Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

Published: January 3, 2017 doi: 10.3791/55101
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston, 3Delaware Biotechnology Institute

Abstract

פרוטוקול מפורט זה מתאר את יישום מונחי תמונה, השפלה הידרוג'ל מבוססי לייזר עבור ייצור של רשתות microfluidic הנגזרות וסקולרית מוטבע הידרוג PEGDA. כאן אנו מתארים יצירת מסכות וירטואליות המאפשרות שליטה מונחה ליזר תמונה; photopolymerization של הידרוג'ל PEGDA micromolded, מתאים ייצור רשת microfluidic ואת זרימת לחץ מונחה ראש; ההתקנה והשימוש מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר זמינים מסחרית זיווג עם פעמו Ti femtosecond: לייזר S לגרום השפלה הידרוג'ל; ואת ההדמיה של רשתות microfluidic מפוברקות באמצעות מיני פלורסנט מיקרוסקופיה confocal. חלק גדול מן הפרוטוקול מתמקד ההגדרה הנכונה והיישום של מאקרו תוכנת מיקרוסקופ מיקרוסקופ, כמו אלה הם צעדים מכריעים באמצעות מיקרוסקופ מסחרי למטרות ייצור microfluidic המכילים מספר המורכבויות. המרכיב מודרך הדימוי של techniqu זהדואר מאפשר ליישום ערימות תמונת 3D או מודלי 3D שנוצר על ידי משתמש, ובכך לאפשר לעיצוב microfluidic יצירתי עבור הייצור של מערכות microfluidic המורכבות של כמעט כל תצורה. עם השפעה צפויה בהנדסת רקמות, השיטות המתאימות בפרוטוקול זה יכול לסייע בייצור של מבני microtissue biomimetic מתקדמים עבור יצורים ו-אדם על-a-chip מכשירים. מאת מחק את האדריכלות, tortuosity המורכבת, גודל, וצפיפות in vivo כלי הדם, תהליכי הובלה ביולוגיים חיוניים יכולים להיות משוכפלים שני המושגים הללו, מה שמובילים דוגמנות במבחנה מדויקת יותר על הפרמקוקינטיקה סמים ומחלות.

Introduction

מערכת כלי הדם, מורכבת משני לימפטי cardiovasculature, הצורות ביותר רשתות צפופות חיוניות להובלת חומרי מזון וחמצן ולמען הסרת פסולת המטבולית. בהתאם לכך, תאים השוכנים ברקמות vascularized הם אף פעם לא יותר מ 50-100 מיקרומטר הרחק מספינת 1. היכולת לשחזר באדריכלות וסקולרית vivo במבחנה היא קריטית מודל מדויק vivo בתהליכי הובלה באמצעות מבנים מהונדסים. עם כונן אחרון לפתח איבר על שבב התקנים 2 עבור תפוקה גבוהה סמי הקרנת 3,4 ומחלות דוגמנות 5,6, שיטות ליצור רשתות microfluidic כי לשחזר in vivo-כמו תחבורת ב הידרוג הסינטטי או טבעי ציור עניין משמעותי. כדי לשפר את ביומימטיקה microtissues של בשימוש במכשירים אלו, פיתחנו שיטה השפלה הידרוג'ל דימוי מודרך, מבוססי לייזר אשר מנצל שלוש dimensional (3D) תמונת ערימות של כלי דם יליד כתבניות כדי ליצור רשתות microfluidic נגזרת וסקולרית המוטבעת PEGDA הידרוג 7. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ ליזר confocal סריקה זמין מסחרי מצויד ליזר פעמיו femtosecond לפברק נגזר-וסקולרית, רשתות microfluidic biomimetic ב הידרוג PEGDA באמצעות מונחי מערכות הדמיה, שפלה מבוססת ליזר.

גישות שוטפות fluidize הידרוג כוללות אינדוקציה של vasculogenic 8-10 או טכניקות 10-12 האנדותל תא עצמי הרכבת microfabrication angiogenic ליצור ערוצים מוגדרים מראש עבור endothelialization 13-16. בעוד רשתות עצמיות התאסף לשחזר את הצפיפות ואדריכלות מורכבת של microvasculature, הם לעתים קרובות יותר חדירים מאשר רשתות vivo ב 11,17,18 אשר עשוי להיות בעייתיים בתחבורת דוגמנות עבור יישומי הקרנה בסמים. רשתות עצמית התאספו מורכב physiologically רלוונטי, כלים בגודל נימים, אבל הם יכולים להיות קשים לשלב עם זרימת נוזל בתפזורת בשל מגבלות ביצירת כלי עורקיק בגודל גדול יותר. מאחר ואין שליטה ישירה על ההרכבה של רשתות אלה, הארכיטקטורה הסופית יכולה להשתנות ממדגם לדגום, מה שהופך אותו קשה לייצר רשתות שוב ושוב עם תכונות זרימה ותחבורה אותו הנוזל.

כדי ליצור 3D, רשתות microfluidic-מוטבע הידרוג'ל עם גיאומטרית דיר ואדריכלות מוגדרת היטב, מספר טכניקות microfabrication פותחו, כולל הרכבת מודולרי 13, הדפסת 3D של חומרי הקרבה 16, הרכבה ישירה לכתוב 14, מכל עברי הדפסה 15. יישום שיטות אלו, אדריכלות microfluidic, ולכן תכונות נוזלי זרימה ותחבורה, יכול להיות מפוברק שוב ושוב על פני מבנים רבים. המגבלה העיקרית של גישות אלה, עם זאת, היא חוסר היכולת ליצור microfרשתות luidic עם תכונות נימים בגודל, 4 עד 10 מיקרומטר 19. רוב טכניקות microfabrication מוגבלות לעתים קרובות תכונות החל 150 עד 650 מיקרומטר בקוטר 13,16. כמה טכניקות קיימות מסוגלות לייצר רשתות היררכיות עם ערוצי פני מגוון בקוטר רחב, 10 עד 300 מיקרומטר להרכבה ישיר לכתוב 14, ו -18 כדי 600 מיקרומטר להדפסת omnidirectional 15, אך הם מוגבל ביכולת שלהם לייצר רשתות צפופות או לייצר רשתות microfluidic מרובות בסמיכות בתוך אחת לבנות 7.

כדי להתגבר על כמה מגבלות אלה, פיתחנו טכניקה השפלה הידרוג'ל דימוי מודרך, מבוססי לייזר המאפשר ייצור הדיר של biomimetic, רשתות microfluidic היררכית כי לשחזר את הארכיטקטורה של microvasculature in vivo. כדי לעשות זאת, 790 ננומטר, 140 femtosecond (FS) לייזר פעמו ההפעלה ב 80 MHz הוא i רסטר-סרקn הרצויה במקומות 3D בתוך הידרוג'ל, כפי שהוגדר על ידי תמונות של כלי הדם בגוף החי. אנו משערים כי התהליך השפל פועל באמצעות ההתפלגות האופטית-induced הליזר של מים, היווצרות הפלזמה כתוצאה, הרחבת thermoelastic המהירה הבאה של מים, והפגיעה ברמה המקומית של הידרוג'ל כמו המים מתרחבים 20. מנגנון זה שונה מעט מן השפלה מבוססת ליזר של הידרוג מבוסס חלבון 21-24. בניגוד PEGDA, אשר יש multiphoton חתך נמוך, חלבונים יש לעתים קרובות multiphoton גדול חתך ולכן מפורק באמצעות שבירה כימית multiphoton נגרמת קליטה 23. כדי ליצור רשתות microfluidic מונחי תמונה, תריס הליזר נשלט על ידי מסכות וירטואליות הנגזרת תמונה, אשר מורכבות מפסיפס של אזורים של עניין 9 המגדירים את ארכיטקטורת microfluidic. בגישה זו, אנו הדגמנו את היכולת לפברק microfluid biomimetic 3D נגזר וסקולריתרשתות ic, אשר לשחזר את הארכיטקטורה הצפופה ומפותלת של כלי דם in vivo, כדי מקומית לשלוט הנקבוביות של הידרוג על ידי שינוי כמות האנרגיה המועברת במהלך שפלה. יש לנו גם הצלחנו לייצר שתי רשתות microfluidic עצמאיות המשתלבות בסמיכות (15 מיקרומטר) אבל אף פעם לא להתחבר 7 ישירות. יש לנו גם הוכיח את יכולתו endothelialize microchannels לייזר מושפל דרך functionalization השפלה פוסט עם רצף הפפטיד ligating integrin, ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה-סרין (rgds), כדי לקדם את הידבקות תא האנדותל ו לומן היווצרות 7.

