Summary
Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l'induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.
Abstract
I nostri studi di laboratorio malattie umane mieloproliferative indotta da oncogeni come Bcr-Abl o recettore del fattore di crescita derivato oncogeni (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, ecc.) Siamo in grado di modellare e studiare un essere umano-come la malattia nel nostro modello di topo, con il trapianto di cellule del midollo osseo precedentemente infettati con un retrovirus che esprime l'oncogene di interesse. Replica difettoso retrovirus che codifica una oncogene umano e un indicatore (GFP, RFP, gene di resistenza agli antibiotici, ecc) è prodotto da un protocollo di trasfezione transiente utilizzando cellule 293T, un essere umano linea di cellule renali epiteliali trasformate dal prodotto adenovirus gene E1A. 293 cellule hanno la proprietà di essere altamente insolito transfectable da fosfato di calcio (CAPO 4), con fino al 50-80% di efficienza di trasfezione facilmente raggiungibile. Qui, abbiamo co-trasfezione 293 cellule con un vettore retrovirale che esprime l'oncogene di interesse e un plasmide che esprime la gag-pol-env funzioni packaging, come ad esempio il singolo genoma imballaggio costruisce kat o PCL, in questo caso la Ecopack plasmide. La transfezione iniziale è ulteriormente migliorata con l'uso di clorochina. Gli stock di virus ecotropic, raccolti come supernatante di coltura 48 ore. post-trasfezione, possono essere conservati a -80 ° C ed utilizzati per l'infezione di linee cellulari in vista della trasformazione e studi in vitro, o cellule primarie come le cellule del midollo osseo di topo, che possono poi essere utilizzati per il trapianto nel nostro modello di topo .
Protocol
- La sera prima trasformazione, le cellule piastra 293T a 3-5x10 6 cellule / 6 cultureplate tessuto cm.
Nota: utilizzare le cellule 293T per la loro facilità di trasfezione delle cellule e del virus efficacyas produzione. Queste cellule sono carenti nella confezione il virus a meno che un aiutante plasmide è introdotto.
- La prima mattina, rimuovere delicatamente medie e sostituirlo con 4 ml di cellule 293T med contenente 25 mM clorochina. Messo in incubatrice per 1 ora.
Nota: il piatto dovrebbe essere di circa l'80% confluenti.
- Nel frattempo, preparare virus-making miscela per 2 piatti alla volta, in provette da 5 ml:
- 2 x 10 mg costruire retrovirali plasmide
- 2 x 5 mg confezione costruire (Ecopack),
- 2 x 62 ml CaCl
- completa di 1 ml con una soluzione sterile DDH 2 O
Nota: Mentre il plasmide retrovirale codifica per l'oncogene di interesse e di un marker, Ecopack codifica gag-pol-env. Insieme con le cellule 293T, produrranno un retrovirus ecotropic (RV) specifici per cellule di topo, ma non infettivo per le cellule umane. Sia Clorochina e CaCl 2 hanno dimostrato di aumentare l'efficienza di trasfezione.
- Aggiungere 1ml di sterileHBS 2x goccia a goccia per la miscela, mentre delicatamente il tubo vortex.
- Aggiungere immediatamente questa soluzione a 2 piastre, 1 ml ciascuna, dolcemente, goccia a goccia.
- Messo in incubatrice per 7 a 11 ore.
- In serata (da 7 a 11 ore. Successiva), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 5 ml di terreno fresco 293T. Messo in incubatrice fino a mezzogiorno, il giorno successivo.
Nota: questo passaggio è importante, perché è necessario togliere la clorochina dalle cellule. Se mantenuto per lunghi periodi di tempo, la clorochina è tossico. La soluzione nei piatti sembra sfocata, a causa di una molto fine, di polvere come precipitazione della miscela di trasfezione.
Nota: è importante fare tutti i cambiamenti dei media con estrema dolcezza, come le cellule sono stati sensibilizzati dalla clorochina, e può facilmente staccare dalla piastra.
- Il giorno dopo, 18 a 24 ore. prima di recuperare il virus (intorno a mezzogiorno), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 3 ml di terreno fresco 293T. Sostituire in incubatore O / N.
- La mattina del terzo giorno (18 a 24 ore. Successiva), lentamente succhiare il modulo di media i piatti con una siringa da 10 ml dotato di un ago 18 G. Questo surnatante contiene i retrovirus.
- Cambiare l'ago di siringa un filtro 45 mm, capovolgere diverse volte siringa per mescolare bene la soluzione, passano attraverso il filtro surnatante, e aliquota in cryotubes
Nota: In alternativa, se si stanno facendo + 3 piastre di virus, piscina per tutte sopranatanti dello stesso virus in un tubo 0 5 ml. Mescolare bene, poi sopranatanti aliquota contenente il retrovirus in cryotubes filtrando.
- I tubi contenenti il virus pieno surnatanti sono conservati in -80 ° C fino al momento.
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Discussion
Quattro punti critici assicurerà il successo di una buona scorta virale:
- Le cellule 293T di produzione devono essere molto sano, nel senso che sono stati divisi su un programma molto regolare, non erano mai troppo lunghi, e sono placcati alla densità ottimale di 3,5-5000000 per 6 piastra di coltura tissutale cm, in modo che raggiungano una densità del 80% del piatto la mattina della trasfezione.
- L'aggiunta di clorochina migliora l'efficienza di trasfezione e titolo del virus successivi, circa 3 - a 5 volte, stabilizzando lysozomes cellulare e aumentando la frazione di DNA che raggiunge il nucleo. Butirrato di sodio (un altro lisosoma stabilizzatore) è stato utilizzato anche per questo scopo. Clorochina può essere omesso, nel qual caso cambiando la media 11/07 ore. post-trasfezione a questo punto non è necessario.
- La qualità del DNA è molto importante. Il metodo preferito di purificazione sia del vettore e DNA imballaggio plasmide è due volte purificato da CsCl-etidio bromuro di centrifugazione densità capace di galleggiare. Ci piace la concentrazione del DNA da almeno 1 mg / ml, e il rapporto di OD 260/280 dovrebbe essere compreso tra 1,75-1,90. Qiagen-DNA purificato anche il lavoro, anche se, nelle mani degli autori, i risultati non sono buoni. E 'importante che il volume combinato delle soluzioni di DNA essere di piccole dimensioni (<50 ul totale per ml finale) al fine di evitare effetti negativi di Tris ed EDTA (TE) il precipitato sul fosfato di calcio.
- La scelta della gamma vettore retrovirale e conduttore del costrutto imballaggio sono importanti. Per l'espressione stabile nel topo le cellule staminali ematopoietiche, un vettore basato sul virus del sarcoma mieloproliferative è preferito. Un vettore backbone comune è il RI MIG, contenente una lunga sequenza di ripetizione MPSV terminale, un sito di clonazione multiplo per l'introduzione di un oncogene, e un interno a valle del sito di entrata ribosoma legato al gene per una migliore proteina verde fluorescente (eGFP). Per la trasduzione del mouse HSC, virus con un intervallo di ospitare ecotropic è ottimale, ma tali scorte sono instabili a temperatura fisiologica e non possono essere concentrate per centrifugazione.
Alcuni check-point: se si desidera, una volta raccolte, le 293 cellule può essere usato per fare lisati proteici per immunoblotting per controllare l'espressione di proteine codificate dal vettore retrovirale (ad esempio, la TK). Inoltre, utilizziamo un controllo codifica plasmide LacZ in lamiera separati al momento della trasfezione (nessun vettore imballaggio necessario) per verificare efficinecy trasfezione di beta-gal assay quando raccogliamo surnatante di altre tavole. Nota: questo metterà alla prova le cellule e reagenti, ma non la qualità dei plasmidi utilizzati per la produzione del virus.
Prima di utilizzare qualsiasi virus, il titolo deve essere determinato. Questo è fondamentale al fine di corrispondere titoli di riserve di virus diversi nello stesso esperimento, e per garantire efficienza di trasduzione delle cellule staminali ematopoietiche.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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