Summary
Otofaji aktivasyonu çeşitli hastalıkların önlenmesinde yararlıdır. Fizyolojik yaklaşımlardan biri in vivo otofaji fiziksel egzersiz teşvik etmek. Burada aerobik egzersiz ile Otofaji etkinleştirmek ve farelerde otofaji düzeylerini ölçmek için nasıl gösterir.
Introduction
Otofaji örneğin açlık ve hipoksi, 1, 2 gibi çeşitli stres koşullarına karşılık olarak indüklenir evrimsel olarak korunmuş bir parçalanma yolu vardır. Otofaji sırasında, çift zar kabarcıklar, gereksiz veya hasarlı hücre içi bileşenleri birleştirmek ve bozulması 3 lizozomlar içine taşımak, autophagosomes çağırdı. Bazal Otofaji nörodejenerasyon, tümör oluşumu ve tip 2 diyabet 4, 5, 6 dahil olmak üzere birçok hastalıkta implike olduğu hücresel fonksiyon ve organizmanın gelişimi, ve bozulmuş bazal Otofaji için gereklidir.
En iyi bilinen fizyolojik otofaji indükleyici açlık olduğunu. Bununla birlikte, iki önemli kısıtlamalara sahiptir. İlk olarak, açlık, örneğin, etkili hayvanlarda Otofaji uyarılması için farelerde besin yasaklaması 48 saat uzun sürdüğüEn organlarda. İkincisi, açlık zorlukla nedeniyle beyinde göreli olarak istikrarlı bir besin kaynağı, beyin Otofaji neden olur. Aslında, birçok ilaç, kan beyin bariyerini geçemez olarak, küçük moleküllü indüklecilerle otofaji indüksiyon tespit etmek de zordur. Bu nedenle, daha iyi bir hastalığın patogenezinde Otofaji aktivasyon fonksiyonunu analiz etmek için, en son egzersiz süresi 7, 8, 9, kısa bir süre içinde Otofaji uyarılması için daha güçlü bir fizyolojik bir yöntem olduğu keşfedilmiştir. açlık ile karşılaştırıldığında, otofaji etkili bir koşu bandı hızlı 30 olarak dakika çalıştırarak indüklenir. Böylece, egzersiz sağlık yararları aracılık ve hastalıkların önlenmesinde otofaji mekanizmasını incelemek için kullanışlı ve güçlü fizyolojik bir yaklaşımdır.
LC3 ve P62 dahil olmak üzere, Otofaji aktivitesinin tespit edilmesi için, bir çok protein işaretleri vardır. LC3 (mikrotübül ilişkili protein 1A / 1B-ışık cHain 3) Bir hücre sıvısı protein (IS LC3 I Otofaji indüksiyondan sonra PE (fosfatidiletanolamin) konjüge edilmiş olduğu) oluşturur. PE-lipide LC3 (LC3 II formu) autophagosomal zarları üzerine işe ve GFP ile işaretlenerek autophagosomes görselleştirmek için kullanılabilmektedir. mikroskopta autophagosomes yapılarını noktalı yanına sitosolden translokasyonu Otofaji indüksiyon gösterir. P62 (örneğin, ubikitinasyon proteinleri gibi) Otofaji yüzeyler için bir kargo reseptördür ve de autophagosomes dahil edilir. Protein autophagosomes birlikte lizozomların parçalanır yana, seviyeleri otofaji akının ölçülmesi için kullanılabilir. Burada zorunlu egzersiz (koşu bandı) ve gönüllü egzersiz (tekerlekler çalıştıran) de dahil olmak üzere aerobik egzersiz, tarafından uyarılan farklı fare dokularda Otofaji ölçmek için bu işaretçileri nasıl kullanılacağını gösterir. Aynı prosedürler, diğer indükleyicilerin tedaviden sonra Otofaji in vivo ölçümü uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvanları da içeren tüm işlemleri Northwestern University Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan kurallara göre gerçekleştirilmiştir.
1. Fare Modelleri
- egzersiz 8-12 haftalık fareler kullanın. In vivo olarak, egzersiz kaynaklı Otofaji tespit etmek için, görüntüleme çalışmaları ve biyokimyasal analizler için C57BL / 6 fareleri için GFP LC3 transgenik fareler (C57BL / 6 plan) kullanın.