עם פרוטוקול זה, הדור של רשתות microfluidic מורכבים הידרוג PEGDA מתאפשר באמצעות מונחי תמונה, שפלה מבוססת ליזר באמצעות מיקרוסקופ זמין מסחרי נגיש בקמפוסים רבים. ככל שתהליך השפלה מונחה על ידי מסכות דיגיטליות, וירטואליות, Fabrica זהטכניקת tion היא נוחה עבור עיצוב יצירה של רשתות microfluidic, המאפשר את השימוש בו במגוון רחב של יישומים. אנו צופים כי השיטה המתוארת כאן תהיה כדאית ביותר בעיצוב מכשירים יצורים ואנושיים-על-שבב biomimetic יכולת שכפול תהליכים ביולוגיים חשובים תחבורה בתחבורת תרופת דוגמנות 2. טכניקת ייצור זו עשויה גם להיות עניין של דור מודלים במבחנה המחלה, כולל גרורות סרטן 5,6 ומודלים המחסום שבין הדם למוח 25. כפי שפלה הידרוג'ל מבוסס ליזר כבר השתמשה בעבר כדי ליצור מסלולים עבור הדרכתו של תולדה עצבית 21-23, הארכת מונחי התמונה של טכניקה זו יכולה להיות שימושית אסטרטגיות הנדסת רקמות מתקדמות למצב תאי סידורי מרחביים 3D המוגדר על ידי משתמש.

Protocol

1. יצירת מסכות וירטואליות

הערה: ערימת תמונת 3D של microvasculature עכבר המוח נבחרה כמודל microfluidic עבור פרוטוקול זה, היה צורך מלוקט במערך הרבה יותר גדול המכיל תמונות של microvasculature במוח עכבר כולו. תמונות כלי הדם נרכשו באמצעות מיקרוסקופיית פיפיות סכין (KESM) 26, 2; נתוני כלי דם דומים זמינים בגלוי דרך אטלס KESM עכבר מוח 28.

  1. פתח את תוכנת עיבוד תמונת 29 ופתוח לחתוך את ערימת תמונת 3D TIF של כלי דם יליד כך רשת microfluidic הרצויה, שתופק בתוך הידרוג'ל, משתלב מ"מ 450 מיקרומטר x 450 מיקרומטר x 1.5 (x על ידי y על ידי z) חַלוֹן. לשם כך, לשרטט ריבוע סביב האזור הרצוי ולחץ על "תמונה" → "חתוך". הסר את פרוסות z-הכיוון על ידי לחיצה על "תמונה" → "שכפל" וסוג ב פרוסה רצויהטווח.
    הערה: פעולה זו מבטיחה כי התכונות הרצויות שתתאמנה לשדה ראייה (x על ידי y) (531.2 x 531.2 מיקרומטר כאשר באמצעות מטרת טבילה במי 20X (NA1.0) עם גודל מסגרת של 2,884 x 2,884 פיקסלים זום של 0.8 באמצעות מיקרוסקופ confocal-סריקת לייזר) ואת מרחק עבודה (z) של טבילה אובייקטיבי מים 20X (NA1.0). אם ידוע, שדה הראייה למערכות אחרות ניתן לקבוע על ידי רכישת תמונה עם אובייקטיבי ההגדרות הרצויות.
  2. סובב את ערימת התמונה כך התכונות מיושרות בעיקר עם הכיוון של סריקת סריקה, או-בכיוון x, על ידי לחיצה על "תמונה" → "מרה" → "סובב". זה מקצר את הזמן הדרוש לצורך ייצור.
  3. קנה המידה של מחסנית התמונה החתוכה כך התאמות גודל פיקסל או עולה ההגדרות ששימשו השפלה על המיקרוסקופ confocal (0.184 מיקרומטר / פיקסל כאשר באמצעות המטרה טבילה במים 20X (NA1.0) עם גודל המסגרת של 2,884 על ידי 2,884 פיקסליםו זום של 0.8). לשם כך, לחץ על "תמונה" → "התאם" → "גודל" והקלד "2446" עבור "רוחב" (כלומר, 450 מיקרומטר, או את גודל התמונה מחולק 0.184 מיקרומטר / פיקסל).
  4. סף / binarize הערימה התמונה על ידי הקלדת "Ctrl + Shift + T". בטל "רקע כהה", ולחץ על "חל" → "בסדר". לסיים את התהליך על ידי לחיצה על "תמונה" → "שולחנות בדיקה" → "LUT הפוך".
  5. באמצעות אלגוריתם מותאם אישית (קוד המקור זמין ההשלמות של כתב יד ההפניה) בתוכנת תכנות 9, שיתאים (הלבן) binarized כולל בפסיפס של יחיד פיקסל גבוה מרובעים במקביל לכיוון של סריקת סריקה (ה- x -direction) כדי ליצור אזורים של עניין (ROIs) אשר מנחה את עמדת ליזר תריס 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
    הערה: האלגוריתם המותאם אישית 9 ממירה כל מטוס פרט בערימת תמונת TIF לקובץ RLS.
  6. שנה את סיומת הקובץ של קבצי RLS כדי .OVL לשימוש במהלך שפלה.

2. הגדרת-סריקת לייזר Confocal מיקרוסקופ

הערה: בעוד מיקרוסקופים סריקת לייזר אחרים המצוידים לייזרים פעמו יכול לשמש, ההגדרות ופרוטוקול כאן מתארים את השימוש של מיקרוסקופ סריקת לייזר (LSM) בשילוב עם התוכנה שלה.

