Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/55099
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

Summary

تفعيل الالتهام الذاتي هو مفيد في الوقاية من عدد من الأمراض. واحدة من الطرق الفسيولوجية للحث على الالتهام الذاتي في الجسم الحي هو ممارسة الرياضة البدنية. نحن هنا تظهر كيفية تفعيل الالتهام الذاتي عن طريق التمارين الرياضية وقياس مستويات الالتهام الذاتي في الفئران.

Introduction

الالتهام الذاتي هو مسار تدهور الحفاظ تطويريا، والذي يتسبب في استجابة لمختلف ظروف الإجهاد مثل الجوع ونقص الأكسجة 1 و 2. خلال الالتهام الذاتي، حويصلات المزدوج غشاء، ودعا autophagosomes، دمج المكونات التحت خلوية غير الضرورية أو التالفة ونقلها إلى الجسيمات الحالة لتدهور 3. الالتهام الذاتي القاعدية أمر ضروري من أجل وظيفة الخلوية وتطوير الحي، وضعف الالتهام الذاتي القاعدية هو متورط في العديد من الاضطرابات، بما في ذلك تنكس عصبي، تكون الأورام والسكري من النوع 2 4، 5، 6.

والالتهام الذاتي محفز الفسيولوجية المعروفة هو الجوع. ومع ذلك، فقد اثنين من القيود الرئيسية. أولا، يأخذ الجوع لفترة طويلة للحث على الالتهام الذاتي بشكل فعال في الحيوانات، على سبيل المثال، 48 ساعة من تقييد الغذاء في الفئرانفي معظم الأجهزة. ثانيا، المجاعة بالكاد يدفع الالتهام الذاتي الدماغ، نظرا لتوريد المواد الغذائية مستقرة نسبيا في الدماغ. في الواقع، فإنه من الصعب أيضا للكشف عن الالتهام الذاتي تحريض من قبل محرضات جزيء صغير، والعديد من الأدوية لا يمكن ان تمر حاجز الدم في الدماغ. وبالتالي، لتحليل أفضل وظيفة تفعيل الالتهام الذاتي في التسبب بالمرض، اكتشفنا مؤخرا أن ممارسة هي طريقة الفسيولوجية أكثر قوة للحث على الالتهام الذاتي في فترة قصيرة من الزمن 7، 8، 9. مقارنة مع الجوع، والناجم عن الالتهام الذاتي على نحو فعال عن طريق تشغيل حلقة مفرغة بأسرع 30 دقيقة. وهكذا، وممارسة هو نهج الفسيولوجية مريحة وقوية لدراسة آلية الالتهام الذاتي في التوسط الفوائد الصحية والوقاية من الأمراض.

هناك العديد من علامات البروتين للكشف عن النشاط الالتهام الذاتي، بما في ذلك LC3 وP62. LC3 (المرتبطة أنيبيب البروتين 1A / 1B-الخفيفة جهين 3) هو بروتين عصاري خلوي (LC3-I تشكيل) الذي يضاف إلى PE (فسفاتيديل إيثانولامين) على تحريض الالتهام الذاتي. وجندت LC3 lipidated PE (شكل LC3-II) على الأغشية autophagosomal، ويمكن استخدامها لتصور autophagosomes عندما المسمى مع GFP. النبات في الفترة من العصارة الخلوية إلى منقط هياكل autophagosomes تحت المجهر وهذا مؤشر على تحريض الالتهام الذاتي. P62 هو مستقبلات البضائع لركائز الالتهام الذاتي (مثل البروتينات ubiquitination)، وأدرج في autophagosomes كذلك. منذ تتحلل البروتين في الجسيمات الحالة جنبا إلى جنب مع autophagosomes، مستوياته يمكن استخدامها لقياس تدفق الالتهام الذاتي. نحن هنا تظهر كيفية استخدام هذه العلامات لتحديد الالتهام الذاتي في أنسجة مختلفة الماوس الناجم عن التمارين الرياضية، بما في ذلك ممارسة القسري (مفرغة) وممارسة طوعية (تشغيل العجلات). ويمكن أيضا أن تطبق نفس الإجراءات لفي الجسم الحي قياس الالتهام الذاتي بعد العلاج من محرضات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها لجنة جامعة نورث وسترن المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).

