Abstract
Deze gedetailleerde protocol beschrijft de uitvoering van beeldgeleide, laser gebaseerde hydrogeldegradatie voor de vervaardiging van vasculaire afgeleide microfluïdische netwerk ingebed in PEGDA hydrogels. Hier beschrijven we de creatie van virtuele maskers die het mogelijk maken voor beeldgeleide laser controle; de fotopolymerisatie van een micromolded PEGDA hydrogel, geschikt voor microfluïdische netwerk fabricage en druk-head gedreven stroom; de installatie en het gebruik van een commercieel beschikbare laser scanning confocale microscoop gekoppeld aan een femtoseconde gepulste Ti: S laser om hydrogel degradatie te induceren; en de beeldvorming van gefabriceerde microfluïdische netwerken met fluorescerende soorten en confocale microscopie. Een groot deel van het protocol is gericht op de juiste instelling en uitvoering van de microscoop software en microscoop macro, omdat deze zijn cruciale stappen in het gebruik van een commercieel microscoop voor microfluïdische fabricage doeleinden die een aantal fijne kneepjes bevatten. De beeldgeleide onderdeel van deze technique voor de implementatie van 3D afbeeldingsstapels of door de gebruiker gegenereerde 3D-modellen, waardoor creatieve microfluidic ontwerp en de fabricage van complexe microfluïdische systemen vrijwel elke configuratie. Met een verwachte impact in tissue engineering, kunnen de in dit protocol methoden helpen bij de fabricage van geavanceerde biomimetische microtissue constructies voor organisaties en human-on-a-chip apparaten. Door het nabootsen van de complexe architectuur, kronkeligheid, grootte en dichtheid van bloedvaten in vivo, kunnen essentiële biologische transportprocessen worden gerepliceerd in deze constructen, waardoor nauwkeuriger vitro modelleren van farmacokinetiek en drug.
Introduction
Het vasculaire systeem, bestaande uit zowel lymfatische en hart en vaten, vormen zeer dichte netwerken die essentieel zijn voor het transport van voedingsstoffen en zuurstof en het verwijderen van metabole afvalstoffen. Dienovereenkomstig, cellen die in gevasculariseerde weefsels zijn nooit meer dan 50-100 urn uit de buurt van een vat 1. Het vermogen om in vivo vasculaire architectuur reproduceren vitro kritisch nauwkeurig modelleren vivo transportprocessen via gemanipuleerde constructen. Met een recente aandrijving van organen-on-a-chip-inrichtingen 2 voor high-throughput drug screening 3,4 en 5,6 ziektemodel ontwikkelen methoden microfluïdische netwerken die in vivo-achtige vervoer in synthetische of natuurlijke hydrogels herhalen tekent creëren significant belang. Om de biomimicry van microweefsels gebruikt in deze apparaten te verbeteren, ontwikkelden we een beeldgeleide, op laser gebaseerde hydrogel degradatie methode die drie-dimensiona gebruikimage l (3D) stapels van inheemse vaatstelsel als templates to-vasculaire afgeleide microfluïdische netwerken ingebed in PEGDA hydrogels 7 genereren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een commercieel verkrijgbare laser-scanning confocale microscoop voorzien van een femtoseconde gepulste laser-vasculaire afgeleide biomimetische microfluïdische netwerken PEGDA hydrogelen fabriceren via beeldgeleide, op laser gebaseerde afbraak.
De huidige aanpak van hydrogels fluïdiseren omvatten de inductie van vasculaire of angiogene 8-10 10-12 endotheliale cellen zelf-assemblage en microfabrication technieken om vooraf gedefinieerde kanalen te creëren voor endothelialisatie 13-16. Terwijl zelf-geassembleerde netwerken recapituleren de dichtheid en complexe architectuur van microvasculatuur, ze vaak meer doorlaatbaar dan in vivo netwerken 11,17,18, die problematisch modellering vervoer medicijnscreeningtoepassingen zijn. Zelf-assemblerende netwerken bestaan uit Physiologtisch relevante, capillaire afmetingen schepen, maar moeilijk te integreren in bulk vloeistofstroom als gevolg van beperkingen in het genereren arteriole groter formaat schepen. Aangezien er geen directe controle over het samenstel van deze netwerken, kan de uiteindelijke architectuur van monster tot monster, waardoor het moeilijk herhaaldelijk produceren netwerken met dezelfde fluïdumstroom en transporteigenschappen.
3D, hydrogel geïntegreerde microfluïdische netwerken herhaalbare geometrie en goed gedefinieerde architectuur genereren een aantal microfabricage technieken ontwikkeld, zoals modulaire opbouw 13, 3D-printen opofferingskolommen materialen 16, direct-write assemblage 14 en omnidirectionele printen 15. Het toepassen van deze methoden, microfluïdische architectuur, en dus stroming en transport eigenschappen, kan herhaaldelijk worden vervaardigd in vele constructies. Een belangrijke beperking van deze benadering is echter het onvermogen om microf creërenluidic netwerken met capillaire afmetingen functies, 4-10 urn 19. Meest microproductietechnieken vaak beperkt tot functies variërend 150-650 urn diameter 13,16. Sommige bestaande technieken kunnen genereren hiërarchische netwerken kanalen in uiteenlopende diameter, 10 tot 300 urn voor direct-write samenstel 14, en 18 tot 600 pm voor omnidirectionele afdrukken 15, maar ze zijn beperkt in hun vermogen om dichte netwerken of genereren meerdere microfluïdische netwerk dicht produceren in een enkel construct 7.
Sommige van deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een beeldgeleide, lasergebaseerde hydrogeldegradatie techniek die reproduceerbare vervaardiging van biomimetische, hiërarchische microfluïdische netwerk dat de architectuur van in vivo microvasculatuur recapituleren toelaat. Om dit te doen, een 790 nm, 140 femtoseconde (fs) gepulste laser die werkt bij 80 MHz-raster gescand in 3D gewenste locaties binnen een hydrogel zoals gedefinieerd beeldvorming in vivo vasculatuur. We speculeren dat het afbraakproces werkt door de laser geïnduceerde optische verdeling van water, het verkregen plasma formatie, de daaropvolgende snelle thermo-elastische uitzetting van water en de plaatselijke afbraak van de hydrogel zoals water uitzet 20. Dit mechanisme verschilt enigszins van laser gebaseerde afbraak van eiwit gebaseerde hydrogels 21-24. Unlike PEGDA, die een lage multifoton dwarsdoorsnede, eiwitten vaak een grote multifoton dwarsdoorsnede en daarom afgebroken via een multifoton absorptie geïnduceerde chemische breuk 23. Om beeldgeleide microfluïdische netwerken te genereren, wordt de laser sluiter gecontroleerd door-afbeelding op basis virtuele maskers, die bestaan uit een mozaïek van regio's van belang 9 dat de microfluïdische architectuur te definiëren. Met deze aanpak, hebben we de mogelijkheid om 3D-afgeleide vasculaire biomimetische Microfluïdieksysteem fabriceren aangetoondic netwerken, die de dichte kronkelige architectuur van in vivo vasculatuur recapituleren, om lokaal te bedienen de porositeit van hydrogelen door het veranderen van de hoeveelheid energie geleverd tijdens afbraak. We zijn ook in staat om twee onafhankelijke microfluïdische netwerken die met elkaar vervlochten in de nabijheid (15 pm), maar nooit rechtstreeks aansluiten 7 genereren geweest. We hebben ook aangetoond dat het vermogen om laser-aangetaste microkanalen endothelialize door post afbraak functionalisering met integrine ligatie peptidesequentie, Arginine-Glycine-Asparaginezuur-Serine (RGDS), endotheliale cel adhesie en vorming van lumen 7 bevorderen.