  1. עם מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה על, פתח את תוכנת מיקרוסקופ, ולחץ על "הפעלת המערכת." בחר את המטרה "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 דסק"ש VIS-IR 75mm M27" בלשונית "שמור".
  2. הגדרת התצורה "ויזואליזציה הידרוג'ל"
    1. בלשונית "רכישה", להבטיח כי קו לייזר (514 ננומטר לייזר ארגון) נבחרה על ב windo "לייזר"w. הערה: ערוץ זה משמש כדי שזה יקלוט את הידרוג'ל באמצעות eosin Y הקרינה למטרות אוריינטציה 7.
    2. בחלון "הגדרת הדמיה", להגדיר את "המצב" כדי "מצב ערוץ", להגדיר "חלף לעקוב אחר כל" כדי "מסגרת", ובוחר "Track1".
    3. בחלון "נתיב האור", לבחור רק את גלאי CH1 ניאון, עם מגוון 516 כדי 735 ננומטר; מפצל קורה מרכזי (MBS) 458/514 מסנן על קו האור הנראה; וצלחת בקו אור בלתי נראה. הסר את הסימון ליד גלאי צינור מכפיל שדה הבהיר, "T-PMT".
    4. בחלון "מצב הרכישה", לבדוק כי המטרה הנכונה נבחרה ולהגדיר את "מצב הסריקה" כדי "מסגרת", "גודל המסגרת" ל "2884" ב X ו- Y, "שלב הקו" ל "1" , את "מיצוע המספר" ל "1", "מצב המיצוע" אל "קו", "שיטת המיצוע" כדי "Mean", את "עומק סיבי "ל" 16 ביט ", ואת" הכיוון "כדי" <-> "לסריקה דו-כיוונית.
    5. בחלון "מצב הרכישה", להגדיר את "מהירות" כרצונך להגדיר "קור X" ו "Y" כדי "0.05" או להתאים לפי הצורך של המיקרוסקופ הספציפי שבשימוש. בטל "HDR".
    6. בחלון "מצב הרכישה", להבטיח כי "שטח סריקה" מציג "גודל תמונה" של "531.2 מיקרומטר x 531.2 מיקרומטר" לבין "פיקסל גודל" של "0.18", עם "זום" מוגדר "0.8" ; להגדיר את כל הערכים "שטח סריקה" אחרים לאפס.
    7. בחלון "ערוצים", בחר "Track1" כמו גלאי פלורסנט CH1. קו לייזר בחר "514", עם כוח אחוז "10.0", א "חריר" של "1AU", ראשוני "רווח (מאסטר)" של "800", של "האופסט הדיגיטלי" של "0", וכן "דיגיטלי רווח" של4; 1 ".
      הערה: ניתן לשנות הגדרות אלו לפי הצורך של המיקרוסקופ הספציפי שבשימוש.
    8. שמור תצורה זו בתור "ויזואליזציה הידרוג'ל".
  3. הגדרת תצורת "גיבוש הערוץ"
    1. בלשונית "רכישה", להבטיח כי קו לייזר (790 ננומטר 140 fs פעמו Ti: לייזר S) נבחרה על בחלון "לייזר". הגדר "תיקון GDD" ל "4000" על תפוקת האנרגיה המקסימלית ב 790 ננומטר.
    2. הגדר את החלון "הגדרת הדמיה" כפי שמתואר בשלב 2.2.2.
    3. בחלון "נתיב האור", לוודא ששום גלאי פלורסנט נבחרים, עם מסנן 458/514/561/633 MBS על קו האור הנראה לבין MBS 760+ מסנן על קו אור בלתי נראה. הסר את הסימון ליד גלאי צינור מכפיל שדה הבהיר, "T-PMT".
    4. בחלון "מצב הרכישה", לבדוק כי המטרה הנכונה מופיעה. בחר את "המהירות" ל "3"וכל הגדרות האחרות כפי שמתואר בשלב 2.2.4.
    5. בחלון "ערוצים", בחר "Track1" כמו גלאי T-PMT. בחר קו לייזר "790", עם כוח אחוז "100.0", ראשוני "רווח (מאסטר)" של "800", של "האופסט הדיגיטלי" של "0", וכן "רווח דיגיטלי" של "1" .
    6. בחלון "הבמה", לאפס את הבמה על ידי לחיצה על "להגדיר אפס". סמן את המיקום על ידי לחיצה על "סמן". זה קריטי עבור העלאת מסכות וירטואליות למאקרו מיקרוסקופ בשלב 3.
    7. בחלון "סדרות עתיות", להגדיר "מחזורים" כמו "1" ו- "מרווח" כמו "0".
    8. בחלון "האקונומיקה", לבדוק את "הלבן התחל לאחר סריקות #" תיבה ולהגדיר אותו לערך של "0 של 1". בחר את "מהירות סריקה אחר", עם שווי של "3" (המקביל ל להתעכב זמן פיקסל של 8.96 מיקרו-שניות / פיקסל). בחר "ה- BL הבטוחכל עבור Gaasp ".
    9. בקטע קו לייזר של החלון "אקונומיקה", בחר קו לייזר 790 ולהגדיר את הכוח אחוזים ל "100.0". השאר את כל התיבות אחרות בחלון האקונומיקה לא מסומן. שמור את הגדרות אקונומיקה בחלון "אקונומיקה".
    10. שמור בתצורה זו כמו "ערוץ הקמת קרן".
      הערה: "Z-Stack", "אזורים", "פוקוס", ו "שלב" חלונות חשובים אף הם לפרוטוקול זה, אבל לא צריך להיות מוגדר או מותאם במהלך קביעת התצורה הראשונית.

