, är autophagy effektivt induceras av treadmill att köra så fort som 30 min. Således, är motion ett bekvämt och potent fysiologisk metod för att studera mekanismen för autophagy i medla hälsofördelar och förebygga sjukdomar.

Det finns flera proteinmarkörer för påvisande av autophagy-aktivitet, inklusive LC3 och p62. LC3 (mikrotubuli-associerat protein 1A / 1B-ljus chain 3) är ett cytosoliskt protein (LC3-I bildar) som är konjugerad till PE (fosfatidyletanolamin) på autophagy induktion. PE-lipiderade LC3 (LC3-II form) rekryteras på autophagosomal membran och kan användas för att visualisera autophagosomes när märkt med GFP. Dess translokation från cytosolen till punktat konstruktioner av autophagosomes enligt mikroskopi är en indikation på autophagy induktion. p62 är en last receptor för Autophagy substrat (t.ex. ubikitinering proteiner), och inkorporeras i autophagosomes också. Eftersom proteinet bryts ned i lysosomer tillsammans med autophagosomes, kan dess nivåer användas för att mäta den autophagy flux. Här visar vi hur man använder dessa markörer för att kvantifiera autophagy i olika mus vävnader induceras av aerob träning, inbegripet tvångs övning (treadmill) och frivillig träning (löphjul). Samma förfaranden kan också tillämpas på in vivo mätning av autophagy efter behandling av andra inducerare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla som deltar i djurförsök utfördes enligt riktlinjer som godkänts av Northwestern University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. musmodeller

  1. Använd 8-12 veckor gamla möss i träning. För att detektera utövas-inducerad autophagy in vivo, använda GFP-LC3 transgena möss (C57BL / 6 bakgrund) för avbildningsstudier och C57BL / 6-möss för biokemiska analyser.

2. Motion-inducerad Autophagy

  1. Löpband setup - tvingas motion
    1. Acklimatisera och träna mössen på en 10 ° uppför öppen löpband under 2 dagar. På dag 1, utöva mössen under 5 minuter vid 8 m / min, och på dag 2, utöva mössen under 5 minuter vid 8 m / min följt av ytterligare 5 min vid 10 m / min 10. Uppmuntra mössen att köra med varsam hand knuff.
    2. Den 3: e dag, låt mössen genomgå en enda våg av att köra i 90 minuter på 10 ° uppåt löpband, starting med en hastighet av 10 m / min. Efter 40 min, öka löpbandet hastigheten vid en hastighet av 1 m / min var 10 min under totalt 30 min, och sedan öka hastigheten i en takt av 1 m / min var 5 min till dess att den når 17 m / min, för totalt 90 min av träningstid och 1,070 meter körsträcka.
    3. Ställ den elektriska stimulans med låg intensitet intervall (1,2 Hz), och uppmuntra mössen att köra för att undvika upprepade fotchock.
    4. För vävnadsuppsamlings, euthanize möss genom isofluran inandning, följt av halsdislokation omedelbart efter träning. Andra godkända dödshjälp metoder kan också användas, såsom CO2 eller IP-injektion av andra narkosmedel. Nivån på autophagy verkar inte påverkas av metoder för eutanasi.
  2. Running hjul setup - frivillig övning
    1. Placera en mus-löphjul (11,4 cm i diameter) i en bur med en enda inrymt mus.
    2. Kontrollera den löpande kapacitet med hjälp av en cykel vägmätare.Ställ in parametern hjulet [avstånd (i mm) per full rotation av hjulet] vid 358 (11,4 * π). Mäta körsträckan efter 24 tim.
    3. Låt musen springa frivilligt för 2 veckor med löphjul. För vävnadsuppsamlings, offra musen på morgonen efter inkörningsperioden.

3. Autophagy Flux Utvärdering

  1. För att mäta autophagic flussmedel enligt vilande och motionsförhållanden, behandla möss med autophagy inhibitorn klorokin i tre dagar och jämföra dem med möss behandlade med PBS.
    1. Upplösa klorokin i PBS (5 mg / ml) och injicera klorokin i möss intraperitonealt i en dos av 50 mg / kg / dag under tre på varandra följande dagar. Offra möss och samla vävnader 3 h efter den sista injektionen.
    2. För utnyttjade möss, förbehandla dem med klorokin under två på varandra följande dagar vid en dos av 50 mg / kg / dag. På den tredje dagen, injicera mössen med samma koncentration av klorokin, och efter90 min låta dem springa på löpbandet i ytterligare 90 minuter.
    3. Euthanize möss genom isofluran inhalering, följt av cervikal dislokation. Samla in vävnad omedelbart efter att ha kört, så att den totala inkubationstiden av klorokin är samma som kontrollen (vila) möss (3 h).
      OBS: Du kan också använda en enda injektion av klorokin att bestämma autophagy flödet i mus vävnader.