1. نماذج ماوس

  1. استخدام فئران عمرها أسابيع 8-12 في التمرينات. للكشف عن الالتهام الذاتي يمارس التي يسببها في الجسم الحي، استخدام الفئران المعدلة وراثيا GFP-LC3 (C57BL / 6 الخلفية) للدراسات التصوير وC57BL / 6 الفئران للتحاليل الكيميائية الحيوية.

2. الالتهام الذاتي الناجم عن التمارين الرياضية

  1. الإعداد المطحنة - ممارسة أجبرت
    1. تأقلم وتدريب الفئران على 10 درجة مفرغة مفتوحة شاقة لمدة 2 أيام. في يوم 1، وممارسة الفئران لمدة 5 دقائق في الساعة 8 م / دقيقة، وفي يوم 2، وممارسة الفئران لمدة 5 دقائق في الساعة 8 م / دقيقة تليها 5 دقائق أخرى في 10 م / دقيقة 10. تشجيع الفئران لتشغيل من خلال دفعة اليد لطيف.
    2. في يوم 3 الثالثة، والسماح للفئران الخضوع لنوبة واحدة من تشغيل لمدة 90 دقيقة على 10 درجة مفرغة شاقة، startiنانوغرام بسرعة 10 م / دقيقة. بعد 40 دقيقة، وزيادة سرعة جهاز المشي بمعدل 1 م / دقيقة كل 10 دقيقة ليصبح المجموع 30 دقيقة، ومن ثم زيادة السرعة بمعدل 1 م / دقيقة كل 5 دقائق حتى يصل إلى 17 م / دقيقة، ليصبح المجموع 90 دقيقة من وقت التمرين و1،070 متر تشغيل عن بعد.
    3. تعيين التحفيز الكهربائي على نطاق وكثافة منخفضة (1.2 هرتز)، وتشجيع الفئران لتشغيل لتجنب صدمة القدم المتكررة.
    4. لجمع الأنسجة، والموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين، تليها خلع عنق الرحم مباشرة بعد ممارسة الرياضة. ويمكن أيضا أن أساليب القتل الرحيم وافقت أخرى يمكن استخدامها، مثل CO2 أو حقن IP التخدير الأخرى. لا يبدو أن مستوى الالتهام الذاتي أن تتأثر أساليب القتل الرحيم.
  2. الإعداد عجلة تشغيل - ممارسة الطوعية
    1. وضع عجلة تشغيل الماوس (11.4 سم القطر) داخل قفص مع الماوس واحد يضم.
    2. التحقق من قدرة تشغيل باستخدام عداد المسافات الدراجة.إعداد المعلمة عجلة [المسافة (مم) في دورة كاملة للعجلة] في 358 (11.4 * π). قياس المسافات الطويلة بعد 24 ساعة.
    3. دع الماوس تشغيل طوعا لمدة 2 اسابيع مع عجلة دوارة. لجمع الأنسجة، والتضحية الماوس في الصباح بعد فترة التشغيل.

3. الالتهام الذاتي الجريان تقييم

  1. لقياس تدفق ذاتية البلعمة تحت يستريح وممارسة الظروف، علاج الفئران مع الكلوروكين الالتهام الذاتي المانع لمدة ثلاثة أيام ومقارنتها مع الفئران التي عولجت مع برنامج تلفزيوني.
    1. حل الكلوروكين في برنامج تلفزيوني (5 ملغ / مل)، وحقن الكلوروكين في الفئران داخل الصفاق في جرعة من 50 ملغ / كغ / يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية. التضحية الفئران وجمع الأنسجة 3 ساعات بعد الحقن الماضي.
    2. بالنسبة للفئران تمارس، يمهد للمعالجة منها مع الكلوروكين لمدة يومين متتاليين في جرعة من 50 ملغ / كغ / يوم. في اليوم الثالث، حقن الفئران مع نفس التركيز من الكلوروكين، وبعداسمحوا 90 دقيقة منها يعمل في حلقة مفرغة لمدة 90 دقيقة أخرى.
    3. الموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين، تليها خلع عنق الرحم. جمع الأنسجة فورا بعد تشغيل، حتى أن فترة حضانة الكلي للالكلوروكين هو نفس التحكم (يستريح) الفئران (3 ساعات).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم حقنة واحدة من الكلوروكين لتحديد تدفق الالتهام الذاتي في الأنسجة الماوس.

4. الأنسجة الحصاد والتثبيت

  1. قبل الحصاد الأنسجة إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والطازجة 4٪ بارافورمالدهيد (منهاج العمل، والحذر: معدات الوقاية الشخصية المطلوبة) في برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني النهائية من 7.4. تخزين كل الحلول عند 4 درجات مئوية.
  2. ملء 30 مل حقنة مع 15-20 مل من 4٪ PFA (بالنسبة للفئران GFP-LC3). ربط المحاقن مع 20 G قسطرة إبرة.
  3. بعد هذه العملية، الموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلورين، تليها خلع عنق الرحم.
  4. وضع الحيوان على سطح العمل نظيفة على بكالوريوس فيالمسيخ. قطع وفتح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز لفضح القلب.
  5. إجراء شق صغير على الكبد للسماح للالدم يخرج، وحقن ما مجموعه 15 مل 4٪ PFA ببطء في البطين الأيمن من القلب عن طريق القسطرة، حتى في الرئة والكبد تتحول شاحبة تماما. يروي الماوس مباشرة بعد جلسة التمرين، وذلك باستخدام مضخة المحاقن مع معدل تدفق مستمر من 90 مل / ساعة.
  6. بعد نضح، وإزالة الإبرة وجمع الأنسجة من الفائدة (على سبيل المثال الدماغ 11 والعضلات والهيكل العظمي). لالعضلات والهيكل العظمي، تشريح الوحشية المتسعة. لفترة وجيزة، وسحب الجلد في الساق الى الوراء لفضح العضلات، وإضفاء الطابع المحلي على عضلات الفخذ الفخذية 12، وتشريح خارج الوحشية المتسعة، وهو العضلات الخارجية تعلق على الجزء العلوي من عظم الفخذ.
  7. لمزيد من التثبيت والجفاف، ووضع أنسجة الفئران GFP-LC3 في PFA 4٪ لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية، ومن ثم نقلها إلى 15٪السكروز-برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية خلال الليل أو حتى استقرت الأنسجة، ثم إلى 30٪ سكروز، برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية خلال الليل أو لتخزين الطويل. الحفاظ على عينات في الظلام قدر الإمكان لأنها قد تكون حساسة للضوء القوي.
  8. لتحليل لطخة الغربي المفاجئة تجميد الأنسجة من C57BL / 6 الفئران مباشرة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

5. تحليل التصوير من GFP-LC3 نقاط و

  1. عملية النسيج
    1. قبل معالجة الأنسجة (المحدد سابقا في PFA وتخزينها في 30٪ سكروز) في تضمين المتوسطة مثل "الأمثل قطع درجة الحرارة مركب" (أكتوبر) لدقائق قليلة في طبق بتري الصغيرة المسمى.
    2. نقل الأنسجة في cryomold المسمى تحتوي على ما يكفي من أكتوبر العذبة لتغطية الأنسجة. الشرق سطح باجتزاء باتجاه الجزء السفلي من cryomold (المقطع العرضي للالمتسعة الوحشية العضلات ومقطع سهمي لنصفي الدماغ). تجنب تشكيل فقاعات.
    3. الصحائفإز العينات عن طريق وضع cryomold لدقائق قليلة في برودة رغوة مغطاة مليئة الثلج الجاف، حتى يتحول أكتوبر الأبيض. التفاف عينات فردية في رقائق المسمى، وختم لهم في كيس من البلاستيك، وتخزينها في -80 درجة مئوية خلال الليل أو لفترة أطول.
    4. استخدام ناظم البرد لخفض أقسام عينة في سمك 10 ميكرون، وتركيب أبواب على الشرائح. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية، واحرص دائما على الشرائح بعيدا عن الضوء كلما كان ذلك ممكنا.
  2. إعداد الشرائح
    1. إزالة الشرائح من الفريزر وذوبان الجليد لهم في درجة حرارة الغرفة. تغطية قسم الأنسجة مع قطرة من تصاعد وسائل الإعلام مع دابي. وضع ساترة من الحجم المناسب على رأس وتجنب تشكيل فقاعة.
    2. استخدام طلاء الأظافر لختم حواف ساترة، والسماح طلاء الأظافر لتجف في الظلام في درجة حرارة الغرفة، ثم تخزين الشرائح في وعاء للضوء ضيق في 4 درجات مئوية، أو المضي في القبض على التصوير من نقاط وGFP-LC3.
  3. <قوي> الكمي من GFP - LC3 نقاط وبواسطة المجهر مضان
    1. أداء epifluorescence المجهري، والتقاط الصور في ال نفسه شرط (التعرض وإعدادات) لجميع العينات. لGFP، استخدام الطول الموجي الانبعاثات من 525 نانومتر. لدابي، استخدم 490 نانومتر. الحصول على عشرة صور على الأقل لكل عينة باستخدام الهدف 60X عن الوحشية المتسعة ومنطقة القشرة الأمامية من الدماغ.
    2. تحديد عدد من نقاط وGFP-LC3 في منطقة الأنسجة من 2500 ميكرون 2 في كل صورة للتحليل الإحصائي، أعمى عن المجموعات التجريبية. حساب متوسط ​​عدد من 10 صور من كل عينة، وذلك باستخدام وظيفة القياس التلقائي "عدد كائن". إعدادات المتسعة الوحشية العضلات هي: العتبة L = 10، H = 200؛ 2X سلس. 1X نظيفة، وإعدادات القشرة الجبهية في الدماغ هم: عتبة L = 11، H = 200؛ 2X سلس. 1X نظيفة.

