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Biology

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/55099

Summary

Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.

Introduction

Autophagy é uma via de degradação evolutivamente conservada, a qual é induzida em resposta a diversas condições de stress tais como hipoxia fome e 1, 2. Durante a autofagia, vesículas de dupla membrana, chamada autofagossomas, incorporar componentes subcelulares desnecessários ou danificados e transportá-los para lisossomos para degradação 3. Autofagia basal é essencial para a função celular e desenvolvimento organismo, e autofagia basal prejudicada está implicada em muitas doenças, incluindo a neurodegeneração, tumorigénese e diabetes 4, 5, 6 do tipo 2.

O indutor autofagia fisiológico mais conhecido é fome. No entanto, tem duas limitações principais. Em primeiro lugar, a fome leva um longo período para induzir eficazmente a autofagia em animais, por exemplo, 48 horas de restrição alimentar em ratosna maioria dos órgãos. Em segundo lugar, apenas induz inanição autofagia cérebro, devido a um fornecimento de nutrientes relativamente estável no cérebro. Na verdade, também é difícil de detectar indução autofagia por indutores de pequenas moléculas, como muitas drogas não pode passar a barreira hemato-encefálica. Assim, para analisar melhor a função de activação autofagia na patogênese da doença, descobrimos recentemente que o exercício é um método fisiológico mais potente para induzir autofagia num curto período de tempo de 7, 8, 9. Em comparação com a fome, a autofagia é efetivamente induzido pela esteira correndo tão rápido quanto 30 min. Assim, o exercício é uma abordagem conveniente e potente fisiológico para estudar o mecanismo de autofagia na mediação de benefícios para a saúde e prevenção de doenças.

Existem vários marcadores proteicos para a detecção de actividade autofagia, incluindo LC3 e p62. LC3 (associada a microtúbulos de proteína 1A / 1B-luz cHain 3) é uma proteína citosólica (LC3-I formam) que é conjugado com PE (fosfatidiletanolamina) após indução autofagia. LC3 PE-lipidada (forma LC3-II) é recrutado para membranas autophagosomal e pode ser usado para visualizar autofagossomas quando marcado com GFP. A sua translocação para o citosol a partir de estruturas puntiformes de autofagossomas sob microscopia é uma indicação da indução autofagia. p62 é um receptor de carga para substratos autophagy (tais como proteínas de ubiquitinação), e é incorporado autofagossomas bem. Uma vez que a proteína é degradada em lisossomas, juntamente com autofagossomas, os seus níveis podem ser usadas para medir o fluxo de autofagia. Aqui nós mostramos como utilizar esses marcadores para quantificar a autofagia em diferentes tecidos de camundongos induzida por exercício aeróbico, incluindo exercício forçado (esteira) e exercício voluntário (rodas de correr). Os mesmos procedimentos podem também ser aplicados para a medição in vivo de autofagia após o tratamento de outros indutores.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Northwestern (IACUC).

1. mouse Models

  1. Use ratos 8-12 semanas de idade no treinamento físico. Para detectar autofagia induzida exercida in vivo, os ratinhos transgénicos usar GFP-LC3 (C57BL / 6, fundo) para estudos de imagiologia e murganhos C57BL / 6 para as análises bioquímicas.

2. Autophagy induzida pelo exercício

  1. Configuração de esteira - exercício forçado
    1. Aclimatar e treinar os ratos em um 10 ° esteira aberta para cima por 2 dias. No dia 1, exercer a ratos durante 5 min a 8 m / min, e no dia 2, exercer os ratos durante 5 min a 8 m / min, seguido por mais 5 min a 10 m / min 10. Incentivar os ratos para ser executado por cotovelada mão suave.
    2. No dia, deixou os ratos submetidos a uma única sessão de correr por 90 min no 10 ° subida esteira, starting a uma velocidade de 10 m / min. Após 40 minutos, aumente a velocidade da esteira a uma velocidade de 1 m / min a cada 10 min durante um total de 30 min, e em seguida aumentar a velocidade com a velocidade de 1 m / min a cada 5 minutos até atingir 17 m / min, para um total de 90 min de tempo de exercício e 1.070 metros de a distância de funcionamento.
    3. Defina o estímulo elétrico na faixa de baixa intensidade (1,2 Hz), e incentivar os ratos que correr para evitar choques repetidos pé.
    4. Para a coleta de tecidos, eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocamento cervical imediatamente após o exercício. Outros métodos de eutanásia aprovados também podem ser utilizados, tais como CO2 ou injecção IP de outros anestésicos. O nível de autofagia não parece ser afectado por métodos de eutanásia.
  2. Executar a instalação roda - exercício voluntário
    1. Coloque uma roda de execução do rato (11,4 cm de diâmetro) dentro de uma gaiola com um rato alojados individualmente.
    2. Verificar a capacidade corrente e com uma conta-quilómetros de bicicleta.Configure o parâmetro de roda [distância (em mm) por rotação completa da roda] em 358 (11,4 * π). Medir a distância percorrida após 24 horas.
    3. Deixe o mouse correr voluntariamente para 2 semanas com a roda de corrida. Para a coleta de tecidos, sacrificar o mouse na parte da manhã após o período de execução.

3. Autophagy Avaliação Flux

  1. Para medir o fluxo autofágica sob repouso e exercício condições, tratar ratos com a cloroquina inibidor autofagia por três dias e compará-los com os ratinhos tratados com PBS.
    1. Dissolve-se cloroquina em PBS (5 mg / ml), e injectar cloroquina em ratinhos por via intraperitoneal na dose de 50 mg / kg / dia durante três dias consecutivos. Sacrificar os ratinhos e recolhem tecidos de 3 horas após a última injecção.
    2. Para ratinhos exercidas, o pré-tratamento com cloroquina-los durante dois dias consecutivos, a uma dose de 50 mg / kg / dia. No terceiro dia, injectar os ratinhos com a mesma concentração de cloroquina, e depois90 min deixá-los correr na esteira por mais 90 min.
    3. Eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical. Recolhe tecidos imediatamente após a execução, de modo que o tempo total de incubação de cloroquina é o mesmo que o controlo (de repouso) ratinhos (3 h).
      NOTA: Como alternativa, usar uma única injecção de cloroquina para determinar o fluxo autofagia em tecidos de ratinho.

4. Tissue Colheita e Fixação

  1. Antes da colheita de tecido preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fresco a 4% de paraformaldeído (PFA, cuidado: equipamentos de protecção pessoal necessário) em PBS a um pH final de 7,4. Armazenar ambas as soluções a 4 ° C.
  2. Encher 30 ml de seringa com 15 - 20 ml de 4% de PFA (para ratinhos GFP-LC3). Ligar a seringa com uma agulha G 20 cateter.
  3. Depois do exercício, sacrificar os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical.
  4. Colocar o animal em uma superfície de trabalho limpa em seu back. Cortar e abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma para expor o coração.
  5. Fazer uma pequena incisão no fígado para permitir que o sangue sair, e injectar um total de 15 ml de 4% de PFA lentamente dentro do ventrículo direito do coração, através do cateter, até que o pulmão e fígado transformar completamente pálido. Perfundir o rato imediatamente após a sessão de exercício, usando uma bomba de seringa com um caudal constante de 90 ml / hr.
  6. Após a perfusão, retire a agulha e recolher tecidos de interesse (por exemplo cerebrais 11 e no músculo esquelético). Para o músculo esquelético, dissecar vasto lateral. Resumidamente, puxar a pele da perna para trás para expor a musculatura, localizar os quadríceps 12, e dissecar vasto lateral, que é o músculo externo ligado à porção superior do osso femoral.
  7. Para mais a fixação e a desidratação, colocar os tecidos de murganhos GFP-LC3 em PFA a 4% durante 24 h a 4 ° C, e, em seguida, transferi-los para 15%sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou até que os tecidos tenham resolvido, e, em seguida, a 30% de sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou durante mais tempo de armazenamento. Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível uma vez que podem ser sensíveis a uma luz forte.
  8. Para a análise Western Blot encaixe congelar os tecidos a partir de ratinhos C57BL / 6 directamente em azoto líquido, e armazená-las a -80 ° C.

5. Análise de Imagem de GFP-LC3 puncta

  1. processo de tecido
    1. Pré-tratamento dos tecidos (previamente fixas em PFA e armazenados em 30% de sacarose) em forma de incorporação tais como "composto de temperatura óptima de corte" (OCT) durante alguns minutos numa pequena placa de petri rotulados.
    2. Transferir o tecido em um cryomold marcado contendo o suficiente fresco OCT para cobrir o tecido. Orient a superfície de corte para a parte inferior do cryomold (seção transversal para o músculo vasto lateral e corte sagital para o hemi-cérebro). Evitar a formação de bolhas.
    3. freeze as amostras colocando a cryomold para poucos minutos em um aplicador coberto de espuma cheio de gelo seco, até que a OCT torna-se branca. Enrole amostras individuais em chapas marcadas, selá-los em um saco plástico, e armazená-los a -80 ° C durante a noite ou mais.
    4. Use um criostato para cortar seções de amostra com uma espessura de 10 um, e montar as seções sobre os slides. Armazenar as lâminas a -20 ° C, e manter sempre as lâminas ao abrigo da luz, sempre que possível.
  2. preparação da lâmina
    1. Retirar as lâminas do congelador e descongelar-los à temperatura ambiente. Cobrir a secção de tecido com uma gota de meio de montagem com DAPI. Coloque uma lamela de tamanho adequado no topo e evitar a formação de bolhas.
    2. Use unha polonês para selar as bordas da lamela, permitir que unha polonês para secar no escuro à temperatura ambiente, e, em seguida, armazenar as lâminas em um recipiente à prova de luz, a 4 ° C, ou prosseguir com captura de imagem de puncta GFP-LC3.
  3. <strong> Quantificação da GFP - LC3 puncta por microscopia de fluorescência
    1. Execute microscopia de epifluorescência, capturando imagens na mesma condição (de exposição e ajustes) para todas as amostras. Para GFP, usar um comprimento de onda de emissão de 525 nm; para DAPI, utilizar 490 nm. Adquirir, pelo menos, dez imagens por exemplo utilizando uma objectiva de 60X para vasto lateral e a região do córtex frontal do cérebro.
    2. Quantificar o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em uma área de tecido de 2,500 uM 2 em cada imagem para análise estatística, cego para os grupos experimentais. Calcule o número médio de 10 imagens de cada amostra, utilizando a função de medição automática de "Contagem de Objetos". Definições para o músculo vasto lateral são: Limiar L = 10, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo, e configurações para o córtex frontal do cérebro são: Limiar L = 11, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo.

6. Ocidental Análise Blot em Autophagy Markers

  1. <strong> processo Tissue
    1. Preparar o tampão de lise: Tris-HCl 50; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; inibidor da protease e inibidores de fosfatase (recém-adicionado).
    2. Remover o tecido de murganhos C57BL / 6 a partir de -80 ° C de armazenamento. Cortar o tecido muscular em pequenos pedaços com uma lâmina de barbear antes com o seguinte processo. Adicionar 800 uL (por hemi-cérebro), ou 500 ul (para vasto lateral) de tampão de lise frio para a amostra. Homogeneizar a amostra a 4 ° C com um homogeneizador a uma velocidade média.
    3. Totalmente lisar a mistura homogeneizada durante mais 30 minutos a 1 hora a 4 ° C com rotação.
    4. Girar o homogenato a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, descartar o sedimento, e recolher o sobrenadante num novo tubo.
  2. análise de autofagia
    1. Determinar a concentração de proteína de lisados ​​de tecido, utilizando o kit de ensaio de BCA proteína de acordo com as especificações do fabricante. Normalizar cada amostraà mesma concentração.
    2. Combinar a amostra com o tampão de amostra 2x Laemmli numa proporção de 1: 1, ferver a 95 ° C durante 5 - 10 min, e prosseguir com a análise de Western blot em autofagia marcadores 13, 14, tal como um anticorpo anti-p62 a p62 (, diluição de 1: 500) e anticorpo anti-LC3 LC3 (, diluição 1: 500). Ferver as amostras imediatamente após a adição do tampão de amostra, como mais tempo de incubação no gelo pode gerar múltiplas bandas degradadas de LC3.
    3. Quantificar p62 e LC3 bandas por análise de densitometria usando ImageJ, e normalizar o valor para a banda de actina correspondente.

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Representative Results

Este protocolo descreve dois métodos diferentes para induzir a autofagia em tecidos de camundongos por exercício aeróbico: um total de 90 min de exercício forçado em uma esteira multi-lane passou por dois dias de aclimatação; ou duas semanas de exercício voluntário em uma roda de corrida usados ​​por camundongos alojados individualmente. Em cada protocolo de exercício, podemos medir o fluxo autofagia por microscopia de fluorescência e análise western blot em vários órgãos.

Nós usamos uma linha de rato transgénico expressando LC3 GFP como um sistema repórter para monitorizar a autofagia pelo exercício 1. Após a indução autofagia, LC3 transloca desde o citosol para o autophagosome em estruturas puntiformes. Depois de cortar, a formação de pontos lacrimais GFP-LC3 pode ser directamente visualizadas por microscopia de fluorescência (Figura 1A). Alternativamente, as estruturas podem ser também autophagosome imunocoradas por um anticorpo para a LC3imagiologia. De qualquer 90 min de exercício esteira ou 2 semanas de corrida voluntária aumentou o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em ambos músculo esquelético (músculo vasto lateral) e córtex cerebral, em comparação à condição de repouso (Figura 1B). Deve notar-se que a região do córtex frontal tem sido a principal região no cérebro onde é claramente autofagia induzida por qualquer um dos métodos até agora. Exercício também induziu a conversão de LC3 a partir da forma citosólica (LC3-I) para a forma conjugados com lípidos (LC3-II), que pode ser detectada por análise de Western blot (Figura 1C).

incremento induzida pelo exercício de autofagossomas (representados por LC3-II e GFP-LC3 pontos lacrimais) é devido a um fluxo autophagic elevada, em vez de um bloco na degradação autophagosome, avaliada pelo uso de inibidores da degradação lisossomal, tal como a bafilomicina A1 ou cloroquina . Aqui nós medimos a degradação do p62 do receptor de carga autophagic como um examplo. Exercício (90 min de esteira) provocou uma degradação mais elevado de p62 no músculo esquelético do que a condição de repouso, o qual foi resgatada por injecção com cloroquina antes do exercício (Figura 2). Os resultados similares também são observados com exercício voluntário executando rodas. Assim, o exercício aeróbico por esteira ou rodas de correr induz a autofagia in vivo, medido pelo nível de estado estacionário de LC3 e a degradação da p62.

figura 1
Figura 1. Exercício aeróbico Induz Autophagy no mouse tecidos. Imagens representativas (A) e quantificação (B) dos pontos lacrimais GFP-LC3 no músculo esquelético (músculo vasto lateral) e cérebro (córtex frontal) dos ratinhos transgénicos GFP-LC3 sob a condição de controle (em repouso), Após 90 min de exercício forçado (esteira ) ou após 2 semanas de exercício voluntário (roda). Resultados representam a média ± SEM de 10 fotos por mouse. N = 5 ratinhos. Foram utilizados os seguintes comprimentos de onda de emissão: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) a detecção de Western blot de LC3 no músculo esquelético (vasto lateral) de camundongos descansado e exercitados (pela esteira). dados de quantificação representam o nível de LC3-II normalizado para actina (esquerda) e a proporção de LC3-II para LC3-I (direita). N = 3 ratos. Estatística é comparar cada valor para a amostra de controlo. Os resultados representam a média ± sem *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001, teste t. Barra de escala, 25 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. O exercício aumenta Autophagy Flux no mouse Skeletal Muscle. (A) Western blotdetecção de p62 no vasto lateral de ratos descansado e exercidas na presença ou ausência da cloroquina inibidores do lisossoma. (B) (esquerda) Quantificação da análise de p62 normalizada para a banda de actina correspondente. (Direita) O fluxo de p62 é determinada subtraindo-se o valor densitométrico normalizada de p62 tratado com PBS a partir de que p62 tratadas com cloroquina. Os resultados representam a média ± SEM n = 3 ratos. *, P <0,05, teste-t. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A autofagia é um processo catabólico que fornece energia e reduz a citotoxicidade pela degradação lisossomal de componentes citoplasma ou organelas danificadas. Estudar a autofagia é importante compreender a regulação da homeostase celular e os mecanismos de resposta ao estresse. Novos modelos e metodologias estão a surgir no domínio da investigação 15, para estudar como autofagia deficiente contribui para inúmeros processos patológicos 16, 17.

A perda de nutrientes (jejum) e a indução farmacológica são abordagens comumente usado para induzir autofagia in vitro e in vivo. Estes métodos, especialmente para modelos animais, podem mostrar efeitos adversos que podem influenciar os resultados globais. Por exemplo, uma vez que requer, pelo menos, 48 ​​horas de inanição de induzir um nível detectável de autofagia, os animais podem não ter energia necessária para a actividade motora normal, a qualafecta os resultados de muitos estudos comportamentais subsequentes. No entanto, os indutores farmacológicos podem também conduzir a efeitos colaterais, devido à sua falta de especificidade para a via autofagia. A principal rapamicina autofagia indutor e os seus derivados de suprimir a actividade da mTOR e causar disfunção metabólica e imunossupressão 18, 19, 20, que devem ser tidos em consideração na concepção experimental para o tratamento a longo prazo. Assim, temos vindo a trabalhar sobre as formas mais fisiológicas e robustos para a ativação da autofagia em modelos animais.

Exercício recentemente, e outros têm identificado como uma forma eficaz, segura indutor autofagia mais rápido e in vivo 7, 8, 9. Ambos exercício forçado pela esteira e exercício voluntário executando roda têm sido usados ​​para analisar os efeitos do exercício sobre a autofagia umctivation, com variações na duração do exercício e intensidade 21, 22. Por exemplo, uma hora de esteira rolante (começando a uma velocidade de 10 m / min a um máximo de 40 m / min) induz lipidação abundante LC3 no músculo esquelético 21, e roda voluntária longo prazo executando durante 3 meses ou 4 - 5 semanas também aumenta basal autofagia e aumenta a expressão de proteínas no músculo esquelético autophagy 21, 22.

Aqui nós descritos e comparados os dois métodos (esteira e rodas de corrida) para exercer ratos, e apresentou otimizado protocolos mais curtos com alta eficiência na indução de autofagia. Cada abordagem tem prós e contras. Uma única sessão de 90 minutos de exercício forçado em esteira é suficiente para induzir a autofagia no músculo esquelético e cérebro. Temos feito um curso de tempo de exercício em esteira 7, e descobriu que o exerciSE condições aqui descritas induzem o nível máximo de autofagia no músculo esquelético de rato, que também é validado por outros 23. Sob estas condições, os ratos submetidos a exercício aeróbico; Como relatado anteriormente, o exercício aeróbico é induzida pela execução prolongada com aumentos graduais na velocidade em uma escada rolante 24, 25, 26, ao passo que a condição anaeróbica é obtido por um curto período de exercício de alta intensidade, o que aumenta a massa muscular, mas não necessariamente aumentar o exercício endurance 27, 28. Além disso, a velocidade de corrida aqui relatados neste protocolo correlaciona-se positivamente com a capacidade de consumo de oxigênio, por métodos indirectos para avaliar a capacidade aeróbia 29. Portanto, o exercício aeróbico em esteira é uma maneira rápida e eficaz para induzir a autofagia.

No entanto, forced executado em um espaço fechado pode exercer o estresse aos ratos. Assim, para evitar dar estresse adicional aos animais, usamos dedo cutuca ou borlas de fio como um método para manter os ratos correndo, em vez de o built-in choque elétrico. Em comparação com o tapete rolante, a utilização da roda de funcionamento tem muitas vantagens. É menos estressante, não requer tempo de observação dos pesquisadores, e é conveniente para estudar os efeitos a longo prazo da ativação autofagia. No entanto, o exercício em uma roda de corrida é voluntária e, portanto, gera variabilidade em termos de funcionamento de distância e velocidade entre os diferentes camundongos ou a mesma do mouse em dias diferentes. Portanto, é necessário executar os ratos de uma roda, por um período de tempo prolongado (por exemplo, várias semanas) para minimizar a variabilidade individual. Importante, a abordagem também requer o uso de um conta-quilómetros à noite para verificar se o mouse está atualmente em execução. Nós medimos a distância média de corrida de tipo selvagem C57BL / 6 ratos ao longo de um período de 2 semanas, e descobriu que eles correm aproximadamente 1 km / noite no início do treinamento (dia 1) e pode ser executado até 8 - 10 km / noite no dia 14. No geral, a roda de corrida é um método eficaz para estimular a autofagia na maioria dos órgãos, embora, é mais difícil para capturar acumulação autophagosome no músculo esquelético em relação ao uso da esteira. A razão é que o músculo esquelético tem um alto fluxo autophagic e uma velocidade de degradação rápida autophagosome, o que requer a colheita de tecido imediatamente após a execução para detectar a indução autofagia por medição de pontos lacrimais GFP-LC3. Em ambos os protocolos, rápida perfusão PFA e fixação dos tecidos após a eutanásia de animais é uma etapa crítica do processo para preservar as estruturas autophagosome que de outra forma facilmente degradados durante a dissecção.

Este protocolo demonstra como usar o exercício aeróbico para estimular a autofagia em tecidos de camundongos, incluindo cérebro e músculo esquelético. Estes métodos podem ser utilizados para estudar os mecanismos da via autofagia na manutenção da função do tecido, como a manutenção mitocondrial 23, e para estudar os efeitos a longo prazo de indução de autofagia na regulação do comportamento e saúde de modelos de doenças dos animais, tais como melhorar os efeitos analgésicos da canabinóides 9. Tanto a esteira e rodas de corrida métodos induzir um bom nível de autofagia; no entanto, é importante considerar suas diferenças ao escolher a melhor abordagem para atender a diferentes objetivos de pesquisa.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Treadmill Columbus Instruments 150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel Super Pet 100079365 diameter 11.4 cm
Odometer Bell DASHBOARD 100
Syringe pump KD Scientific KDS100
Fluorescence microscope Nikon Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat Leica CM 1850UV
Homogenizer IKA 003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine CAYMAN CHEMICAL COMPANY 14194
Parafolmaldehye SIGMA-ALDRICH P6148 Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.
Mounting media Vector Laboratories H-1200
p62 antibody BD Biosciences 610833
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad Laboratories 161-0737
ImageJ NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos
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Rocchi, A., He, C. ActivatingMore

Rocchi, A., He, C. Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice. J. Vis. Exp. (120), e55099, doi:10.3791/55099 (2017).

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