4. Tissue Skörd och Fixering

  1. Före vävnad skörd förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och färsk 4% paraformaldehyd (PFA, försiktighet: personlig skyddsutrustning som krävs) i PBS vid ett slutligt pH av 7,4. Lagra både lösningar vid 4 ° C.
  2. Fyll 30 ml spruta med 15 - 20 ml 4% PFA (för GFP-LC3 möss). Anslut sprutan med en 20 G kateter nål.
  3. Efter övningen, avliva möss av isofluran inandning, följt av halsdislokation.
  4. Placera djuret på en ren arbetsyta på back. Skära och öppna brösthålan genom att skära membranet att exponera hjärtat.
  5. Göra ett litet snitt på levern för att låta blodet komma ut, och injicera totalt 15 ml 4% PFA långsamt in i den högra ventrikeln av hjärtat via katetern, tills lungan och levern blir helt blek. BEGJUTA musen omedelbart efter ett träningspass, med användning av en sprutpump med en konstant flödeshastighet av 90 ml / h.
  6. Efter perfusion, ta bort nålen och samla vävnad av intresse (t.ex. hjärnan 11 och skelettmuskeln). För skelettmuskulaturen, dissekera vastus lateralis. Kortfattat, dra huden av benet bakåt för att exponera de muskler, lokalisera quadriceps femoris 12, och dissekera ut vastus lateralis, vilket är den externa muskeln fäst vid den övre delen av den femorala benet.
  7. För ytterligare fixering och dehydratisering, placera vävnader hos GFP-LC3 möss i 4% PFA under 24 h vid 4 ° C, och sedan överföra dem till 15%sukros-PBS vid 4 ° C över natten eller tills vävnaderna har bosatt sig, och sedan till 30% sackaros-PBS vid 4 ° C över natten eller under längre förvaring. Håll proverna i mörker så mycket som möjligt eftersom de kan vara känsliga för starkt ljus.
  8. För Western blot-analys knäppa frysa vävnaderna från C57BL / 6-möss direkt i flytande kväve, och förvara dem vid -80 ° C.

5. Imaging Analys av GFP-LC3 puncta

  1. vävnadsprocessen
    1. Förbehandla vävnaderna (tidigare fastställts i PFA och lagras i 30% sackaros) i bädda medium såsom "Optimal Cutting Temperature förening" (oktober) för några minuter i en märkt liten petriskål.
    2. Överföra vävnaden i en märkt cryomold innehållande tillräckligt färskt oktober för att täcka vävnaden. Orientera sektioneytan mot botten av cryomold (tvärsnittet för vastus later muskler och sagittal sektion för hemi-hjärnan). Undvik bildandet av bubblor.
    3. FreEZE proverna genom att placera cryomold för några min i en täckt skum kylare fylld med torris, tills oktober blir vit. Wrap enskilda prover märkta folier, täta dem i en plastpåse och förvara dem vid -80 ° C över natten eller längre.
    4. Använd en kryostat att skära prov sektioner med en tjocklek av 10 um, och montera delarna på bilderna. Förvara bilderna vid -20 ° C, och alltid hålla bilderna borta från ljus när det är möjligt.
  2. glaspreparering
    1. Ta diabilder från frysen och tina dem vid rumstemperatur. Täck vävnadssnitt med en droppe montering media med DAPI. Placera en täck av lämplig storlek på topp och undvika bubbelbildning.
    2. Använd nagellack att försegla kanterna på täck låta nagellack torka i mörker vid rumstemperatur, och sedan lagra bilderna i en ljustät behållare vid 4 ° C, eller fortsätta med bildbehandling av GFP-LC3 puncta.
  3. <strong> Kvantifiering av GFP - LC3 puncta genom fluorescensmikroskopi
    1. Utför epifluorescensmikroskopi, fånga bilder i samma skick (exponering och inställningar) för alla prover. För GFP, använda en emissionsvåglängd av 525 nm; för DAPI, använd 490 nm. Förvärva minst tio bilder per prov med användning av en 60X objektiv för vastus lateralis och frontala cortex regionen av hjärnan.
    2. Kvantifiera antalet GFP-LC3 puncta i ett vävnadsområde 2500 pm 2 i varje bild för statistisk analys, förblindade för experimentella grupper. Beräkna det genomsnittliga antalet från 10 bilder av varje prov med hjälp av automatisk mätning funktion "Object Count". Inställningar för vastus later muskeln är: Threshold L = 10, H = 200; 2X släta; 1X ren, och inställningar för hjärnan frontala cortex är: Threshold L = 11, H = 200; 2X släta; 1X ren.