6. الغربية تحليل وصمة عار على الالتهام الذاتي علامات

  1. <قوية> عملية الأنسجة
    1. إعداد العازلة تحلل: 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك. 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. 1 ملم EDTA. 1٪ تريتون X-100. مثبط البروتياز ومثبط الفوسفاتيز (المضافة حديثا).
    2. إزالة الأنسجة من C57BL / 6 الفئران من -80 ° C التخزين. قطع الأنسجة العضلية إلى قطع صغيرة مع شفرة حلاقة قبل العملية التالية. إضافة 800 ميكرولتر (لنصفي الدماغ) أو 500 ميكرولتر (لالوحشية المتسعة) من تحلل العازلة البارد للعينة. تجانس العينة عند 4 درجات مئوية مع الخالط في سرعة متوسطة.
    3. ليز تماما الخليط المتجانس لمدة 30 دقيقة أخرى ل1 ساعة عند 4 درجات مئوية مع دوران.
    4. تدور باستمرار جناسة في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل بيليه، وجمع طاف في أنبوب جديد.
  2. تحليل الالتهام الذاتي
    1. تحديد تركيز البروتين لست] الأنسجة باستخدام عدة فحص BCA البروتين وفقا لمواصفات الشركة الصانعة. تطبيع كل عينةلنفس التركيز.
    2. الجمع بين العينة مع عينة العازلة 2X Laemmli في نسبة 1: 1، أنها تغلي في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق، والمضي قدما في تحليل لطخة غربية على الالتهام الذاتي علامات 13، 14، مثل P62 (مكافحة P62 الأجسام المضادة، 1: 500 تمييع) وLC3 (مكافحة LC3 الأجسام المضادة، 1: 500 تمييع). تغلي العينات فورا بعد إضافة عينة العازلة، وأطول الحضانة على الجليد قد تولد العصابات المتدهورة متعددة من LC3.
    3. قياس P62 وLC3 العصابات من خلال تحليل كثافة استخدام يماغيج، وتطبيع القيمة إلى الفرقة الأكتين المقابلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول طريقتين مختلفتين للحث على الالتهام الذاتي في الأنسجة الماوس عن طريق التمارين الرياضية: ما مجموعه 90 دقيقة من ممارسة اضطر في حلقة مفرغة متعددة الحارات شرع يومان من التأقلم. أو أسبوعين من ممارسة الطوعية على عجلة دوارة المستخدمة من قبل الفئران وحيدة يضم. في كل بروتوكول ممارسة، يمكننا قياس تدفق الالتهام الذاتي بواسطة المجهر مضان وتحليل لطخة غربية في مختلف الأجهزة.

استخدمنا خط الماوس المعدلة وراثيا معربا عن LC3 GFP الموسومة كنظام مراسل لرصد الالتهام الذاتي من ممارسة 1. على تحريض الالتهام الذاتي، LC3 translocates من العصارة الخلوية إلى جسيم بلعمي ذاتي في الهياكل منقط. بعد باجتزاء، وتشكيل نقاط وGFP-LC3 يمكن تصور مباشرة بواسطة المجهر مضان (الشكل 1A). بدلا من ذلك، الهياكل جسيم بلعمي ذاتي يمكن أيضا أن immunostained بواسطة الأجسام المضادة LC3 لالتصوير. إما 90 دقيقة من ممارسة المشي أو 2 أسابيع من تشغيل الطوعي ازداد عدد نقاط وGFP-LC3 في كل من العضلات والهيكل العظمي (الوحشية المتسعة) والقشرة الدماغية، مقارنة مع حالة الراحة (الشكل 1B). وتجدر الإشارة إلى أن منطقة القشرة الأمامية كانت منطقة رئيسية في الدماغ حيث هو فعل الالتهام الذاتي بشكل واضح من قبل أي طريقة حتى الآن. ممارسة أيضا يتسبب في تحويل LC3 من النموذج عصاري خلوي (LC3-I) إلى شكل الدهون مترافق (LC3-II)، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة تحليل لطخة غربية (الشكل 1C).

هو زيادة ممارسة النشاط من autophagosomes (ممثلة LC3-II وGFP-LC3 نقاط و) بسبب تعرضها لتدفق ذاتية البلعمة مرتفعة، بدلا من كتلة في تدهور جسيم بلعمي ذاتي، وتقييمها، عن طريق استخدام مثبطات تدهور الليزوزومية، مثل bafilomycin A1 أو الكلوروكين . نحن هنا قياس تدهور ذاتية البلعمة P62 مستقبلات البضائع، بحكموافرة. ممارسة (90 دقيقة مفرغه) تسبب في تدهور أعلى من P62 في العضلات والهيكل العظمي من حالة الراحة، والتي تم انقاذها عن طريق الحقن مع الكلوروكين قبل ممارسة (الشكل 2). ولوحظت نتائج مماثلة أيضا مع ممارسة الطوعية عن طريق تشغيل عجلات. وبالتالي، التمارين الرياضية من قبل المشي أو الجري عجلات الحث الالتهام الذاتي في الجسم الحي، يقاس مستوى ثابت للدولة من LC3 وتدهور P62.

شكل 1
الشكل 1. بممارسة الهوائية الحث الالتهام الذاتي في الأنسجة الماوس. صور الممثل (A) وتقدير (ب) من نقاط وGFP-LC3 في العضلات والهيكل العظمي (الوحشية المتسعة) والدماغ (القشرة الأمامية) من GFP-LC3 الفئران المعدلة وراثيا تحت سيطرة حالة (يستريح)، بعد 90 دقيقة من ممارسة القسري (حلقة مفرغة ) أو بعد 2 أسابيع من ممارسة طوعية (عجلة). نتيجةالصورة تمثل يعني ± ووزارة شؤون المرأة من 10 صور في الماوس. N = 5 الفئران. واستخدمت موجات الانبعاثات التالية: GFP - 525 نانومتر. دابي - 490 نانومتر. (ج) كشف الغربي لطخة من LC3 في العضلات والهيكل العظمي (الوحشية المتسعة) من الفئران راحة وتمارس (عن طريق حلقة مفرغة). تمثل البيانات الكمي مستوى LC3-II تطبيع مع الأكتين (يسار) ونسبة LC3-II لLC3-I (يمين). N = 3 الفئران. إحصائية هو المقارنة بين كل قيمة إلى العينة الضابطة. وتمثل النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة *، P <0.05. **، P <0.01. ***، P <0.001، اختبار t. شريط النطاق، 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التمرين يزيد من الالتهام الذاتي الجريان في ماوس الهيكل العظمي العضلات. (A) لطخة غربيةالكشف عن P62 في الوحشية المتسعة من الفئران راحة وتمارس في وجود أو عدم وجود الكلوروكين مثبطات الليزوزومية. (ب) (يسار) التحليل الكمي للP62 تطبيع للفرقة الأكتين المقابلة. (الحق) يتم تحديد تدفق P62 بطرح قيمة الكثافات تطبيع من P62 تعامل برنامج تلفزيوني من أن من P62 المعالجة الكلوروكين. وتمثل النتائج يعني ± ووزارة شؤون المرأة N = 3 الفئران. *، P <0.05، اختبار (ت). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الالتهام الذاتي هو عملية الهدم التي توفر الطاقة ويقلل من السمية الخلوية بسبب تدهور الليزوزومية من مكونات السيتوبلازم أو العضيات التالفة. دراسة الالتهام الذاتي مهم لفهم تنظيم التوازن الخلوي وآليات الاستجابة للضغط النفسي. النماذج والمنهجيات الجديدة والناشئة في مجال البحوث 15، لدراسة كيفية الالتهام الذاتي ضعاف يساهم في العديد من العمليات المرضية 16 و 17.

وتستخدم الحرمان من المغذيات (المجاعة) وتحريض الدوائي عادة النهج للحث على الالتهام الذاتي في المختبر، وفي الجسم الحي. هذه الطرق، خاصة بالنسبة للنماذج حيوانية، قد تظهر الآثار الضارة التي يمكن أن تؤثر على النتائج الإجمالية. على سبيل المثال، لأنه يتطلب على الأقل 48 ساعة من الجوع للحث على مستوى قابل للكشف من الالتهام الذاتي، والحيوانات قد لا يكون هناك حاجة للطاقة للالنشاط الحركي المنتظم، الذييؤثر على نتائج العديد من الدراسات السلوكية اللاحقة. ومع ذلك قد يؤدي محرضات الدوائية أيضا إلى آثار جانبية نظرا لعدم وجود خصوصية للمسار الالتهام الذاتي. ورئيسيا rapamycin الالتهام الذاتي محفز ومشتقاته قمع النشاط mTOR س ويسبب ضعف التمثيل الغذائي والمناعة 18، 19، 20، والتي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار في التصميم التجريبي للعلاج على المدى الطويل. وهكذا، ونحن نعمل على المزيد من الطرق الفسيولوجية وقوية لتفعيل الالتهام الذاتي في النماذج الحيوانية.

ممارسة مؤخرا نحن وغيرنا قد حددت باعتبارها فعالية وأسرع وأكثر أمانا محفز الالتهام الذاتي في الجسم الحي 7، 8، 9. وقد استخدمت كل من ممارسة القسري من قبل حلقة مفرغة وممارسة الطوعية عن طريق تشغيل عجلة لتحليل آثار التمرينات على الالتهام الذاتي لctivation، مع وجود اختلافات في مدة التمرين وكثافة 21 و 22. على سبيل المثال، ساعة من حلقة مفرغة تعمل (ابتداء من سرعة 10 م / دقيقة لمدة أقصاها 40 م / دقيقة) يدفع فرة lipidation LC3 في العضلات والهيكل العظمي 21، وعجلة الطوعية على المدى الطويل تشغيل لمدة 3 أشهر أو 4-5 أسابيع كما يزيد القاعدية الالتهام الذاتي ويعزز من التعبير عن البروتينات الالتهام الذاتي في العضلات والهيكل العظمي 21 و 22.

نحن هنا وصف ومقارنة الطريقتين (حلقة مفرغة وعجلة دوارة) إلى ممارسة الفئران، وقدم الأمثل بروتوكولات أقصر مع كفاءة عالية في تحريض الالتهام الذاتي. كل نهج له إيجابيات وسلبيات. نوبة واحدة من 90 دقيقة من ممارسة القسري على جهاز المشي كافية للحث على الالتهام الذاتي في الهيكل العظمي والعضلات والدماغ. لقد فعلنا مدار الساعة من ممارسة مفرغة 7، وجدت أن exerciالظروف ذاتها الموصوفة هنا لحث على المستوى القصوى من الالتهام الذاتي في الماوس العضلات والهيكل العظمي، والتي يتم التحقق من صحة أيضا من قبل الآخرين 23. في ظل هذه الظروف، الفئران الخضوع التمارين الرياضية. كما ذكرت سابقا، وبفعل التمارين الرياضية التي تعمل لفترات طويلة مع الزيادة التدريجية في بسرعة في حلقة مفرغة 24، 25، 26، في حين يتم الحصول على حالة اللاهوائية قبل مدة قصيرة من ممارسة كثافة عالية، مما يزيد من كتلة العضلات ولكن لا يعزز بالضرورة ممارسة التحمل 27 و 28. وعلاوة على ذلك، فإن سرعة تشغيل ذكرت هنا في هذا البروتوكول يرتبط بشكل إيجابي مع قدرة استهلاك الأكسجين، عن طريق وسائل غير مباشرة لتقييم القدرة الهوائية 29. وبالتالي، التمارين الرياضية في حلقة مفرغة هو وسيلة سريعة وفعالة للحث على الالتهام الذاتي.

ومع ذلك، forcإد تعمل في مكان مغلق قد بذل الضغط على الفئران. وهكذا، لتجنب إعطاء ضغوط إضافية على الحيوانات، ونحن نستخدم الإصبع إشارات تنبيه أو شرابات سلك كوسيلة للحفاظ على الفئران على التوالي، بدلا من المدمج في صدمة كهربائية. مقارنة مع حلقة مفرغة، واستخدام عجلة دوارة لديه العديد من المزايا. ومن اقل وطأة، لا تتطلب وقتا المراقبة الباحثين، وغير مريحة لدراسة الآثار الطويلة الأجل لتفعيل الالتهام الذاتي. بعد ممارسة على عجلة دوارة طوعية وبالتالي يولد التباين من حيث تشغيل المسافة والسرعة بين الفئران مختلفة أو الماوس نفسه في أيام مختلفة. وبالتالي، فمن الضروري لتشغيل الفئران على عجلة لفترة طويلة من الزمن (على سبيل المثال، عدة أسابيع) للحد من تقلب الفردية. الأهم من ذلك، يتطلب النهج أيضا باستخدام عداد المسافات ليلا للتحقق من أن الماوس يعمل في الواقع. قمنا بقياس متوسط ​​المسافات الطويلة من النوع البري C57BL / 6 الفئران على مدى فترة من 2 أسابيع، ووجد أنها تعمل يقاربالمطاف 1 كم / ليلة في بداية التدريب (يوم 1) ويمكن تشغيل ما يصل إلى 8-10 كم / الليل في يوم 14. وعموما، فإن عجلة دوارة هو وسيلة فعالة لتحفيز الالتهام الذاتي في معظم الأجهزة، على الرغم من أنه من الصعب لالتقاط تراكم جسيم بلعمي ذاتي في العضلات والهيكل العظمي مقارنة باستخدام حلقة مفرغة. والسبب هو أن العضلات والهيكل العظمي لديها تدفق ذاتية البلعمة عالية ومعدل تدهور جسيم بلعمي ذاتي سريع، الأمر الذي يتطلب حصاد الأنسجة فورا بعد تشغيل للكشف عن تحريض الالتهام الذاتي عن طريق قياس نقاط وGFP-LC3. في أي بروتوكول، نضح PFA السريع وتثبيت للأنسجة بعد القتل الرحيم الحيوان هو خطوة حاسمة من إجراء للحفاظ على الهياكل جسيم بلعمي ذاتي التي يتم على خلاف ذلك تدهورت بسهولة أثناء تشريح.

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام التمارين الرياضية لتحفيز الالتهام الذاتي في الأنسجة الماوس، بما في ذلك الدماغ والعضلات والهيكل العظمي. هذه الطرق يمكن استخدامها لدراسة آليات مسار الالتهام الذاتي في مaintenance وظيفة الأنسجة، مثل صيانة الميتوكوندريا 23، ودراسة الآثار الطويلة الأجل للتحريض الالتهام الذاتي بشأن تنظيم السلوك والصحة من نماذج الأمراض الحيوانية، مثل تعزيز تأثيرات مسكنة من المواد المخدرة 9. كل من طرق مفرغة وعجلة دوارة لحث على مستوى جيد من الالتهام الذاتي. ومع ذلك، فمن المهم النظر خلافاتهم عند اختيار أفضل نهج لتحقيق أهداف بحثية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Treadmill Columbus Instruments 150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel Super Pet 100079365 diameter 11.4 cm
Odometer Bell DASHBOARD 100
Syringe pump KD Scientific KDS100
Fluorescence microscope Nikon Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat Leica CM 1850UV
Homogenizer IKA 003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine CAYMAN CHEMICAL COMPANY 14194
Parafolmaldehye SIGMA-ALDRICH P6148 Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.
Mounting media Vector Laboratories H-1200
p62 antibody BD Biosciences 610833
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad Laboratories 161-0737
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
  2. Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
  3. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  4. Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
  5. Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
  6. Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
  7. He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
  8. He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
  9. Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
  10. Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
  11. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
  12. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  14. Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
  15. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
  16. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  17. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  18. Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
  19. Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
  20. Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
  21. Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
  22. Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
  23. Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
  24. Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
  25. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
  26. Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
  27. Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
  28. Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
  29. Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 120، الالتهام الذاتي، وممارسة، LC3، الدماغ، العضلات، الكلوروكين، المجهري، والماوس
تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rocchi, A., He, C. Activating… More

Rocchi, A., He, C. Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice. J. Vis. Exp. (120), e55099, doi:10.3791/55099 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter