Summary
activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones.
Introduction
La autofagia es una vía de degradación evolutivamente conservado, que se induce en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como el hambre y la hipoxia 1, 2. Durante la autofagia, las vesículas de doble membrana, llamados autofagosomas, incorporan componentes subcelulares innecesarias o dañadas y los transportan hacia los lisosomas para la degradación 3. Autofagia basal es esencial para la función celular y el desarrollo organismo, y alteración de la autofagia basal está implicado en muchos trastornos, incluyendo neurodegeneración, la tumorigénesis y la diabetes 4, 5, 6 tipo 2.
El más conocido inductor de la autofagia fisiológica es el hambre. Sin embargo, tiene dos limitaciones importantes. En primer lugar, el hambre toma un largo período de inducir la autofagia con eficacia en animales, por ejemplo, 48 horas de restricción de alimentos en ratonesen la mayoría de órganos. En segundo lugar, el hambre apenas induce la autofagia cerebro, debido a un suministro de nutrientes relativamente estable en el cerebro. De hecho, también es difícil de detectar la inducción de la autofagia por inductores de molécula pequeña, como muchos fármacos no pueden pasar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, para analizar mejor la función de activación de la autofagia en la patogénesis de enfermedades, recientemente hemos descubierto que el ejercicio es un método fisiológico más potente para inducir la autofagia en un corto período de tiempo 7, 8, 9. En comparación con el hambre, la autofagia se induce de manera efectiva mediante la ejecución de cinta de correr tan rápido como 30 minutos. Por lo tanto, el ejercicio es un enfoque fisiológico conveniente y potente para estudiar el mecanismo de la autofagia en la mediación de beneficios para la salud y la prevención de enfermedades.
Hay varios marcadores de proteínas para la detección de la actividad de la autofagia, incluyendo LC3 y p62. LC3 (proteína asociada a los microtúbulos 1A / 1B-c luzhain 3) es una proteína citosólica (LC3-I de forma) que está conjugado con PE (fosfatidiletanolamina) a la inducción de la autofagia. LC3 lipidada-PE (forma LC3-II) es reclutado en las membranas de autophagosomal y se puede utilizar para visualizar autofagosomas cuando están marcados con GFP. Su translocación desde el citosol a punctata estructuras de autofagosomas bajo microscopía es una indicación de la inducción de la autofagia. p62 es un receptor de carga para sustratos autofagia (tales como proteínas de ubiquitinación), y se incorpora en autofagosomas también. Dado que la proteína se degrada en los lisosomas, junto con autofagosomas, sus niveles se pueden utilizar para medir el flujo la autofagia. Aquí mostramos cómo utilizar estos marcadores para cuantificar la autofagia en diferentes tejidos de ratón inducidos por el ejercicio aeróbico, incluyendo ejercicio forzado (cinta) y el ejercicio voluntario (con ruedas de rodamiento). Los mismos procedimientos se pueden aplicar también a la medición in vivo de la autofagia después del tratamiento de otros inductores.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Northwestern (IACUC).
1. Los modelos de ratones
- Utilice los ratones 8-12 semanas de edad, en la práctica de ejercicio. Para detectar la autofagia inducida ejercido in vivo, utilizar los ratones transgénicos GFP-LC3 (C57BL / 6 antecedentes) para estudios de imagen y ratones C57BL / 6 para los análisis bioquímicos.
2. La autofagia inducida por el ejercicio
- Configuración cinta de correr - forzado ejercicio
- Aclimatarse y entrenar a los ratones en una cinta abierta hacia arriba 10 ° durante 2 días. En el día 1, ejercer los ratones durante 5 min a 8 m / min, y en el día 2, ejercer los ratones durante 5 min a 8 m / min seguido de otro 5 min a 10 m / min 10. Alentar a los ratones a correr por el codazo suave mano.
- En el 3er día, dejar que los ratones sometidos a una única serie de correr durante 90 minutos en el 10 ° cinta de correr cuesta arriba, starting a la velocidad de 10 m / min. Después de 40 min, aumentar la velocidad de la cinta a una velocidad de 1 m / min cada 10 min durante un total de 30 min, y luego aumentar la velocidad a la velocidad de 1 m / min cada 5 min hasta que llega a 17 m / min, para un total de 90 minutos de tiempo de ejercicio y 1.070 metros de distancia de funcionamiento.
- Ajuste el estímulo eléctrico a una gama de baja intensidad (1,2 Hz), y animar a los ratones a correr para evitar una descarga repetida pie.
- Para la recogida de tejidos, la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical inmediatamente después del ejercicio. Otros métodos de eutanasia aprobadas también se pueden utilizar, tal como CO2 o inyección IP de otros anestésicos. no parece ser afectada por el método de eutanasia El nivel de la autofagia.
- Configuración de rueda para correr - ejercicio voluntario
- Coloque una rueda del ratón-funcionamiento (11,4 cm de diámetro) dentro de una jaula con un alojados solo ratón.
- Comprobar la capacidad de funcionamiento utilizando un odómetro de la bicicleta.Configurar el parámetro de la rueda [distancia (en mm) por la rotación completa de la rueda] en 358 (11,4 * π). Medir la distancia recorrida después de 24 horas.
- Deje que el ratón funciona de manera voluntaria durante 2 semanas con la rueda de funcionamiento. Para la recogida de tejidos, sacrificar el ratón en la mañana después del período de rodaje.
3. La autofagia Evaluación Flux
- Para medir el flujo de autofagia en condiciones de reposo y de ejercicio, el tratamiento de ratones con el inhibidor de la autofagia cloroquina durante tres días y compararlos con los ratones tratados con PBS.
- Disolver la cloroquina en PBS (5 mg / ml), e inyectar la cloroquina en ratones por vía intraperitoneal a la dosis de 50 mg / kg / día durante tres días consecutivos. Sacrificar los ratones y recoger tejidos de 3 horas después de la última inyección.
- Para los ratones ejercidas, pretratar con cloroquina durante dos días consecutivos a una dosis de 50 mg / kg / día. En el tercer día, se inyecta a los ratones con la misma concentración de cloroquina, y después de90 min dejar correr en la cinta durante otros 90 min.
- La eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical. Recoger los tejidos inmediatamente después de ejecutar, de manera que el tiempo total de incubación de la cloroquina es la misma que los ratones (en reposo) de control (3 h).
NOTA: También puede utilizar una única inyección de cloroquina para determinar el flujo de la autofagia en tejidos de ratón.
4. Tejido de cosecha y Fijación
- Antes de la cosecha de tejidos preparar una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y fresco 4% de paraformaldehído (PFA, precaución: equipo de protección personal requerido) en PBS a un pH final de 7,4. Almacenar ambas soluciones a 4 ° C.
- Llenar la jeringa de 30 ml con 15 - 20 ml de PFA al 4% (para los ratones GFP-LC3). Conectar la jeringa con una aguja de 20 G catéter.
- Después del ejercicio, la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical.
- Colocar el animal sobre una superficie de trabajo limpia en su back. Cortar y abrir la cavidad torácica por el diafragma de corte para exponer el corazón.
- Hacer una pequeña incisión en el hígado para permitir que la sangre salga, e inyectar un total de 15 ml 4% PFA lentamente hacia el ventrículo derecho del corazón a través del catéter, hasta que el pulmón y el hígado se vuelven completamente pálido. Perfundir el ratón inmediatamente después de la sesión de ejercicio, utilizando una bomba de jeringa con un caudal constante de 90 ml / hr.
- Después de la perfusión, retire la aguja y recoger tejidos de interés (por ejemplo, el cerebro y el músculo esquelético 11). Para el músculo esquelético, diseccionar el músculo vasto lateral. En pocas palabras, tirar de la piel de la pierna hacia atrás para exponer los músculos, localizar los cuádriceps femoral 12, y diseccionar vasto externo, que es el músculo externo conectado a la parte superior del hueso del fémur.
- Para mayor fijación y deshidratación, colocar los tejidos de ratones GFP-LC3 en PFA al 4% durante 24 horas a 4 ° C, y luego transferirlos a 15%sacarosa-PBS a 4 ° C durante la noche o hasta que los tejidos se han establecido y, a continuación, a 30% de sacarosa-PBS a 4 ° C durante la noche o para un almacenamiento más largo. Mantener las muestras en la oscuridad tanto como sea posible, ya que pueden ser sensibles a la luz intensa.
- Para el análisis de transferencia de Western congelamiento rápido los tejidos de ratones C57BL / 6 ratones directamente en nitrógeno líquido, y almacenar a -80 ° C.
5. Análisis de Imágenes de GFP-LC3 puntos lagrimales
- proceso de tejido
- Pre-tratamiento de los tejidos (previamente fijadas en PFA y almacenados en sacarosa al 30%) en medio de inclusión como "compuesto de la temperatura óptima de corte" (OCT) durante unos minutos en una placa de Petri etiquetada pequeña.
- Transferir el tejido en un criomolde marcado que contiene suficiente octubre fresca para cubrir el tejido. Oriente la superficie de seccionamiento hacia la parte inferior de la criomolde (sección transversal para el músculo vasto lateral y corte sagital de la hemi-cerebro). Evitar la formación de burbujas.
- Freeze las muestras colocando el criomolde durante unos minutos en un enfriador de espuma cubierto con hielo seco, hasta la OCT se vuelve blanco. Envolver las muestras individuales en láminas etiquetados, sellarlos en una bolsa de plástico, y almacenar a -80 ° C durante la noche o más.
- Utilice un criostato para cortar secciones de la muestra con un espesor de 10 micras, y montar las secciones en las diapositivas. Almacenar las diapositivas a -20 ° C, y mantener siempre las diapositivas lejos de la luz siempre que sea posible.
- preparación de los portaobjetos
- Retirar los portaobjetos del congelador y descongelar a temperatura ambiente. Cubrir la sección de tejido con una gota de medio de montaje con DAPI. Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado en la parte superior y evitar la formación de burbujas.
- Use esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos, permitir que el esmalte de uñas se seque en la oscuridad a temperatura ambiente, y luego almacenar los portaobjetos en un recipiente hermético a la luz a 4 ° C, o proceder con la captura de imágenes de puntos lagrimales GFP-LC3.
- <strong> La cuantificación de GFP - LC3 puntos lagrimales mediante microscopía de fluorescencia
- Realizar microscopía de epifluorescencia, la captura de imágenes en el mismo estado (ajustes de exposición y) para todas las muestras. Para GFP, utilice una longitud de onda de emisión de 525 nm; para DAPI, utilice 490 nm. Adquirir al menos diez imágenes por muestra usando un objetivo de 60X para vasto lateral y la región de la corteza frontal del cerebro.
- Cuantificar el número de puntos lagrimales GFP-LC3 en un área de tejido de 2.500 m 2 en cada imagen para el análisis estadístico, ciego para los grupos experimentales. Calcular el promedio de 10 imágenes de cada muestra, utilizando la función de medición automática de "recuento de objetos". Ajustes para el músculo vasto lateral son: Umbral L = 10, H = 200; 2X liso; 1X limpia, y la configuración de la corteza frontal del cerebro son: Umbral L = 11, H = 200; 2X liso; 1X limpia.
6. Análisis Western Blot en la autofagia Marcadores
- <strong> proceso de Tejidos
- Preparar el tampón de lisis: 50 mM Tris-HCl; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% Triton X-100; inhibidor de la proteasa y el inhibidor de fosfatasa (recién añadido).
- Eliminar el tejido de los ratones C57BL / 6 de -80 ° C de almacenamiento. Cortar el tejido muscular en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar antes de la siguiente proceso. Añadir 800 l (por hemi-cerebro) o de 500 l (por vasto lateral) de tampón de lisis frío a la muestra. Homogeneizar la muestra a 4 ° C con un homogeneizador a una velocidad media.
- lisar completamente la mezcla se homogeneizó durante otros 30 minutos a 1 hora a 4 ° C con rotación.
- Centrifugar el homogeneizado a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sedimento, y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo.
- análisis de la autofagia
- Determinar la concentración de proteína de lisados de tejido utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Normalizar cada muestraa la misma concentración.
- Combinar la muestra con el tampón de muestra 2x Laemmli en una proporción 1: 1, hervir a 95 ° C durante 5 a 10 min, y proceder con el análisis de transferencia Western en la autofagia marcadores 13, 14, tales como p62 anticuerpo anti-p62 (, dilución 1: 500) y LC3 anticuerpo anti-LC3 (, 1: 500 dilución). Hervir las muestras inmediatamente después de la adición del tampón de muestra, como de incubación más largo en el hielo puede generar múltiples bandas degradadas de LC3.
- Cuantificar p62 y LC3 bandas por análisis de densitometría utilizando ImageJ, y normalizar el valor de la banda de actina correspondiente.
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Representative Results
Este protocolo describe dos métodos diferentes para inducir la autofagia en tejidos de ratón de ejercicio aeróbico: un total de 90 minutos de ejercicio en una cinta rodante forzada de varios carriles precedida por dos días de aclimatación; o dos semanas de ejercicio voluntario en una rueda de funcionamiento utilizado por los ratones alojados individualmente. En cada protocolo de ejercicio, podemos medir el flujo autofagia mediante microscopía de fluorescencia y análisis de Western blot en diversos órganos.
Se utilizó una línea de ratones transgénicos que expresan GFP-LC3 etiquetado como un sistema indicador para controlar la autofagia por el ejercicio 1. Tras la inducción de la autofagia, LC3 transloca desde el citosol a la autofagosoma en estructuras puntiformes. Después de seccionar, la formación de puntos lagrimales GFP-LC3 puede estar directamente visualizó por microscopía de fluorescencia (Figura 1A). Alternativamente, las estructuras también se pueden autofagosoma inmunotiñeron por un anticuerpo LC3 paraformación de imágenes. O bien 90 minutos de ejercicio caminadora o 2 semanas de carrera voluntaria aumentaron el número de puntos lagrimales GFP-LC3 tanto en el músculo esquelético (vasto externo) y la corteza cerebral, en comparación con la condición de reposo (Figura 1B). Cabe señalar que la región de la corteza frontal ha sido la región principal en el cerebro donde la autofagia está claramente inducida por cualquiera de los métodos hasta ahora. El ejercicio también induce la conversión de LC3 de la forma citosólica (LC3-I) a la forma conjugados de lípidos (LC3-II), que se puede detectar por análisis de transferencia Western (Figura 1C).
incremento inducido por el ejercicio de autofagosomas (representados por LC3-II y GFP-LC3 puntos lagrimales) se debe a un flujo autophagic elevada, en lugar de un bloque en la degradación autophagosome, evaluada por el uso de inhibidores de la degradación lisosomal, tales como bafilomicina A1 o cloroquina . A continuación se midió la degradación de la autofagia p62 del receptor de carga como examplio. El ejercicio (90 min de cinta de correr) causó una mayor degradación de p62 en el músculo esquelético de la condición de reposo, que fue rescatado por inyección con cloroquina antes del ejercicio (Figura 2). Los resultados similares se observan también con el ejercicio voluntario de ruedas corriendo. Por lo tanto, el ejercicio aeróbico por las ruedas de la máquina para correr o correr induce la autofagia en vivo, medida por el nivel de estado estacionario de LC3 y la degradación de p62.
Figura 1. El ejercicio aeróbico Induce la autofagia en el ratón tejidos. Imágenes representativas (A) y cuantificación (B) de los puntos lagrimales GFP-LC3 en el músculo esquelético (vasto externo) y el cerebro (corteza frontal) de ratones transgénicos GFP-LC3 bajo la condición de control (en reposo), después de 90 minutos de ejercicio forzado (cinta de correr ) o después de 2 semanas de ejercicio voluntario (rueda). Resultados representan la media ± SEM de 10 fotografías por ratón. N = 5 ratones. Se utilizaron las siguientes longitudes de onda de emisión: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) de detección de transferencia Western de LC3 en el músculo esquelético (vasto lateral) de ratones descansado y ejercidos (por cinta). Cuantificación de datos representan el nivel de LC3-II normalizó a la actina (izquierda) y la relación de LC3-II a LC3-I (derecha). N = 3 ratones. Estadística está comparando cada valor de la muestra de control. Los resultados representan la media ± SEM *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001, prueba t. Barra de escala, 25 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El ejercicio aumenta el flujo autofagia en ratón músculo esquelético. (A) Western blotdetección de p62 en el vasto externo de ratones descansado y ejercidos en la presencia o ausencia de inhibidores de la cloroquina lisosomales. (B) (izquierda) análisis de cuantificación de p62 normalizado a la banda de actina correspondiente. (Derecha) El flujo de p62 se determina restando el valor densitométrico normalizado de p62 tratado con PBS de la de p62 cloroquina tratados. Los resultados representan la media ± SEM N = 3 ratones. *, P <0,05, prueba t. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La autofagia es un proceso catabólico que proporciona energía y reduce la citotoxicidad por la degradación lisosomal de los componentes del citoplasma o orgánulos dañados. El estudio de la autofagia es importante comprender la regulación de la homeostasis celular y los mecanismos de respuesta al estrés. Nuevos modelos y metodologías están emergiendo en el campo de investigación de 15, para estudiar cómo la autofagia alterada contribuye a numerosos procesos patológicos 16, 17.
La privación de nutrientes (inanición) y la inducción farmacológica se usan comúnmente enfoques para inducir la autofagia in vitro e in vivo. Estos métodos, especialmente para los modelos animales, pueden mostrar efectos adversos que pueden influir en los resultados generales. Por ejemplo, ya que requiere al menos 48 horas de inanición para inducir un nivel detectable de la autofagia, los animales pueden no haber energía necesaria para la actividad de motor regular, queafecta el resultado de muchos estudios de comportamiento siguientes. Sin embargo, inductores farmacológicos también pueden dar lugar a efectos secundarios debido a su falta de especificidad a la vía de la autofagia. La principal rapamicina autofagia inductor y sus derivados suprimen la actividad mTOR y provocan disfunción metabólica y la inmunosupresión 18, 19, 20, que debe ser tomado en consideración en el diseño experimental para el tratamiento a largo plazo. Por lo tanto, hemos estado trabajando sobre las formas más robustas y fisiológicos para la activación de la autofagia en modelos animales.
Recientemente ejercicio y otros han identificado como una solución eficaz, más rápido y más seguro inductor de la autofagia en vivo 7, 8, 9. Tanto el ejercicio forzado por cinta de correr y el ejercicio voluntario mediante la ejecución de la rueda se han utilizado para analizar los efectos del ejercicio en la autofagia unactivation, con variaciones en la duración del ejercicio e intensidad 21, 22. Por ejemplo, una hora de carrera en cinta rodante (a partir de la velocidad de 10 m / min hasta un máximo de 40 m / min) induce abundante lipidación LC3 en el músculo esquelético 21, y la rueda voluntaria a más largo plazo se ejecuta durante 3 meses o 4 - 5 semanas también aumenta la autofagia basal y aumenta la expresión de proteínas en el músculo esquelético autofagia 21, 22.
Aquí describimos y se compararon los dos métodos (cinta rodante y la rueda de marcha) para ejercer los ratones, y presentó optimizado protocolos más cortos con una alta eficiencia en la inducción de la autofagia. Cada método tiene ventajas y desventajas. Una sola sesión de 90 minutos de ejercicio en cinta rodante forzada es suficiente para inducir la autofagia en el músculo esquelético y el cerebro. Hemos hecho un curso de tiempo de ejercicio en cinta ergométrica 7, y se encontró que el exerciSE condiciones descritas aquí inducen el nivel máximo de la autofagia en músculo esquelético del ratón, que también está validada por otros 23. En estas condiciones, los ratones se someten a ejercicio aeróbico; como se informó anteriormente, el ejercicio aeróbico es inducida mediante la ejecución prolongada con aumentos graduales de velocidades en una cinta de correr 24, 25, 26, mientras que la condición anaeróbica se obtiene por un corto período de ejercicio de alta intensidad, lo que aumenta la masa muscular, pero no necesariamente a mejorar el ejercicio la resistencia 27, 28. Por otra parte, la velocidad de circulación se informó aquí en este protocolo se correlaciona positivamente con la capacidad de consumo de oxígeno, por métodos indirectos para evaluar la capacidad aeróbica 29. Por lo tanto, el ejercicio aeróbico sobre una cinta de correr es una forma rápida y eficaz para inducir la autofagia.
Sin embargo, forced que se ejecuta en un espacio cerrado puede ejercer el estrés a los ratones. Por lo tanto, para evitar dar un estrés adicional a los animales, utilizamos el dedo empuja o borlas de alambre como un método para mantener los ratones corriendo, en lugar de la incorporada en el choque eléctrico. En comparación con la cinta, el uso de la rueda de rodadura tiene muchas ventajas. Es menos estresante, no requiere tiempo de observación de los investigadores, y es conveniente para estudiar los efectos a largo plazo de la activación de la autofagia. Sin embargo, el ejercicio en una rueda de correr es voluntaria y por lo tanto genera variabilidad en términos de la distancia de funcionamiento y la velocidad entre los diferentes ratones o el mismo ratón en días diferentes. Por lo tanto, es necesario ejecutar los ratones en una rueda durante un período prolongado de tiempo (por ejemplo, varias semanas) para minimizar la variabilidad individual. Es importante destacar que el enfoque también requiere la utilización de un cuentakilómetros en la noche para verificar que el ratón está en realidad en funcionamiento. Se midió la distancia promedio de ejecución de ratones C57BL / 6 de tipo salvaje durante un período de 2 semanas, y se encontró que corren aproximadamente 1 km / noche en el comienzo de la formación (día 1) y se puede ejecutar hasta 8 - 10 km / noche en el día 14. En general, la rueda de correr es un método eficaz para estimular la autofagia en la mayoría de los órganos, si bien, es más difícil para capturar la acumulación autofagosoma en el músculo esquelético en comparación con el uso de la cinta de correr. La razón es que el músculo esquelético tiene un alto flujo autophagic y una tasa de degradación autophagosome rápido, que requiere la recolección inmediata del tejido después de correr para detectar la inducción de la autofagia por medición puntos lagrimales GFP-LC3. En cualquiera de los protocolos, la rápida perfusión PFA y la fijación de los tejidos después de la eutanasia de los animales es un paso crítico del procedimiento para conservar las estructuras autofagosoma que son de otra manera degradan fácilmente durante la disección.
Este protocolo se muestra cómo utilizar el ejercicio aeróbico para estimular la autofagia en tejidos de ratón, incluyendo el cerebro y el músculo esquelético. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de la vía de la autofagia en el mantenimiento de la función de los tejidos, tales como el mantenimiento mitocondrial de 23 años, y para estudiar los efectos a largo plazo de la inducción de la autofagia en la regulación del comportamiento y la salud de modelos de enfermedad animal, tales como la mejora de los efectos analgésicos de los cannabinoides 9. Tanto los métodos de cinta rodante y la rueda para correr inducen un buen nivel de autofagia; sin embargo, es importante tener en cuenta sus diferencias a la hora de elegir el mejor enfoque para satisfacer diferentes objetivos de investigación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
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