6. Western blot-analys på Autophagy Markörer

  1. <strong> Tissue process
    1. Förbered lysbuffert: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; proteashämmare och fosfatas-inhibitor (färskt tillsatt).
    2. Avlägsna vävnaden hos C57BL / 6-möss från -80 ° C lagring. Skär muskelvävnaden i små bitar med ett rakblad före följande process. Tillsätt 800 | il (för hemi-hjärna) eller 500 | il (för vastus lateralis) kallt lysbuffert till provet. Homogenisera provet vid 4 ° C med en homogenisator vid en medelhög hastighet.
    3. Fullständigt lysera den homogeniserade blandningen under ytterligare 30 minuter till 1 timme vid 4 ° C med rotation.
    4. Centrifugera ner homogenatet vid 12.000 xg under 10 min vid 4 ° C, kassera pellet, och samla supernatanten i ett nytt rör.
  2. autophagy analys
    1. Bestämma proteinkoncentration av vävnads lysat med användning av BCA Protein-analyskitet enligt tillverkarens specifikationer. Normalisera varje provtill samma koncentration.
    2. Kombinera provet med provbuffert 2x Laemmli vid ett 1: 1-förhållande, koka den vid 95 ° C under 5 - 10 min, och gå vidare med western blot-analys på autophagy markörer 13, 14, såsom p62 (anti-p62-antikroppen, 1: 500 utspädning) och LC3 (anti-LC3 antikropp, 1: 500 utspädning). Koka proverna omedelbart efter tillsats av provbuffert, som längre inkubation på is kan generera flera nedbrutna band av LC3.
    3. Kvantifiera P62 och LC3 band genom densitometri analys med ImageJ, och normalisera värdet till motsvarande aktin-bandet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver två olika metoder för att inducera autophagy i mus vävnader genom aerob träning: totalt 90 min tvångs motion på en flerfiliga löpband föregås av två dagars acklimatisering; eller två veckors frivillig övning på en löphjul som används av enkel inrymt möss. I varje övningsprotokollet, kan vi mäta autophagy flödet genom fluorescensmikroskopi och western blot-analys i olika organ.

Vi använde en transgen mus som uttrycker GFP-märkta LC3 som reporter för att övervaka autophagy av motion 1. Upon autophagy induktion, translokerar LC3 från cytosolen till autophagosome i punktuell strukturer. Efter snitt, kan bildandet av GFP-LC3 puncta visualiseras direkt genom fluorescensmikroskopi (figur 1A). Alternativt kan autophagosome strukturer också immun av en LC3 antikropp föravbildning. Antingen 90 min av löpband motion eller 2 veckor av frivillig löpning ökat antalet GFP-LC3 puncta i både skelettmuskel (vastus lateralis) och cerebral cortex, jämfört med vilotillstånd (Figur 1B). Det bör noteras att den frontala cortex regionen har varit den stora regionen i hjärnan där autophagy är tydligt induceras av endera metoden hittills. Ansträngningsutlöst också omvandlingen av LC3 från cytosoliska formen (LC3-I) till lipiden-konjugerad form (LC3-II), som kan detekteras genom Western blot-analys (Figur 1C).

Ansträngningsutlöst ökning av autophagosomes (representeras av LC3-II och GFP-LC3 puncta) beror på en förhöjd autophagic flöde, snarare än ett block i autophagosome nedbrytning, bedömas av användning av hämmare av lysosomal nedbrytning, såsom bafilomycin A1 eller klorokin . Här har vi mätte nedbrytning av autophagic last receptorn p62 som en exriklig. Träning (90 min av löpbandet) orsakade en högre nedbrytning av p62 i skelettmuskel än vilotillstånd, som räddades genom injektion med klorokin före träning (Figur 2). Liknande resultat observeras också med frivillig träning genom att köra hjul. Således, aerob träning av löpband eller löphjulen inducerar autophagy in vivo, mätt med steady-state nivå LC3 och nedbrytningen av p62.

Figur 1
Figur 1. aerob träning inducerar Autophagy i musvävnader. Representativa bilder (A) och kvantifiering (B) av GFP-LC3 puncta i skelettmuskel (vastus lateralis) och hjärna (frontala cortex) av GFP-LC3 transgena möss under kontroll tillstånd (vilande), efter 90 minuter av tvångs träning (löpband ) eller efter 2 veckor av frivillig motion (hjul). Resultats representerar medelvärde ± SEM av 10 bilder per mus. N = 5 möss. Följande emissionsvåglängder användes: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) Western blot detektering av LC3 i skelettmuskel (vastus lateralis) från utvilad och utövas (av löpbandet) möss. Kvantifiering data representerar nivån av LC3-II normaliserat till aktin (vänster), och förhållandet mellan LC3-II till LC3-I (höger). N = 3 möss. Statistik är att jämföra varje värde till kontrollprovet. Resultaten representerar medelvärde ± sem *, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001, t-test. Skalstock, 25 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Motion Ökar Autophagy Flux i mus skelettmuskulatur. (A) Western blotdetektering av p62 i vastus lateralis från utvilade och utövas möss i närvaro eller frånvaro av den lysosomala inhibitorer klorokin. (B) (vänster) Kvantifiering analys av p62 normaliserades till motsvarande aktin band. (Höger) p62 flödet bestäms genom att subtrahera normaliserade densitometriska värdet av PBS-behandlade p62 från den hos klorokin behandlade P62. Resultaten representerar medelvärde ± sem n = 3 möss. *, P <0,05, t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Autophagy är en katabolisk process som ger energi och minskar cytotoxicitet genom lysosomal nedbrytning av cytoplasma komponenter eller skadade organeller. Studerar autophagy är viktigt att förstå regleringen av cellulär homeostas och mekanismerna för stressrespons. Nya modeller och metoder växer fram inom forskningsområdet 15, för att studera hur nedsatt autophagy bidrar till många patologiska processer 16, 17.

Näringsämne deprivation (svält) och farmakologisk induktion är allmänt använda metoder för att inducera autophagy in vitro och in vivo. Dessa metoder, särskilt för djurmodeller, kan visa negativa effekter som kan påverka de övergripande resultaten. Till exempel, eftersom det krävs minst 48 timmar av svält för att inducera en detekterbar nivå av autophagy, djuren får inte ha energi som behövs för regelbunden motorisk aktivitet, vilketpåverkar resultatet av många efterföljande beteendestudier. Ändå farmakologiska inducerare kan också leda till biverkningar på grund av deras brist på specificitet till autophagy vägen. Den stora autophagy inducerar rapamycin och dess derivat trycka mTOR-aktivitet och orsaka metabolisk dysfunktion och immunosuppression 18, 19, 20, som bör beaktas i den experimentella designen för långtidsbehandling. Därför har vi arbetat med flera fysiologiska och robusta sätt för autophagy aktivering i djurmodeller.

Nyligen vi och andra har identifierat motion som en effektiv, snabbare och säkrare autophagy inducerar in vivo 7, 8, 9. Både tvingas utöva löpband och frivillig träning genom att köra hjulet har använts för att analysera effekterna av träning på autophagy enctivation, med variationer i träningstid och intensitet 21, 22. Till exempel, en timmes löpband igång (start vid en hastighet av 10 m / min till ett maximum av 40 m / min) inducerar riklig LC3 lipidering i skelettmuskel 21, och på längre sikt frivillig hjul kör för 3 månader eller 4 - 5 veckor ökar också basal autophagy och förbättrar uttrycket av autophagy proteiner i skelettmuskel 21, 22.

