Abstract
이 상세한 프로토콜은 PEGDA의 하이드로 겔에 포함 된 혈관 유래 미세 유체 네트워크의 제작을위한 영상 유도, 레이저 기반 하이드로 겔 저하의 구현을 설명합니다. 여기서는 영상 유도 레이저 제어를 허용 가상 마스크의 생성을 설명; 미세 유체 네트워크 제조 및 압력 헤드 구동 흐름에 적합한 micromolded PEGDA 하이드로 겔의 광중합; 펨토초 펄스의 Ti와 결합 시판의 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 설치 및 사용 : 하이드로 겔 저하를 유도 S 레이저; 그리고 제작 된 미세 유체 네트워크 촬상 형광 종 및 공 촛점 현미경을 사용. 이러한 복잡성의 번호를 포함하는 미세 가공을 위해 상용 현미경 사용에 중요한 단계는 같은 프로토콜의 대부분은 현미경 소프트웨어 및 현미경 매크로의 적절한 설정 및 구현에 집중된다. 이 techniqu의 영상 유도 구성 요소E함으로써 소재 미세 디자인 거의 모든 구성이 복잡한 마이크로 유체 시스템의 제작을 가능 3D 이미지 스택 또는 사용자가 생성 한 3D 모델의 구현을 허용한다. 조직 공학에 예상되는 영향으로,이 프로토콜에 설명 된 방법은 organ- 인간 - 온 - 어 - 칩 장치에 대한 고급 생체 모방 microtissue 구조의 제작에 도움을 수 있습니다. 생체 내 혈관의 복잡한 구조, 비틀림, 크기 및 밀도를 흉내 필수적 생물학적 전송 과정은 약물 약동학과 질병의 정확한 시험 관내 모델 선도 이러한 구조로 복제 될 수있다.
Introduction
림프 및 cardiovasculature 모두 구성된 혈관 시스템, 형태 영양분과 산소의 수송과 대사 폐기물의 제거에 필수적인 고밀도 네트워크를. 따라서, 혈관 조직에 존재하는 세포보다 50 ~ 100 μm의 거리에 용기 (1)에서 결코 없습니다. 시험관 내에서 생체 내 혈관 구조를 재생하는 기능을 정확하게 설계 구조를 사용하여 생체 내에서 전송 프로세스를 모델링하는 것이 중요하다. 3,4 질병 모델링 5,6 선별 높은 처리량 약물 기관 - 온 - 어 - 칩 장치 (2)를 개발하기 위해 최근 드라이브, 방법이 그리는 합성 또는 천연 하이드로 겔의 생체 -like 전송을 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 만들 수 있습니다 상당한 관심. 이들 장치에 사용 microtissues의 생체 모방을 강화하기 위해 세 dimensiona를 이용하는 영상 유도 레이저 기반 겔 분해 방법을 개발템플릿으로 기본 혈관의 리터 (3D) 이미지 스택은 7 하이드로 겔 PEGDA에 포함 된 혈관 유래 미세 유체 네트워크를 생성합니다. 이 프로토콜은 이미지 유도 레이저 기반 열화 통해 PEGDA 하이드로 겔 혈관 유래, 생체 모방 미세 유체 네트워크를 제작 펨토초 펄스 레이저를 구비 한 시판되는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 사용을 설명합니다.
하이드로 겔을 유동화하는 현재의 접근 방식에 내피 13-16를 위해 미리 정의 된 채널을 생성하는 혈관 신생 8-10 또는 혈관 신생 10-12 내피 세포의 자기 조립과 미세 기술의 유도를 포함한다. 자기 조립 네트워크가 밀도와 미세 혈관의 복잡한 구조를 요점을 되풀이하는 동안, 그들은 종종 약물 검사 애플리케이션을위한 모델링 전송에 문제가 될 수있다 생체 네트워크 11,17,18,보다 더 투과성이다. 자기 조립 네트워크는 physiolog 구성ically 관련, 모세관 크기의 용기,하지만 인해 큰 세동맥 크기의 혈관 생성의 제한 대량 유체 흐름과 통합하기가 어려울 수 있습니다. 이러한 네트워크의 조립을 통해 직접 제어가 없으므로, 최종 구조는 반복해서 같은 유체 유동 및 전송 특성을 갖는 네트워크를 생성하는 것이 곤란하게 샘플들에서 변할 수있다.
3D, 반복 구조 및 잘 정의 된 구조를 가진 하이드로 겔 포함 미세 유체 네트워크를 생성하기 위하여, 마이크로 제조 기술의 개수는 모듈 어셈블리 (13), 희생 물질 (16), 직접 기록 조립체 (14) 및 전 방향성 인쇄 (15)의 3D 인쇄를 포함하여 개발되었다. 이들 방법, 미세 구조, 따라서 유체 유동 및 전송 특성을 적용하여 반복하여 다수의 구조물에 걸쳐 제조 될 수있다. 이러한 방식의 가장 큰 한계는 있지만, 초 미세 합성 섬유를 만들 수 없다는 것이다모세관 크기의 기능을 luidic 네트워크, 4 ~ 10 μm의 19. 대부분의 미세 가공 기술은 종종 직경 13, 16에서 150에서 650 μm의에 이르기까지 다양한 기능으로 제한됩니다. 일부 기존의 기술은 직접 기록 조립체 (14)에 대해 10 내지 300 ㎛, 다양한 직경의 범위에 걸쳐 채널 계층 네트워크를 생성 할 수 있으며, 전 방향성 인쇄 15 18-600 μm의,하지만 이들은 밀집 네트워크 또는 생성 할 수있는 능력에 제한이 단일 구조 (7) 내에서 가까운 거리에 여러 개의 미세 유체 네트워크를 생성한다.
이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해, 우리는 생체 모방의 반복 가공, 생체 내 미세 혈관의 구조를 계층 적 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 허용하는 영상 유도 레이저 기반 겔 분해 기술을 개발 하였다. , 그래서 790 nm의, 140 펨토초 (FS) 80 MHz에서 동작하는 펄스 레이저를 수행하려면 래스터 스캔 전입니다생체 맥관계의 이미지에 의해 정의 된 N, 하이드로 겔 내에서 3 차원 위치를 원하는. 우리는 물 (20)을 팽창과 같이 분해 처리 물의 레이저 광 유도 분해, 생성 된 플라즈마의 형성 물 후속 급속 열 탄성 팽창 및 하이드로 겔의 지방 분해를 통해 동작하는 것을 추측. 이 메커니즘은 단백질 기반의 하이드로 겔 21-24의 레이저 기반 저하와 약간 다릅니다. 낮은 다 광자 단면을 갖는 PEGDA 달리, 단백질은 종종 많은 광자 단면을 가지며, 따라서 광자 흡수 유도 화학 파손 (23)를 통해 저하한다. 영상 유도 미세 유체 네트워크를 생성하기 위해, 레이저 셔터는 미세 구조를 정의하는 관심 영역 (9)의 모자이크 이미지로 구성 유래 가상 마스크에 의해 제어된다. 이 방법을 사용하여, 3 차원 혈관 유래 생체 모방 미세 유체를 제조 할 수있는 능력을 입증하기 위해, 생체 내 혈관의 밀도 및 아키텍처 비틀린 요점을 되풀이 IC 네트워크는 로컬 분해시 발생하는 에너지의 양을 변경하여 하이드로 겔의 다공성을 제어한다. 우리는 또한 가까운 거리 (15 μm의)에 얽혀 있지만 직접 칠을 연결하지 마십시오 두 개의 독립적 인 미세 유체 네트워크를 생성 할 수 있었다. 우리는 또한 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 - 세린 (RGDS가), 내피 세포 부착 및 루멘 형성 7을 홍보하기 위해 인테그린 결찰 펩타이드 서열과 포스트 분해 작용을 통해 레이저 성능이 저하 된 마이크로 채널을 endothelialize 할 수있는 능력을 증명하고있다.
이 프로토콜로, PEGDA 하이드로 겔 복잡한 미세 유체 네트워크의 생성은 많은 대학 캠퍼스에 액세스 할 수있는 상업적으로 이용 가능한 현미경을 사용하여 영상 유도, 레이저 기반 분해를 통해 가능합니다. 분해 공정은 디지털 가상 마스크에 의해 안내되고,이 FABRICA기 기술은 다양한 애플리케이션에서의 사용을 허용하는, 미세 유체 네트워크 소재 디자인 의무이다. 우리는 여기에 기재된 방법은 모델링 약물 수송이 중요한 생물학적 전송 프로세스를 복제 할 수있는 생체 모방 organ- 인간 - 온 - 칩 디바이스 설계에 가장 유리할 것으로 예상된다. 이 제조 기술은 암전 5,6- 및 혈액 - 뇌 장벽 모델 (25)을 포함한 체외 질병 모델의 생성에 대한 관심이있을 수있다. 레이저 기반 겔 열화는 이전 신경 생장 21-23의 안내 트랙을 만드는 데 사용 된 바와 같이,이 기법은 영상 유도 확장은 사용자 정의 된 3 차원 공간 배치의 셀 위치를 고급 조직 공학 전략에서 유용 할 수있다.
Protocol
1. 가상 마스크를 생성
참고 : 마우스 뇌의 미세 혈관의 3D 이미지 스택은,이 프로토콜에 대한 미세 유체 모델로 선정되었다 전체 마우스 뇌의 미세 혈관의 이미지를 포함하는 훨씬 더 큰 데이터 세트에서 수집 된. 미세 혈관 이미지는 칼을 예리하게 스캐닝 현미경 (KESM) (26), (2)를 통해 취득한; 유사한 미세 혈관 데이터는 KESM 마우스 뇌 아틀라스 (28)를 통해 공개적으로 사용할 수 있습니다.
- (Z로 Y로 X)는 450 μm의 X 450 μm의 X 1.5 mm에 맞는 이미지 처리 소프트웨어 (29)를 열고 열고 원하는 미세 유체 네트워크, 하이드로 겔 내에서 생성 할 수 있도록 기본 혈관의 3D TIF 이미지 스택을 자르 창문. 이렇게하려면 원하는 영역 주위에 사각형을 그리고 "이미지"→ "자르기"를 클릭합니다. 원하는 조각의 "이미지"→ "중복"을 입력을 클릭하여 z 방향의 조각을 제거합니다범위.
주 :이 원하는 기능 시야 내 (Y 의해 X)를 (맞게되도록 531.2 X 531.2 ㎛의 2884 X 2884 픽셀의 프레임 크기와 0.8의 줌 20 배 (NA1.0) 수침 대물를 사용 20 배 (NA1.0) 침수 목적의 레이저 스캐닝 공 초점 현미경) 및 작동 거리 (Z)와 함께. 알 수없는 경우, 다른 시스템의 시야 원하는 목적과 설정 영상을 획득함으로써 결정될 수있다. - 기능은 주로 "이미지"→ 클릭하여, 래스터 주사의 방향, 또는 x 방향으로 정렬되도록 이미지 스택을 회전 → "회전"을 "변환". 이는 제조에 필요한 시간을 감소시킨다.
- 화소 사이즈가 일치은 공 초점 현미경에 분해에 사용되는 설정 (0.184 μm의 / 픽셀 2884 픽셀 2884의 프레임 크기를 갖는 20X (NA1.0) 수침 대물를 이용 초과되도록 자른 이미지 스택 스케일0.8 줌). 이렇게하려면 "이미지"를 클릭 → → "크기"를 "조정"과 "폭"(즉, 450 μm의, 또는 0.184 μm의 / 픽셀로 나누어 이미지의 크기)은 "2446"을 입력합니다.
- 임계 값 / "Ctrl 키 + 시프트 + T"를 입력하여 이미지 스택을 이진화. "어두운 배경"을 선택 취소하고 → "확인" "적용"을 클릭합니다. "이미지"→ "조회 테이블"→ "반전 LUT"를 클릭하여 프로세스를 완료합니다.
- 사용자 정의 알고리즘을 사용하여 X (래스터 주사의 방향에 평행 진화 (흰색)에 맞게 하나의 픽셀 높은 사각형의 모자이크와 기능, 프로그래밍 소프트웨어 9 (소스 코드를 참조 원고의 보충 자료에서 사용할 수 있습니다) Y 방향) <관심 영역 레이저 위치 및 셔터 (9), 7, 30, 31 가이드 (로아)를 생성하도록SUP> 32.
참고 : 사용자 정의 알고리즘 9는 RLS 파일에 TIF 이미지 스택에서 각각의 평면을 변환합니다. - 분해시 사용 .OVL하는 RLS 파일의 파일 확장자를 변경합니다.
2. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 구성
주 : 펄스 레이저 갖춘 다른 레이저 주사 현미경을 사용할 수 있지만, 설정 및 프로토콜이 여기에서의 소프트웨어와 함께 레이저 주사 현미경 (LSM)의 사용을 설명한다.
- 의 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, 현미경 소프트웨어를 열고 "시작 시스템을." 은 "유지"탭에서 목표 "W 계획 - 고차 색지움 20 배 / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm"를 선택합니다.
- 은 "하이드로 겔 시각화"구성 설정
- 은 "취득"탭에서, 그리고에서 "레이저"진열창에 레이저 선이 (514 nm의 아르곤 레이저)이 선택되어 있는지 확인w 참고 :이 채널은 방향을 목적으로 7 이미지에 에오신 Y 형광을 통해 하이드로 겔을 사용한다.
- 은 "이미지 설정"창에서 "모드"를 "채널 모드"설정을 "프레임", "스위치는 모든 트랙"및 "트랙 1"을 선택을 설정합니다.
- 은 "광경"창에서, 516 내지 735의 범위로, 단지 채널 1 형광 검출기를 선택; 메인 빔 스플리터 (MBS) 가시 광선 라인에 514분의 458 필터; 그리고 눈에 보이지 않는 빛 라인의 접시. 밝은 필드 광전자 증 배관 탐지기, "T-PMT"을 선택 취소합니다.
- 은 "수집 모드"창에서 "1"로 "선 단계"는 "스캔 모드"를 "프레임", "프레임 크기"를 "2884"X와 Y를, 올바른 목적이 선택되어 있는지 확인하고 설정 은 "평균화 수"는 "1"은 "평균화 모드" "선"은 "평균화 방법"은 "을"평균 "으로 할 수 있습니다비트 심도 "를"16 비트 ", 그리고"방향 "에서"- 양방향 스캔 "<>.
- 은 "수집 모드"창에서 원하는 및 "자료 Corr X"와 "Y"을 "0.05"또는 특정 현미경 사용을 위해 필요한 조정 설정으로 "속도"를 설정합니다. "HDR"을 선택 취소합니다.
- 은 "수집 모드"창에서 "스캔 영역은"설정 "줌"로 "531.2 μm의 X 531.2 μm의"의 "이미지 크기"와 "0.18"의 "픽셀 크기"를 표시하는지 확인을 "0.8" ; 제로로 다른 모든 "스캔 영역"값을 설정합니다.
- 은 "채널"창에서 채널 1 형광 검출기로 "트랙 1"을 선택합니다. "800"의 "10.0"의 백분율 파워 선택 레이저 라인 "514", "1AU"의 "핀홀"초기 "게인 (마스터)"A는 "0"의 "디지털 오프셋"및 "디지털 이득"의4 1 ".
참고 : 특정 현미경에 대한 필요에 따라 설정을 조정하여 사용된다. - "하이드로 겔 시각화 '등이 구성을 저장합니다.
- "채널 형성"구성 설정
- 은 "레이저"창에서 선택하고 다음 "취득"탭에서 레이저 라인 (S 레이저 티 펄스 790 nm의 140 FS)가 있는지 확인합니다. 790 nm에서 최대 전력 출력은 "4000"에서 "GDD 수정"을 설정합니다.
- 단계 2.2.2에 설명 된대로 "이미지 설정"창을 설정합니다.
- 은 "광경"창에서, 어떤 형광 검출기는 가시 광선 라인에 MBS 458/514/561/633 필터와 760+ 필터 보이지 않는 빛 라인에 MBS로, 선택되지되어 있는지 확인합니다. 밝은 필드 광전자 증 배관 탐지기, "T-PMT"을 선택 취소합니다.
- 은 "수집 모드"창에서 올바른 목적이 나열되어 있는지 확인합니다. 3 "에"속도 "로 설정"단계 2.2.4에 설명 된대로 다른 모든 설정.
- 은 "채널"창에서 T-PMT 검출기으로 "트랙 1"을 선택합니다. A는 "0"의 "디지털 오프셋", "800"의 "100.0"의 퍼센트 전력, 초기 "게인 (마스터)"로, 레이저 라인 "790"을 선택하고 "1"의 "디지털 이득" .
- 은 "무대"창에서 "제로 설정"을 클릭하여 무대를 제로. "마크"를 클릭하여 위치를 표시합니다. 이 3 단계에서 현미경 매크로 가상 마스크를 업로드 중요합니다.
- "시간 시리즈"창에서 "0"으로 "1"과 "간격"로 "사이클"로 설정하십시오.
- 은 "블리치"창에서 상자 "# 스캔 후 시작 표백의"을 확인하고 "0 1"의 값으로 설정합니다. (8.96 μS / 픽셀의 픽셀 체류 시간에 해당) "3"의 값은 "다른 스캔 속도"를 선택합니다. 은 "안전 BL을 선택하나로 이루어질 수에 대한 각 ".
- 은 "블리치"윈도우의 레이저 라인 섹션에서에 "100.0"퍼센트 전력을 790 레이저 라인을 선택하고 설정합니다. 선택하지 않은 표백제 창에서 다른 모든 상자를 둡니다. 은 "블리치"창에서 표백제 설정을 저장합니다.
- "채널 형성"등이 구성을 저장합니다.
참고 : "Z-스택", "지역", "포커스"및 "무대"창은 또한이 프로토콜에 중요하지만, 초기 구성 중에 설정하거나 조정할 필요가 없습니다.
3. 레시피를 작성 및 현미경 소프트웨어 및 매크로에 가상 마스크를 업로드
- "채널 형성"구성에서 계속 실행 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 여전히 현미경 소프트웨어, 선택 (옆에있는 "실험 시작"버튼) 만 "지역"창.
- 마스크가 올바른 현미경 매크로로드되었는지 확인하려면LY는 "수집 모드"창 "8"의 "채널"창에 "0.2"및 "속도"의 %의 전력을 설정하고, 화면의 왼쪽 상단에 "스냅"을 클릭합니다.
- 이미지의 "정보"탭에서 "0.18"의 픽셀 크기로, 이미지 크기가 "531.2 μm의 X 531.2 μm의는"아직 있는지 확인합니다. 이 값이 올바르지 않으면, 다시 "프레임 크기"와 "줌"값을 확인합니다.
- CRITICAL 다음 "단계"창에서 X 및 Y 위치를 제로되어 있고 위치가 현미경 매크로를 열기 전에 표시되어 있는지 확인합니다. 2.3.6 단계를 참조하십시오.
- 현미경 매크로, 유형 "Alt + F8"을 열려면 "로드"를 클릭하고 올바른 버전을 선택합니다. 특정 재료 / 장비의 목록에서 세부 사항을 참조하십시오. 서브 매크로의 긴 목록은 "매크로 컨트롤"창에서 열립니다.
- 은 "매크로 컨트롤"창에서 MICR을 열고 "실행"을 클릭합니다매크로 oscope 다음 "매크로 컨트롤"창을 닫습니다.
참고 : 현미경 매크로의 대체 버전이 프로토콜을 사용하여 레이저 기반 하이드로 겔 저하와 호환되지 않을 수 있습니다. - 현미경 매크로의 "저장"탭에서 "단일 파일 출력"을 선택, 임의의 "기본 파일 이름"을 제공하고, "임시 파일"폴더를 선택했다. 위치 "1"을 "열기 임시 폴더"설정 "단일 임시 이미지 폴더"를 선택하고 선택 "리콜 위치 목록"과 "저장 / 레시피 적용"에서 래서 이름을 지정합니다. 처음에 레시피를 만들기 위해 "저장"을 클릭합니다.
- 현미경 매크로의 "취득"탭에서 "스캔 구성"단계 2.3에서 설정 한 현미경 소프트웨어 구성에 지정된 이름과 일치하는지 확인합니다. "0"의 "간격"과 "1"을 "블록 내에 시간의 포인트"를 설정합니다. 그 "로 표시된 Z를 확인 - Z STAC 위로 가기"녹색 강조 k는. 다른 모든 기본 설정을 그대로 잘 수 있습니다.
- 현미경 매크로의 "타이밍"탭에서, "지연 대기"되도록, 녹색 강조 "1"과 "0"으로 "오직 첫 번째 위치에 블록 전에 간격을 기다립니다"을 "실험 반복"과 "그룹 번 반복"로 설정 . 다른 모든 기본 설정을 그대로 잘 수 있습니다.
참고 : "그룹 반복]"(이 아닌 "실험 반복") 하나가 영역에 배 레이저 스캔의 수를 설정할 수있는 상자가 (즉, 조리법의 반복). - 현미경 매크로 "Z리스트"탭에서 Z 방향의 열화 평면이 규정된다. 사용하는 가상 마스크의 개수와 일치하도록 설정 "위치 번호"와 Z-간격 "DZ"행 "1 ㎛"를 설정한다.
- "드롭 다운 메뉴에 표시 리를"Z 목록 "을 만들기 위해"Z 스택 만들기 "버튼을 클릭창 하단으로 위치 "의 일입니다. 위치 및 z-간격의 개수가 올바른지 확인하고 X 및 Y 위치는 제로됩니다.
주 :이없는 경우, 제조법을 저장하지 않습니다; 현미경 매크로를 닫고 현미경 매크로를 다시 열고 다시 조리법을 설정하기 전에 단계 2.3.6를 반복합니다.
NOTE 대신 1 ㎛ 각으로 이격 100 마스크를 갖는, 예를 들어, 각 현미경 매크로 개별 마스크로드로서 등가 미세 구조를 얻기 위해, 1 ㎛로 두번 사용 이격 50 마스크를하는 것이 바람직 할 수 있습니다 많은 시간이 소요됩니다. - 현미경 매크로의 '블리치'탭에서 마스크 모든로드해야하고 "위치 목록"에서 특정 번호가 매겨진 위치와 일치. 시작하려면 "블리치"상자를 선택하고 있는지 확인 "구성." 메인 현미경 소프트웨어 화면의 "표백"창에서 표백제 설정의 이름 (2 단계를 참조 일치.3.8). 해제, "0"에 "블리치 후 지연을 기다립니다"설정 "자리"와 "ROI"빈 둡니다.
- '위치'에서 아무것도 변경하지 마십시오, "타일", "그리드", "자동 초점", "블록"및 기본 설정에서 "옵션"탭.
- 현미경 매크로 마스크를로드하려면, 현미경 소프트웨어 만 "지역"창을 선택하고 현미경 매크로의 "블리치"탭을 엽니 다. 은 "지역"창에서 "로드"버튼을 클릭 저하되는 Z-스택의 맨 아래에있는 마스크에 대한 .OVL 파일을 선택합니다.
참고 : "Z 목록"의 첫 번째 위치는 Z-스택의 바닥, 그리고 현미경 매크로는 Z-스택, 또는 하이드로 겔의 상단에 그것의 방법을 작동합니다. - 로아의 목록은 "지역"창에 표시되면 (이미지가 단계 3.2에서 스냅에) 시야 내에서 마스크의 로아를 보려면 화살표 버튼을 클릭합니다. ROI 영역 내에서 맞는 있는지 확인시야.
- 다음, 현미경 매크로에로드 된 마스크를 저장 "블리치"탭에서 "ROI 목록에 현재 지역 추가"상자에 마스크에 이름과 번호를주고,하려면 "ROI 목록에 현재 지역 추가"버튼을 클릭합니다. 이름과 번호는 (다른 이전에 만든 조리법에서 마스크 포함) 다른 마스크와 "ROI"드롭 다운 목록에 표시됩니다. 현미경 소프트웨어의 "지역"창에서 마스크를 삭제합니다.
- 반복 현미경 매크로 모든 마스크를 업로드하고 저장할 3.14 및 3.16 단계를 반복합니다.
- 각각의 Z-위치에 업로드 된 마스크를 지정하려면, 드롭 다운 "위치 목록"에 위치 하나를 강조 표시합니다. 은 "ROI"드롭 다운 목록에서 적절한 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 은 "블리치"상자가 현미경 매크로에서 "블리치"탭의 상단에 선택되어 있는지 확인합니다.
- 반복 한 다음 "위치에서"드롭 다운 메뉴에서 모든 위치에 대한 단계 3.18, 그리고 &의 "저장"을 클릭합니다# 34; 저장 "탭은 최종 형태의 레시피를 저장합니다.
4. PEGDA 하이드로 겔을 광중합
- 만들기 무균 HEPES 완충 생리 식염수 트리에탄올 아민과 (HBS) (TEOA)
- 1 L 비이커에, 염화나트륨 2.922 g, HEPES의 1.196 g 및 흄 후드에서 TEOA 7.5 mL에 저어, 교반 막대와 500 mL의 DI의 H 2 O를 추가합니다.
- 파스퇴르 피펫을 적가하여 1 N 수산화 나트륨 용액으로 pH 8.3로 조정한다.
- 멸균 필터를 500 ㎖의 멸균 된 유리 용기에 미디어 0.2 μm의 진공 여과를 통해 컵 용액. 4 ° C에서 나누어지는 및 저장.
- 하단 중 20 mm 구멍 잘라 전문 60 mm 페트리 접시에 뒷면이 양면 접착의 고리를 연결합니다. 접착 링에지지를 떠나, 페트리 접시와 접착제 사이에서 공기 방울을 누릅니다.
- 재료를 준비합니다. 합성 (33) (3)를 가져옵니다.4 kDa의 PEGDA -80 ° C 냉동고 중과 실내 온도에 도달 할 수 있습니다. 하이드로 겔을 광중합하기 전에 백색 광원에 적어도 15 분을 돌립니다.
- 흄 후드 (Y 에오신, 광개시제의 노광을 방지하는 데) 호일 덮인 2 mL의 황색 원심 관에 TEOA HBS로 1 ㎖를 추가한다. DI H 2 O에 Y 나트륨 염을 에오신 1 mm의 10 μL를 추가
- 흄 후드에서 파스퇴르 피펫 유리 비커에 넣고, 1- 비닐 -2- 피 롤리 디논 (NVP)의 작은 부피를 추출한다. 이 책에서, 피펫 3.5 NVP의 μL하여 HBS, TEOA와 호박 원심 분리기 튜브 및 에오신 (Y)에
- 제 호 덮인 2 mL의 황색 원심 튜브 3.4kDa PEGDA 10 ㎎을 추가 (예비 중합체 용액의 잘못된 photoactivation을 방지하기 위해 사용). Y, / V PEGDA 사전 고분자 용액 w 5 %에 대한 NVP 솔루션을 에오신은 HBS, TEOA의 0.2 ML을 추가합니다. PEGDA 때까지 소용돌이가 완전히 용해된다. 파워 미터 및 검출기 지팡이를 사용하면, 흰색 리튬의 강도를 조정95 mW의에 GHT 소스.
- 폴리 (디메틸 실록산)를 구축 (PDMS) 금형
- 취급의 용이성을 위해 더 큰 표면 (유리, 폴리스티렌 조직 배양 접시)에 PDMS 몰드 (7)을 구축하고 성형 하이드로 겔은 20 mm 직경의 원형에 맞지하는 금형은 조립한다.
- 500 ㎛의 두께를 갖는 직사각형 형상의 하이드로 겔을 생성하는 두 개의 겔 정의 에지를 생성하기 위해 PDMS 표면 상에 두 500 μm의 두께 PDMS 스페이서를 배치했다.
- 유체를 도입하기위한 도움이 하이드로 겔의 표면에 300 μm의 깊은 우물을 부여하기 300 μm의의 PDMS 스페이서를 포함합니다.
- PEGDA 사전 고분자 용액 V / 승 PDMS 몰드 상에 5 %의 피펫 60 μL. 피펫 중에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
- 센터 [프로필 3- (메타 크릴)] 트리 메 톡시 실란 (TMPSA을)를 배치 솔루션의 상단에 7, 40 mm 직경, # 1.5 유리 커버 슬립을 작용. coversl 있는지 확인ip는 500 μm의의 PDMS 스페이서에 달려있다. 하이드로 겔은 커버 슬립 메타 크릴 레이트에 결합하고, 상기 용액에 떠에서 하이드로 겔을 방지한다.
- PDMS의, PEGDA 예비 중합체 용액을 넣고 3 분 동안 백색 광원 하에서 조립체 커버 슬립.
- 흐름 DI H 2 몰드와 PDMS에서 하이드로 겔을 분리 커버 슬립 사이 O. 실험실 티슈로 커버 슬립의 가장자리를 건조 DI H 2 O와 하이드로 젤을 씻어. 하이드로 겔에서 만지거나 심지 물 않도록주의하십시오.
- 접착제에서지지를 제거한 후, 준비된 페트리 접시에 coverslip에 부착하고 부드럽게 접착제와 유리 사이에 공기 방울을 제거합니다. DI H 2 O와 페트리 접시에 하이드로 겔 잠수함
주 : 질소로 건조 DI H 2 O로 세정하고, 먼지 유지하면 PDMS 몰드는 추가로 하이드로 겔을 만들기 위해 재사용 될 수있다.
5. 꾸며 혈관 유래 미세 유체 네트워크레이저 기반의 분해를 통해의
- 의 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 현미경 소프트웨어로, "유지"탭에서 목표 "W 계획 - 고차 색지움 20 배 / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm"를 선택합니다. 에 있으며 예열하십시오 "취득"탭에서 필요한 레이저 라인 (S 레이저 514 nm의 아르곤 레이저 및 Ti 펄스 790 nm의 140 FS)에 있는지 확인합니다.
- 하이드로 겔을 설정하면, 입구 채널을 형성하도록
- 무대 삽입의 하이드로 겔과 페트리 접시를 장착하고 현미경 무대에서 무대 삽입물을 배치합니다. 디 H 2 O로 침수 목표를 낮추는 전에 적어도 5 mL의 DI의 H 2 O 센터와 눈에 의한 하이드로 젤 잘 기능을 페트리 접시를 채우
참고 : 목표 - 터치해서는 안 두 사람과 함께 하이드로 겔을 분쇄하지 마십시오! - 하이드로 겔을 찾으려면 단계 2.2에서 "하이드로 겔 시각화"구성으로 전환합니다. 에 레이저 라인을 설정하고 일을 가지고 "라이브"를 클릭즉, 하이드로 겔의 상단 (CH1의 형광 검출기에 의해 검출)가 에오신 Y 신호까지 겔을 목적 가까이 볼 수있다.
참고 용이하게 하이드로 겔을 찾기 위해 전력 비율이 증가 될 수 있거나 또는 핀홀이 개방 될 수있다. 목적은 하이드로 겔에 집중되면, 그러나, 형광 검출기를 보호하고 검출기의 과포화를 방지하기 위해 정확하게 하이드로 겔의 표면을 찾아 다시 1AU에 핀홀을 감소 백분율 전력 놓는다. - 은 "스테이지"윈도우에서, 상기 하이드로 겔과 웰의 저부의 상부 및 하부의 위치를 표시한다.
주 : 여기에서, Z 값은 하이드로 겔의 두께 및 우물의 깊이를 결정하는데 도움이 될 것이다. - 우물의 에지를 찾는 X 및 Y 이동 조이스틱을 사용한다. 반대로 좌측 웰과, 화면의 오른쪽에있는 하이드로 겔을 배치하거나. 하이드로 겔은보기의 필드에는 3 분의 2 이상을 채우지 할 수 있습니다.
- 는 PL 드롭초점 아래 150 μm의 "포커스 방식"창에 "150"은 "단계 크기"를 설정하고 "Z-위치"상자 옆에있는 아래쪽 화살표를 클릭하여 하이드로 겔에을의 메탄. 단계를 반복 5.2.4 필요한 경우.
주 : 입구의 x, y, z 위치는 오직 가상 마스크의 설계에 의존한다. - CRITICAL : 영점 "단계"창에서 X 및 Y 위치, 다른 모든 표시 사항을 삭제 만이 위치를 표시합니다.
주 :이 단계가 수행되지 않는 경우, 현미경 매크로 적절히 이전에 저장된 레시피에 위치를 복원하며, 하이드로 겔은 원하는 위치에서 분해되지 않는다.
- 무대 삽입의 하이드로 겔과 페트리 접시를 장착하고 현미경 무대에서 무대 삽입물을 배치합니다. 디 H 2 O로 침수 목표를 낮추는 전에 적어도 5 mL의 DI의 H 2 O 센터와 눈에 의한 하이드로 젤 잘 기능을 페트리 접시를 채우
- 입구 채널을 형성
- "스냅"이미지와 "지역"창에서 사각형 버튼을 사용하여 혈관 네트워크에 유입 될 것입니다 사각형 영역을 그립니다.
참고 :이 지역의 확인 부분 번째을 보장하기 위하여 우물에 밖으로 확장전자 입구는 혈관 네트워크에 잘 연결됩니다. - 다음은 "지역"창에서 발생하는 투자 수익 (ROI)에, "취득"을 선택하고 "블리치"와 "분석"을 선택 해제합니다.
- "지역"을 선택 해제 "하이드로 겔 시각화"구성을 저장하고 단계 2.3에서 설정 한 "채널 형성"구성을 변경합니다. "채널 형성"구성에서, "지역"을 다시 선택합니다.
참고 : "하이드로 겔 시각화"및 "채널 형성"구성 사이를 전환 할 때 화면의 왼쪽 상단에 지역을 해제해야합니다. 이렇게하지 않으면 때로는 지역의 스케일링은 구성 사이에 예기치 않게 변경 될 수 있습니다. - "채널 형성"구성에서, 단지 "지역"및 "Z-스택"을 선택되어 있는지 확인합니다. 은 "Z-스택"창에서, 다음, 상단과 "센터"엉덩이에 "센터"버튼을 클릭위의 현재 Z 위치와 Z-스택의 중심을 설정하려면 "오프셋". 입구가 할 필요가 얼마나 큰지에 따라 "1"의 "간격"과 "조각"의 수를 설정합니다. Z 축 스택의 크기는 "범위"아래에 표시됩니다.
- 은 "수집 모드"창에서 "속도"가 "3"로하고 "채널"창에서 "백분율 파워"를 "100"로 설정되어 있는지 설정되어 있는지 확인합니다. 구성을 저장하고 "실험 시작"버튼을 클릭합니다.
주 : 입구 채널을 생성하기 위해 여기에 수행으로 현미경 매크로는 여러면에서 같은 간단한 모양을 저하 필요하지 않습니다. 각 평면 상에 상이한 영역을 분해 할 때 매크로에만 필요하고,이 레시피 내의 가상 마스크를 저장하는 데 사용된다. - 분해시 하이드로 겔을 시각화 중 하나 "채널"창에서 "게인 (마스터)"를 증가하는 경우 t의 영역보기 그는 필드는 검은 색, 또는 영역이 흰색 인 경우 "게인 (마스터)"를 감소.
참고 : 거품 형성은 여기에 레이저 유도 하이드로 겔 저하의 표시입니다. - 입구를 대신 한 번에 여러 번 저하 "시간 시리즈"창에서 "사이클"을 조정합니다.
- 은 "하이드로 겔 시각화"구성에서, 입구가 형성되도록 "라이브"를 클릭합니다.
- "스냅"이미지와 "지역"창에서 사각형 버튼을 사용하여 혈관 네트워크에 유입 될 것입니다 사각형 영역을 그립니다.
- 하이드로 겔을 설정하는 것은 미세 유체 네트워크를 생성하는
- 은 "지역"창에서 가상 마스크의 z 스택에서 어떤 .OVL 파일을로드 뷰의 필드에 ROI를 볼 수있는 화살표 버튼을 클릭합니다.
- 은 "하이드로 겔 시각화"구성을 검사 살고 입구가 혈관 네트워크 내에서 올바른 위치에 연결되도록 X와 Y에있는 하이드로 겔의 위치를 조이스틱 또는 "단계"창을 사용하여 "라이브"를 클릭합니다.
참고 : 확인가상 마스크의 ROI는 이전에 형성된 흡입구와 약간 중첩된다. - "포커스 방식"창에서 "단계 크기"를 사용하고 "Z-위치 옆에있는 아래쪽 화살표를 클릭, 아래 초점면 이전 중심의 Z-위치에서 50 μm의, 또는 하이드로 겔의 표면에서 200 μm의 드롭 "상자. 이 현미경 매크로의 첫 번째 위치에있을 것입니다.
참고 : 실제 거리를 Z 축 방향으로 이동은 네트워크 설계에 의존한다. 원하는 네트워크가 z 방향의 하이드로 겔의 상단 또는 하단면을 넘어 확장되지 않도록하십시오. - CRITICAL 다음 "단계"창에서 X 및 Y 위치 제로, 다른 모든 표시 사항을 삭제 만이 위치를 표시합니다.
주 :이 현미경 매크로 시작점 것이다. 레시피는 하이드로 겔의 표면을 향해 다시 그것의 방법을 작동합니다. - "스냅"은 "하이드로 겔 시각화"구성에서 이미지 삭제 및 deselect "지역"및 구성을 저장합니다.
- 미세 유체 네트워크를 생성
- "채널 형성"구성으로 변경하고 만 "시간 시리즈"와 "표백"창을 선택합니다. 그들은 초기 단계 2.3.7과 2.3.8에서 설정 한 바와 같이 "시간 시리즈"와 "표백"창에 대한 설정이 있는지 확인합니다.
- "8"의 "수집 모드"창에서 "속도"와 "채널"창에서 레이저 라인에 "0.2"의 %의 전력을 설정합니다. 구성을 저장합니다.
- 단계 3.5 다음 현미경 매크로를 엽니 다. 매크로의 "저장"탭에서, 3 단계에서 이전에 만든 조리법을 선택하고 "적용"을 클릭합니다.
참고 : "저장"을 클릭하지 마십시오 제조법을 덮어 쓰게됩니다! - 모든 탭의 설정을 확인하고 가상 마스크 (.OVL 파일)이 여전히 제대로 t과 연관되어 있는지 확인그는 드롭 다운 목록에서 Z-위치. 또한, 제 1 Z 위치는 현미경 소프트웨어의 "단계"창에 표시된 위치와 일치하는지 확인합니다.
참고 : 현미경 매크로 하이드로 겔의 바닥에서 그것의 방법을 작동으로 직관과는 반대로, 드롭 다운 목록에서 두 번째 위치합니다 (가장 가까운 (가장 멀리 떨어진 목표에서) 하이드로 겔의 상단에, 최초의 위치 위에 물리적으로있을 것입니다 목표). - 다시 "채널 형성"구성을 저장 한 다음 현미경 매크로에서 "업데이트"를 클릭합니다. 클릭 "아니오"레시피를 시작하기 위해 현미경 매크로에서 "시작"버튼을 클릭 한 다음 "? 현재 위치 목록을 덮어 쓰기"하고 있습니다.
6. 미세 유체 네트워크를 시각화
- 하이드로 겔과 분해 후 형성된 미세 유체 네트워크를 보려면 현미경 매크로를 닫습니다. 에오신 Y의시를 보려면 "하이드로 겔 시각화"구성으로 전환하이드로 겔의 gnal; 성능이 저하 된 네트워크는 어두운 나타납니다.
주 : 현미경 매크로 실행되는 동안 하이드로 겔 열화 시각화 할 수 없다. - 특히 미세 유체 네트워크를 보려면, 하이드로 겔의 기본 에오신 Y 신호보다 밝은 신호가 도입 형광 (FITC) 라벨이 지정된 덱스 트란의 영상을 가능하게 낮은 레이저 파워에서 "하이드로 겔 시각화"구성을 사용합니다.
- 형광 표지 덱스 트란의 도입 전에 실험실 조직을 이용하여 하이드로 겔의 웰에서 물을 심지. 5 mg을 10 μL에 피펫 / ㎖의 000 kDa의 H 2에서 덱스 트란 DI FITC 표지 O (0.2 μm의 주사기 필터를 통해 여과 사전).
참고 : 어떤 덱스 트란을 사용하여 겔에 확산을 방지하기 위해 2,000 kDa의 또는 더 큰 크기의. 이미징 이상 30 분 동안의 FITC 표지 된 덱스 트란 용액으로부터 하이드로 겔 건조 및 물의 증발을 방지하기 위하여 습도 60 % (또는 그 이상)과 함께 항온 배양 단계를 사용하는 경우. - 하이드로 겔 a를 제거차 무대에서 페트리 접시와 나중에 실험 기간 동안 형성된 혈관 네트워크의 쉬운 위치를 사용할 수 있도록 페트리 접시를 표시합니다.
Representative Results
3 차원 혈관이 유래 미세 유체 네트워크를 생성하는 영상 유도, 레이저 기반 하이드로 겔 저하의 구현을 입증하기 위해, 우리는 칼을 예리하게 스캐닝 현미경 (KESM) (26), (27)를 통해 인수 한 마우스 뇌 혈관의 3D 이미지 스택을 사용 . 전술 한 바와 같이 미세 혈관 큰 데이터 세트의 선택된 3 차원 영역은 영상 유도 미세 망 형성을위한 가상 마스크의 시리즈로 전환시켰다. 제조 후, 생성 된 미세 유체 네트워크를 FITC 표지 2,000 kDa의 덱스 트란 용액으로 관류시키고, 공 초점 현미경을 통해 영상화. 네트워크 구조 (도 1a 및 C) 상기 제조 된 미세 유체 네트워크 (도 1b 및 D)를 정의 생체 내 혈관의 화상 스택 Z-돌기 (도 1A 및 B) 및 3D 렌더링 (도 1C를 생성하는 데 사용하고, 디 생체 내 혈관의 복잡한 구조를 요점을 되풀이 3D 생체 모방 미세 유체 네트워크의 제작을 가능하게 보여줍니다. 이 기술은 직경의 광범위한 네트워크를 포함하는 제조 의무가있다; 그림 1에서 3.3에서 직경 28.8 μm의에 이르기까지 다양한 채널이 생성되었습니다. 그림 1B의 왼쪽 상단에 그림 1D의 왼쪽 모서리에있는 큰 직사각형 구조가 네트워크에 흐름을 소개하는 입구 채널 있음을 유의하십시오.
그림 1 : 미세 유체 네트워크 혈관 유래. 마우스 뇌 혈관 (A 및 C)의 화상 스택으로부터 유도 가상 마스크의 시리즈는 FABRICA에 사용 된영상 유도 레이저 기반 열화 통해 PEGDA 하이드로 겔 (B 및 D)에 포함 된 생체 모방 차원 미세 네트워크 TE. 미세 유체 네트워크는 2,000 kDa의 FITC 표지 덱스 트란과 관류 및 공 초점 현미경을 통해 이미지화했다. Z-돌기 (A 및 B)와 두 개의 네트워크의 3D 렌더링 (C 및 D)의 농도, 조직 및 생체 내 혈관의 전체 구조 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 생성 할 수있는 능력을 입증한다. 화살표 (D)는 덱스 트란을 소개하기 위해 만든 직사각형 입구를 표시합니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
우리는 유체 (F)을 시작하는 두 가지 방법, 압력 머리와 주사기 펌프를 구현이 포함 된 미세 유체 네트워크에서 낮은. 예를 들어, (30)가 30 ㎛의 직사각형 채널은 가압 헤드 (7)를 통해 구동되는 유체 흐름과 더불어, micromolded PEGDA 하이드로 겔 두 개의 웰 (도 2a)를 연결하는 제조 하였다. 웰에서 생성 된 좌, 압력 헤드가 오른쪽에있는 마이크로 채널을 통해 잘 유입을 유도. 도 2A, 테트라 메틸 (TRITC)의 초기 전면 - 표지에서 70 kDa의 덱스 트란이 경과 현미경을 사용하여 채널을 통해 이동이 관찰되었다. (가) 오른쪽의 잘에 채널을 통해 잘 왼쪽에서 나중에도 2b에, 10 μm의 직경 형광 폴리스티렌 구가 흘렀다. 상기 입구 잘 micromolded에 존재하는 유체의 체적에 의해 제어 흐름의 기간 및 유입구 사이에 발생하는 정압 구배에 의해 제어되는 유량과 잘 출구 micromolded 하이드로 압력 헤드 구동 흐름 간단한 방법을 제공한다 의 흐름에 대한duction 외부 하우징 또는 주사기 펌프 없이도.
그림 2 : Micromolded PEGDA 하이드로 겔의 압력 헤드 구동 흐름. PEGDA는 임베디드 마이크로 의해 연결된 두 개의 웰을 포함하는 하이드로 겔을 형성하는 micromolded 하였다. 압력 헤드는에 잘 일에서 30 일까지 30 μm의 직사각형 채널을 통해 흐름 개시 잘 왼쪽 TRITC을 표지, 70 kDa의 덱스 트란 (A1-A3) 및 10 μm의 폴리스티렌 구 (B1-B3)에서 생성 된 다른. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
또한, 미세 유체 네트워크 내에서 일정한 유체 흐름을 생성, 주사기 펌프 구동 F로우는 주사기 펌프 인터페이스하기위한 입구 및 출구 포트 보조 미세 유체 소자 내부에 겔을 광중합에 의해 개시 될 수있다. 도 3a에, 시판되는 사전 제작 된 미세 유체 소자는 장치 (7)의 폭을 가로 질러 광중합 하이드로 겔의 1 mm 밴드 나타낸다. 레이저 기반 열화 하이드로 자립 여기 기술 된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 수납 하이드로 겔의 미세 유체 채널 네트워크를 제조하기 위해 구현되었다. 주사기 펌프 생성 흐름은 20 ㎛의 직경의 원통형 채널은 미세 유체 소자 내에 수용 하이드로 겔로 제조 된도 3b에서 알 수있다. 5 μL / s 유량이인가되면, 구체는 시야를 이동하는 반면 스트리킹 의해 입증이 20 μm의 직경 채널 개별 2 μm의 형광 폴리스티렌 스피어 용이 유체 흐름없이 (도 3B1)를 해결 (그림 3B2 </ STRONG>). 이와 같은 접근법은 TRITC 표지의 유동을 모니터링하는 차원 혈관 유래 네트워크를 통한 흐름을 유도하기 위해 사용하고, 주위의 하이드로 겔 (도 3C)에 네트워크를 통해 확산 및 65 kDa의 덱스 트란.
그림 3 : 미세 유체 하우징에 PEGDA 히드로 겔 중합 된 주사기 펌프 구동 형 흐름. 17 X 3.8 X 0.53 mm (X, Y, Z) 마이크로있는 시판 미리 제조 된 미세 유체 소자 (A)는로 표시되는 광중합 1 X 3.8 X 0.53 mm (X, Y, Z) PEGDA 하이드로 겔을 수납 검은 색 화살표. 20 ㎛의 직경의 실린더 형 채널은 하이드로 겔을 분해시키고, 2 ㎛의 폴리스티렌 스피어는 장치 (B)를 통해 펌핑 하였다. 구체 명확 유체 흐름 (B1)없이 해결되지만, 5 μL / s의 유속에 줄무늬로 나타나는(B2). 다른 수납 하이드로 겔에서는 2 차원 혈관 유래 네트워크를 제작하고, TRITC 표지 된 65 kDa의 덱스 트란 네트워크 (C)를 통해 펌핑 하였다. 저속 현미경은 채널을 가득 주변으로 확산 하이드로 겔로 형광 덱스 트란을 모니터링 하였다. (B) 및 (C)의 흰색 화살표는 유체의 흐름 방향을 나타낸다. (C)의 교정 바는 형광 덱스 트란의 강도를 나타냅니다. 스케일 바 (C)에서 (B1)에서 20 μm의 (B2) 및 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
영상 유도 레이저 기반 분해 가상 마스크를 사용할 수 있도록 현미경 소프트웨어의 표준 기능을 무시 긴급 현미경 매크로 설정 조심스럽게 조작한다. 방법 현미경 매크로 현미경 소프트웨어 인터페이스는 종종 직관에 반하는 일 수 있고, 많은 노력이 방법을 개발하기 위해 두 프로그램의 최적 설정을 결정하는데 투자했다. 기본 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 사용에 대한 일반적인 이해를 특히 "단계"를 찾아 정확하게 레이저 기반 분해 전에, x, y 및 z 차원 히드로 겔을 위치시키는 "포커스"윈도우에 추천된다. 또한, 입구 채널의 제조 프로토콜에 중요하다; 현탁 형광 종 성공적인 촬상 네트워크 특성화 미세 유체 시스템을 입력 할 수 있어야한다. 이 프로토콜은 특정 적용된다는 점에 유의해야합니다 레이저 가공스캐닝 공 초점 현미경은 특정 현미경 소프트웨어의 버전 및 현미경 매크로 (특정 자재 / 장비의 목록 정보를 참조)를 실행, 특정 펨토초 펄스 레이저로 구성. 우리는 현미경 매크로의 최신 버전은 영상 유도 레이저 제어에 필요한 필요한 제어 기능이없는 것을 발견했다. 다른 현미경 플랫폼 및 펄스 레이저 소스를 사용할 수 있지만,이 프로토콜이 시스템에 특별히 적용 및 구현 플랫폼, 레이저 소스 및 소프트웨어에 따라 수정이 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 기본 원칙은 여전히 있지만, 적용됩니다.
이 프로토콜에 대한 잠재적 인 수정은 하이드로 겔 조성물을 변경하는 것을 포함한다. PEG 화 피브린 포함한 합성 및 천연 하이드로 겔 모두 저하 구현되었습니다 여기서는 5 중량 %, 3.4 kDa의 PEGDA 하이드로 겔을 이용하지만, (미세 유체 네트워크 생성 제외 상업적) 레이저 기반 저하21,22 ogen 실크 단백질은 23 하이드로 겔, 콜라겐 24. 레이저 파워, 주사 속도, Z-조각 사이의 간격 및 반복 횟수를 조절 다른 하이드로 겔 제형의 미세 유체 네트워크를 제조하는 최적의 파라미터를 결정하는 데 도움된다.
기술 중 하나는 전류 제한 시간의 가능한 양으로 분해 될 수있는 하이드로 겔의 전체 부피이다. 열린 공극 또는 하이드로 겔 내에서 미세 유체 기능을 만들려면 레이저는 37.7 뉴저지 / μm의 2의 레이저 플루 언스를 사용하는 경우 시간 (/ μs의 또는 0.021 ㎛의 레이저 스캔 속도) 또는 8.96 μS / 픽셀 이상이어야 거. (그림 1) 이러한 설정으로, 그것은 0.014 mm 3 볼륨 내에서 혈관을 저하 1.4 시간이 걸립니다. 아래 4.48 μS / 또는 픽셀의 레이저 체류 시간을 이용하여 전달 된 에너지는 여기에서 사용 된 하이드로 겔 제형의 완전 분해 충분하지 않다. 다른 하이드로 겔 구현조성물은 이러한 한계를 극복 할 수있다. 감광 요소 또는 34-36 큰 광자 단면 21-24을 포함 광 불안정성 히드로 겔의 사용은 더 적은 에너지의 사용을 가능하게 할 빠르게 저하 될 것이 좋은 선택이다. 치수의 제한과 관련하여, 특징은 하이드로 겔 (7)의 깊이는 1.5 mm까지 제조되어왔다. 깊이 달성 대물의 작동 거리의 함수이고, 생체 내 영상에 최적화 울트라 긴 작동 거리를 사용하여 목표를 증가시킬 수있다. 최소 측정 된 채널 7은 20 배 (NA1.0) 침수 목적은 그림 1에서 생성 된 작은 채널의 크기와 파에 8.9 ㎛의 3.3 μm의 폭과 깊이를 가지고 사용하여 만들었습니다. 다른 실험실 낮은 NA 목표 21,23,24를 사용하고 있지만, 우리는 작은 기능과 미세 유체 네트워크는 높은 사용하여 생성 될 수 있다는 것을 예상감소 된 작동 거리를 희생 ER NA 목적. 궁극적으로, 그러나, 기술의 해상도가 집중된 레이저 빔의 점 확산 함수의 함수이고, 상기 스캔 특성, 레이저에 의해 전달되는 에너지의 양, 그리고 재료의 레이저 흡수 특성이 저하된다.
합성 대 단백질 계 : 또한, 레이저 특성 (속도, 플루 언스는 가상 마스크 및 반복 횟수 사이의 간격) (가교 밀도 로머 / 단량체 분자량 중량 %, 및 하이드로 겔의 형태 겔 특성에 기초하여 최적화되어야 )이 본질적 레이저 따라서 공정의 궁극적 인 분해능과의 상호 작용을 변경하는 바와 같이. 전달 된 에너지는 또한 사용 목적에 의해 좌우되기 때문에 목표를 전환 할 때, 추가의 최적화가 필요하다. 관련된 비용과 관련하여, 펄스 레이저 현미경에 대한 액세스가 필요하고, 많은 다른 objec 반면tives 높은 NA와 (생체 내 이미징) 긴 작동 거리들은 고가 일 수 사용될 수있다.
상기 및 여기 설명 된 프로토콜을 넘어,이 기술을 사용하여 생성 된 미세 유체 네트워크는 또한 내피 세포 부착 및 루멘 형성 (7)을 유도하는 세포 접착 성 펩티드 후 채널을 제조하여 관능 화 될 수있다. 또한, 저하를 채널로 대량 재료 (9) 이전에 세포 분해 펩타이드 서열의 혼입에와 하이드로 겔을 통해 세포 이동의 연구를 위해 허용 할 수 있습니다. 도 2 및도 3 내지 7에서 설명한 바와 같이, 하이드로 겔 내의 미세 망의 연속 유동 들어, 하이드로 겔이 큰 유체 장치 또는 하우징에 광중합 할 수있다.
혈관 신생 또는 혈관 신생 조립식 8-12 통한 혈관 네트워크의 VA 생성을 유도하는 간단한 방법을 제공한다상대적으로 큰 겔 부피에 걸쳐 scularization. 이 방법은 관류 유체 네트워크에서 발생하지만, 직접 크기, 비틀림, 밀도, 및 전반적인 네트워크 아키텍처를 제어하는 것은 곤란하다. 이러한 제한으로 인해 혈관의 흐름 프로필 및 전단 속도는 실험 사이에 다를 수 있습니다. 또한, 미세 기술 13-16 네트워크 아키텍처를 직접 제어를 허용하지만 종종 작은 모세관 크기의 채널 또는 생체 내 혈관 구조에 모방 조밀 한 네트워크의 제조를 생성하기 위해 자신의 무능력에 의해 제한됩니다. 여기에 설명 된 레이저 기반 겔 분해 기술이 새롭게 미세 세대 용도 변경되었지만, 동시에 구조적 제어 밀도 비틀림 요점을 되풀이 3D 생체 모방 미세 유체 네트워크의 생성을 가능하게함으로써, 기존 미세 가공 방법의 크기 기반 제한을 모두 극복 크기 범위 및 전반적인 건축 설계생체 내 혈관의 전자. 또한, 다중 유체 네트워크 간 네트워크 전송 (7)의 조사를 허용 한 겔에서 생성 될 수있다. 더 밀접하게 체외에서 생체 내 운송 과정에서 복제하기 위해 노력하고 조직 공학 응용 프로그램의 경우, 여기에 설명 된 고도의 해결 하이드로 겔 포함 된 미세 유체 네트워크는 적합하다. 우리는이 프로토콜은 조직 구조를 개발에 도움이 될 것으로 예상하는 약물 검사 장치와 같은 체외 질병 모델에서 사용하기에 더 정확하게 모방 생체 내 전송.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