Met dit protocol, is het genereren van complexe microfluïdische netwerken in PEGDA hydrogels mogelijk gemaakt via beeldgeleide, op laser gebaseerde degradatie met behulp van een commercieel verkrijgbare microscoop toegankelijk op veel universiteitscampussen. Als de afbraak wordt gestuurd door digitale, virtuele maskers, dit fabricatietechniek is vatbaar voor de creatieve vormgeving van microfluïdische netwerk, waardoor het gebruik ervan in diverse toepassingen. We verwachten dat de hier beschreven werkwijze voordeligst ontwerpen biomimetische lijke en menselijke-on-a-chip apparaten kan repliceren biologische transportprocessen belang modelleren geneesmiddeltransport 2 is. Deze fabricagetechniek kan ook van belang voor het genereren van in vitro ziektemodellen, zoals kanker metastase 5,6 en bloed-hersenbarrière modellen 25 zijn. As-laser gebaseerde hydrogel degradatie is eerder gebruikt om tracks voor de begeleiding van neuronale uitgroei 21-23 te creëren, kan de beeldgeleide uitbreiding van deze techniek nuttig blijken in geavanceerde tissue engineering strategieën aan cellen in door de gebruiker gedefinieerde 3D ruimtelijke regelingen te positioneren.
Protocol
1. Het genereren van Virtual Maskers
LET OP: Een 3D beeld stapel muizenhersenen microvasculatuur werd gekozen als de microfluïdische model voor dit protocol, die zijn geselecteerd uit een veel grotere dataset met afbeeldingen van een hele muizenhersenen microvasculatuur. Microvasculaire beelden werden via messcherpe scanning microscopie (KESM) 26, 2 verworven; vergelijkbare microvasculaire gegevens openlijk beschikbaar via de KESM Mouse Brain Atlas 28.
- Open de beeldverwerkingssoftware 29 open en snijd de 3D TIF stapel natieve vasculatuur zodat de gewenste microfluïdische netwerk binnen de hydrogel te genereren, past in een 450 urn x 450 um x 1,5 mm (x van y door z) venster. Om dit te doen, trek een vierkant rond het gewenste gebied en klik op "Beeld" → "Crop". Verwijder de schijfjes in de z-richting door te klikken op "Beeld" → "Duplicate" en typ in een gewenste slicerange.
LET OP: Dit zorgt ervoor dat de gewenste eigenschappen passen binnen het gezichtsveld (x door y) (531,2 x 531,2 urn bij gebruik van een 20X (NA1.0) water immersie objectief met een framemaat van 2884 x 2884 pixels en een zoom van 0,8 met een laser-scanning confocale microscoop) en de werkafstand (z) van een 20X (NA1.0) water immersie objectief. Als bekend is, kan het gezichtsveld voor andere systemen worden bepaald door het verwerven van een beeld met het nagestreefde doel en instellingen. - Draai het beeld stack, zodat de functies in de eerste plaats zijn afgestemd op de richting van het raster scanning, of de x-richting, door te klikken op "Beeld" → "Transform" → "Rotate". Dit vermindert de tijd die nodig is voor de productie.
- Schaal de bijgesneden afbeelding stapel, zodat de pixelgrootte lucifers of de gebruikte voor de afbraak van de confocale microscoop instellingen (0,184 micrometer / pixel bij gebruik van een 20X (NA1.0) water immersie objectief met een framemaat van 2884 door 2884 pixels overschrijdten een zoom van 0,8). Om dit te doen, klikt u op "Beeld" → "Adjust" → "Size" en type in "2446" voor "Breedte" (dwz, 450 urn, of de grootte van het beeld gedeeld door 0,184 micrometer / pixel).
- Threshold / binarize de afbeelding stapel door het intikken van "Ctrl + Shift + T". Deselecteer "Donkere Achtergrond", en klik op "solliciteren" → "ok". Beëindig het proces door te klikken op "Beeld" → "Lookup Tables" → "Omkeren LUT".
- Met behulp van een aangepaste algoritme (broncode is beschikbaar in het aanvullende materiaal van het gerefereerde manuscript) in de programmeersoftware 9, monteer de gebinariseerd (wit) is voorzien met een mozaïek van enkele pixel-high quadrilaterals parallel aan de richting van het raster scanning (de x -richting) om gebieden van belang (ROI) de laserpositie en sluiter 9, 7, 30, 31 leiden, genereren <sup> 32.
LET OP: De aangepaste algoritme 9 zet elke individuele vliegtuig in de TIF afbeelding stapel om een RLS-bestand. - Wijzig de bestandsextensie van de RLS bestanden .OVL voor gebruik tijdens de afbraak.
2. Configureren van de laser-scanning confocale microscoop
OPMERKING: Terwijl andere laser scanning microscoop uitgerust met gepulste lasers kunnen worden gebruikt, instellingen en protocol hier beschrijven het gebruik van een laser scanning microscoop (LSM) in combinatie met software.
- Met de laser-scanning confocale microscoop op, opent de microscoop software, en klik op "Start-systeem." Selecteer de doelstelling "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" op het tabblad "onderhouden".
- Het instellen van de 'Hydrogel Visualization "Configuratie
- In het tabblad "Acquisition", ervoor zorgen dat de laser lijn (514 nm Argon laser) is geselecteerd en in de "Laser" window. LET OP: Dit kanaal wordt gebruikt voor het imago van de hydrogel via eosine Y fluorescentie ter oriëntatie 7.
- In het venster "Imaging Setup", stelt u de "Mode" naar "Channel Mode", stelt u "Switch volgen elke" tot "Frame", en selecteer "Track1".
- In het venster 'lichtpad', selecteert u alleen de kanaal 1 tl-detector, met een bereik van 516-735 nm; een van de belangrijkste bundelsplitser (MBS) 458/514 filter op het zichtbare licht lijn; en een bord in de onzichtbare licht lijn. Schakel het bright-field fotomultiplicatorbuis detector, "T-PMT".
- In het venster "Acquisition Mode", controleer dan of het juiste doel is geselecteerd en stel de "Scan Mode" naar "Frame", de "Frame Size" op "2884" in de X en Y, de "Line Step" op "1" , "Aantal Middelings-" naar "1", de "middelfunctie" op "Line", de "middelingsmethode" naar "Mean", de "Bitdiepte "tot" 16 Bit "en de" Direction "tot" <-> "voor bidirectionele scannen.
- In het venster "Acquisition Mode", zet de "Speed" zoals gewenst en zet "Corr X" en "Y" naar "0.05" of aan te passen als nodig is voor de specifieke microscoop wordt gebruikt. Deselecteer "HDR".
- In het venster "Acquisition Mode", ervoor zorgen dat de "Scan Area" verschijnt er een "Image Size" of "531,2 urn x 531,2 um" en een "Pixel Size" van de "0,18", met een "Zoom" op "0.8" ; stellen alle andere "Scan Area" waarden op nul.
- In het venster "Channels", selecteer "Track1" als de K1 fluorescerende detector. Kies laserlijn "514", met een percentage kracht "10,0", een "pinhole" of "1AU" een eerste "Gain (Master)" of "800", een "Digital Offset" of "0", en een "Digitale Gain 'van4, 1 ".
LET OP: Pas deze instellingen die nodig zijn voor de specifieke microscoop wordt gebruikt. - Bewaar deze configuratie als "Hydrogel Visualization".
- Instellen van de Configuration "Channel Formation"
- In het tabblad "Acquisition", ervoor zorgen dat de laser lijn (790 nm 140 fs gepulseerde Ti: S laser) is geselecteerd en op in het venster "Laser". Stel "GDD Correction" tot "4000" voor het maximale vermogen bij 790 nm.
- Stel het venster "Imaging Setup", zoals beschreven in stap 2.2.2.
- In het venster 'lichtpad', ervoor zorgen dat er geen fluorescerende detectoren zijn geselecteerd, met een MBS 458/514/561/633 filter op het zichtbare licht lijn en een MBS 760+ filter op de onzichtbare licht lijn. Schakel het bright-field fotomultiplicatorbuis detector, "T-PMT".
- In het venster "Acquisition Mode", controleer dan of het juiste doel wordt vermeld. Stel de "Speed" naar "3"En alle andere instellingen zoals beschreven in stap 2.2.4.
- In het venster "Channels", selecteer "Track1" als de T-PMT-detector. Selecteer de laserlijn "790", met een percentage kracht "100,0", een eerste "Gain (Master)" of "800", een "Digital Offset" of "0" en een "Digital Gain" of "1" .
- In het venster "Stage", nul het podium door te klikken op "set nul". Markeer de locatie door te klikken op "Mark". Dit is essentieel voor het uploaden virtuele maskers om de macro microscoop in stap 3.
- In het venster "Time Series", stelt u "Cycles" als "1" en "Interval" als "0".
- In het venster "Bleach", controleer dan de "Start Bleaching na # scans" doos en zet deze op een waarde van "0 of 1". Selecteer de "Different scansnelheid", met een waarde van "3" (overeenkomend met een pixel verblijftijd van 8,96 ps / pixel). Selecteer de "Safe blelk voor GaAsP ".
- In de laser lijn van het venster "Bleach", selecteert u de 790 laserlijn en stel het percentage macht om "100.0". Laat alle andere vakken in het bleekmiddel venster selectie opgeheven. Sla de bleekmiddel instellingen in het venster "Bleach".
- Bewaar deze configuratie als "Channel Formation".
LET OP: De "Z-Stack", "Regio's", "Focus" en "Fase" ramen zijn ook belangrijk om dit protocol, maar hoeft niet te worden ingesteld of aangepast tijdens de initiële configuratie.
3. Het creëren van een Recept en uploaden Virtual maskers aan de microscoop Software en Macro
- Met de laser-scanning confocale microscoop nog loopt en de microscoop software nog steeds op, selecteert u alleen het venster "Regio's" (naast de knop "Start Experiment") in het "Channel Formation" configuratie.
- Opdat de maskers laden de microscoop juiste macroly, stelt het percentage macht in het venster "Channels" naar "0.2" en de "Speed" in de "Acquisition Mode" venster op "8", en klik op "Snap" in de linkerbovenhoek van het scherm.
- Controleer of het beeldformaat is nog steeds "531,2 micrometer x 531,2 urn", met een pixelgrootte van "0.18", in het tabblad "Information" van het beeld. Als deze waarden niet juist zijn, controleer dan de "Frame Size" en "Zoom" waarden weer.
- Kritiek: Controleer of de X- en Y-locaties in het venster "Stage" worden op nul gezet en dat de positie wordt gemarkeerd voor het openen van de microscoop macro. Zie stap 2.3.6.
- Om de microscoop macro, type "Alt + F8" te openen, klikt u op "Load" en selecteer de juiste versie. Zie details in de lijst van specifieke materialen / Equipment. Een lange lijst van sub-macro's wordt geopend in het venster "Macro Control".
- In het venster "Macro Control", klikt u op "Run" om de MICR openenoscope macro, en sluit het venster "Macro Control".
LET OP: Alternatieve versies van de microscoop macro mogelijk niet compatibel met laser gebaseerde hydrogel degradatie met dit protocol te zijn. - In het tabblad "Saving" van de microscoop macro, zorgen voor een willekeurige "Base File Name", selecteer "Single File Output", en koos voor een "Temporary File" map. Stel "Open Temp Folder" om location "1", selecteer "Single Tijdelijke Afbeelding Folder", en de naam van het recept in "Store / Apply Recept" met "Recall Locations List" geselecteerd. Klik op "Store" om het recept in eerste instantie te maken.
- In het tabblad "Acquisition" van de microscoop macro, ervoor te zorgen dat de "Scan Configuration" komt overeen met de naam die aan de microscoop softwareconfiguratie ingesteld in stap 2.3. Stel het "Aantal tijdstip binnen Block" naar "1", een "Interval" of "0". Zorg dat "Marked Z - Top of the Z Stack "is gemarkeerd groen. Alle andere standaard instellingen zijn prima zoals ze zijn.
- In het tabblad "Timing" van de microscoop macro, ervoor te zorgen dat "Wacht Delay" is gemarkeerd groen, stelt u "Experiment Herhalingen" en "Group Herhalingen" op "1" en "Wacht Interval Voordat Block at First Location Only" op "0" . Alle andere standaard instellingen zijn prima zoals ze zijn.
OPMERKING: De "Group Herhalingen" (en niet het "Experiment Herhalingen") box is wanneer men het aantal keren dat de laser scans verdeeld over een gebied (dwz herhalingen van het recept). - In het tabblad "Z List" van de microscoop macro, worden de degradatie vliegtuigen in de z-richting opgegeven. Stel de z-afstand "dZ" naar "1 micrometer", de "Aantal posities" ingesteld op het aantal virtuele maskers te gebruiken passen.
- Klik op de knop "Create Z Stack" om de "Z List" laten verschijnen in het dropdown "List van Locations 'naar de bodem van het venster. Controleer of het aantal locaties en z-afstand correct zijn en dat de X en Y-locaties worden op nul gezet.
LET OP: Als ze niet, het recept niet op te slaan; sluit de microscoop macro en herhaal stap 2.3.6 voor het opnieuw openen van de microscoop macro en het opzetten van het recept opnieuw.
Opmerking: In plaats van 100 maskers gescheiden door 1 urn elk, bijvoorbeeld, kan het voordelig zijn om 50 maskers zijn, elk tweemaal dienst en gescheiden door 1 pm met gelijkwaardige microfluïdische structuur krijgt, het laden individuele maskers om de microscoop macro kan zijn tijdrovend. - In het tabblad 'Bleach' van de microscoop macro, moeten alle van de maskers worden geladen en gekoppeld aan een bepaalde genummerde plaats in de "lijst met locaties". Om te beginnen, selecteert u het vak 'Bleach' en ervoor te zorgen dat "Config." overeenkomt met de naam van het bleekmiddel instellingen in het venster "Bleach" in het hoofdmenu microscoop software scherm (zie stap 2.3.8). Stel "Wacht Delay Na Bleach" op "0", schakelt "spot", en laat de "ROI" leeg.
- Niet veranderen niets in de "Location", "Tile", "Grid", "Autofocus", "Blokken" en "Opties" tabs van de standaardinstellingen.
- Maskers aan de microscoop macro te laden, selecteert u alleen het venster "Regio's" in de microscoop software en open het tabblad 'Bleach' van de microscoop macro. In het venster "Regio's", klik op "Load" en selecteer de .OVL bestand voor het masker aan de onderkant van de z-stack wordt afgebroken.
OPMERKING: De eerste locatie in de "Z lijst" is de onderkant van de z-stack en de microscoop macro werkt zijn weg naar de top van de z-stack of hydrogel. - Zodra de lijst van de ROI in het venster "Regio's" verschijnt, klik op de pijl knop om de ROI van het masker te bekijken binnen het gezichtsveld (op het beeld knapte in stap 3.2). Controleer of de ROI passen binnenhet gezichtsveld.
- Om de geladen masker op te slaan in de microscoop macro, geeft het masker een naam en het nummer in de "Add Current Gewest ROI List" op het tabblad 'Bleach' en klik op de knop "Add Current Gewest om de ROI List". De naam en het nummer zal verschijnen in de "ROI" keuzelijst met andere maskers (met inbegrip van maskers uit andere eerder gemaakte recepten). Verwijder het masker in het venster "Regio's" in de microscoop software.
- Herhaal stap 3.14 en 3.16 te uploaden en op te slaan alle maskers om de microscoop macro.
- Geüploade maskers om elke Z-locatie toe te wijzen, markeert positie 1 in het dropdown "lijst met locaties". Selecteer de juiste ROI van de "ROI" keuzelijst. Zorg ervoor dat de box "Bleach" is geselecteerd aan de bovenkant van het tabblad 'Bleach' in de microscoop macro.
- Herhaal stap 3.18 voor alle posities in de dropdown "lijst met locaties", en klik vervolgens op "Store" op het &# 34; Saving "tab om het recept in zijn definitieve vorm op te slaan.
4. fotopolymeriseren een PEGDA Hydrogel
- Het maken van Steriele HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS) met Triethanolamine (TEOA)
- In een 1-L beker, voeg 500 ml DI H 2 O. Met een roerstaafje, roer er 2,922 g natriumchloride, 1,196 g HEPES, en 7,5 ml TEOA in een zuurkast.
- Op pH 8,3 met 1 N natriumhydroxideoplossing door druppelsgewijze toevoeging met een pasteurpipet.
- Steriele filter de oplossing door een 0,2-um vacuümfiltratie beker in een 500 ml autoclaaf glas media fles. Aliquot en bewaar bij 4 ° C.
- Bevestig een ring van dubbelzijdige kleefband met steun aan een gespecialiseerde 60-mm petrischaal met een 20-mm gat gesneden uit de bodem. Het verlaten van de steun aan de lijm ring, druk op eventuele luchtbellen van tussen de petrischaal en de lijm.
- Bereid de materialen. Breng de gesynthetiseerde 33 3.4 kDa PEGDA uit de -80 ° C vriezer en laat het op kamertemperatuur komen. Schakel de witte lichtbron ten minste 15 minuten vóór fotopolymeriseren hydrogels.
- In een zuurkast, voeg 1 ml HBS met TEOA om een folie bedekt, 2-mL amber centrifugebuis (gebruikt voor de belichting van de foto-initiator te voorkomen, eosine Y). Voeg 10 ul van 1 mM eosine Y dinatriumzout in DI H2O
- In een zuurkast extract een klein volume van 1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) in een bekerglas met een Pasteur pipet. Vanuit dit volume, pipet 3,5 pi van NVP in het barnsteen centrifugebuis met de HBS, TEOA en eosine Y.
- In een tweede-folie bedekt, 2-mL amber centrifugebuis (gebruikt voor de dolende fotoactivering van het prepolymeer oplossing te voorkomen), voeg 10 mg 3.4kDa PEGDA. Voeg 0,2 ml HBS, TEOA, eosine Y, NVP oplossing voor een 5% w / v PEGDA pre-polymeeroplossing. Vortex totdat de PEGDA volledig is opgelost. Met behulp van een power meter en detector wand, past de intensiteit van de witte light bron tot 95 mW.
- Het bouwen van een Poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) Mold
- Bouw een PDMS mal 7 op een groter oppervlak (glas, polystyreen weefselkweek schotel) voor het gemak van de behandeling en assembleren de vormen zodanig dat de gevormde hydrogels passen binnen een cirkel met een diameter van 20 mm.
- Een rechthoekige hydrogel met een dikte van 500 urn te genereren, plaats twee 500 urn dikke PDMS spacers op een PDMS oppervlak twee gedefinieerde hydrogel kant vormt.
- Omvatten een 300-um PDMS spacer een 300 urn diepe put geven in het oppervlak van de hydrogel, die nuttig is voor het inbrengen van vloeistoffen.
- Pipetteer 60 pi van de 5% w / v PEGDA pre-polymeeroplossing op de PDMS mal. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren tijdens het pipetteren.
- Centrum en plaats een [3- (methacryloyloxy) propyl] trimethoxysilaan (TMPSA) gefunctionaliseerd 7, 40-mm diameter # 1,5 glazen dekglaasje bovenop de oplossing. Zorg ervoor dat de coverslip rust op de 500-um PDMS spacers. De hydrogel zal binden aan de gemethacryleerd dekglaasje en voorkomen dat de hydrogel drijven in de oplossing.
- Plaats de PDMS, PEGDA pre-polymeeroplossing en dekglaasje het samenstel onder de witte lichtbron voor 3 minuten.
- Flow DI H2O tussen de mal en het dekglaasje op de hydrogel te scheiden van het PDMS. Spoel de hydrogel met DI H2O Droog de randen van het dekglaasje met een lab weefsel. Wees voorzichtig niet aan te raken of lont water uit de hydrogel.
- Na het verwijderen van de steun van de kleefstof, hechten de dekglaasje op de voorbereide petrischaal en verwijder voorzichtig luchtbellen van tussen de lijm en het glas. Dompel de hydrogel in een petrischaal met DI H2O
OPMERKING: De PDMS mal kan worden gebruikt om extra hydrogels maken als gespoeld met DI H2O, gedroogd met stikstof en stofvrij houden.
5. Fabricating Vasculaire-afgeleide microfluïdische Networks via Laser-gebaseerde Degradatie
- Met de laser-scanning confocale microscoop en microscoop software op, selecteert u de doelstelling "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" op het tabblad "onderhouden". In het tabblad "Acquisition", zorg ervoor dat de benodigde laser lijnen (514 nm Argon laser en 790 nm 140 fs gepulseerde Ti: S laser) zijn ingeschakeld en opgewarmd.
- Het opzetten van de Hydrogel om een inlaatkanaal Vorm
- Breng de hydrogel en petrischaal op het podium en leg het podium insert op de microscoop podium. Vul de petrischaal met minstens 5 ml DI H 2 O. Center de hydrogel en goed functies op het oog voor het verlagen van de water immersie objectief in de DI H 2 O.
LET OP: Do not crush de hydrogel met de objectieve-de twee mag nooit aanraken! - Om de hydrogel te vinden, over te schakelen naar de "Hydrogel Visualization" configuratie van stap 2.2. Klik op "Live" om de laser lijn aan en breng the doel dichterbij de hydrogel tot eosine Y-signaal (gedetecteerd door de fluorescentie detector Ch1) van de top van de hydrogel te zien.
OPMERKING: Om de hydrogel gemakkelijk vinden, kan het percentage vermogen worden verhoogd of de pinhole geopend kan worden. Zodra het doel is gericht op de hydrogel echter dalen het percentage bevoegdheid om de fluorescerende detector beschermen en pengat naar 1AU dalen tot oververzadiging van de detector te vermijden en trefzeker de hydrogel oppervlak. - In het venster "Stage", markeert de plaats van de boven- en onderkant van de hydrogel en de bodem van de put.
OPMERKING: De z-waarden hier zal helpen bij het bepalen van de dikte van de hydrogel en de diepte van de put. - Gebruik de joystick om te bewegen in de X en Y aan de rand van een goed te vinden. Plaats de hydrogel op de rechterkant van het scherm, met de put links of vice versa. Laat de hydrogel niet meer dan twee derde van het gezichtsveld vullen.
- Laat de plane van de focus naar beneden 150 micrometer in de hydrogel door het instellen van de "Step Size" naar "150" in het venster "Focus" en klikken op de pijl naast het vak "Z-positie". Herhaal stap 5.2.4, indien nodig.
OPMERKING: De x, y en z-positie van de inlaat hangt uitsluitend af van het ontwerp van de virtuele maskers. - Kritiek: Zero de X- en Y-locatie in het venster "Stage", verwijder alle andere gemarkeerde locaties, en markeer alleen deze locatie.
OPMERKING: Als deze stap niet wordt uitgevoerd, de microscoop macro niet goed de locaties te herstellen in de eerder opgeslagen recept, en de hydrogel niet zal worden afgebroken in de gewenste locatie.
- Breng de hydrogel en petrischaal op het podium en leg het podium insert op de microscoop podium. Vul de petrischaal met minstens 5 ml DI H 2 O. Center de hydrogel en goed functies op het oog voor het verlagen van de water immersie objectief in de DI H 2 O.
- Het vormen van een inlaatkanaal
- "Snap" een afbeelding en teken een rechthoekig gebied dat de inlaat van de vasculaire netwerk met behulp van de rechthoek-knop in het venster "Regio's" zal zijn.
LET OP: Zorg ervoor dat een deel van de regio strekt zich uit in de put om ervoor te zorgen dat de the inlaat zal goed sluit het aan het vasculaire netwerk. - Naast de ROI gegenereerd in het venster "Regio's", selecteer "Acquisition" en schakel "Bleach" en "analyse".
- Sla de "Hydrogel Visualization" configuratie, schakelt u "Regio's", en ga naar de "Channel Formation" configuratie, opgericht in stap 2.3. In de "Channel Formation" configuratie, selecteer "Regio's" weer.
LET OP: Bij het overschakelen tussen de "Hydrogel Visualization" en de "Channel Formation" configuraties, zorg ervoor dat de regio's te heffen in de linkerbovenhoek van het scherm. Soms is de schaal van de regio's kunnen onverwacht veranderen tussen configuraties als dit niet gebeurt. - In de "Channel Formation" configuratie, zorg ervoor dat alleen "Regio's" en "Z-Stack" zijn geselecteerd. In het venster "Z-Stack", klikt u op de knop "Center" aan de bovenkant en dan is de "Center" buttop de "Offset" naar het midden van de z-stack actuele Z-positie ingesteld. Afhankelijk van hoe groot de inlaat moet zijn, stelt het aantal "Plakken" met een "Interval" of "1". De omvang van de Z-stack weergegeven onder "bereik".
- Controleer of "Speed" in het venster "Acquisition Mode" is ingesteld op "3" en dat het "Percentage Power" in het venster "Channels" is ingesteld op "100". Sla de configuratie en klik op de "Start Experiment" knop.
NB: De macro microscoop is niet vereist voor het afbreken dezelfde eenvoudige vorm op meerdere vlakken, zoals hier uitgevoerd met een inlaatkanaal genereren. De macro is alleen vereist wanneer degraderende verschillende gebieden op elk individueel vlak en het wordt gebruikt om de virtuele maskers in een recept te slaan. - Om de hydrogel te visualiseren tijdens degradatie, ofwel verhoging van de "Gain (Master)" in het venster "Channels" als de regio in thij gezichtsveld is zwart, of de "Gain (Master)" afnemen als de regio is wit.
OPMERKING: Belvorming hier een indicatie van door laser geïnduceerde hydrogeldegradatie. - Naar de inlaat degraderen meerdere keren in plaats van slechts een keer, passen de "Cycli" in het venster "Time Series".
- In de "Hydrogel Visualization" configuratie op "live" dat de inlaat is gevormd.
- "Snap" een afbeelding en teken een rechthoekig gebied dat de inlaat van de vasculaire netwerk met behulp van de rechthoek-knop in het venster "Regio's" zal zijn.
- Instellen van de Hydrogel om de microfluïdische netwerk Generate
- In het venster "Regio's", laadt elke .OVL bestand uit de z-stack van virtuele maskers en klik op de pijl knop om de ROI te zien in het gezichtsveld.
- Klik "live" om het scannen "Hydrogel Visualization" configuratie en gebruik van de joystick of het venster "Fase" de hydrogel X en Y, zodanig dat de inlaat verbindt met de juiste locatie binnen het vasculaire netwerk positioneren.
LET OP: Zorg ervoor dat deROI van de virtuele masker enigszins overlappen met de eerder gevormde inlaat. - Drop het vlak van de focus naar beneden 50 urn van de vorige gecentreerd Z-locatie of 200 urn van het oppervlak van de hydrogel, met behulp van de "Step Size" in het venster "Focus" en klik op de pijl omlaag naast de "Z-Position "box. Dit zal de eerste positie in de microscoop macro zijn.
OPMERKING: De werkelijke afstand te bewegen in de z-richting afhankelijk van het netwerk ontwerp. Zorg ervoor dat het gewenste netwerk niet verder reikt dan de boven- of onderkant van de hydrogel in de z-richting. - Kritiek: Zero van de X- en Y-locaties in het venster "Stage", verwijder alle andere gemarkeerde locaties, en markeer alleen deze locatie.
LET OP: Dit zal het uitgangspunt in de microscoop macro zijn. Het recept zal zijn werk terug naar het oppervlak van de hydrogel. - "Snap" een beeld in het "Hydrogel Visualization" configuratie, verwijderen en deselect "Regio's", en sla de configuratie.
- Het genereren van de microfluïdische Network
- Ga naar de "Channel Formation" configuratie en de "Time Series" en "Bleken" windows alleen selecteren. Controleer of de instellingen voor de "Time Series" en de "Bleken" windows zijn als ze in eerste instantie werden in stappen 2.3.7 en 2.3.8.
- Stel de "Speed" in het venster "Acquisition Mode" naar "8" en het percentage vermogen van de laser lijn naar "0.2" in het venster "Channels". Sla de configuratie.
- Open de microscoop macro volgende stap 3.5. Op het tabblad "Saving" van de macro, selecteert u de eerder gemaakte recept uit stap 3 en klik op "Apply".
OPMERKING: Klik niet op "Store" of het recept worden overschreven! - Controleer de instellingen op alle tabbladen en controleer of de virtuele maskers (.OVL bestanden) worden nog steeds correct geassocieerd met tHij Z-locaties in de keuzelijst. Controleer ook dat de eerste Z-locatie overeenkomt met de gemarkeerde locatie in het venster "Stage" van de microscoop software.
OPMERKING: counterintuitively, de tweede locatie in de keuzelijst zal fysiek boven de eerste locatie, aangezien de microscoop macro weg werken van de bodem van de hydrogel (verst van het doel) naar de top van de hydrogel (het dichtst bij de doelstelling). - Sla de "Channel Formation" configuratie opnieuw, en klik vervolgens op "Update" in de microscoop macro. Klik op "Nee" om "Overschrijven huidige locatie List? ', En klik op" Start "in de microscoop macro het recept beginnen.
6. Het visualiseren van de microfluïdische Network
- Om de hydrogel en de gevormde microfluïdische netwerk na degradatie te bekijken, sluit de microscoop macro. Schakel over naar de "Hydrogel Visualization" configuratie om de eosine Y si bekijkengnaal van de hydrogel; het gedegradeerde netwerk zal verschijnen donker.
OPMERKING: De hydrogeldegradatie niet zichtbaar terwijl de microscoop macro wordt uitgevoerd. - Om de microfluïdische netwerk specifiek bekijken, gebruikt u de "Hydrogel Visualization" configuratie op een lager laservermogen aan de beeldvorming van geïntroduceerde fluoresceïne (FITC) gemerkte dextran, die een helderder signaal dan de oorspronkelijke eosine Y-signaal van de hydrogel heeft mogelijk te maken.
- Vóór de invoering van fluorescent gelabelde dextran, lont water uit de put in de hydrogel met behulp van lab weefsel. Pipetteer in 10 ui 5 mg / ml 2000 kDa FITC-gemerkt dextran in DI H2O (vooraf gefiltreerd door een 0,2 urn spuitfilter).
LET OP: Gebruik een dextran formaat 2000 kDa of groter naar diffusie in de gel te voorkomen. Als imaging langer dan 30 min, geïncubeerd gebruik een podium met 60% vocht (of hoger) ter voorkoming hydrogel drogen en verdamping van water uit de FITC-gelabelde dextran oplossing. - Verwijder de hydrogel eennd petrischaal van het podium en markeer de petrischaal naar de gemakkelijke locatie van de gevormde vasculaire netwerk in te schakelen tijdens latere experimenten.
Representative Results
Om de uitvoering van beeldgeleide, op laser gebaseerde hydrogel degradatie te tonen om een 3D, vasculaire-afgeleide microfluïdische netwerk te genereren, benut we een 3D-beeld stapel muizenhersenen vasculatuur die via messcherpe scanning microscopie (KESM) 26, 27 werd overgenomen . Een geselecteerde 3D gebied van de grotere dataset microvasculaire omgezet in een reeks virtuele maskers voor beeldgeleide vorming microfluïdische netwerk, zoals hierboven beschreven. Na vervaardiging werd de resulterende microfluïdische netwerk geperfuseerd met een oplossing van FITC-gelabeld, 2000 kDa dextran en afgebeeld via confocale microscopie. De afbeeldingsstapel van de in vivo vaatstelsel dat de netwerkarchitectuur (Figuur 1 A en C) en de gefabriceerde microfluïdische netwerk (Figuur 1B en D) gedefinieerd werden gebruikt om Z-uitsteeksels (Figuur 1 A en B) en 3D renderings (figuur 1C genereren en D in vivo vasculatuur recapituleren. De techniek is ontvankelijk voor de fabricage van netwerken met uiteenlopende diameters; in Figuur 1, werden kanalen variërend 3,3-28,8 pm in diameter gegenereerd. Merk op dat de grote rechthoekige structuur in de linkerbovenhoek van figuur 1B en in de linker hoek van figuur 1D is het inlaatkanaal om stroming te introduceren in het netwerk.
Figuur 1: Vasculaire-Afgeleide microfluïdische Network. Een reeks virtuele maskers, afgeleid van een beeld stapel muizenhersenen vasculatuur (A en C), werden gebruikt om fabricate 3D biomimetische microfluïdische netwerk ingebed in een PEGDA hydrogel (B en D) via beeldgeleide, op laser gebaseerde afbraak. De microfluïdische netwerk werd geperfuseerd met 2000 kDa FITC-gemerkt dextran en afgebeeld via confocale microscopie. Z-uitsteeksels (A en B) en 3D renderings (C en D) van de twee netwerken demonstreren de mogelijkheid om microfluïdische netwerk dat de dichtheid, organisatie en algemene structuur van in vivo vasculatuur recapituleren genereren. De pijl (D) markeert de rechthoekige inlaat leven geroepen om de dextran te introduceren. De schaal balk geeft 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
We hebben twee methoden, druk koppen en spuitpompen, om de vloeistof f initiëren geïmplementeerdlaag in deze ingesloten microfluïdische netwerken. Zo werd een 30 30 urn rechthoekig kanaal vervaardigd twee putten in een micromolded PEGDA hydrogel (figuur 2A) verbinden, met vloeistofstroom aangedreven via een drukkop 7. Gegenereerd in zowel de linker, de druk hoofd geïnduceerde stroom door de microkanaal en in de put aan de rechterkant. In figuur 2A, een eerste voor tetramethylrhodamine (TRITC) gemerkt, werd 70 kDa dextran waargenomen bewegen door het kanaal met behulp van time-lapse microscopie. Later, in Figuur 2B, een 10-um diameter fluorescerende polystyreen bol stroomde uit de put links, door het kanaal, naar de put aan de rechterkant. De duur van de volumestroom van het vloeistofvolume in de micromolded goed bij de inlaat en de stroomsnelheid geregeld door de hydrostatische gradiënt gegenereerd tussen de inlaat en uitlaat goed, druk-head aangedreven stroming in micromolded hydrogelen is een eenvoudige werkwijze voor stroming inproductie, zonder dat een externe behuizing of injectiepomp.
Figuur 2: Pressure-Head Gedreven Flow in een Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA werd micromolded een hydrogel die twee putjes verbonden door een ingebedde microkanaal vormen. Een druk hoofd werd gegenereerd in de put links naar stroom van initiëren TRITC-label, 70 kDa dextran (A1-A3) en een 10-um polystyreen bol (B1-B3) door middel van een 30 bij 30 micrometer rechthoekig kanaal van de ene goed aan de andere. De schaal balk geeft 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Als alternatief, om een constante vloeistofstroom binnen microfluïdische netwerken genereren, spuit-pomp aangedreven flaag kan worden geïnitieerd door het fotopolymeriseren hydrogel binnenkant van een secundaire microfluïdische apparaat met inlaat- en uitlaatpoorten voor spuitpomp interfacing. In figuur 3A, wordt een commercieel verkrijgbare, geprefabriceerde microfluïdische apparaat getoond met een 1-mm band hydrogel gefotopolymeriseerd over de breedte van de inrichting 7. Laser gebaseerde degradatie werd uitgevoerd om microfluïdische kanalen en netwerken in gehuisvest hydrogels met hetzelfde protocol hier beschreven voor vrijstaande hydrogels te fabriceren. Injectiespuit-pomp opgewekte stroom kan worden gezien in figuur 3B, waarbij een 20-um diameter cilindrisch kanaal werd vervaardigd in een hydrogel zich in een microfluïdische apparaat. In deze 20-um diameter kanaal worden afzonderlijke 2-micrometer fluorescerende polystyreen bolletjes eenvoudig opgelost zonder fluïdumstroom (Figuur 3B1), terwijl als een 5 ul / s debiet wordt toegepast, de gebieden bewegen door het gezichtsveld, zoals blijkt uit strepen (Figuur 3B2 </ Strong>). Dezelfde benadering werd gebruikt om stroming door een 2D-afgeleide vasculaire netwerk te induceren tot stroming van TRITC-gelabelde monitoren 65 kDa dextran via het netwerk en diffusie in het omgevende hydrogel (figuur 3C).
Figuur 3: Spuit Pump-Driven Flow in PEGDA Hydrogels gepolymeriseerd in microfluïdische behuizingen. Een in de handel verkrijgbaar, geprefabriceerde microfluïdische inrichting (A) met een 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) microkanaal herbergt een gefotopolymeriseerd 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel aangeduid met de zwarte Pijl. Een 20-um diameter cilindrisch kanaal werd afgebroken door de hydrogel en 2 urn polystyreen bolletjes werden door de inrichting (B) gepompt. De bollen zijn duidelijk opgelost zonder vloeistofstroom (B1), maar ze als stroken bij een debiet van 5 pl / s(B2). In andere ondergebracht hydrogel werd een 2D-afgeleide vasculaire netwerk vervaardigd en TRITC-gelabeld, werd 65 kDa dextran gepompt via het netwerk (C). Time-lapse microscopie werd gebruikt om de fluorescerende dextran toezicht te vulde de kanalen en gediffundeerd in de omringende hydrogel. Witte pijlen in (B) en (C) geven de richting van fluïdumstroming. De kalibratiebalk in (C) geeft de intensiteit van het fluorescerende dextran. De schaalbalken vertegenwoordigen 20 urn (B1) en (B2) en 50 um (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Cruciaal dwingende standaardfuncties van de microscoop software om het gebruik van virtuele maskers voor beeldgeleide, laser gebaseerde afbraak schakelen, moet de microscoop macro worden ingesteld en zorgvuldig gemanipuleerd. Hoe de microscoop software-interfaces met de microscoop macro kan soms contra-intuïtief, en veel moeite geïnvesteerd in het bepalen van de optimale instellingen in beide programma's om deze methode te ontwikkelen. Een algemene basiskennis van laser scanning confocale microscoop gebruikt, vooral in verband met de "Fase" en "Focus" vensters voor het vinden en correct positioneren van de hydrogel in de x, y en z dimensies, voordat laser gebaseerde afbraak. Bovendien is de vervaardiging van een inlaatkanaal is van cruciaal belang om het protocol; gesuspendeerd fluorescerende species moet kunnen de microfluïdische systemen invoeren voor succesvolle beeldvorming en karakterisatie netwerk. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol van toepassing is op een bepaalde laser-scanning confocale microscoop geconfigureerd met een specifiek femtoseconde gepulste laser, hardlopen specifieke versies van de microscoop software en de microscoop macro (zie details in de lijst van specifieke materialen / Equipment). We hebben ontdekt dat nieuwere versies van de microscoop macro niet over de nodige controle en de functionaliteit die nodig is voor beeldgeleide laser controle. Terwijl andere platforms microscoop en gepulste laserbronnen worden gebruikt, dit protocol zijn specifiek voor dit systeem en moeten gewijzigd worden afhankelijk van het platform, laserbron en software geïmplementeerd. De uitgangspunten in dit protocol nog steeds van toepassing, echter.
Een mogelijke wijziging van dit protocol omvat het veranderen van de hydrogelsamenstelling. Hier, benut we 5 gew%, 3,4 kDa PEGDA hydrogels, maar op laser gebaseerde afbraak (voor doeleinden afgezien van microfluïdische netwerk generatie) is ingevoerd om zowel synthetische en natuurlijke hydrogels, met inbegrip van gePEGyleerd fibrine af te brekenOgen 21,22, zijde eiwit hydrogels 23, en collageen 24. Aanpassing van het laservermogen, scansnelheid, afstand tussen Z-segmenten, en het aantal herhalingen helpt bij het bepalen van de optimale parameters microfluïdische netwerken in andere hydrogelformuleringen fabriceren.
Een stroombegrenzing van de techniek is de totale hoeveelheid hydrogel die kan worden afgebroken in een mogelijke tijd. Open holten of microfluïdische functies binnen de hydrogel te creëren, de laser verblijftijd moet op of boven de 8.96 ps / pixel (of een laser scan snelheid van 0,021 micrometer / ps) bij gebruik van een laser Fluence van 37,7 nJ / um 2. Met deze instelling duurt 1,4 h tot schepen binnen 0,014 mm 3 volume degraderen (zoals gezien in figuur 1). Met behulp van een laser verblijftijd van 4,48 ps / pixel of onder het afgegeven energie is niet genoeg voor een volledige afbraak van de hydrogel formulering hier gebruikt. Het implementeren van een ander hydrogelsamenstelling kan deze beperking te overwinnen. Het gebruik van fotolabiele gels die lichtgevoelige componenten 34-36 of hydrogels die grote multiphoton dwarsdoorsneden 21-24 gaat met een goede opties die het gebruik van minder energie mogelijk wordt en resulteren in een snellere afbraak. Wat dimensionele beperkingen zijn functies gefabriceerd tot 1,5 mm diep in de hydrogel 7. De diepte haalbaar is een functie van de werkafstand van het doel en kan worden verhoogd met behulp van ultra-lange werkafstand doelstellingen geoptimaliseerd voor in vivo beeldvorming. De kleinste gemeten kanaal 7 gemaakt met een 20X (NA1.0) doelstelling waterdompel had een breedte van 3,3 urn en de diepte van 8,9 urn, die op een lijn met de grootte van de kleinste kanalen gegenereerd in figuur 1. Terwijl andere labs lagere NA doelstellingen 21,23,24 hebben gebruikt, verwachten we dat microfluïdische netwerken met kleinere functies kunnen worden gegenereerd met behulp van hogedoelstellingen er NA ten koste van een verminderde werkafstand. Uiteindelijk vereist het oplossen van de techniek is een functie van de puntspreidingsfunctie van de gefocusseerde laserbundel, de laser scanning eigenschappen, de hoeveelheid energie die de laser geleverde, en de laser absorptie-eigenschappen van het materiaal dat wordt afgebroken.
Voorts laser eigenschappen (snelheid, fluentie, afstand tussen de virtuele maskers en aantal herhalingen) worden geoptimaliseerd op basis van hydrogel eigenschappen (verknopingsdichtheid macromeer / monomeer molecuulgewicht gewichtsprocent en type hydrogel: eiwit gebaseerde synthetische vs. ), omdat deze inherent veranderen interacties met de laser en daarmee de uiteindelijke uitkomst van het proces. De geleverde energie ook beïnvloed door het doel gebruikt, is extra optimalisatie nodig bij het schakelen tussen doelstellingen. Met betrekking tot de kosten, is toegang tot een microscoop met een gepulste laser vereist, en hoewel veel verschillende bezwaarlingen kan worden gebruikt, die met een hoge NA en lange werkafstand (in vivo beeldvorming) kan duur zijn.
Boven en buiten het protocol hier beschreven, kan microfluïdische netwerken gegenereerd met behulp van deze techniek ook worden gefunctionaliseerd met cell-lijm peptiden post-channel fabricage om endotheelcellen adhesie en vorming van lumen 7 induceren. Bovendien kan de opname van cel-afbreekbare peptidesequenties in het bulkmateriaal 9 vóór degradatie kanaal kunnen worden bestudeerd van celmigratie in en door de hydrogel. Voor continue fluïdisatie van de microfluïdische netwerk binnen de hydrogel, hydrogels kunnen worden gefotopolymeriseerd in grotere fluïduminrichtingen of huizen, zoals blijkt uit figuren 2 en 3 7.
Het genereren van vasculaire netwerken via vasculaire of angiogene zelfassemblage 8-12 biedt een eenvoudige benadering van de va inducerenscularization gedurende een relatief groot volume hydrogel. Deze aanpak resulteert in perfusable vloeibare netten is moeilijk rechtstreeks de grootte, kronkeligheid, dichtheid en algemene netwerkarchitectuur regelen. Door deze beperking kan het stromingsprofiel en afschuifsnelheden in de vasculatuur verschillen experimenten. Als alternatief microfabrication technieken 13-16 zorgen voor directe controle over het netwerk van architectuur, maar zijn vaak beperkt door hun onvermogen om kleine, capillaire-sized kanalen of de fabricage van dichte netwerken die na te bootsen in vivo vasculaire architectuur te genereren. Terwijl de laser-gebaseerde hydrogel degradatie techniek hier beschreven is onlangs hergebruikt voor microfluïdische generatie, daar tegelijkertijd overwint zowel de bouwkundige controle en grootte op basis van beperkingen van de bestaande microfabrication methoden doordat de creatie van 3D biomimetische microfluïdische netwerken die de dichtheid, kronkeligheid recapituleren, grootte, en de algehele architecture in vivo vasculatuur. Bovendien kunnen meerdere fluïde netwerken worden opgewekt in een hydrogel, die de studie van inter-netwerktransport 7. Voor tissue engineering-toepassingen die streven naar nauwer repliceren in vivo transportprocessen in vitro, de hoogst vastbesloten-hydrogel ingesloten microfluïdische netwerken die hier geschetst zijn zeer geschikt. We verwachten dat dit protocol bij de ontwikkeling van weefsel constructies zal zijn dat nauwkeuriger na te bootsen in vivo transport voor gebruik als drug discovery-apparaten en in vitro modellen ziekte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