Här har vi beskrivit och jämfört de två metoderna (löpband och löphjul) att utöva möss, och presenterade optimerad kortare protokoll med hög effektivitet i autophagy induktion. Varje metod har fördelar och nackdelar. En enda bout av 90 min av påtvingad träning på löpband är tillräcklig för att inducera autophagy i skelettmuskulatur och hjärna. Vi har gjort ett tidsförlopp för löpband motion 7, och fann att exerciSE villkor som beskrivs här inducera maximal nivå av autophagy i mus skelettmuskel, som även valideras av andra 23. Under dessa förhållanden, möss genomgår aerob träning; som tidigare rapporterats, är aerob träning induceras vid långvarig kör med gradvisa ökningar i hastigheter på ett löpband 24, 25, 26, medan den anaeroba tillstånd erhålls genom en kortvarig hög intensitet, vilket ökar muskelmassan men inte nödvändigtvis öka motion uthållighet 27, 28. Dessutom löphastigheten redovisas här i detta protokoll korrelerar positivt med syre förbrukning genom indirekta metoder för att bedöma den aeroba kapaciteten 29. Därför aerob träning på ett löpband är ett snabbt och effektivt sätt att framkalla autophagy.

Emellertid iska kraftered körs i ett slutet utrymme kan utöva stress möss. Således, för att undvika att ytterligare stress för djuren, använder vi finger knuffar eller tråd tofsar som en metod för att hålla möss igång, i stället för den inbyggda elektriska stötar. Jämfört med löpbandet, användningen av löphjul har många fördelar. Det är mindre stressande, inte kräver forskarnas observationstid, och är bekvämt att studera långsiktiga effekter av autophagy aktivering. Ändå övning på en löphjul är frivillig och därmed genererar variabilitet när det gäller att köra avstånd och hastighet mellan olika möss eller samma mus på olika dagar. Därför är det nödvändigt att köra möss på ett hjul under en längre tidsperiod (t.ex. flera veckor) för att minimera den individuella variabiliteten. Viktigare, det tillvägagångssätt kräver också användning av en vägmätare på natten för att kontrollera att musen faktiskt är igång. Mätte vi den genomsnittliga körsträckan av vildtyp C57BL / 6-möss under en period av 2 veckor, och fann att de kör approxiändan en km / natt i början av utbildningen (dag 1) och kan köras upp till 8-10 km / dag vid dag 14. Totalt sett är löphjul en effektiv metod för att stimulera autophagy i de flesta organ, även om det är svårare att fånga autophagosome ackumulering i skelettmuskeln jämfört med att använda löpbandet. Anledningen är att skelettmuskulaturen har en hög autophagic flöde och en hastighet snabb autophagosome nedbrytning, som kräver omedelbar vävnad skörd efter att ha kört för att detektera autophagy induktion genom GFP-LC3 puncta mätning. I båda protokoll, snabb PFA perfusion och fixering av vävnader efter avlivning är ett kritiskt steg i proceduren för att bevara de autophagosome strukturer som annars bryts ned lätt under dissekering.

Detta protokoll visar hur man använder aerob träning för att stimulera autophagy i mus vävnader, inklusive hjärnan och skelettmuskulatur. Dessa metoder kan användas för att studera mekanismerna i autophagy reaktionsvägen i mnderhåll av vävnadsfunktion, såsom mitokondriella underhåll 23, och att studera de långsiktiga effekterna av autophagy induktion om reglering av beteende och hälsa djursjukdomsmodeller, såsom att förbättra de smärtstillande effekterna av cannabinoider 9. Både löpband och löphjul metoder framkalla en god nivå av autophagy; men det är viktigt att ta hänsyn sina meningsskiljaktigheter när man väljer det bästa sättet att möta olika forskningsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Treadmill Columbus Instruments 150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel Super Pet 100079365 diameter 11.4 cm
Odometer Bell DASHBOARD 100
Syringe pump KD Scientific KDS100
Fluorescence microscope Nikon Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat Leica CM 1850UV
Homogenizer IKA 003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine CAYMAN CHEMICAL COMPANY 14194
Parafolmaldehye SIGMA-ALDRICH P6148 Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.
Mounting media Vector Laboratories H-1200
p62 antibody BD Biosciences 610833
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad Laboratories 161-0737
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
  2. Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
  3. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  4. Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
  5. Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
  6. Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
  7. He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
  8. He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
  9. Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
  10. Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
  11. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
  12. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  14. Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
  15. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
  16. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  17. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  18. Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
  19. Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
  20. Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
  21. Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
  22. Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
  23. Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
  24. Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
  25. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
  26. Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
  27. Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
  28. Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
  29. Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).

Tags

Cellbiologi autophagy motion LC3 hjärna muskler klorokin mikroskopi mus
Aktivera Autophagy av aerob träning hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rocchi, A., He, C. ActivatingMore

Rocchi, A., He, C. Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice. J. Vis. Exp. (120), e55099, doi:10.3791/55099 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter