Summary
Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.
Abstract
Nossos estudos de laboratório humano doenças mieloproliferativas induzidas por oncogenes, como Bcr-Abl ou receptor do fator de crescimento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Somos capazes de modelo e estudo de doenças humanas-como em nosso modelo de mouse, através do transplante de células da medula óssea previamente infectadas com um retrovírus expressando o oncogene de interesse. Replicação defeituosa retrovírus codificação de um oncogene humano e um marcador (GFP, RFP, o gene de resistência a antibióticos, etc) é produzido por um protocolo de transfecção transiente usando células 293T, uma linha celular humana renal epiteliais transformadas pelo produto do gene E1A do adenovírus. 293 células têm a propriedade incomum de ser altamente transfectable por fosfato de cálcio (CAPO 4), com até 50-80% de eficiência de transfecção prontamente atingível. Aqui, nós co-transfecção 293 células com um vetor retroviral expressando o oncogene de interesse e um plasmídeo que expressa as funções gag-pol-env embalagens, tais como o genoma de um único embalagem constrói kat ou PCL, neste caso, o Ecopak plasmídeo. A transfecção inicial é melhorada pelo uso da cloroquina. Estoques de vírus ecotropic, coletados como cultura sobrenadante de 48 horas. pós-transfecção, podem ser armazenadas a -80 ° C e utilizado para a infecção de células-lines em vista da transformação e estudos in vitro, ou pilhas como as células da medula óssea do rato, que pode então ser utilizada para transplante em nosso modelo de camundongo .
Protocol
- A noite antes que as células de transformação, placa 293T em 3-5x10 6 células / 6 cultureplate tecido cm.
Nota: Nós usamos células 293T pela sua facilidade de transfecção e células produtoras de vírus efficacyas. Estas células são deficientes em embalagens do vírus, a menos que um ajudante plasmídeo é introduzido.
- A primeira manhã, remova médio e substituir com 4 ml de células 293T med contendo 25 mM cloroquina. Coloque em uma incubadora para hr.
Nota: a placa deve ser de cerca de 80% confluentes.
- Enquanto isso, prepare vírus tomada de mistura para 2 placas de cada vez, em 5 tubos de ml:
- 2 x 10 mg construir plasmídeo retroviral
- 2 x 5 mg embalagem construção (Ecopak),
- 2 x 62 ml CaCl
- completa para 1 ml com 2 O estéril DDH
Nota: Enquanto o plasmídeo retroviral codifica o oncogene de interesse e um marcador, Ecopak codifica gag-pol-env. Juntamente com as células 293T, eles produzirão um retrovírus ecotropic (RV) específico para células de ratos, mas não infectantes para células humanas. Ambos cloroquina e CaCl 2 foram mostrados para aumentar a eficiência de transfecção.
- Adicionar 1 ml de sterileHBS 2x gota a gota, à mistura, enquanto delicadamente o tubo vortex.
- Imediatamente adicionar esta solução a 2 placas, 1 ml cada, gentilmente, gota a gota.
- Coloque em incubadora para 7-11 horas.
- À noite (7 a 11 hrs. Mais tarde), remova médio, e muito gentilmente substituir com 5 ml meio fresco 293T. Coloque em incubadora até meio-dia, no dia seguinte.
Nota: este passo é importante, porque você precisa tirar a cloroquina das células. Se mantido por longos períodos de tempo, a cloroquina é tóxico. A solução nas placas olha fuzzy, devido a uma muito fina, precipitação de pó-like da mistura de transfecção.
Nota: É importante fazer todas as alterações de mídia com extrema suavidade, como as células foram sensibilizados pela cloroquina, e pode facilmente retirar do prato.
- No dia seguinte, 18 a 24 hrs. antes de recuperar o vírus (cerca de meio-dia), remova médio, e muito gentilmente substituir com 3 ml 293T meio fresco. Substituir na incubadora S / N.
- A terceira manhã (18 a 24 hrs. Mais tarde), sugar delicadamente o formulário de médio as placas com uma seringa de 10 ml equipado com uma agulha de G 18. Este sobrenadante contém os retrovírus.
- Trocar a agulha a um filtro de seringa de 45 mm, inverter vezes seringa várias para misturar bem a solução, passe o sobrenadante através de filtro, e da alíquota em criotubos
Nota: Como alternativa, se você estiver fazendo 3 placas + de vírus, piscina todos os sobrenadantes do mesmo vírus em um tubo de 5 ml 0 cônico. Misture bem, então sobrenadantes alíquota contendo o retrovírus em criotubos de filtragem.
- Os tubos contendo os sobrenadantes vírus completo são mantidos em -80 ° C até sua utilização.
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Discussion
Quatro pontos críticos vai garantir o sucesso de um bom estoque viral:
- As células 293T produzir têm de ser muito saudável, o que significa que foram divididas em uma programação muito regular, nunca foram cobertas, e são banhados na densidade otimizada de 3,5-5.000.000 por 6 centímetros placa de cultura de tecido, para que atinjam uma densidade de 80% da placa, na manhã da transfecção.
- Além da cloroquina melhora a eficiência de transfecção e titulação do vírus subseqüentes, cerca de 3 - a 5 vezes, através da estabilização lysozomes células e aumentando a fração de DNA que atinge o núcleo. Butirato de sódio (outro estabilizador lisossomo) também tem sido utilizado para esta finalidade. Cloroquina pode ser omitido, caso em que mudando o meio de 11/07 hrs. pós-transfecção neste momento não é necessária.
- A qualidade do DNA é muito importante. O método preferido de purificação de ambos os vetores e DNAs embalagem plasmídeo é duas vezes purificado por centrifugação CsCl-etídio densidade brometo flutuante. Nós gostamos da concentração do DNA a ser, pelo menos, 1 mg / ml, e os OD relação 260/280 deve estar entre 1,75-1,90. Qiagen-DNA purificado também irá funcionar, embora, nas mãos dos autores, os resultados não são tão boas. É importante que o volume combinado de soluções de DNA ser pequena (<ul total de 50 por ml final) para evitar efeitos adversos de Tris e EDTA (TE) na precipitar fosfato de cálcio.
- A escolha da faixa de vetores e hospedeiros retroviral da construção da embalagem são importantes. Para a expressão estável em camundongos células-tronco hematopoéticas, um vetor baseado no vírus do sarcoma mieloproliferativas é o preferido. A espinha dorsal do vetor comum é a MIG RI, contendo uma longa sequência de repetição MPSV terminal, um sítio múltiplo de clonagem para a introdução de um oncogene, e um local de entrada a jusante internas dos ribossomas ligados ao gene para a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP). Para a transdução do mouse HSC, vírus com uma gama de hospedeiros ecotropic é o ideal, mas tais ações são instáveis à temperatura fisiológica e não podem ser concentrados por centrifugação.
Alguns pontos de check-: Se desejar, uma vez colhida, a 293 células podem ser usadas para fazer lisados proteína para immunoblotting para verificar a expressão de proteínas codificadas pelo vetor retroviral (por exemplo, o TK). Nós também usamos um controle de codificação LacZ plasmídeo em chapa separada no momento da transfecção (nenhum vetor de embalagem necessários) para verificar efficinecy transfecção por beta-gal ensaio quando coletamos o sobrenadante das outras placas. Nota: esta vai testar as células e reagentes, mas não a qualidade dos plasmídeos utilizados para a tomada de vírus.
Antes de utilizar qualquer vírus, o título precisa ser determinado. Isto é crítico, a fim de coincidir com os títulos dos stocks de vírus diferentes no mesmo experimento, e para garantir a transdução eficiente de células-tronco hematopoéticas.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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