2. Egzersiz kaynaklı Otofaji
- Koşu bandı kurulumu - zorla egzersiz
- ACCLIMATE ve 2 gün boyunca 10 ° yokuş yukarı açık koşu bandı üzerinde fareler eğitmek. 1. günde, 5 dakika boyunca fareler egzersiz 8 m / dakika ve 2 gün, 10 m başka bir 5 dakika, ardından 8 m / dakika, 5 dakika boyunca fareler egzersiz / 10 dak. hafif el dürtmek tarafından işletilen fareler teşvik edin.
- 3. günde, fareler 10 ° yokuş yukarı bandı, starti 90 dakika boyunca çalışan tek bir nöbeti maruz izin10 m / dak hızında ng. 40 dakika sonra, 30 dakikalık bir toplam 1 m / dakika, her 10 dk bir oranda bandı hızını artırmak, ve bundan sonra da bir oranda hızını artırmak, 1 m / varıncaya kadar her 5 dakikada en az 17 m / dak, egzersiz süresi 90 dakika ve mesafe çalışan 1.070 metre olmak üzere toplam.
- düşük yoğunluklu aralığında (1.2 Hz) elektrik uyaran ayarlayın ve tekrarlanan ayak çarpmasını önlemek için çalıştırmak için fareler ediyoruz.
- Doku toplanması için, egzersizden hemen sonra servikal dislokasyon tarafından takip izofluran inhalasyon yoluyla fareler, euthanize. Diğer kabul ötenazi yöntemleri aynı zamanda, CO2 ve diğer anestetikler IP enjeksiyon kullanılabilir. otofaji düzeyi ötanazi yöntemleri etkilenecek görünmüyor.
- Koşu tekerlek ayarı - istemli egzersiz
- tek ev sahipliği fare ile bir kafes içinde bir fare çalışan tekerleğini (11,4 cm çap) yerleştirin.
- Bir bisiklet kilometre sayacı kullanarak çalışan kapasitesini doğrulayın.358 de [tekerleğin tam dönme başına (mm) mesafesini] tekerlekli parametresini ayarlayın (11,4 * π). 24 saat sonra koşu mesafeyi ölçün.
- Fare koşu tekerleği ile 2 hafta boyunca gönüllü çalıştıralım. Doku toplanması için, çalışma sonrası sabah fare kurban.
3. Otofaji Akı Değerlendirilmesi
- istirahat ve egzersiz koşulları altında otofajik akının ölçülmesi için, üç gün boyunca Otofaji önleyicisi klorokin ile fareler tedavi etmek ve PBS ile tedavi edilen farelere karşılaştırın.
- PBS (5 mg / ml) içinde çözülür klorokin ve karın içinden arka arkaya üç gün boyunca 50 mg / kg / gün dozunda farelere chloroquine enjekte edilir. fareler Kurban ve son enjeksiyondan sonra dokular 3 saat toplamak.
- icra fareler için, 50 mg / kg / gün arasında bir dozda birbirini takip eden iki gün klorokin ile ön muamele. Üçüncü gün, sonra, klorokin aynı konsantrasyonda farelere enjekte ve90 dakika onları başka bir 90 dakika koşu bandı üzerinde çalışmasına izin verin.
- servikal dislokasyon tarafından takip izofluran inhalasyon yoluyla fareler, Euthanize. klorokin toplam inkübasyon süresi kontrolü (dinlenme) farelerde (3 saat) aynı şekilde, hemen çalıştırdıktan sonra dokuların toplayın.
NOT: Alternatif olarak, fare dokularda otofaji akı belirlemek için klorokin tek bir enjeksiyon kullanın.
4. Doku Hasat ve Fiksasyon
- 7.4 bir son pH PBS: doku hasat öncesi fosfat tamponlu salin (PBS) ve taze% 4 paraformaldehid (gerekli kişisel koruma araçları PFA, DİKKAT) hazırlanması. 4 ° C 'de, her iki çözüm saklayın.
- (GFP LC3 fareler için)% 4 PFA, 20 ml - 15 30 ml şırınga doldurun. 20 G kateter iğne ile şırınga bağlayın.
- Egzersiz sonrasında servikal dislokasyon ardından izofluran inhalasyon yoluyla fareler euthanize.
- kendi ba temiz bir çalışma yüzeyine hayvan yerleştirinck. Kesme ve kalp maruz diyaframın keserek göğüs boşluğu açın.
