Summary
Autophagy aktivering er nyttig i forebygging av en rekke sykdommer. En av de fysiologiske fremgangsmåter for å indusere autophagy in vivo er fysisk trening. Her viser vi hvordan du kan aktivere autofagi av aerob trening og måle autofagi nivåer i mus.
Introduction
Autophagy er en evolusjonært konservert degradering veien, som blir indusert i respons til forskjellige stressbetingelser som sult og hypoksi 1, 2. Under autofagi, dobbel-membran vesikler, kalt autophagosomes, innlemme unødvendige eller skadde subcellulære komponenter og transportere dem til lysosomer for degradering tre. Basal autofagi er viktig for cellulær funksjon og utvikling organisme, og svekket basal autophagy er innblandet i mange lidelser, inkludert nevrodegenerasjon, tumorigenese og type 2-diabetes 4, 5, 6.
Det mest kjente fysiologiske autofagi indus er sult. Den har imidlertid to store begrensninger. For det første tar sult lang tid til effektivt å indusere autophagy i dyr, for eksempel 48 timer med mat begrensning i musi de fleste organer. For det andre, sult knapt induserer hjerne autophagy, på grunn av en forholdsvis stabil næringstilførsel i hjernen. Faktisk er det også vanskelig å oppdage autofagi induksjon av små-molekyl induktorer, som mange medikamenter ikke kan passere blod-hjerne barrieren. Således, for bedre å analysere funksjonen av autophagy aktivering i patogenesen sykdom, vi nylig oppdaget at oppgaven er en mer potent fysiologisk metode for å indusere autophagy i løpet av kort tid 7, 8, 9. Sammenlignet med sult, er autofagi effektivt indusert av tredemølle å kjøre så fort som 30 min. Dermed er trening en praktisk og potent fysiologisk tilnærming for å studere mekanismen av autofagi i formidling helsemessige fordeler og forebygge sykdommer.
Det er flere protein markører for påvisning av autophagy aktivitet, blant annet LC3 og P62. LC3 (microtubule-assosiert protein 1A / 1B-light cHain 3) er et cytosolisk protein (LC3-I skjemaet), som er konjugert til PE (fosfatidyletanolamin) ved autophagy induksjon. PE-lipidert LC3 (LC3-II form) er rekruttert til autophagosomal membraner og kan brukes til å visualisere autophagosomes når merket med GFP. Dens trans fra cytosol til punktat strukturer av autophagosomes henhold mikroskopi er en indikasjon på autophagy induksjon. p62 er en last reseptor for Autophagy substrater (for eksempel ubiquitinering proteiner), og er inkorporert i autophagosomes også. Siden proteinet nedbrytes i lysosomer sammen med autophagosomes, kan nivåene brukes til å måle den autophagy fluksen. Her viser vi hvordan du bruker disse markørene for å kvantifisere autofagi i forskjellige muse vev forårsaket av aerob trening, herunder tvungen trening (tredemølle) og frivillig trening (løping hjul). De samme prosedyrer kan også bli brukt til in vivo måling av autophagy etter behandling av andre inducere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til retningslinjer godkjent av Northwestern University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. musemodeller
- Bruk 8-12 uker gamle mus i trening. For å oppdage utøves-induced autofagi in vivo, bruke GFP-LC3 transgene mus (C57BL / 6 bakgrunn) for bildediagnostikk og C57BL / 6 mus for biokjemiske analyser.
2. Anstrengelsesutløst Autophagy
- Setup tredemølle - tvungen trening
- Akklimatisere og trene musene på en 10 ° oppoverbakke åpen tredemøllen i 2 dager. På dag 1, utøve musene i 5 min ved 8 m / min, og på dag to, utøve musene i 5 min ved 8 m / min etterfulgt av en 5 min ved 10 m / min 10. Oppmuntre musene å kjøre med mild hånd dytt.
- På den 3. dagen, la musene gjennomgå en enkelt anfall av å kjøre i 90 min på 10 ° oppoverbakke tredemølle, starting med en hastighet på 10 m / min. Etter 40 min, øker tredemølle hastigheten ved en hastighet på 1 m / minutt hvert 10. minutt i totalt 30 minutter, og deretter øke hastigheten ved en hastighet på 1 m / min hver 5 min inntil den når 17 m / min, for totalt 90 minutter med trening tid og 1,070 meter med kjørt distanse.
- Sett den elektriske stimulus på en lav intensitet område (1,2 Hz), og oppmuntre musene å kjøre for å unngå gjentatt foten sjokk.
- For vev samling, avlive musene med isofluran inhalering, etterfulgt av cervikal dislokasjon umiddelbart etter trening. Andre godkjente eutanasi metoder kan også anvendes, slik som CO2 eller IP-injeksjon av andre anestetika. Nivået på autofagi synes ikke å bli påvirket av avlivingsmetode.
- Kjører oppsett hjul - frivillig trening
- Plasser en mus-kjører hjulet (11,4 cm diameter) inne i et bur med en single-huset mus.
- Kontroller kjører kapasitet ved hjelp av en sykkel kilometerteller.Sett opp hjulet parameter [avstand (i mm) per omdreining av hjulet] på 358 (11,4 * π). Mål kjørt distanse etter 24 timer.
- La musen kjøre frivillig for 2 uker med løpehjul. For vev samling, ofre musen i morgen etter innkjøringsperioden.
3. Autophagy Flux Evaluering
- For å måle autophagic flux under hvile og mosjon forhold, behandle mus med autofagi inhibitor klorokin i tre dager, og sammenligne dem med mus behandlet med PBS.
- Oppløs klorokin i PBS (5 mg / ml), og injisere klorokin i mus intraperitonealt i en dose på 50 mg / kg / dag i tre påfølgende dager. Offer mus og samle vev 3 timer etter den siste injeksjonen.
- For utøves mus, forbehandle dem med klorokin i to påfølgende dager i en dose på 50 mg / kg / dag. På den tredje dag, injisere musene med den samme konsentrasjon av klorokin, og etter90 min la dem kjøre på tredemølle for en annen 90 min.
- Avlive musene med isofluran inhalering, etterfulgt av cervikal dislokasjon. Samle vev umiddelbart etter å ha kjørt, slik at den samlede inkubasjonstid på klorokin er det samme som kontroll (hvile) mus (3 timer).
MERK: Du kan også bruke en enkelt injeksjon av klorokin å bestemme autofagi fluksen i mus vev.
4. Tissue Harvest og Fiksering
- Før vev høste forberede fosfat saltvann (PBS) og fersk 4% paraformaldehyde (PFA, forsiktighet: personlig verneutstyr påkrevet) i PBS ved en endelig pH på 7,4. Oppbevar begge løsninger ved 4 ° C.
- Fyll 30 ml sprøyte med 15 - 20 ml av 4% PFA (for GFP-LC3 mus). Koble sprøyten med en 20 G kateter nål.
- Etter øvelsen, avlive musene med isofluran inhalering, etterfulgt av cervikal dislokasjon.
- Plasser dyret på en ren arbeidsflate på egen back. Klipp og åpne brysthulen ved å kutte mellomgulvet å avsløre hjertet.
- Lage et lite snitt på leveren for å la blodet kommer ut, og injisere en total av 15 ml 4% PFA langsomt inn i den høyre ventrikkel i hjertet via kateteret til lungene og leveren slå helt blek. Perfuse musen umiddelbart etter trening økt, ved anvendelse av en sprøytepumpe med en konstant strømningshastighet på 90 ml / time.
- Etter perfusjon, fjern nålen og samle vev av interesse (f.eks hjerne 11 og skjelettmuskel). For skjelettmuskulatur, dissekere vastus lateralis. Kort beskrevet pull huden på benet bakover for å eksponere muskler, lokalisere quadriceps femoris 12, og dissekere ut vastus lateralis, som er den ytre muskelen er festet til den øvre delen av lårbenet.
- For ytterligere fiksering og dehydrering, plasserer vev av GFP-LC3 mus i 4% PFA i 24 timer ved 4 ° C, og deretter overføre dem til 15%sukrose-PBS ved 4 ° C over natten eller inntil vevet har slått seg ned, og deretter til 30% sukrose-PBS ved 4 ° C over natten eller lenger lagring. Hold prøvene i mørket så mye som mulig så de kan være følsomme for sterkt lys.
- For western blot-analyse smekk fryse vevet fra C57BL / 6 mus direkte i flytende nitrogen, og lagre dem ved -80 ° C.
5. Imaging Analyse av GFP-LC3 puncta
- tissue prosess
- Pre-behandle vev (tidligere løst i PFA og lagret i 30% sukrose) i innstøpningsmediet eksempel "Optimal Cutting Temperatur forbindelse« (OCT) i noen få minutter i en merket liten petriskål.
- Overfør vevet i en merket cryomold inneholdende nok frisk oktober å dekke vevet. Orienter snittflate mot bunnen av cryomold (tverrsnitt for vastus lateralis muskler og sagittal seksjon for hemi-hjernen). Unngå dannelse av bobler.
- freEze prøvene ved å plassere cryomold for noen min i en dekket skum kjøligere fylt med tørris, helt til oktober blir hvit. Pakk individuelle prøver i merkede folier, forsegle dem i en plastpose, og lagre dem ved -80 ° C over natten eller lenger.
- Bruk en cryostat å kutte prøve seksjoner med en tykkelse på 10 mikrometer, og monter delene på lysbildene. Oppbevar lysbilder ved -20 ° C, og alltid holde lysbilder vekk fra lys når det er mulig.
- Slide forberedelse
- Fjern lysbilder fra fryseren og tine dem i romtemperatur. Dekk vev seksjon med en dråpe montering media med DAPI. Plasser et dekkglass av passende størrelse på toppen og unngå bobledannelse.
- Bruk neglelakk for å forsegle kantene av dekkglass, tillate neglelakk tørke i mørke ved romtemperatur, og deretter lagre glir i en lystett beholder ved 4 ° C, eller fortsette med avbildning fangst av GFP-LC3 puncta.
- <strong> Kvantifisering av GFP - LC3 puncta ved fluorescens mikroskopi
- Utfør epifluorescence mikroskopi, ta bilder i samme tilstand (eksponering og innstillinger) for alle prøvene. For GFP, bruk en emisjon bølgelengde på 525 nm; for DAPI, bruker 490 nm. Erverve minst ti bilder per prøve ved anvendelse av et 60X objektiv for vastus lateralis og frontal cortex region av hjernen.
- Kvantifisere antallet GFP-LC3 puncta i en vev område på 2500 mikrometer to i hvert bilde for statistisk analyse, blindet for eksperimentelle grupper. Beregne gjennomsnittlig tall fra 10 bilder av hver prøve, ved hjelp av automatisk måling funksjon av "Object Count". Innstillinger for vastus lateralis muskelen er: Terskel L = 10, H = 200; 2X glatt; 1X ren, og innstillinger for hjernen frontal cortex er: Terskel L = 11, H = 200; 2X glatt; 1X ren.
6. Western Blot analyse på Autophagy Markers
- <strong> Tissue prosess
- Klargjør lyseringsbuffer: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; proteasehemmer og fosfatase inhibitor (fersk lagt).
- Fjerne vevet fra C57BL / 6 mus fra -80 ° C lagring. Skjær muskelvev i små biter med et barberblad før den følgende prosess. Legg 800 ul (for hemi-hjerne) eller 500 ul (for vastus lateralis) av kald lyseringsbuffer til prøven. Homogenisere prøven ved 4 ° C med en homogenisator ved en middels hastighet.
- Fullt lyserer den homogeniserte blandingen i ytterligere 30 minutter til 1 time ved 4 ° C med rotasjon.
- Spinne ned homogenatet ved 12.000 xg i 10 min ved 4 ° C, pelleten kastes, og samle supernatanten i et nytt rør.
- autophagy analyse
- Bestem proteinkonsentrasjonen av vev lysater ved hjelp av BCA Protein assay kit ifølge produsentens spesifikasjoner. Normal hver prøvetil den samme konsentrasjon.
- Kombiner prøven med 2 x Laemmli-prøvebuffer ved et 1: 1 forhold, koker det ved 95 ° C i 5 - 10 min, og fortsette med western blot analyse på autophagy markører 13, 14, som for eksempel p62 (anti-p62-antistoff, 1: 500 fortynning) og LC3 (anti-LC3 antistoff, 1: 500 fortynning). Koke prøvene umiddelbart etter tilsetning av prøvebuffer, som lengre inkubasjon på is kan generere flere nedbrutte bånd av LC3.
- Kvantifisere P62 og LC3 band av densitometry analyse ved hjelp ImageJ, og normalisere verdien til tilsvarende aktin band.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver to ulike metoder for å indusere autofagi i mus vev ved aerob trening: totalt 90 min av tvungen trening på en flerfelts tredemølle satte etter to dager med akklimatisering; eller to uker med frivillig trening på en løpehjul brukt av enkelt-huset mus. I hver øvelse protokollen, kan vi måle autofagi flux av fluorescens mikroskopi og western blot analyse i ulike organer.
Vi brukte en transgen muselinje som uttrykker GFP-merket LC3 som reporter system for å overvåke autofagi av trening en. Ved autofagi induksjon, translocates LC3 fra cytosol til autophagosome i punctate strukturer. Etter seksjonering, kan dannelsen av GFP-LC3 puncta være direkte visualisert ved fluorescens mikroskopi (figur 1A). Alternativt kan autophagosome strukturer også immunostained av en LC3 antistoff forbildebehandling. Enten 90 min på tredemølle trening eller 2 ukers frivillig løpe økt antall av GFP-LC3 puncta både i skjelettmuskel (vastus lateralis) og cerebral cortex, i forhold til hviletilstand (figur 1B). Det bør bemerkes at den frontale cortex regionen har vært den store området i hjernen hvor autophagy er tydelig fremkalt ved enten metode hittil. Trening også indusert omdannelse av LC3 fra cytosoliske formen (LC3-I) til lipid-konjugert form (LC3-II), som kan påvises ved western blot analyse (figur 1C).
Exercise-indusert økning av autophagosomes (representert ved LC3-II og GFP-LC3 puncta) skyldes en forhøyet autophagic flussmiddel, i stedet for en blokk i autophagosome degradering, vurdert ved anvendelse av inhibitorer av lysosomal degradering, slik som bafilomycin A1 eller klorokin . Her målte vi nedbrytningen av autophagic last reseptoren p62 som en exrikelig. Exercise (90 min på tredemølle) forårsaket en større degradering av p62 i skjelettmuskel enn hviletilstand, som ble reddet ved injeksjon med klorokin før trening (figur 2). De tilsvarende resultater er også observert med frivillig trening ved å kjøre hjul. Dermed aerob trening av tredemølle eller løpehjul induserer autophagy in vivo, målt ved steady-state nivå av LC3 og degradering av p62.
Figur 1. Aerobic Exercise Induserer Autophagy i Muse vev. Representative bilder (A) og kvantifisering (B) av GFP-LC3 puncta i skjelettmuskel (vastus lateralis) og hjerne (frontal cortex) av GFP-LC3 transgene mus under kontroll tilstand (hvile), etter 90 min for tvungen trening (tredemølle ) eller etter 2 uker med frivillig trening (hjul). Resultats representerer gjennomsnitt ± SEM av 10 bilder per mus. N = 5 mus. De følgende emisjonsbølgelengder ble anvendt: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) Western blot påvisning av LC3 i skjelettmuskulaturen (vastus lateralis) fra uthvilt og utøvd (med tredemølle) mus. Kvantifisering data representerer nivået av LC3-II normalisert til aktin (til venstre), og forholdet mellom LC3-II til LC3-I (høyre). N = 3 mus. Statistikken sammenligne hver verdi til kontrollprøven. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM *, P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001, t-test. Scale bar, 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Exercise Øker Autophagy Flux i Mouse Skeletal Muscle. (A) Western blotpåvisning av p62 i vastus lateralis fra uthvilt og utøves mus i nærvær eller fravær av lysosomale inhibitorer klorokin. (B) (venstre) Kvantifisering analyse av p62 normalisert til den tilsvarende aktin bandet. (Høyre) p62 fluksen blir bestemt ved å subtrahere den normaliserte verdien på densitometrisk PBS-behandlede p62 fra den for kloroquin-behandlede P62. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM N = 3 mus. * P <0,05, t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Autophagy er en katabolsk prosess som gir energi og reduserer cytotoksisitet av lysosomal degradering av cytoplasma komponenter eller skadede organeller. Studerer autofagi er viktig å forstå at reguleringen av cellulær homeostase og mekanismene for stressrespons. Nye modeller og metoder dukker opp i forskningsfeltet 15, for å studere hvordan nedsatt autofagi bidrar til en rekke patologiske prosesser 16, 17.
Nutrient deprivasjon (sult) og farmakologisk induksjon anvendes vanligvis fremgangsmåter for å indusere autophagy in vitro og in vivo. Disse metodene, spesielt for dyremodeller, kan vise negative effekter som kan påvirke det samlede resultatet. For eksempel, siden det krever minst 48 timer av sult for å indusere et påvisbart nivå av autophagy, dyrene ikke kan ha energi som er nødvendig for vanlige motor-aktivitet, hvilkenpåvirker utfallet av mange påfølgende atferdsstudier. Ennå farmakologiske indusere kan også føre til bivirkninger på grunn av deres mangel på spesifisitet til autophagy pathway. Den store autofagi indus rapamycin og dets derivater undertrykke mTOR aktivitet og forårsake metabolsk dysfunksjon og immunsuppresjon 18, 19, 20, som bør tas i betraktning i den eksperimentelle design for langvarig behandling. Derfor har vi jobbet med flere fysiologiske og robuste måter for autofagi aktivering i dyremodeller.
Nylig har vi og andre har identifisert øvelse som en effektiv, raskere og sikrere autophagy inducer in vivo 7, 8, 9. Både tvunget trening av tredemølle og frivillig trening ved å kjøre hjulet har blitt brukt til å analysere effekten av trening på autofagi enctivation, med variasjoner i øvelsen varighet og intensitet 21, 22. For eksempel, en time av tredemølle kjører (som starter ved en hastighet av 10 m / min til et maksimum på 40 m / min) induserer rikelig LC3 lipidering i skjelettmuskel 21, og på lengre sikt frivillig hjul som kjører i 3 måneder eller 4 - 5 uker øker også basal autofagi og forbedrer ekspresjonen av autophagy proteiner i skjelettmuskel 21, 22.
Her har vi beskrevet og sammenlignet de to metodene (tredemølle og kjører hjul) å utøve mus, og present optimalisert kortere protokoller med høy effektivitet i autofagi induksjon. Hver tilnærming har fordeler og ulemper. En enkelt anfall av 90 min av tvungen trening på tredemølle er tilstrekkelig til å indusere autofagi i skjelettmuskulatur og hjernen. Vi har gjort en gang løpet av tredemølle trening 7, og funnet ut at exerciSE vilkårene som er beskrevet her indusere maksimale nivået av autofagi i mus skjelettmuskulatur, som også er validert av andre 23. Under disse forholdene, mus gjennomgå aerob trening; som tidligere rapportert, er aerob trening indusert ved langvarig å kjøre med gradvis økning i hastigheter på en tredemølle 24, 25, 26, mens den anaerobe tilstand oppnås ved en kort varighet av høy intensitet, noe som øker muskelmasse, men ikke nødvendigvis forbedre utøvelse utholdenhet 27, 28. Videre løpehastigheten rapportert her i denne protokollen positivt korrelerer med oksygenforbruk kapasitet, ved indirekte metoder for å vurdere den aerobe kapasiteten 29. Derfor aerob trening på en tredemølle er en rask og effektiv måte å indusere autofagi.
Men forced kjører i et lukket rom kan utøve stress til mus. Derfor, for å unngå å gi ekstra stress for dyr, vi bruker finger nudges eller tråd dusker som en metode for å holde mus kjører, i stedet for den innebygde elektriske støt. I forhold til tredemøllen, bruk av løpehjulet har mange fordeler. Det er mindre stressende, krever ikke forskeres observasjon tid, og er praktisk å studere langtidseffekter av autofagi aktivering. Likevel trening på en løpehjul er frivillig og dermed genererer variasjon når det gjelder å kjøre avstand og hastighet mellom forskjellige mus eller samme musen på ulike dager. Derfor er det nødvendig å kjøre mus på et hjul for en lengre tidsperiode (f.eks, flere uker) for å minimalisere den individuelle variabilitet. Viktigere, den tilnærmingen krever også bruker en kilometerteller om natten for å bekrefte at musen er faktisk kjører. Vi målte gjennomsnittlige kjørt distanse fra villtype C57BL / 6-mus over en periode på 2 uker, og fant at de kjører approxiinstans 1 km / natt i begynnelsen av treningen (dag 1) og kan kjøre opptil 8 - 10 km / natt på dag 14. Totalt sett er løpehjulet en effektiv metode for å stimulere autofagi i de fleste organer, selv om, er det vanskeligere å fange autophagosome opphopning i skjelettmuskulatur forhold til å bruke tredemøllen. Årsaken er at skjelettmuskulatur har en høy autophagic flux og en rask autophagosome nedbrytningshastigheten, noe som krever umiddelbar vev innhøsting etter å ha kjørt for å oppdage autofagi induksjon av GFP-LC3 puncta måling. I begge protokoll, hurtig PFA perfusjon og fiksering av vevet etter at dyret eutanasi er et kritisk trinn i fremgangsmåten for å bevare de autophagosome strukturer som ellers lett nedbrytes under dissekering.
Denne protokollen viser hvordan du bruker aerobic trening for å stimulere autofagi i mus vev, inkludert hjernen og skjelettmuskulatur. Disse metodene kan brukes til å studere mekanismene i autophagy bane i maintenance av vev funksjon, slik som mitokondrie vedlikehold 23, og å studere de langsiktige effektene av autofagi induksjon om regulering av atferd og helse dyresykdomsmodeller, for eksempel styrke smertestillende effekten av cannabinoider 9. Både tredemølle og kjører hjul metoder indusere et godt nivå av autophagy; likevel er det viktig å vurdere sine forskjeller når du velger den beste tilnærmingen til å møte ulike forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
