Summary
Cette technique démontre d'une manière efficace de se préparer à réplication déficiente stocks rétroviraux codant pour une oncogène humain, et par la suite utilisé pour l'induction de syndromes myéloprolifératifs dans le modèle murin.
Abstract
Nos études de laboratoire humaine myéloprolifératifs induite par les oncogènes tels que Bcr-Abl ou facteur de croissance dérivé des récepteurs oncogènes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Nous sommes capables de modéliser et d'étudier une maladie humaine, comme dans notre modèle de souris, par la transplantation de cellules de moelle osseuse préalablement infectés par un rétrovirus exprimant l'oncogène d'intérêt. La réplication des rétrovirus défectifs codant pour une oncogène humain et un marqueur (GFP, RFP, gène de résistance aux antibiotiques, etc) est produit par un protocole de transfection transitoire en utilisant des cellules 293T, une lignée de cellules épithéliales rénales transformés par le produit du gène E1A d'adénovirus. 293 cellules ont la propriété inhabituelle d'être très transfectables par phosphate de calcium (Capo 4), avec un maximum à 50-80% d'efficacité de transfection facilement réalisable. Ici, nous avons co-transfecter 293 cellules avec un vecteur rétroviral exprimant l'oncogène d'intérêt et un plasmide qui exprime les fonctions de conditionnement gag-pol-env, tel que le génome unique emballage construit kat ou PCL, dans ce cas le EcoPak plasmide. La transfection initiale est encore améliorée par l'utilisation de la chloroquine. Les stocks de virus de écotrope, recueillis dans le surnageant de culture de 48 heures. post-transfection, peuvent être conservés à -80 ° C et utilisés pour l'infection de lignées cellulaires en vue de la transformation et des études in vitro, ou des cellules primaires tels que les cellules de la moelle osseuse de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour une transplantation dans notre modèle de souris .
Protocol
- Le soir, avant la transformation des cellules plaque, au 293T 3-5x10 6 cellules / tissus 6 cultureplate cm.
Note: Nous utilisons des cellules 293T pour leur facilité de transfection et les cellules produisant le virus efficacyas. Ces cellules sont déficientes en emballage le virus moins un plasmide auxiliaire est introduite.
- Le premier matin, retirer délicatement les moyennes et les remplacer avec 4 ml de cellules 293T med contenant 25 mM de chloroquine. Mettez dans un incubateur pendant 1 heure.
Remarque: la plaque devrait être d'environ 80% de confluence.
- Pendant ce temps, préparer le virus de prise de mélange pour 2 plaques à la fois, dans des tubes de 5 ml:
- 2 x 10 mg de construire plasmidique retroviral
- 2 x 5 mg d'emballage de construire (EcoPak),
- 2 x 62 ml de CaCl
- complète à 1 ml avec stériles O 2 ddH
Note: Bien que le plasmide rétroviral codant l'oncogène d'intérêt et un marqueur, EcoPak encode gag-pol-env. Ensemble avec les cellules 293T, ils vont produire un rétrovirus écotrope (RV) spécifique des cellules de souris, mais pas infectieux pour les cellules humaines. Fois à la chloroquine et du CaCl 2 a été démontré pour augmenter l'efficacité de la transfection.
- Ajouter 1ml de sterileHBS 2x goutte à goutte au mélange, tout doucement le tube vortex.
- Immédiatement ajouter cette solution à 2 plaques, 1 ml chacun, doucement, goutte à goutte.
- Mettez dans un incubateur pendant 7 à 11 heures.
- Dans la soirée (7 à 11 heures. Ultérieurement), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 5 ml de milieu 293T frais. Mettre en incubateur jusqu'à midi, le lendemain.
Remarque: cette étape est importante, car vous avez besoin pour décoller de la chloroquine à partir des cellules. Si on les garde pour des périodes de temps prolongées, la chloroquine est toxique. La solution dans les plaques semble floue, en raison d'une très fine, comme de la poussière précipitation du mélange de transfection.
Note: Il est important de faire tous les changements des médias avec une douceur extrême, comme les cellules ont été sensibilisés par la chloroquine, et peut facilement se détacher de la plaque.
- Le lendemain, 18 à 24 heures. avant de récupérer le virus (vers midi), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 3 ml de milieu 293T frais. Remplacer dans l'incubateur d'O / N.
- Le troisième matin (18 à 24 heures. Ultérieurement), doucement sucer le formulaire support les plaques avec une seringue de 10 ml muni d'une aiguille de 18 G. Ce surnageant contient les rétrovirus.
- Changer l'aiguille à un filtre à seringue de 45 mm, inverser la seringue plusieurs fois pour mélanger la solution ainsi, passer le surnageant à travers le filtre, et de l'aliquote pour cryotubes
Note: Alternativement, si vous faites 3 plaques + de virus, de la piscine tous les surnageants du même virus dans un 5 0 ml tube conique. Mélangez bien, puis les surnageants aliquote contenant le rétrovirus dans des cryotubes par filtrage.
- Les tubes contenant les surnageants virus complets sont conservés dans -80 ° C jusqu'à leur utilisation.
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Discussion
Quatre points essentiels seront d'assurer la réussite d'un bon stock viral:
- Les cellules 293T de production doivent être en très bonne santé, ce qui signifie qu'ils ont été séparés sur un calendrier très régulière, n'ont jamais été envahi, et sont étalées à la densité optimale de 3,5 à 5000000 pour 6 cm de plaque de culture tissulaire, afin qu'ils atteignent une densité de 80% de la plaque sur le matin de la transfection.
- L'addition de chloroquine améliore l'efficacité de transfection et le titre du virus ultérieure, environ 3 - à 5 fois, en stabilisant lysozomes cellulaire et l'augmentation de la fraction d'ADN qui atteint le noyau. Butyrate de sodium (un autre lysosome stabilisateur) a également été utilisé à cette fin. La chloroquine peut être omis, auquel cas changer le 7-11 moyennes heures. post-transfection à ce point n'est pas nécessaire.
- La qualité de l'ADN est très important. La méthode préférée de purification à la fois du vecteur et ADN plasmidique emballage est deux fois purifié par CsCl-bromure d'éthidium centrifugation de densité porteur. Nous aimons la concentration de l'ADN à au moins 1 mg / ml, et le rapport de DO 260/280 doit être comprise entre 1,75 à 1,90. Qiagen-ADN purifié travaillera également, bien que, dans les mains des auteurs, les résultats ne sont pas aussi bonnes. Il est important que le volume combiné des solutions d'ADN sont de petite taille (total <50 ul par ml final) pour éviter les effets néfastes de Tris et d'EDTA (TE) sur le précipité de phosphate de calcium.
- Le choix de la gamme de vecteur rétroviral et hôte de la construction de l'emballage sont importantes. Pour une expression stable dans les cellules souches hématopoïétiques murines, un vecteur basé sur le virus du sarcome myéloprolifératif est préférable. Un squelette du vecteur commun est le RI MIG, contenant une longue séquence MPSV répétition terminale, un site de clonage multiple pour l'introduction d'un oncogène, et un site en aval interne d'entrée du ribosome lié au gène de la protéine verte fluorescente améliorée (eGFP). Pour la transduction de la souris HSC, virus avec une gamme d'hôtes écotrope est optimal, mais ces stocks sont instables à température physiologique et ne peut être concentrée par centrifugation.
Certains points de contrôle: Si désiré, une fois récoltés, les cellules 293 peut être utilisé pour faire des lysats de protéines pour immunoblot pour vérifier l'expression des protéines codées par le vecteur rétroviral (par exemple, les savoirs traditionnels). Nous utilisons également un contrôle LacZ dans le plasmide codant pour plaque séparée au moment de la transfection (pas de vecteur d'emballage nécessaire) pour vérifier efficinecy transfection par bêta-gal test lorsque nous recueillons le surnageant des autres plaques. Remarque: ce sera de test des cellules et des réactifs, mais pas la qualité des plasmides utilisés pour rendre le virus.
Avant d'utiliser un virus, le titre doit être déterminé. Ceci est essentiel afin de faire correspondre les titres des stocks de virus différents dans la même expérience, et pour assurer la transduction efficace de cellules souches hématopoïétiques.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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