- Akciğer ve karaciğer tamamen soluk açana kadar, kan çıkıp izin karaciğer üzerinde küçük bir kesi yapmak ve kateter yoluyla kalbin sağ ventrikül içine yavaş yavaş 15 ml% 4 PFA toplam enjekte edilir. / Saat 90 ml sabit bir akış oranı ile bir şırınga pompası kullanılarak, idman oturumu hemen sonra fare serpmek.
- Perfüzyon sonra, iğne kaldırmak ve ilgi dokular (örneğin beyin 11 ve iskelet kası) toplamak. iskelet kası için, vastus lateralis teşrih. Kısaca, kuadriseps lokalize, kasları ortaya çıkarmak için geriye doğru bacağın cilt çekin 12 femoris ve femur kemiğinin üst kısmına takılan harici kas Vastus lateralis, teşrih.
- Daha fazla tespit ve dehidrasyon için, 4 ° C'de 24 saat süreyle% 4 PFA GFP LC3 farelerin dokuları yerleştirin ve sonra% 15 aktarmak4 ° C 'de sükroz PBS gece boyunca veya dokuları çökene kadar, ve daha sonra gece boyunca 4 ° C'de% 30 sukroz-PBS ya da daha uzun süre depolama için. onlar güçlü ışığa duyarlı olabileceği gibi mümkün olduğunca karanlık örnekleri tutun.
- Western blot analizi için sıvı azot içinde doğrudan C57BL / 6 farelerinden alınan doku dondurma, ve -80 ° C'de saklayın oturur.
GFP-LC3 puncta 5. Görüntü Analizi
- doku süreci
- Bu etiketlenmiş bir küçük bir petri birkaç dakika "optimal kesme ısısı bileşiği" (OCT) halinde gömme orta dokular (daha önce PFA sabit ve% 30 sukroz içinde saklanan) ön-muamele.
- doku karşılamak için yeterli taze OCT içeren etiketli cryomold doku aktarın. Orient cryomold altına doğru kesit yüzeyi (vastus için kesitte hemi-beyin için kas ve sagital bölümü lateralis). kabarcıkların oluşumunu önlemek.
- freEkim beyaza dönene kadar, kuru buz dolu bir kapalı köpük soğutucu bir kaç dakika cryomold koyarak örnekleri Eze. Etiketli folyo bireysel örnekleri sarın bir plastik torba içinde üzerleri mühürlenir, -80 ° C gecede veya daha uzun saklayın.
- slaytlar üzerinde bölümleri, 10 um kadar bir kalınlıkta Örnek bölümleri kesilmiş ve monte etmek için bir kriyostat kullanarak. -20 ° C'de slaytlar Mağaza ve her zaman mümkün olduğunca ışıktan uzak slaytlar tutun.
- slayt hazırlama
- dondurucu slaytları çıkarın ve oda sıcaklığında onları Çözülme. DAPI ile medya montaj bir damla doku bölümü kapsamaktadır. en uygun büyüklükte bir lamel yerleştirin ve kabarcık oluşumunu önlemek.
- , Lameller kenarları mühür oje, oda sıcaklığında karanlıkta kurumasını bekleyin ve sonra 4 ° C'de bir ışık geçirmez bir kapta slaytlar saklamak veya GFP-LC3 puncta görüntüleme yakalama devam etmek oje kullanın.
- <GFP strong> miktar tayini - floresan mikroskop ile LC3 puncta
- Bütün numuneler için aynı durumda resim (pozlama ve ayarları) yakalayan Epifloresans mikroskopi gerçekleştirin. GFP için, 525 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanımı; DAPI için, 490 nm kullanımı. vastus lateralis bir 60x objektif ve beynin ön korteks bölgesini kullanarak örnek başına en az on görüntüler elde.
- Deney grupları için kör istatistiksel analiz için her görüntüde 2.500 mikron 2 bir doku alanı, GFP-LC3 puncta sayısını ölçmek. "Nesne Sayma" otomatik ölçüm fonksiyonunu kullanarak, her numunenin 10 görüntüleri ortalama sayısını hesaplayın. vastus için Ayarlar kas vardır lateralis: Eşik L = 10, H = 200; 2X pürüzsüz; 1X, temiz ve beyin frontal korteks için ayarları şunlardır: Eşik L = 11, H = 200; 2X pürüzsüz; 1X temiz.
Otofaji Belirteçleri 6. Western Blot Analizi
- <strong> Doku süreci
- liziz tamponu: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCI; 1 mM EDTA; % 1 Triton X-100; Proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörleri (taze ilave edildi).
- C Depolama -80 ° den C57BL / 6 farelerinin doku çıkarın. aşağıdaki işlem öncesinde bir jilet ile küçük parçalar halinde kas dokusu kesilir. (Hemi-beyin için) 800 ul veya numune soğuk lizis tamponu (vastus lateralis için) 500 ul ekleyin. Orta hızda bir homojenizatör ile 4 ° C sıcaklıkta örnek homojenize edilir.
- Tam rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat kadar 30 dakika daha homojenleştirilir karışımı lize.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 xg'de Homojenat Spin pelet atın ve yeni bir tüp içinde supernatant toplamak.
- otofaji analizi
- üreticinin talimatlarına uygun olarak BCA protein tahlil kiti kullanılarak doku lysate'lerin protein konsantrasyonu belirlenir. Her bir örnek normalizeAynı konsantrasyona seyreltildi.
- Bir 1 2x Laemmli numune tampon maddesi ile örnek birleştirin: 1 oranında, 5 95 ° C 'de kaynatın - 10 dakika, ve P62 (anti-P62 antikoru gibi, Otofaji Batı benek analizi 14, 13 işaretleri ile devam edin 1: 500 seyreltme) ve LC3 (anti-LC3 antikoru, 1: 500 seyreltme). Buz üzerinde daha uzun kuluçka LC3 birden fazla bozulmuş bantları oluşturur edilebilir hemen örnek tamponu ilave edildikten sonra numune kaynatılır.
- ImageJ kullanarak dansitometre analizi yolu ile P62 ve LC3 bantları sayısal olarak ve ilgili aktin bandının değer normalize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol aerobik egzersiz fare dokularda Otofaji ikna etmek için iki farklı yöntem açıklanır: aklimasyonundan iki gün ilerledi çok şeritli koşu bandı üzerinde zorunlu egzersiz 90 dakika olmak üzere toplam; veya tek ev sahipliği fareler tarafından kullanılan bir koşu tekerlek üzerinde gönüllü egzersiz iki hafta. Her seri protokol, çeşitli organlarda, flüoresans mikroskopisi ve Western blot analizi ile Otofaji akı ölçebilir.
Bu egzersiz 1 ile Otofaji izlemek için bir raportör sistem olarak GFP etiketli LC3 eksprese eden bir transgenik fare hattı kullanılmıştır. Otofaji indüksiyonu üzerine, LC3 noktalı yapılarda autophagosome yanına sitosolden translocates. Kesit sonra, GFP-LC3 puncta oluşumu doğrudan floresan mikroskobu (Şekil 1A) tarafından görüntülenmiştir olabilir. Seçenek olarak ise, autophagosome yapılar için bir LC3 antikoru ile boyanmış olabilirgörüntüleme. Ya koşu bandı egzersiz 90 dakika ya da gönüllü çalışan 2 hafta dinlenme durumuna (Şekil 1B) ile karşılaştırıldığında, her iki iskelet kası (vastus lateralis) ve serebral korteks GFP-LC3 puncta sayısı arttı. Frontal korteks bölgesi Otofaji şimdiye kadar net olarak iki yöntemle de indüklenir beynindeki temel bölge olmuştur unutulmamalıdır. Egzersiz western blot analizi (Şekil 1C) ile tespit edilebilir lipid konjüge edilmiş formda (LC3-II) 'sitosolik formu (LC3-I) ile ilgili LC3 dönüşümünü arttırmaktadır.
(LC3-II ve GFP-LC3 puncta ile temsil edilen) autophagosomes Egzersiz kaynaklı artışı oldukça örneğin bafilomisin A1 veya klorokin gibi lizozomal bozulma inhibitörlerinin kullanımı ile değerlendirildi autophagosome bozulması bir blok, daha yüksek bir otofajik akı nedeniyle . Burada bir eski olarak otofajik kargo reseptör P62 parçalanmasını ölçülenbol. Egzersiz (bandının 90 dakika) (Şekil 2) egzersiz önce klorokin ile enjeksiyon ile kurtarıldı dinlenme durumuna göre daha iskelet kasında P62 daha yüksek bir kötüleşmesine yol açar. Benzer sonuçlar, aynı zamanda tekerlekleri çalıştırarak gönüllü egzersiz ile gözlenir. Böylece, koşu bandı veya çalışan tekerlekler tarafından aerobik egzersiz LC3 kararlı devlet düzeyinde ve P62 bozulması ile ölçülen in vivo Otofaji, neden olur.
Figürün 1. Aerobik Egzersiz Fare Dokularda Autophagy İndükler. Örnek görüntüler (A) ve iskelet kasında GFP LC3 puncta ölçümü (B) (vastus lateralis) ve kontrol koşulunda (dinlenme) altında GFP-LC3 transgenik farelerin beyin (frontal korteks), zorunlu egzersiz 90 dakika (yürüme bandı sonra ) ya da gönüllü egzersiz (tekerlek) 2 hafta sonra. Sonuçs fare başına 10 resim ± sem ortalama temsil etmektedir. K = 5 fare. Aşağıdaki emisyon dalga boyları kullanılmıştır: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. Dinlenmiş ve (yürüme bandı) tarafından uygulanan farelerden (C), iskelet kası (vastus lateralis) 'de LC3 Western blot algılama. Niceleme verileri LC3-II 'nin düzeyi aktin (sol) ve (sağ)-I LC3 LC3-II' nin oranı normalize temsil etmektedir. N = 3 fare. İstatistik kontrol örneği her değer karşılaştırarak olduğunu. Sonuçlar ± sem *, P <0.05 ortalama temsil eder; ** P <0.01; *** P <0.001, t-testi. Ölçek çubuğu, 25 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Egzersiz Fare İskelet Kası içinde Autophagy Flux artırır. (A), Western blotlızozomal inhibitörleri klorokin varlığında veya yokluğunda dinlenmiş ve icra farelerden vastus lateralis içinde P62 tespiti. (B) ilgili aktin bandının normalize P62 (Sol) Kantitasyonu analizi. (Sağ) P62 akı klorokin'e muamele P62, de PBS ile tedavi edilmiş P62 arasında normalize edilen dansitometrik değeri çıkarılarak belirlenir. Sonuçlar ± sem N = 3 fareler ortalama temsil etmektedir. * P <0.05, t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Otofaji enerji sağlar ve sitoplazma bileşenleri veya zarar görmüş organellerin lizozomal degradasyonu ile sitotoksisitesini azaltır katabolik işlemdir. Otofaji incelenmesi hücresel homeostazının düzenlenmesi ve stres yanıtı mekanizmalarını anlamak için önemlidir. Yeni modeller ve yöntemler çok sayıda patolojik süreçler 16, 17 nasıl katkı bozulmuş otofaji incelemek için, araştırma alanında 15 ortaya çıkıyor.
Besin yoksunluğu (açlık) ve farmakolojik indüksiyon yaygın in vitro ve in vivo olarak Otofaji uyarılması için yaklaşımlar kullanılır. özellikle hayvan modellerinde bu yöntemler, genel sonuçları etkileyebilecek yan etkilere sahip olur. Bu açlık en az 48 saat gerektirdiği Örneğin Otofaji bir seviyede, indükleme, hayvanlar, enerji normal motor aktivitesi için gerekli olabilir kiBirçok sonraki davranışsal çalışmaların sonucunu etkiler. Ancak farmakolojik indükleyiciler da bağlı Otofaji yoluna Spesifite eksikliği yan etkilere neden olabilir. Ana Otofaji indükleyici rapamisin ve onun türevleri mTOR aktivitesi bastırmak ve uzun süreli tedavisinde deney tasarımında dikkate alınmalıdır metabolik disfonksiyon ve bağışıklık 18, 19, 20, yol açar. Böylece, hayvan modellerinde otofaji aktivasyonu için daha fizyolojik ve sağlam yollar üzerinde çalışıyoruz.
Olarak son biz ve diğerleri belirledik egzersiz etkili, hızlı ve güvenli otofaji indükleyici in vivo 7, 8, 9. tekerleği çalıştırarak koşu bandı ve gönüllü egzersiz hem zorunlu egzersiz otofaji a egzersizin etkilerini analiz etmek için kullanılmaktadırctivation, idman süresi ve yoğunluğu 21, 22 farkları olabilir. 5 hafta - Örneğin, bandının bir saat çalışan (40 m / dakikalık bir maksimum 10 m / dk hızda başlayan) 3 ay ya da 4 çalışan iskelet kası 21 bol LC3 lipidasyon ve daha uzun süreli gönüllü tekerlek indükler bazal otofaji arttırır ve iskelet kası 21, 22 otofaji proteinlerinin ekspresyonunu arttırır.
Burada anlatılan ve fareler egzersiz iki yöntem (koşu bandı ve koşu tekerlek) karşılaştırıldığında, ve otofaji indüksiyon yüksek verimlilik ile daha kısa protokolleri optimize sundu. Her yaklaşım artıları ve eksileri vardır. bandı üzerinde zorunlu egzersiz 90 dakika tek bir nöbeti, iskelet kası ve beyinde Otofaji uyarılması için yeterli olmaktadır. Bu bandı egzersiz 7'nin bir zaman süreci yapılır ve Exerci bulmuşlardırBurada anlatılan se koşullar da başkaları 23 tarafından doğrulandıktan fare iskelet kasında, içinde otofaji maksimal seviyesine neden olur. Bu koşullar altında, farenin aerobik egzersiz tabi; Daha önce bildirildiği gibi anaerobik koşul kas kütlesi artar ama mutlaka egzersiz geliştirmek değil yüksek yoğunluklu egzersiz kısa bir süre, elde edilen ise, aerobik egzersiz, uzun bir koşu bandı 24, 25, 26 hızlarda kademeli artışlar ile çalışıyor indüklenir dayanıklılık 27, 28. Ayrıca, bu protokolde Burada bildirilen çalışma hızı pozitif aerobik kapasiteyi 29 değerlendirmek için dolaylı yöntemlerle, oksijen tüketim kapasitesi ile ilişkilidir. Bu nedenle, bir koşu bandı üzerinde aerobik egzersiz Otofaji ikna etmek için hızlı ve etkili bir yoldur.
Bununla birlikte, forced farelere stres yaratması halinde kapalı bir alanda çalışan. Böylece, hayvanlara ek stres vermekten kaçınmak için, biz yerine, çalışan fareler tutmak için bir yöntem olarak parmak titreşim veya tel püsküllü kullanmak yerleşik elektrik çarpması. koşu bandı ile karşılaştırıldığında, koşu çarkının kullanılması pek çok avantajı vardır. Bu, daha az stresli araştırmacıların gözlem süresi gerektirmez ve otofaji aktivasyonunun uzun vadeli etkilerini incelemek için uygundur. Oysa dönen bir tekerlek üzerinde egzersiz gönüllüdür ve böylece farklı fareler ya da farklı günlerde aynı fare arasında mesafe ve hız çalışan açısından değişkenlik oluşturur. Bu nedenle, tek tek değişkenliği en aza indirmek için zaman (örneğin, bir kaç hafta) uzun bir süre için bir tekerlek fareler çalıştırmak için gereklidir. Daha da önemlisi, yaklaşım aynı zamanda fare aslında çalıştığını doğrulamak için geceleri bir kilometre sayacı kullanarak gerektirir. 2 hafta arasında bir süre boyunca, vahşi tip C57BL / 6 farelerinin ortalama çalışma mesafesinde ölçülmüş, ve approxi çalıştırmak bulundukalıntılarından 1 km / eğitim yılı başında gece (gün 1) ve 8 kadar çalışabilir - 14. Genel günde 10 km / gece, zor olmasına rağmen, çalışan tekerlek, çoğu organda Otofaji uyarmak için etkili bir yöntemdir koşu bandını kullanmaya kıyasla iskelet kasında autophagosome birikimi yakalamak için. nedeni, iskelet kası, yüksek otofajik akı ve GFP-LC3 puncta ölçümü ile Otofaji indüksiyon tespit etmek için çalışan hemen sonra, doku hasat gerektiren hızlı autophagosome degradasyon oranı sahip olmasıdır. Hayvan ötenazi sonra dokuların iki protokolü, hızlı PFA perfüzyon ve fiksasyonu aksi kolayca diseksiyon sırasında bozulmuş olan autophagosome yapıları korumak için prosedürün kritik bir adımdır.
Bu protokol beyin ve iskelet kası da dahil olmak üzere fare dokularda Otofaji uyarmak için aerobik egzersiz için nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntemler, m Otofaji yolunun mekanizmaları incelemek için kullanılabilirBöyle mitokondriyal bakım 23 gibi doku fonksiyonunun aintenance ve bu kannabinoidlerin 9 analjezik etkilerini artırıcı olarak hayvan hastalık modelleri, davranış ve sağlık kuruluşuna ilişkin otofaji indüksiyon uzun vadeli etkilerini incelemek için. Hem koşu bandı ve çalışan tekerlek yöntemleri otofaji iyi düzeyde teşvik; henüz farklı araştırma hedeflerine ulaşmak için en iyi yaklaşım seçerken aralarındaki farklılıkları dikkate almak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