3. יצירת מתכון והעלאת מסכות וירטואליות לתוכנת מיקרוסקופ ומקרו

  1. עם מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עדיין פועל התוכנה מיקרוסקופ עדיין על, לבחור רק את החלון "אזורים" (לצד לחצן "התחל ניסוי") בתצורת "ערוץ הקמת הקרן".
  2. כדי להבטיח כי המסכות לטעון למאקרו מיקרוסקופ הנכוןly, להגדיר את כוח האחוז בחלון "ערוצים" כדי "0.2" ואת "המהירות" בחלון "מצב הרכישה" ל "8", ולחץ על "צמד" בפינה השמאלית העליונה של המסך.
  3. אנא בדוק שגודל התמונה עדיין "531.2 מיקרומטר x 531.2 מיקרומטר", עם גודל פיקסל של "0.18", בלשונית "מידע" של התמונה. אם ערכים אלה אינם נכונים, לבדוק את "גודל מסגרת" ו "זום" ערכים שוב.
  4. קריטי: בדוק כי במקומות X ו- Y בחלון "הבמה" הם התבייתו וכי העמדה מסומנת לפני פתיחת מאקרו מיקרוסקופ. עיין לשלב 2.3.6.
  5. לפתיחת מאקרו מיקרוסקופ, הקלד "Alt + F8", לחץ על "טען", ובחר את הגירסה הנכונה. ראה פירוט הרשימה של חומרים / ציוד ספציפי. שורה ארוכה של פקודות מאקרו-משנה תפתח בחלון "בקרת מאקרו".
  6. בחלון "בקרת מאקרו", לחץ על "הפעל" כדי לפתוח את microscope מאקרו, ולאחר מכן לסגור את החלון "שליטה מאקרו".
    הערה: גרסאות חלופיות של מאקרו מיקרוסקופ לא יכול להיות תואם השפלה הידרוג'ל מבוססי לייזר באמצעות פרוטוקול זה.
  7. בלשונית "החיסכון" של מאקרו מיקרוסקופ, לספק "שם קובץ Base" שרירותי, בחר "פלט קובץ יחיד", ובחר תיקייה "קובץ זמני". הגדר "תיקיית Temp פתח" כדי מיקום "1", בחר "תיקיית תמונות זמניות יחידה", ולהעניק לו שם את המתכון "חנות / החל מתכון" עם "רשימת מיקומים יזכירו" שנבחרה. לחץ על "חנות" בתחילה כדי ליצור את המתכון.
  8. בלשונית "הרכישה" של מאקרו מיקרוסקופ, להבטיח כי "תצורת הסריקה" תואמת את השם שניתן תצורת התוכנה מיקרוסקופ להגדיר בשלב 2.3. בחר את "נקודות לא של זמן בתוך בלוק" ל "1", עם "מרווח" של "0". ודא "כי Z מסומן - Top של Z Stack "מודגש ירוק. כל הגדרות ברירת המחדל האחרות הן בסדר כפי שהם.
  9. בלשונית "העיתוי" של מאקרו מיקרוסקופ, להבטיח כי "חכה עיכוב" מודגש ירוק, להגדיר "מחזר ניסוי" ו "קבוצה מחזרת" ל "1" ו- "חכה מרווח לפני הבלוק ב המיקום הראשון בלבד" ל "0" . כל הגדרות ברירת המחדל האחרות הן בסדר כפי שהם.
    הערה: "מחזר הקבוצה" (ולא "מחזר ניסוי") בתיבה היא המקום שבו אפשר להגדיר את מספר פעמי סריקות הליזר מעל אזור (כלומר, חזרות של המתכון).
  10. בלשונית "רשימת Z" של מאקרו מיקרוסקופ, המטוסים השפלים ה- z בכיוון שצוינו. הגדר את z-spacing, "DZ", כדי "1 מיקרומטר", עם "מספר המיקומים" מוגדר להתאים את מספר מסכות וירטואליות לשמש.
  11. לחצו על כפתור "צור Z סטאק" לעשות "רשימת Z" להופיע בתפריט הנפתח "List של מיקומים 'בחלק התחתון של החלון. בדוק כי במספר המוקדים ו- Z-spacing נכון וכי במקומות X ו- Y הם מאופסים.
    הערה: אם הם לא, אין לאחסן את המתכון; לסגור את המאקרו מיקרוסקופ וחזור על שלב 2.3.6 לפני מחדש פתיחת מאקרו מיקרוסקופ והקמת מתכון שוב.
    הערה: במקום שיש 100 מסכות במרווחים על ידי 1 מיקרומטר כל אחד, למשל, זה יכול להיות יתרון יש 50 מסכות, כל מועסקים פעמים במרווחים על ידי 1 מיקרומטר, כדי לקבל מבנה microfluidic שקולה, כמו טעינת מסכות פרט למאקרו מיקרוסקופ יכול להיות זמן רב.
  12. בלשונית "Bleach" של מאקרו מיקרוסקופ, כל המסכות יש לטעון מתאים עם מיקום ממוספר ספציפי "הרשימה של מיקומים". כדי להתחיל, בחר את תיבת "Bleach" ולהבטיח כי "Config." תואם לשם של הגדרות אקונומיקה בחלון "Bleach" במסך התוכנה מיקרוסקופ הראשי (עיין לשלב 2.3.8). סט "חכה עיכוב לאחר Bleach" ל "0", בטל "נקודה", ולהשאיר את "ההחזר על ההשקעה" ריק.
  13. אל תשנה דבר "הארץ", "טייל", "רשת", "מיקוד אוטומטי", "בלוקים", ו "אפשרויות" כרטיסיות מהגדרות ברירת המחדל.
  14. כדי לטעון מסכות למאקרו מיקרוסקופ, לבחור רק את החלון "אזורים" בתוכנה מיקרוסקופ ופתח את הכרטיסייה "Bleach" של מאקרו מיקרוסקופ. בחלון "אזורים", לחץ על "טען" ובחר את הקובץ .OVL עבור המסכה בתחתית של Z- מחסנית להיות מושפל.
    הערה: המיקום הראשון "רשימת Z" הוא החלק התחתון של Z- המחסנית, ואת המאקרו מיקרוסקופ עובד שלה דרך החלק העליון של Z- מחסנית, או הידרוג'ל.
  15. לאחר הרשימה של ROIs מופיעה בחלון "האזורים", לחץ על לחצן החץ כדי להציג את ROIs של המסכה בתוך שדה הראייה (על התמונה התיזה בשלב 3.2). ודא כי ROIs יתאיםשדה הראייה.
  16. כדי לשמור את המסכה הטעונה במאקרו מיקרוסקופ, לתת את המסכה שם ומספר ב "אזור הנוכחי הוסף רשימת ROI" התיבה בכרטיסייה "האקונומיקה", ולאחר מכן ללחוץ על "אזור הנוכחי הוסף ROI רשימה" כפתור. שם והמספר יופיעו ברשימה הנפתחת "ROI" עם מסכות אחרות (כולל מסכות מתכונים שנוצרו בעבר אחרים). מחק את המסכה בחלון "האזורים" בתוכנת מיקרוסקופ.
  17. חזור על שלבים 3.14 ו 3.16 להעלות ולשמור את כל המסכות למאקרו מיקרוסקופ.
  18. כדי להקצות מסכות שהועלו לכל Z-מיקום, להדגיש עמדה 1 בתפריט הנפתח "רשימה של מיקומים". בחר את ההחזר על ההשקעה המתאימה מתוך תפריט נפתח הרשימה "ROI". ודא שהתיבה "Bleach" נבחרה בחלק העליון של הלשונית "Bleach" במאקרו מיקרוסקופ.
  19. חזור על שלב 3.18 עבור כל הפוזיציות בתפריט הנפתח "רשימה של מיקומים", ולאחר מכן לחץ על "חנות" על &# 34; חיסכון "כרטיסייה כדי להציל את המתכון בצורתו הסופית.

4. Photopolymerizing PEGDA הידרוג'ל

  1. ביצוע סטרילי HEPES בופר (HBS) עם Triethanolamine (TEOA)
    1. בכוס 1-L, להוסיף 500 מ"ל של DI H 2 O. עם בר ומערבבים, מוסיפים 2.922 גרם של נתרן כלורי, 1.196 גרם של HEPES, ו -7.5 מ"ל של TEOA במנדף.
    2. התאם ל -8.3 pH עם פתרון הידרוקסיד 1 N נתרן על ידי הוספת dropwise עם פיפטה פסטר.
    3. סינון סטרילי הפתרון באמצעות כוס סינון ואקום -0.2 מיקרומטר לתוך בקבוק התקשורת זכוכית autoclaved 500 מ"ל. Aliquot ולאחסן ב 4 ° C..
  2. צרף טבעת של דבק דו צדדי בגיבוי לצלחת 60 מ"מ פטרי מיוחד עם חור 20 מ"מימ מתוך בתחתית. השארת הגיבוי על טבעת הדבק, ללחוץ את כל בועות אוויר בין צלחת פטרי הדבק.
  3. הכן את החומרים. תביא את 33 3 המסונתז.4 kDa PEGDA מהמקפיא -80 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר. הפעל את מקור האור הלבן לפחות 15 דקות לפני הידרוג photopolymerizing.
  4. במנדף קטר, להוסיף 1 מ"ל של HBS עם TEOA על קרקרים, 2 מ"ל צינור ענבר צנטריפוגות (השתמשו כדי למנוע חשיפה לאור photoinitiator, eosin Y). הוסף 10 μL של 1 מ"מ eosin מלח disodium Y ב DI H 2 O.
  5. במנדף, לחלץ נפח קטן של 1-ויניל-2-pyrrolidinone (NVP) לתוך כוס זכוכית עם פיפטה פסטר. מן הכרך הזה, פיפטה 3.5 μL של NVP לתוך הצינור צנטריפוגות ענבר עם HBS, TEOA, ו eosin י
  6. בתוך צינור צנטריפוגות הענבר שני מכוסה בנייר כסף, 2 מיליליטר (המשמש למניעת photoactivation התועה של פתרון prepolymer), להוסיף 10 מ"ג של 3.4kDa PEGDA. להוסיף 0.2 מ"ל של HBS, TEOA, eosin Y, פתרון NVP עבור 5% w / v PEGDA פתרון מראש פולימר. וורטקס עד PEGDA נמס לגמרי. באמצעות מד כוח שרביט גלאי, להתאים את עוצמת li הלבןght מקור ל -95 מילי-ואט.
  7. בניית midi (dimethylsiloxane) (PDMS) עובש
    1. לבנות עובש PDMS 7 על משטח גדול יותר (זכוכית, צלחת תרבות קלקר רקמות) כדי להקל על טיפול ולהרכיב את התבניות כאלה כי הידרוג'ל היצוק מתאימות בתוך עיגול בקוטר של 20 מ"מ.
    2. כדי ליצור הידרוג'ל מלבני בעובי של 500 מיקרומטר, הנח שני מפרידי 500 מיקרומטר בעובי PDMS על משטח PDMS ליצור שני קצוות הידרוג'ל מוגדרים.
    3. כלול spacer PDMS 300 מיקרומטר להקנות גם 300 מיקרומטר עמוק בתוך השטח של הידרוג'ל, שהוא מועיל עבור החדרת נוזלים.
  8. פיפטה 60 μL של 5% w / v פתרון מראש פולימר PEGDA על התבנית PDMS. היזהר לא להכניס בועות כלשהן במהלך pipetting.
  9. מרכז ומקום [3- (methacryloyloxy) propyl] trimethoxysilane (TMPSA) פונקציונלי 7, בקוטר 40 מ"מ, זכוכית coverslip 1.5 # על גבי הפתרון. ודא כי coverslIP נשען על מפרידי PDMS 500 מיקרומטר. הידרוג יהיה הקשר כדי coverslip methacrylated ולמנוע הידרוג'ל מ צף הפתרון.
  10. מניח את PDMS, פתרון מראש פולימר PEGDA ו coverslip ההרכבה תחת מקור האור הלבן במשך 3 דקות.
  11. תזרים DI H 2 O בין התבנית ואת coverslip להפריד בין הידרוג'ל מן PDMS. שוטפים את הידרוג'ל עם DI H 2 O. יבש את הקצוות של coverslip עם רקמות במעבדה. היזהר שלא לגעת או מי פתיל מן הידרוג'ל.
  12. לאחר הסרת המדבקה האחורית מחומר ההדבקה, דבקי coverslip כדי בצלחת פטרי המוכנה בעדינות להסיר בועות אוויר בין הדבק ועל הזכוכית. להטביע את הידרוג'ל בצלחת פטרי עם DI H 2 O.
    הערה: עובש PDMS ניתן לעשות שימוש חוזר לעשות הידרוג נוסף אם שטף עם DI H 2 O, מיובש עם חנקן, והמשיך ללא אבק.

5. בודה הנגזרות דם רשת Microfluidicים באמצעות ביזוי מבוסס ליזר

  1. עם מיקרוסקופ ותוכנה מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר, בחר את המטרה "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 דסק"ש VIS-IR M27 75mm" בלשונית "שמור". בלשונית "רכישה", לוודא את קווי לייזר הכרחי (514 ננומטר לייזר ארגון ו 790 ננומטר 140 fs פעמו Ti: לייזר S) הם על וחיממה.
  2. הגדרת הידרוג'ל להקים ערוץ מפרצון
    1. התאימו את הידרוג'ל צלחת פטרי על להכניס בשלב ולמקם את הכנס הבמה על הבמה מיקרוסקופ. מלאו את צלחת פטרי עם לפחות 5 מ"ל של DI H 2 O. מרכז התכונות הידרוג'ל היטב לפי העין לפני הורדת המטרה טבילה במים לתוך O. DI H 2
      הערה: אין לכתוש את הידרוג'ל במטרה-שני אסור לגעת!
    2. כדי למצוא את הידרוג'ל, לעבור את תצורת "ויזואליזציה הידרוג'ל" משלב 2.2. לחץ על "חי" הופך את הקו לייזר על ולהביא הדואר המטרה קרוב הידרוג'ל עד האות Y eosin (זוהה על ידי גלאי פלורסנט CH1) של החלק העליון של הידרוג'ל ניתן לראות.
      הערה: כדי למצוא את הידרוג'ל בקלות, כוח האחוז ניתן להגדיל או החריר ניתן לפתוח. ברגע המטרה מתמקדת הידרוג'ל, לעומת זאת, להחזיר את הכח האחוז להגן על גלאי פלורסנט ולהפחית את החריר חזרה 1AU להימנע oversaturation של הגלאי כדי למצוא את השטח הידרוג'ל במדויק.
    3. בחלון "הבמה", לסמן את מיקומם של החלק העליון והתחתון של הידרוג'ל ושל בתחתית הבאר.
      הערה: הערכים-z כאן יסייעו בקביעת העובי של הידרוג'ל ואת עומק הבאר.
    4. השתמש בג'ויסטיק כדי לנוע X ו- Y כדי למצוא את שפת הבאר. מניחים את הידרוג'ל בחלק הימני של המסך, עם הבאר בפינה השמאלית, או להיפך. אפשר הידרוג'ל למלא לא יותר משני שלישים של שדה הראייה.
    5. זרוק את plAne לפוקוס למטה 150 מיקרומטר לתוך הידרוג'ל על ידי קביעת "גודל שלב" ל "150" בחלון "פוקוס" ולחיצה על החץ למטה ליד תיבת "Z-פוזיציה". חזור על שלב 5.2.4, במידת הצורך.
      הערה: x, y ו- z עמדה הכניסה תלויה באופן בלעדי על העיצוב של המסכות הווירטואליות.
    6. קריטי: Zero X ו- Y המיקום בחלון "הבמה", למחוק את כל המיקומים המיוחדים האחרים, ולסמן רק לאתר זה.
      הערה: אם צעד זה לא מבוצע, המאקרו מיקרוסקופ לא כמו שצריך לשחזר את המיקומים במתכון שנשמר בעבר, ואת הידרוג'ל לא יהיה מושפל למיקום הרצוי.
  3. יצירת ערוץ מפרצון
    1. "צמד" תמונה ולצייר אזור מלבני יהיה הכניסה לרשת כלי הדם באמצעות הלחצן המלבן בחלון "האזורים".
      הערה: הפוך חלק בטוח של האזור משתרע החוצה לתוך הבאר כדי להבטיח כי הכניסת דואר תתחבר באר לרשת כלי הדם.
    2. ליד ROI שנוצר בחלון "אזורים", בחר "רכישת" ובטל "Bleach" ו- "ניתוח".
    3. שמור את התצורה "ויזואליזציה הידרוג'ל", בטל "אזורים", ולשנות את התצורה "ערוץ הקמת הקרן", הקים בשנת צעד 2.3. בתצורת "ערוץ הקמת הקרן", בחר "אזורים" שוב.
      הערה: בעת מעבר בין "ויזואליזציה הידרוג'ל" ואת התצורות "ערוץ הקמת קרן", כדי להיות בטוח כדי לבטל את בחירת אזורים בחלק השמאלי העליון של המסך. לפעמים את קנה המידה של אזורים יכול להשתנות באופן בלתי צפוי בין תצורות אם זה לא נעשה.
    4. בתצורה "ערוץ הקמת הקרן", לוודא כי רק "אזורים" ו "Z-Stack" נבחרים. בחלון "Z-Stack", ללחוץ על כפתור ה "המרכז" בחלק העליון ולאחר מכן את התחת "המרכז"על מעל "אופסט" כדי להגדיר במרכז Z- מחסנית כמו Z-המיקום הנוכחי. בהתאם לאופן גדול הכניסה צריכה להיות, להגדיר את המספר "פרוסות" עם "מרווח" של "1". גודלו של מחסנית Z מוצג מתחת "טווח".
    5. בדוק כי "מהירות" בחלון "מצב הרכישה" מוגדר "3" וכי "כוח אחוז" בחלון "ערוצים" מוגדר "100". שמור את התצורה ולחץ על כפתור "התחל ניסוי".
      הערה: מאקרו מיקרוסקופ אינו נדרש עבור משפיל אותה הצורה פשוטה במישורים רבים, כפי שבוצע כאן כדי ליצור ערוץ מפרצון. המאקרו נדרש רק כאשר משפילים באזורים שונים על כל מטוס יחיד, והוא ממשמש לאחסון המסכות הווירטואליות בתוך מתכון.
    6. כדי להמחיש את הידרוג'ל במהלך השפלה, גם להעלות את "רווח (מאסטר)" בחלון "ערוצים" אם האזור לאשדה הראייה הוא שחור, או להקטין את "הרווח (מאסטר)" אם האזור הוא לבן.
      הערה: היווצרות הבועה כאן היא אינדיקציה השפלה הידרוג'ל הנגרמת לייזר.
    7. כדי לבזות את כניסת מספר פעמים במקום רק פעם אחת, להתאים את "מחזורים" בחלון "סדרות עתיות".
    8. בתצורת "ויזואליזציה הידרוג'ל", לחץ על "חי" על מנת להבטיח כי הכניסה הוקמה.
  4. הגדרת הידרוג'ל כדי ליצור את רשת microfluidic
    1. בחלון "האזורים", לטעון כל קובץ .OVL מן Z- המחסנית של מסכות וירטואליות ולחץ על לחצן החץ כדי לראות את ROIs בתחום מבט.
    2. לחץ על "חי" לחיות לסרוק את התצורה "ויזואליזציה הידרוג'ל" ולהשתמש ג'ויסטיק או חלון "הבמה" כדי למקם את הידרוג'ל ב X ו- Y, כך המפרצון מתחבר אל המיקום הנכון בתוך רשת כלי הדם.
      הערה: ודאROIs של המסכה הווירטואלית חופף מעט עם הכניסה יצרה בעבר.
    3. זרוק את המטוס של המוקד ירד ב -50 מיקרומטר מהמיקום-Z מרוכז הקודם, או 200 מיקרומטר מפני השטח של הידרוג'ל, באמצעות "גודל שלב" בחלון "פוקוס" ולחיצה על החץ למטה ליד "את תפקיד Z " קופסא. זו תהיה העמדה הראשונה המאקרו מיקרוסקופ.
      הערה: המרחק בפועל לנוע-בכיוון z תלויה בעיצוב הרשת. ודא כי הרשת הרצויה אינה משתרעת מעבר לפני השטח העליון או התחתון של הידרוג'ל ב-בכיוון z.
    4. קריטי: אפס המיקומים X ו- Y בחלון "הבמה", למחוק את כל המיקומים המיוחדים האחרים, ולסמן רק לאתר זה.
      הערה: זו תהיה נקודת ההתחלה במאקרו מיקרוסקופ. המתכון יעבוד דרכו חזרה אל פני השטח של הידרוג'ל.
    5. "הצמד" תמונה בתצורת "ויזואליזציה הידרוג'ל", למחוק deselect "אזורים", ולשמור את התצורה.
  5. יצירת רשת Microfluidic
    1. שינוי התצורה "גיבוש הערוץ", ורק לבחור את חלונות "הסדרות עתיות" ו "לבנים". ודא שהגדרות עבור "סדרות עתיות" והחלונות "הלבנה" הם כפי שהם בתחילה נקבעו צעדים 2.3.7 ו 2.3.8.
    2. בחר את "מהירות" בחלון "מצב רכישת" ל "8" ואת כוח אחוז קו לייזר כדי "0.2" בחלון "ערוצים". שמור את התצורה.
    3. פתח את המאקרו מיקרוסקופ, לאחר שלב 3.5. בכרטיסיה "החיסכון" של מאקרו, בחר את המתכון בעבר עשוי צעד 3 ולחץ על "החל".
      הערה: אל תלחץ על "חנות" או את המתכון יוחלף!
    4. בדקו את ההגדרות בכל הכרטיסיות ולוודא כי המסכות הווירטואליות (קבצי .OVL) עדיין קשורות כראוי עם tהוא במקומות-Z ברשימה הנפתחת. כן, ודא כי Z-המיקום הראשון תואם למיקום המסומן בחלון "הבמה" של תוכנת מיקרוסקופ.
      הערה: counterintuitively, המיקום השני ברשימה הנפתחת יהיה פיזי מעל המיקום הראשון, כמו מאקרו מיקרוסקופ יעבוד דרכו מלמטה של ​​הידרוג'ל (רחוק האובייקטיבי) לחלק העליון של הידרוג'ל (הקרוב ביותר מַטָרָה).
    5. שמור את התצורה "ערוץ הקמת הקרן" שוב, ולאחר מכן לחץ על "עדכן" במאקרו מיקרוסקופ. לחץ על "לא" "דרוס רשימת מיקום נוכחית?", ולאחר מכן לחץ על "התחל" במאקרו מיקרוסקופ כדי להתחיל את המתכון.

6. לדמיין את רשת microfluidic

  1. להצגת הידרוג'ל ורשת microfluidic נוצר לאחר השפלה, לסגור את המאקרו מיקרוסקופ. Switch to התצורה "ויזואליזציה הידרוג'ל" כדי להציג את סי Y eosingnal של הידרוג'ל; הרשת המושפלת תופיע כהה.
    הערה: השפלה הידרוג'ל לא ניתן דמייני בעוד מאקרו מיקרוסקופ פועל.
  2. כדי להציג את רשת microfluidic במיוחד, להשתמש בתצורת "ויזואליזציה הידרוג'ל" בהספק ליזר נמוך על מנת לאפשר ההדמיה של והעמסה הציגה (FITC) dextran -labeled, אשר יש אות בהירה יותר את אות Y eosin היליד הידרוג'ל.
  3. לפני החדרת dextran שכותרתו fluorescently, פתיל מים מן הבאר הידרוג באמצעות רקמות במעבדה. פיפטה 10 μL של 5 מ"ג / מ"ל 2,000 kDa FITC שכותרתו dextran ב DI H 2 O (טרום מסוננים דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר).
    הערה: השתמש בכל dextran בגודל 2,000 kDa או גדול יותר כדי למנוע דיפוזיה לתוך הג'ל. אם הדמיה למשך זמן ארוך יותר מ -30 דקות, השתמש בשלב מודגרות עם 60% לחות (ומעלה) כדי למנוע התייבשות הידרוג'ל אידוי של מים מפתרון dextran שכותרתו FITC.
  4. הסר את הידרוגnd צלחת פטרי המשלב ולסמן את צלחת פטרי לאפשר מיקום הקל של רשת כלי דם נוצרה במהלך ניסויים מאוחר יותר.

Representative Results

כדי להדגים את יישום מונחי תמונה, שפלה הידרוג'ל מבוסס ליזר כדי ליצור רשת microfluidic נגזרת וסקולרית 3D, השתמשנו ערימת תמונת 3D של כלי דם במוח עכבר אשר נרכשה באמצעות מיקרוסקופיית פיפיות סכין (KESM) 26, 27 . אזור 3D נבחר של בסיס נתוני כלי דם הגדול הוסב לסדרת מסכות וירטואליות ליצירת רשת microfluidic מונחי תמונה, כפי שתואר לעיל. לאחר ייצור, רשת microfluidic וכתוצאה מכך היה perfused עם תמיסה של FITC שכותרתו, 2,000 dextran kDa צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. מחסנית תמונה של כלי הדם in vivo, אשר הגדיר את ארכיטקטורת הרשת (איור 1 א ו- C) ואת רשת microfluidic מפוברק (איור 1B ו- D) שימשו להפקת-תחזיות Z (איור 1 א 'וב') ואת הדמיות 3D (איור 1 ג ו D בגוף החי. הטכניקה ניתנת ייצור של רשתות המכילות מגוון רחב של קטרים; בתוך איור 1, ערוצי החל 3.3 כדי 28.8 מיקרומטר קוטר נוצרו. ראוי לציין, כי מבנה מלבני הגדול בפינה השמאלית העליונה של האיור 1B ובפינה השמאלית של 1D האיור הוא ערוץ הכניסה להציג תזרים לתוך הרשת.

איור 1
איור 1: כלי דם נגזר Microfluidic רשת. סדרת מסכות וירטואליות, הנגזרת ערימת תמונה של כלי דם במוח העכבר (A ו- C), שמשה Fabricate רשת microfluidic biomimetic 3D המוטבע הידרוג'ל PEGDA (B ו- D) באמצעות מונחי תמונה, שפלה מבוססת ליזר. רשת microfluidic היה perfused עם 2,000 kDa FITC שכותרתו dextran צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. Z-תחזיות (A ו- B) ו הדמיות 3D (C ו- D) של שתי הרשתות להדגים את היכולת ליצור רשתות microfluidic כי לשחזר את הצפיפות, ארגון, ואדריכלות כוללת של כלי דם בגוף חי. החץ (D) מסמן את כניסת המלבני נוצרה כדי להציג את dextran. סרגל הסולם מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יישמנו שתי שיטות, ראשי לחץ משאבות מזרק, ליזום נוזל fנמוך ברשתות microfluidic המוטבעים אלה. לדוגמה, ערוץ מלבני 30 על ידי 30 מיקרומטר היה מפוברק להתחבר שתי בארות הידרוג PEGDA micromolded (איור 2 א), עם זרימת הנוזל מונע באמצעות לחץ לאספקת 7. שנוצר שמאל היטב, שרוולי המושרה זרימת דרך microchannel ולתוך גם מימין. באיור 2 א, חזית ראשונית של tetramethylrhodamine (TRITC) -labeled, 70 dextran kDa נצפה עובר דרך הערוץ באמצעות מיקרוסקופיה הזמן לשגות. מאוחר יותר, באיור 2B, כדור קלקר פלורסנט בקוטר 10 מיקרומטר זרמו מהאגף השמאלי היטב, דרך הערוץ, אל הבאר מימין. עם משך הזרימה המבוקר על ההיקף כולל של הווה נוזל micromolded גם על הכניסה, ואת בספיקה בשליטת השיפוע ההידרוסטטי שנוצר בין הכניסה ויציאה היטב, זרימת מונחת שרוולים ב הידרוג micromolded מספקת שיטה פשוטה להזרמהduction, ללא צורך דיור חיצוני או משאבת מזרק.

איור 2
איור 2: תזרים ראש-לחץ מונע בתוך הידרוג'ל Micromolded PEGDA. PEGDA היה micromolded לגבש הידרוג'ל המכיל שתי בארות המחוברים ביניהם באמצעות microchannel מוטבע. ראש הלחץ נוצר שמאל גם ליזום זרימת TRITC שכותרתו, 70 dextran kDa (A1-A3) ואת כדור קלקר 10 מיקרומטר (B1-B3) באמצעות 30 על ידי 30 מיקרומטר ערוץ מלבני מאחד היטב אַחֵר. סרגל הסולם מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לחלופין, כדי ליצור זרימת נוזל קבועה בתוך רשתות microfluidic, משאבת מונחת מזרק fיכול להיות יזם נמוך ידי photopolymerizing הידרוג הפנימי של המכשיר microfluidic משנית עם ויציאות יציאה עבור התממשקות משאבת מזרק. באיור 3 א, מכשיר microfluidic זמין מסחרי, מראש מפוברק מוצג עם להקת 1 מ"מ של הידרוג'ל photopolymerized לרוחב המכשיר 7. שפלת ליזר מבוסס יושמה לפברק ערוצים ורשתות microfluidic ב הידרוג שוכן באמצעות אותו הפרוטוקול המתואר כאן הידרוג בודד. זרימת משאבה שנוצרה מזרק ניתן לראות באיור 3 ב, שם ערוץ גלילי בקוטר 20 מיקרומטר היה מפוברק הידרוג'ל שוכן מכשיר microfluidic. באפיק בקוטר 20 מיקרומטר זה, כדורי קלקר ניאון 2 מיקרומטר פרט נפתרים בקלות ללא זרימת נוזל (איור 3B1), ואילו כאשר s flowrate 5 μL / מוחל, הספירות לעבור דרך שדה הראייה, כפי שמעידים קווים מפוספסים (איור 3B2 </ Strong>). אותה גישה זו שימשה לגרום זרימת באמצעות רשת 2D, נגזר-וסקולרית לפקח זרימת שכותרתו TRITC, 65 dextran kDa דרך הרשת דיפוזיה לתוך הידרוג'ל שמסביב (איור 3 ג).

איור 3
איור 3: מזרק משאבה-Driven זרימה PEGDA הידרוג polymerized מעטה Microfluidic. זמין מסחרי, מכשיר microfluidic מראש מפוברק (א) עם 17 x 3.8 x 0.53 מ"מ (x, y, z) microchannel בתים הידרוג'ל photopolymerized 1 x 3.8 x 0.53 מ"מ (x, y, z) PEGDA, שמסומן על ידי חץ שחור. ערוץ גלילי בקוטר 20 מיקרומטר היה מושפל דרך הידרוג'ל, ותחומי פוליסטירן 2 מיקרומטר הוזרמו דרך המכשיר (B). התחומים נפתרים בבירור ללא זרימת נוזל (B1), אך הם מופיעים פסים בכל flowrate 5 μL / s(B2). בעוד הידרוג'ל שוכן, 2 ד וסקולרית נגזרות רשת הייתה מפוברקת TRITC שכותרתו, 65 dextran kDa נשאב דרך הרשת (C). זמן לשגות מיקרוסקופי שמש לפקח על dextran הניאון כפי שהוא מלא את הערוצים מתפזרים לתוך הידרוג'ל שמסביב. חיצים לבנים ב (ב) ו- (ג) לציין את כיוון זרימת הנוזל. בר הכיול (C) מציין את עוצמת dextran הניאון. ברי הסולם מייצגים 20 מיקרומטר (B1) ו- (B2) ו -50 מיקרומטר (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הקריטיים דריסה של הפונקציות הסטנדרטיות של תוכנת מיקרוסקופ כדי לאפשר את השימוש במסכות וירטואליות עבור מונחי תמונה, שפלה מבוססת ליזר, המאקרו מיקרוסקופ חייב להיות התקנת מניפולציות בזהירות. כיצד ממשקי התוכנה מיקרוסקופ עם המאקרו מיקרוסקופ יכולים לפעמים להיות מנוגדים, ומאמצים רבים הושקעו בקביעת ההגדרות האופטימליות בשתי התוכניות לפתח שיטה זו. הבנה כללית של שימוש במיקרוסקופ confocal ליזר סריקה בסיסית מומלצת, במיוחד עם "הבמה" ו- "הפוקוס" חלונות למציאה ונכונה מיצוב הידרוג'ל ב x, y, z וממדים, לפני שתנסה שפלה מבוססת ליזר. בנוסף, הייצור של ערוץ כניסה הוא קריטי הפרוטוקול; מיני פלורסנט מושעים חייבים להיות מסוגלים להיכנס מערכות microfluidic עבור הדמיה מוצלחת ואפיון רשת. חשוב לציין כי פרוטוקול זה חל על ספציפי laser-מיקרוסקופ סורק confocal מוגדר עם לייזר פעמו femtosecond ספציפיים, שבהם פועלות גירסאות ספציפיות של תוכנה מיקרוסקופ ואת המאקרו מיקרוסקופ (ראה פירוט רשימה של חומרים / ציוד ספציפי). גילינו כי גרסאות חדשות יותר של מאקרו מיקרוסקופ חסרים מלאה פונקציונליות הנדרשים לשליטה מונחה לייזר התמונה. בעוד פלטפורמות מיקרוסקופ אחרות ומקורות ליזר פעמו יכולים לשמש, פרוטוקול זה מתייחס באופן ספציפי במערכת זו ויהיה צורך לבצע שינוי על פי הפלטפורמה, מקור ליזר, ותוכנה מיושמת. העקרונות שבבסיס בכל פרוטוקול זה עדיין חלים, עם זאת.

שינוי פוטנציאל לפרוטוקול זה כרוך בשינוי הרכב הידרוג'ל. הנה, השתמשנו 5% wt, 3.4 הידרוג kDa PEGDA, אבל שפלה מבוססת ליזר (למטרות מלבד דור רשת microfluidic) יושם כדי לבזות הוא הידרוג סינטטיים וטבעיים, כולל הפיברין PEGylatedעוגן 21,22, חלבון משי הידרוג 23, ו -24 קולגן. התאמת כוח לייזר, מהירות סריקה, המרווח בין-פרוסות Z, ומספר חזרות יסייעו בקביעת הפרמטרים האופטימלי לפברק רשתות microfluidic בניסוחים הידרוג'ל אחרים.

מגבלה נוכחית אחת של הטכניקה היא ההיקף הכולל של הידרוג'ל שיכול להיות מושפל בסכום ריאלי של זמן. כדי ליצור חללים פתוחים או תכונות microfluidic בתוך הידרוג'ל, הלייזר להתעכב זמן חייב להיות בבית או מעל 8.96 מיקרו-שניות / פיקסל (או ומהירות סריקה לייזר של 0.021 מיקרומטר / מיקרו-שניות) בעת שימוש השטף לייזר של 37.7 NJ / מיקרומטר 2. עם הגדרות אלה, זה לוקח 1.4 שעות כדי לבזות כלי בתוך נפח 0.014 מ"מ 3 (כפי שניתן לראות באיור 1). שימוש להתעכב זמן לייזר של 4.48 מיקרו-שניות / פיקסל או מתחת, האנרגיה מועברת לא מספיק השפלה מלא של ניסוח הידרוג'ל משמש כאן. הטמעת הידרוג'ל שונהרכב יכול להתגבר על מגבלה זו. שימוש ג'לים photolabile המכיל רכיבים רגישים לאור 34-36 או הידרוג'ל שיש חתכי multiphoton הגדול 21-24 הם אפשרויות טובות שתאפשרנה את השימוש באנרגיה פחות ו תבאנה שפלה מהר. לעניין מגבלות ממדים, תכונות כבר מפוברקות עד 1.5 מ"מ עמוק בתוך הידרוג'ל 7. השגת העומק היא פונקציה של מרחק העבודה של אובייקטיבית ניתן להגדיל באמצעות מטרות מרחק עבודת אולטרה ארוכות אופטימיזציה עבור הדמית vivo. ערוץ הנמדד הקטן 7 שנוצר באמצעות מטרת טבילה במי 20X (NA1.0) הייתה ברוחב של 3.3 מיקרומטר ועומק של 8.9 מיקרומטר, אשר הוא שוה עם הגודל של הערוצים הקטנים שנוצרו באיור 1. בעוד מעבדות אחרות השתמשו מטרות NA נמוכות 21,23,24, אנו צופים כי רשתות microfluidic עם תכונות קטנות יכולות להיות שנוצרו באמצעות גבוהאה NA מטרות על חשבון מרחק עבודה מופחת. אולם בסופו של דבר, ההחלטה של ​​הטכניקה היא פונקציה של הפונקציה להפיץ את הצבע של קרן לייזר ממוקדת, המאפיינים סריקת לייזר, כמות האנרגיה המועברת על ידי לייזר, ואת המאפיינים לייזר הקליטה של ​​החומר להיות מושפל.

יתר על כן, תכונות ליזר (מהירות, השטף, המרווח בין מסכות וירטואליות, ומספר החזרות) חייב להיות מותאמים המבוסס על מאפייני הידרוג'ל (צפיפות crosslink, macromer / משקל מולקולרי מונומר, אחוזים במשקל, וסוג הידרוג'ל: חלבון מבוסס לעומת סינתטיים ), כמו אלו ישנו מטבעו אינטראקציות עם הליזר וכך ההחלטה הסופית של התהליך. כמו האנרגיה מועברת מושפע גם על ידי המטרה בשימוש, אופטימיזציה נוספת נדרשת בעת מעבר בין היעדים. עם כל הכבוד העלויות הכרוכות, גישה מיקרוסקופ עם לייזר פעמו נדרש, ובעוד objec רבים ושוניםעזרי למידה ניתן להשתמש, אלה עם NA גבוהה מרחק עבודה ארוך (הדמית in vivo) יכולים להיות יקרים.

מעל ומעבר הפרוטוקול המפורט כאן, רשתות microfluidic שנוצרו באמצעות טכניקה זו יכולה להיות פונקציונליות גם עם ייצור שלאחר ערוץ פפטידים-דבק תא כדי לגרום הדבקת תא האנדותל ו לומן היווצרות 7. בנוסף, השילוב של רצפי פפטיד מתכלה תא עיקר החומר 9 לפני לתעל שפלה עלול לאפשר לחקר נדידת תאים לתוך ודרך הידרוג'ל. לקבלת הרחפה רציפה של רשת microfluidic בתוך הידרוג'ל, הידרוג ניתן photopolymerized בהתקנים fluidic גדול או מעטה, כפי שמודגם איורים 2 ו 3 7.

הדור של רשתות כלי דם באמצעות הרכבה עצמית vasculogenic או angiogenic 8-12 מספק גישה פשוטה לגרום vascularization ברחבי נפח הידרוג'ל גדול יחסית. גישה זו אמנם גורמת רשתות fluidic perfusable, קשה לשלוט על גודל ישירות, tortuosity, צפיפות, ואדריכלות ברשת הכוללת. בשל מגבלה זו, פרופיל הזרימה ושיעורי גזירה בכלי הדם עשוי להיות שונים בין ניסויים. לחלופין, טכניקות microfabrication 13-16 לאפשר שליטה ישירה על ארכיטקטורת רשת אבל הם מוגבלים לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם ליצור קטנים, ערוצים בגודל נימים או הייצור של רשתות צפופות המחקות באדריכלות וסקולרית vivo. בעוד טכניקת השפלה הידרוג'ל מבוססי לייזר המפורטים כאן כבר לשנות את ייעודו החדש לייצור microfluidic, הוא מתגבר בו זמנית הן את השליטה אדריכלי ומגבלות מבוססי גודל של שיטות microfabrication הקיימים על ידי המאפשר יצירת רשתות microfluidic biomimetic 3D כי לשחזר את הצפיפות, tortuosity, גודל טווח, ועל אדריכלות הכוללתדואר של כלי דם בגוף חי. יתר על כן, רשתות fluidic מרובים יכול להיווצר הידרוג יחיד, המאפשר חקר התחבורה הבין-רשת 7. עבור יישומי הנדסת רקמות כי שואף יותר מקרוב לשכפל בתהליכי ההובלה vivo במבחנה, רשתות microfluidic-מוטבע הידרוג'ל נפתרו מאוד המפורטות כאן הן גם מתאימות. אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה מועיל בפיתוח בונה רקמות שיותר במדויק לחקות in vivo תחבורה לצריכה כמכשירי הקרנה בסמים במודלי מחלה במבחנה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATLAB Mathworks R2015a named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH version 1.51a named "image processing software" in protocol
LSM 780 Confocal Microscope Zeiss named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation
Zen 2010B SP1 Zeiss release version 6.0 named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780
Multitime, 2010 Zeiss v16.0 named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen)
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm Zeiss 421452-9880-000 for use on Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser Coherent named "high-powered pulsed laser" in protocol
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Triethanolamine (TEOA) Sigma-Aldrich 90279-100ML flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane VWR 10040-460
PEGDA synthesized in house refer to source 33 for synthesis methods; store under argon
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E6003-25G
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil Thomas Goldkamp 37728
Flexmark 90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 backing for handling of double coated tape
Model SC Plotter (adhesive cutter) USCutter SC631E used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole MatTek Corporation P60-20-F-NON
High Intensity Illuminator (white light source) Fiber-Lite 4715MS-12WB10
Power Meter Newport 1916-R detect power at 524 nm when using white light source
Slim Profile Wand Detector Newport 918D-ST for use with power meter
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round synthesized in house refer to source 7 for methods
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Life Technologies D7137 can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel
1 mL Syringe, Luer-Lok BD 309628
Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602
sticky-Slide VI0.4  Ibidi 80601 microfluidic devices that can be used to house hydrogels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
  2. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  3. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  4. Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
  5. Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  6. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
  7. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
  8. Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
  9. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
  10. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
  12. Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
  13. He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
  14. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
  15. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
  16. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  17. Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
  18. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
  19. Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
  20. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  21. Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
  22. Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
  23. Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
  24. Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
  25. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  26. Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
  27. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
  28. Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
  29. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
  31. Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
  32. Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
  33. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  36. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).

Tags

Bioengineering גיליון 119 biomimetic הנדסת רקמות כלי הדם חומרים ביולוגיים המיקרו-סביבה microfabrication biotransport הלימפה הידרוג'ל
תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, … More

Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. J. Vis. Exp. (119), e55101, doi:10.3791/55101 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter