Abstract
Denne detaljerte protokollen beskriver gjennomføring av bildestyrt, laser-baserte hydrogel degradering for fabrikasjon av kar-avledede microfluidic nett innleiret i PEGDA hydrogeler. Her beskriver vi etablering av virtuelle masker som gir mulighet for bildestyrt laser kontroll; den fotopolymeriserings av en micromolded PEGDA hydrogel, egnet for mikrofluid nettverk fabrikasjon og presset hodet drevet flyt; oppsett og bruk av en kommersielt tilgjengelig laser scanning konfokalmikroskop paret med en femtosecond pulset Ti: S laser for å indusere hydrogel degradering; og avbildning av fabrikkerte microfluidic nettverk ved hjelp av fluorescerende arter og konfokal mikroskopi. Mye av protokollen er fokusert på korrekt oppsett og gjennomføring av mikroskop programvare og mikroskop makro, da disse er avgjørende skritt i å bruke en kommersiell mikroskop for microfluidic fabrikasjon formål som inneholder en rekke vanskelighetene. Den bildestyrt del av denne teknikk;e åpner for gjennomføring av 3D bildestakker eller brukergenererte 3D-modeller, og dermed åpner for kreative mikrofluid design og for fabrikasjon av komplekse microfluidic systemer av nesten enhver konfigurasjon. Med en forventet effekt i tissue engineering, kan metodene som er skissert i denne protokollen hjelp i fabrikasjon av avanserte biomimetic microtissue konstruksjoner for orga- og menneske-on-a-chip-enheter. Ved å etterligne kompleks arkitektur, tortuosity, størrelse og tetthet av in vivo blodkar, kan essensielle biologiske transportprosesser bli kopiert i disse konstruksjonene, som fører til mer nøyaktig in vitro modellering av narkotika farmakokinetikk og sykdom.
Introduction
Det vaskulære system, bestående av både lymfatisk og cardiovasculature, danner svært tett nettverk som er avgjørende for transport av næringsstoffer og oksygen og for fjerning av metabolsk avfall. Følgelig celler som befinner seg i vaskulariserte vev er aldri mer enn 50-100 um bort fra et fartøy 1. Evnen til å reprodusere in vivo vaskulær arkitektur in vitro er kritisk for nøyaktig modellere in vivo transportprosesser som benytter modifiserte konstruksjoner. Med en fersk kjøretur for å utvikle organ-on-a-chip enheter 2 for high-throughput narkotika screening 3,4 og sykdom modellering 5,6, metoder skape microfluidic nettverk som rekapitulere in vivo -lignende transport i syntetiske eller naturlige hydrogeler tegner betydelig interesse. For å forbedre biomimicry av microtissues brukes i disse enhetene, har vi utviklet en bildestyrt, laser-baserte hydrogel degradering metode som benytter tredimensjonall (3D) bilde stabler av innfødte blodkar som maler for å generere vaskulære-avledet microfluidic nettverk innebygd i PEGDA hydrogeler 7. Denne protokollen beskriver bruk av en kommersielt tilgjengelig laser-scanning confocal mikroskop utstyrt med en femtosecond pulset laser for å dikte vaskulære-avledet, biomimetic microfluidic nettverk i PEGDA hydrogeler via bildestyrt, laserbaserte degradering.
Dagens tilnærminger til å fluid hydrogeler inkludere induksjon av vaskulær 8-10 eller angiogene 10-12 endotelceller selv montering og microfabrication teknikker for å lage forhåndsdefinerte kanaler for endotelialisering 13-16. Selv om selv montert nettverk rekapitulere tetthet og kompleks arkitektur av microvasculature, de er ofte mer gjennomtrengelig enn in vivo nettverk 11,17,18, som kan være problematisk i modellering transport for narkotika screening-programmer. Selv montert nettverk består av physiologmatisk relevant, kapillær store fartøy, men de kan være vanskelig å integrere med bulk væskestrømmen på grunn av begrensninger i å generere større arteriole store fartøy. Så det er ingen direkte kontroll over monteringen av disse nettverkene, kan den endelige arkitektur variere fra prøve til prøve, noe som gjør det vanskelig å gjentatte ganger produsere nettverk med de samme strømnings og transportegenskaper.
For å generere 3D, hydrogel-embedded microfluidic nettverk med repeterbare geometri og veldefinert arkitektur, har en rekke microfabrication teknikker blitt utviklet, inkludert modulær montering 13, 3D printing av offer materialer 16, direkte skrive montering 14, og rundstrålende trykking 15. Bruk av disse metodene, mikrofluid arkitektur, og derfor strømnings og transportegenskaper, kan gjentatte ganger fabrikkert over mange konstruksjoner. En vesentlig begrensning av disse metodene er imidlertid den manglende evne til å lage microfluidic nettverk med kapillære store funksjoner, 4 til 10 mikrometer 19. De fleste microfabrication teknikker er ofte begrenset til funksjoner som strekker seg 150 til 650 pm i diameter 13,16. Noen eksisterende teknikker er istand til å generere hierarkiske nettverk med kanaler over et bredt diameterområde, 10 til 300 um for direkte-skriveenheten 14, og 18-600 um for rundtstrålende utskrift 15, men de er begrenset i deres evne til å generere tett nettverk eller til å produsere flere microfluidic nett i umiddelbar nærhet innenfor en enkelt konstruksjon 7.
For å overvinne noen av disse begrensningene, har vi utviklet en bildestyrt, laser-baserte hydrogel degradering teknikk som gjør at repeterbare fabrikasjon av biomimetic, hierarkiske microfluidic nettverk som rekapitulere arkitekturen i in vivo microvasculature. For å gjøre dette, en 790 nm, 140 femtosecond (fs) pulset laser som opererer på 80 MHz er raster-skannet in ønskede 3D-steder i en hydrogel, slik det er definert ved bilder av in vivo vaskulatur. Vi spekulerer i at nedbrytningsprosessen opererer gjennom laser-indusert optisk nedbrytning av vann, den resulterende plasmadannelsen, den påfølgende rask thermoelastic ekspansjon av vann, og den lokale forringelse av hydrogel som vannet utvider seg 20. Denne mekanismen varierer litt fra laserbaserte nedbrytning av protein-baserte hydrogeler 21-24. I motsetning til PEGDA, som har en lav multiphoton tverrsnitt, proteiner har ofte et stort multiphoton tverrsnitt og derfor degraderes via en multiphoton absorpsjon-indusert kjemisk brudd 23. For å generere bildeveiledet microfluidic nettverk, laser lukker kontrollert av bilde-avledet virtuelle masker, som består av en mosaikk av områder av interesse ni som definerer microfluidic arkitektur. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi vist evne til å dikte 3D vaskulær-avledet biomimetic microfluidic nettverk, som rekapitulere den tette og kroket arkitektur av in vivo vaskulatur, for å lokalt styre porøsiteten av hydrogeler ved å endre mengden av energi som leveres ved nedbrytning. Vi har også vært i stand til å generere to uavhengige microfluidic nettverk som fletter i umiddelbar nærhet (15 mm), men aldri direkte kobler 7. Vi har også vist evnen til endothelialize laser-degradert mikrokanaler gjennom stolpen degradering funksjonalisering med integrin ligere peptidsekvensen, Arginine-Glycine-Aspartic Acid-serin (RGDS), for å fremme endotelial celleadhesjon og lumen formasjon 7.
Med denne protokollen, er generering av komplekse microfluidic nettverk i PEGDA hydrogeler gjort mulig via bildestyrt, laserbaserte nedbrytning ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig mikroskop tilgjengelig på mange universitetsområder. Som nedbrytingsprosessen er styrt av digitale, virtuelle masker, dette fabricasjon teknikk er mottagelig for den kreative utformingen av microfluidic nettverk, slik at dens anvendelse i en lang rekke anvendelser. Vi forventer at metoden som er beskrevet her vil være mest fordelaktig i å utforme biomimetic orga- og menneske-on-a-chip enheter i stand til å replikere biologiske transportprosesser viktige i modellering narkotika transport 2. Dette fabrikasjon teknikken kan også være av interesse for generering av in vitro sykdomsmodeller, blant annet kreft metastaser 5,6 og blod-hjerne barrieren modeller 25. Som laser-baserte hydrogel degradering har tidligere blitt brukt til å lage spor for veiledning av nevronale utvekst 21-23, kan bildestyrt forlengelse av denne teknikken være nyttig i avanserte tissue engineering strategier for å posisjonere celler i brukerdefinerte 3D romlige ordninger.
Protocol
1. Generering Virtuelle Masker
MERK: Et 3D-bilde bunke med mus hjernen microvasculature ble valgt som mikrofluid modell for denne protokollen, etter å ha blitt hentet fra en mye større datasett som inneholder bilder av en hel mus hjernen microvasculature. Mikrovaskulære bildene ble kjøpt via kniv kanter scanning mikroskopi (KESM) 26, 2; lignende mikrovaskulære data er åpent tilgjengelig gjennom KESM Mouse Brain Atlas 28.
- Åpne bildebehandling 29 og åpne og beskjære 3D TIF bildestabelen nativt vaskulatur, slik at den ønskede mikrofluid nettverk, for å bli generert innenfor den hydrogel, som passer i en 450 um x 450 um x 1,5 mm (x med y ved z) vindu. For å gjøre dette, tegne en firkant rundt ønsket region, og klikk på "Image" → "Crop". Fjern skivene i z-retning ved å klikke på "Image" → "Duplicate" og skriv inn ønsket skiveområde.
MERK: Dette sikrer at de ønskede egenskaper passer innenfor synsfeltet (x av y) (531,2 x 531,2 nm ved bruk av en 20X (NA1.0) vann nedsenking objektiv med en rammestørrelse på 2,884 x 2,884 piksler og en zoom på 0,8 med en laser-scanning konfokalmikroskop) og arbeidsavstanden (z) av en 20X (NA1.0) nedsenking i vann objektiv. Hvis ukjent, kan synsfeltet for andre systemer bestemmes ved å kjøpe et bilde med ønsket objektiv og innstillinger. - Roter bildet stabelen slik at funksjonene er i hovedsak på linje med retning av raster skanning, eller x-retning, ved å klikke på "Image" → "Transformer" → "Roter". Dette reduserer tiden som er nødvendig for fabrikasjon.
- Skalere det beskårne bildet stabelen slik at pikselstørrelsen matcher eller overgår innstillingene som brukes for degradering på konfokal mikroskop (0,184 mikrometer / pixel når du bruker en 20X (NA1.0) vann nedsenking objektiv med en rammestørrelse på 2884 av 2,884 pikslerog en zoom på 0,8). For å gjøre dette, klikk på "Image" → "Juster" → "Size" og skriv inn "2446" for "bredde" (dvs. 450 mikrometer, eller størrelsen på bildet delt på 0,184 mikrometer / pixel).
- Terskel / binarize bildet stabelen ved å skrive "Ctrl + Shift + T". Fjern markeringen for «Mørk bakgrunn", og klikk "Apply" → "ok". Fullføre prosessen ved å klikke på "image" → "Oppslag Tables" → "Inverter LUT".
- Ved hjelp av en egendefinert algoritme (kildekoden er tilgjengelig i supplerende materiale av den refererte manuskript) i programmeringsprogramvaren 9, passer binærisert (hvit) har med en mosaikk av enkelt piksel-høy firkanter parallelt med retningen av raster skanning (x -direction) for å generere regioner av interesse (Rois) som styrer laseren posisjon og lukker 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
MERK: tilpasset algoritme 9 konverterer hvert enkelt fly i TIF bildestakk til en RLS-fil. - Endre filtypen av RLS filer til .OVL for bruk ved nedbrytning.
2. Konfigurere Laser-skanning konfokalmikroskop
MERK: Mens andre laser scanning mikroskop utstyrt med pulsede lasere kan anvendes, innstillinger og protokoll her beskriver anvendelse av en laser scanning mikroskop (LSM) sammen med sin programvare.
- Med laserskanning konfokalmikroskop på, åpner mikroskop programvare, og klikk "Start System". Velg objektiv "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" i "Vedlikehold" -kategorien.
- Stille "Hydrogel Visualisering" Configuration
- I "Acquisition" -kategorien, sørge for at laserlinjen (514 nm Argon laser) er valgt, og videre i "Laser" window. MERK: Denne kanalen brukes til å avbilde hydrogel via eosin Y fluorescens for orienteringsformål 7.
- I "Imaging Setup" vinduet, satt på "Mode" til "Channel Mode", sett "Switch spore hver" til "Frame", og velg "track1".
- I "Light Path" vinduet, velg bare CH1 fluorescerende detektoren, med en rekkevidde på 516-735 nm; en hovedstrålesplitter (MBS) 458/514 filter på synlig lys linjen; og en plate i den usynlige lys linje. Fjern markeringen i lyse-feltet fotomultiplikatorrøret detektor, "T-PMT".
- I "Acquisition Mode" -vinduet, sjekke at riktig mål er valgt og sette "Scan Mode" til "Frame", "Frame Size" til "2884" i X og Y, "Line Step" til "1" , "Antall Midling" til "1", den "Midling Mode" til "line", den "gjennomsnittsmetoden" til "Mean", den "Bit Depth "til" 16 Bit ", og" Retning "til" <-> "for toveis skanning.
- I "Acquisition Mode" -vinduet, sett "Speed" set "Corr X" og "Y" til "0,05" eller justere etter behov for den spesifikke mikroskop blir brukt som ønsket og. Fjern markeringen for «HDR".
- I "Acquisition Mode" -vinduet, sørge for at "Scan Area" viser en "Image Size" fra "531,2 nm x 531,2 mikrometer" og en "Pixel Size" fra "0,18", med en "Zoom" satt til "0,8" ; sette alle andre "Scan Area" verdier til null.
- I "Channels" vinduet, velg "track1" som Ch1 fluorescerende detektoren. Velg laserlinje "514", med en prosent kraft "10,0", en "pinhole" av "1AU", en innledende "Gain (Master)" fra "800", en "Digital Offset" av "0", og en "Digital Gain» av4; 1 ".
MERK: Juster disse innstillingene etter behov for spesifikke mikroskop som brukes. - Lagre denne konfigurasjonen som "Hydrogel Visualisering".
- Innstilling av "Channel Formation" Configuration
- I "Acquisition" -kategorien, sørge for at laserlinjen (790 nm 140 fs pulsert Ti: S laser) er valgt, og videre i "Laser" -vinduet. Sett "GDD Correction" til "4000" for maksimal effekt på 790 nm.
- Sett "Imaging Setup" vinduet som skissert i trinn 2.2.2.
- I "Light Path" vinduet, sikre at ingen fluorescerende detektorer er valgt, med en MBS 458/514/561/633 filter på synlig lys linje og en MBS 760+ filter på usynlig lys linje. Fjern markeringen i lyse-feltet fotomultiplikatorrøret detektor, "T-PMT".
- I "Acquisition Mode" -vinduet, sjekke at riktig mål er oppført. Still "Speed" til "3"Og alle andre innstillinger som er skissert i trinn 2.2.4.
- I "Channels" vinduet, velg "track1" som T-PMT-detektor. Velg laserlinjen "790", med en prosent kraft "100,0", en innledende "Gain (Master)" fra "800", en "Digital Offset" av "0", og en "Digital Gain" "1" .
- I "Stage" -vinduet, null scenen ved å klikke på "set null". Markere plasseringen ved å klikke på "Mark". Dette er avgjørende for å laste opp virtuelle masker til mikroskopet makro i trinn tre.
- I "Time Series" vindu, sett "Cycles" som "1" og "Interval" som "0".
- I "Bleach" vinduet, sjekk "Start Bleking etter # skanner" boksen og sett den til en verdi på "0 av 1". Velg "Different skannehastighet", med en verdi på "3" (tilsvarende en piksel oppholdstid på 8,96 ms / pixel). Velg "Safe blhver for Gaasp ".
- I laserlinjen delen av "Bleach" vinduet, velg 790 laserlinjen og angi hvor mange prosent strøm til "100,0". La alle andre bokser i blekemiddel vinduet opphevet valget. Redd bleke innstillingene i "Bleach" -vinduet.
- Lagre denne konfigurasjonen som "Channel Dannelse".
MERK: "Z-Stack", "regioner", "Fokus", og "scenen" vinduer er også viktig for denne protokollen, men trenger ikke å stilles inn eller justeres under innledende konfigurasjon.
3. Opprette en oppskrift og laste opp virtuelle Masker til mikroskopet programvare og Macro
- Med laser-scanning konfokalmikroskop fortsatt kjører og mikroskop programvaren fremdeles på, velger du bare "Regioner" vinduet ( "Start Experiment" -knappen ved siden av) i "Channel Formation" konfigurasjon.
- For å sikre at maskene laster til mikroskopet makro riktigly, angi hvor mange prosent strøm i "Channels" vinduet til "0,2" og "Speed" i "Acquisition Mode" vinduet til "8", og klikk "Snap" øverst til venstre på skjermen.
- Sjekk at bildestørrelsen er fortsatt "531,2 nm x 531,2 mikrometer", med en pikselstørrelse på "0,18", i "Information" fanen på bildet. Hvis disse verdiene ikke er riktige, sjekk "Frame Size" og "Zoom" verdiene igjen.
- KRITISK: Kontroller at X og Y steder i "Stage" -vinduet er nullstilt og at posisjonen er markert før du åpner mikroskop makro. Se trinn 2.3.6.
- For å åpne mikroskop makro, type "Alt + F8", klikk på "Load", og velg den riktige versjonen. Se detaljer i Liste over spesifikke materialer / utstyr. En lang liste med under makroer åpnes i "Macro Control" vinduet.
- I "Macro Control" vinduet, klikk "Kjør" for å åpne microscope makro, og deretter lukke "Macro Control" vinduet.
MERK: Alternative versjoner av mikroskop makro er kanskje ikke kompatible med laser-baserte hydrogel nedbrytning ved hjelp av denne protokollen. - I "Saving" kategorien i mikroskop makro, gi en vilkårlig "Base File Name", velger du "Single File Output", og valgte en "midlertidig fil" -mappen. Still "Open Temp mappe" til sted "1", velger du "Single Midlertidig bilde mappe", og navnet på oppskriften på "Lagre / Apply oppskrift" med "Recall Steder List" valgt. Klikk "Lagre" for å begynne med å lage oppskriften.
- I "Erverv" kategorien i mikroskop makro, sikre at "Scan Configuration" matcher navnet gitt til mikroskopet programvarekonfigurasjonen satt i trinn 2.3. Sett "Ingen av tidspunkter innenfor Block" til "1", med en "Intervall" fra "0". Pass på at "Merket Z - Top of the Z StacK "er uthevet i grønt. Alle andre standardinnstillingene er fine som de er.
- I "Timing" kategorien i mikroskop makro, sikre at "Vent Delay" er uthevet i grønt, stille "Experiment Repetisjoner" og "Gruppe Repetitions" til "1" og "Vent Intervall Før Block at First Location Only" til "0" . Alle andre standardinnstillingene er fine som de er.
MERK: "Gruppe Repetisjoner" (og ikke "Experiment Repetisjoner") boksen er der man kan angi antall ganger laser skanner over et område (dvs. gjentakelser av oppskriften). - I "Z Liste" kategorien i mikroskop makro, nedbrytnings plan i z-retningen som er angitt. Still z-avstand, "dZ", til "1 um", med "Antall stillinger" set for å passe antall virtuelle masker som skal brukes.
- Klikk på "Create Z Stack" -knappen for å gjøre "Z List" vises i rullegardin "List av Steder »nederst i vinduet. Kontroller at antall steder og z-avstanden er korrekte og at X og Y steder er nullstilt.
MERK: Hvis de ikke er det, må du ikke oppbevare oppskriften; lukke mikroskop makro og gjentar trinn 2.3.6 før re-åpning av mikroskop makro og sette opp oppskriften igjen.
NB: I stedet for å ha 100 masker avstand fra hverandre av en mikrometer hver, for eksempel, kan det være fordelaktig å ha 50 masker, hver anvendt to ganger, og i en avstand av 1 um, for å få en tilsvarende mikrofluid struktur, som å fylle de enkelte masker for å mikroskopet makro mulig være tidkrevende. - I "Bleach" kategorien i mikroskop makro, må alle maskene lastes og matchet med en bestemt nummerert beliggenhet i "Liste over Locations". For å starte, velg "Bleach" boksen og sørge for at "Config". samsvarer med navnet på de bleike innstillingene i "Bleach" vinduet i hoved mikroskop programvare skjermen (se trinn 2.3.8). Angi "Vent Delay Etter Bleach" til "0", fjerner du merket for "spot", og la "ROI" tom.
- Ikke endre noe i "Location", "Tile", "Grid", "Autofokus", "blokker", og "Alternativer" tabs fra standardinnstillingene.
- Slik legger masker til mikroskopet makro, velger du bare "regioner" vindu i mikroskop programvare og åpne "Bleach" kategorien i mikroskop makro. I "regioner" vinduet, klikk på "Load" og velg .OVL fil for masken på bunnen av z-stack blir degradert.
MERK: første beliggenhet i "Z-listen" er nederst i z-stabelen, og den mikroskop makro arbeider seg til toppen av z-stabelen, eller hydrogel. - Når listen over ROIs vises i "Regioner" -vinduet, klikk på pilen for å vise de Rois av masken innenfor synsfeltet (på bildet knipset i trinn 3.2). Kontroller at Rois passe innenforsynsfeltet.
- Hvis du vil lagre lastet masken i mikroskop makro, gi masken et navn og nummer i "Legg til gjeldende Region til avkastning List" boksen på "Bleach" -kategorien, og klikk deretter på "Legg Gjeldende Region til avkastning List" -knappen. Navnet og tallet vil vises i "ROI" nedtrekksliste med andre masker (inkludert masker fra andre tidligere opprettede oppskrifter). Slett masken i "regioner" vindu i mikroskop programvare.
- Gjenta trinn 3,14 og 3,16 for å laste opp og lagre alle masker til mikroskopet makro.
- For å tildele opplastede masker til hver Z-plassering, markere posisjon 1 i rullegardin "Liste over Locations". Velg riktig ROI fra "ROI" rullegardinlisten. Pass på at "Bleach" er merket av på toppen av "Bleach" -fanen i mikroskop makro.
- Gjenta trinn 3,18 for alle stillinger i dropdown "Liste over Locations", og klikk deretter på "Store" på &# 34; Lagre "for å lagre oppskriften i sin endelige form.
4. Photopolymerizing en PEGDA Hydrogel
- Making Sterile HEPES saltvann (HBS) med Trietanolamin (TEOA)
- I en 1-L begerglass, tilsett 500 ml DI H2O med en rørestav, røres i 2,922 g natriumklorid, 1,196 g HEPES og 7,5 ml TEOA i en avtrekkshette.
- Juster til pH 8,3 med 1 N natronlut ved dråpevis tilsetning av med en Pasteur-pipette.
- Sterilt filter oppløsningen gjennom et 0,2 um vakuumfiltrering koppen inn i en 500 ml glass Autoclaved media flaske. Delmengde og oppbevares ved 4 ° C.
- Fest en ring av tosidige limet med støtte til en spesialisert 60-mm petriskål med en 20-mm hull skåret ut av bunnen. Forlater backing på limet ring, presse ut eventuelle luftbobler fra mellom petriskål og limet.
- Forbered materialer. Ta med syntetisert 33 3.4 kDa PEGDA ut av -80 ° C fryser og la det nå romtemperatur. Slå på den hvite lyskilden i minst 15 minutter før photopolymerizing hydrogeler.
- I et avtrekksskap, tilsett 1 ml HBS med TEOA til en folie-dekket, 2-ml rav sentrifugerør (som brukes til å forhindre lys eksponering av fotoinitiator, eosin Y). Tilsett 10 ul av 1 mM Eosin Y dinatriumsalt i DI H 2 O.
- I et avtrekksskap, trekke ut et lite volum av 1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) inn i et glassbeger med en Pasteur pipette. Fra dette volumet, pipette 3,5 mL av NVP inn den gule sentrifugerør med HBS, TEOA, og eosin Y.
- I en andre folie-dekket, 2-ml rav sentrifugerør (som brukes for å hindre feilaktige fotoaktivering av prepolymeren løsning), tilsett 10 mg 3.4kDa PEGDA. Legg 0,2 ml HBS, TEOA, eosin Y, NVP-løsning for en 5% vekt / volum PEGDA pre-polymerløsning. Vortex inntil PEGDA er fullstendig oppløst. Ved hjelp av en strømmåleren og detektor wand, justere intensiteten av den hvite likjempe kilde til 95 mW.
- Bygge en Poly (dimetylsiloksan) (PDMS) Mold
- Bygge opp en PDMS mugg 7 på en større flate (glass, polystyren vevskulturskål) for enkel håndtering og montere formene slik at de støpte hydrogeler passer inn i en sirkel med diameter på 20 mm.
- For å generere et rektangelformet hydrogel med en tykkelse på 500 um ved å plassere to 500 um tykke PDMS avstandsstykker på en PDMS overflate for å skape to definerte hydrogel kanter.
- Omfatte en 300-um PDMS spacer for å gi en 300 um-dyp brønn på overflaten av hydrogel, som er nyttig for innføring av fluider.
- Pipetter 60 ul av 5% vekt / volum PEGDA pre-polymerløsning på PDMS formen. Vær forsiktig med å innføre noen bobler under pipettering.
- Center og plassere en [3- (metakryloyloksy) propyl] trimethoxysilane (TMPSA) funksjon 7, diameter 40 mm, # 1,5 dekkglass på toppen av løsningen. Kontroller at coverslip hviler på 500-um PDMS avstandsstykker. Den hydrogel vil hefte til den methacrylated dekkglass og hindre den fra hydrogel flytende i oppløsningen.
- Plasser PDMS, PEGDA pre-polymerløsning og dekksammenstillingen under den hvite lyskilde for 3 min.
- Strømnings DI H 2 O mellom støpeformen og dekkglass for å skille den fra hydrogel PDMS. Skyll hydrogel med DI H2O Tørk kantene av dekkglass med lab vev. Vær forsiktig så du ikke berører eller veke vann fra hydrogel.
- Etter fjerning av støtte fra limet, holder dekkglass til det klargjorte petriskål og forsiktig fjerne luftbobler mellom limet og glass. Senk hydrogel i petriskål med DI H 2 O.
MERK: PDMS mugg kan gjenbrukes til å gjøre ytterligere hydrogeler hvis skylles med DI H 2 O, tørket med nitrogen, og holdes fri for støv.
5. Fabricating Vaskulær-avledet microfluidic Networks via Laser-baserte Nedbrytning
- Med laser-scanning konfokalmikroskop og mikroskop programvare, velger målet "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" i "Vedlikehold" -kategorien. I "Acquisition" -kategorien, må de nødvendige laserlinjene (514 nm Argon laser og 790 nm 140 fs pulsert Ti: S laser) er på og varmet opp.
- Sette opp Hydrogel å danne en innløpskanal
- Monter hydrogel og petriskål på scenen innsatsen og plassere scenen innsatsen på mikroskopet scenen. Fyll petriskål med minst 5 ml DI H 2 O. senteret de hydrogel og brønn funksjoner ved øyet før du senker nedsenking i vann objektiv inn i DI H 2 O.
MERK: Ikke knuse hydrogel med mål-to skal aldri røre! - For å finne den hydrogel, bytte til "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon fra trinn 2.2. Klikk "live" for å slå laserlinjen på og bringe the objektiv nærmere til hydrogelen før eosin Y signal (detektert av Ch1 fluorescerende detektor) av toppen av hydrogelen kan sees.
MERK: For å finne den hydrogel lett kan prosent kraft økes eller pinhole kan åpnes. Når målet er fokusert på hydrogelen, men slippe prosent for å beskytte det fluorescerende detektoren og redusere pinhole tilbake til 1AU for å unngå oversaturation av detektoren og for å finne nøyaktig den hydrogel overflate. - I "Trinn" vinduet, markere plasseringen av toppen og bunnen av hydrogel og av bunnen av brønnen.
MERK: z-verdiene her vil bidra til å bestemme tykkelsen av hydrogel og dybden av brønnen. - Bruk joysticken til å bevege seg i X og Y for å finne kanten av en brønn. Plasser hydrogel på høyre side av skjermen, med godt til venstre, eller vice versa. Tillat den hydrogel til å fylle ikke mer enn to tredjedeler av synsfeltet.
- Slipp plane av fokus ned 150 mikrometer inn i hydrogel ved å sette "Trinn Size" til "150" i "Focus" vinduet og klikke på pil ned ved siden av "Z-Position" boksen. Gjenta trinn 5.2.4, hvis det er nødvendig.
MERK: x, y, og z-posisjonen av innløps avhenger utelukkende av utformingen av de virtuelle masker. - KRITISK: Zero X og Y beliggenhet i "Stage" -vinduet, slette alle andre avmerkede stedene, og merk bare dette stedet.
MERK: Hvis dette trinnet ikke er utført, vil mikroskop makro ikke riktig gjenopprette steder i den tidligere lagrede oppskriften, og hydrogel vil ikke bli degradert på ønsket sted.
- Monter hydrogel og petriskål på scenen innsatsen og plassere scenen innsatsen på mikroskopet scenen. Fyll petriskål med minst 5 ml DI H 2 O. senteret de hydrogel og brønn funksjoner ved øyet før du senker nedsenking i vann objektiv inn i DI H 2 O.
- Danner en innløpskanal
- "Snap" et bilde og tegne et rektangulært område som vil være innløpet til vaskulære nettverk ved hjelp av rektangel knappen i "regioner" vinduet.
MERK: Pass på at en del av regionen strekker seg ut i brønnen for å sikre at the innløp vil forbinde brønnen til det vaskulære nettverk. - Ved siden av ROI genereres i "regioner" vinduet, velg "Kjøp" og fjern markeringen "Bleach" og "Analysis".
- Lagre "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon, fjerner du merket "regioner", og endre til "Channel Formation" konfigurasjon, satt opp i trinn 2.3. I "Channel Formation" konfigurasjon, velg "Regioner" igjen.
MERK: Når du bytter mellom "Hydrogel visualisering" og "Channel Dannelse" konfigurasjoner, sørg for å fjerne markeringen regioner øverst til venstre på skjermen. Noen ganger skalering av regionene kan endres uventet mellom konfigurasjoner dersom dette ikke er gjort. - I "Channel Formation" konfigurasjon, sørg for at bare "regioner" og "Z-Stack" er valgt. I "Z-Stack" -vinduet, klikk på "Center" knappen øverst og deretter "Center" buttpå ovenfor "Offset" for å sette den midt på z-stack som gjeldende Z-posisjon. Avhengig av hvor stor innløpet trenger å være, angi antall "Slices" med en "Interval" fra "1". Størrelsen av Z-stabel vil bli vist under "Range".
- Sjekk at "Speed" i "Acquisition Mode" -vinduet er satt til "3" og at den "Percent Power" i "Channels" vinduet er satt til "100". Lagre konfigurasjonen, og klikk på "Start Experiment" -knappen.
MERK: mikroskop makro er ikke nødvendig for å nedbryte den samme enkle form på flere plan, som utføres her for å generere en innløpskanal. Makroen er kun nødvendig når nedverdigende ulike regioner på hver enkelt plan, og den brukes til å lagre virtuelle masker i en oppskrift. - For å visualisere hydrogel ved nedbrytning, enten øke "Gain (Master)" i "Channels" om vinduet regionen i than synsfelt er svart, eller redusere "Gain (Master)" dersom regionen er hvit.
MERK: Bubble formasjon her er en indikasjon på laser-indusert hydrogel degradering. - Å degradere innløpet flere ganger i stedet for bare én gang, justere "Cycles" i "Time Series" -vinduet.
- I "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon, klikker du "live" for å sikre at innløpet ble dannet.
- "Snap" et bilde og tegne et rektangulært område som vil være innløpet til vaskulære nettverk ved hjelp av rektangel knappen i "regioner" vinduet.
- Sette opp Hydrogel å generere microfluidic Network
- I "regioner" vinduet, legger noen .OVL fil fra z-stabel av virtuelle masker og klikk på pilen for å se Rois i synsfeltet.
- Klikk "live" for å leve skanne "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon og bruke joysticken eller "Stage" vinduet for å plassere hydrogel i X og Y, slik at innløpet kobles til riktig sted innenfor vaskulære nettverket.
MERK: Pass på atROIs av den virtuelle masken overlapper noe med den tidligere dannede innløpet. - Slipp fokusplanet ned 50 mikrometer fra forrige sentrert Z-plassering, eller 200 mikrometer fra overflaten av hydrogel, ved hjelp av "Step Size" i "Focus" vinduet og klikke på pil ned ved siden av "Z-posisjon "boksen. Dette vil være den første posisjon i mikroskopet makro.
MERK: Den faktiske avstand å bevege seg i z-retning avhenger av nettverksdesign. Sørge for at den ønskede nettverket ikke strekker seg ut over den øvre eller nedre overflate av hydrogelen i z-retningen. - KRITISK: Zero X og Y steder i "Stage" -vinduet, slette alle andre avmerkede stedene, og merk bare dette stedet.
MERK: Dette vil være utgangspunktet i mikroskopet makro. Oppskriften vil arbeide seg tilbake mot overflaten av den hydrogel. - "Snap" et bilde i "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon, slette og deselect "regioner", og lagre konfigurasjonen.
- Genererer mikrofluid Network
- Bytt til "Channel Formation" konfigurasjon, og bare velge "Time Series" og "Bleking" vinduer. Kontroller at innstillingene for "Time Series" og "Bleking" windows er som de ble i utgangspunktet satt i trinn 2.3.7 og 2.3.8.
- Still "Speed" i "Acquisition Mode" vinduet til "8" og prosent kraften i laserlinjen til "0,2" i "Channels" -vinduet. Lagre konfigurasjonen.
- Åpne mikroskop makro følgende trinn 3.5. På "Saving" kategorien i makro, velge den tidligere laget oppskriften fra trinn 3 og klikk "Apply".
MERK: Ikke klikk på "Lagre" eller oppskriften vil bli overskrevet! - Sjekk innstillingene på alle faner og kontrollere at de virtuelle masker (.OVL filer) er fortsatt riktig forbundet med tHan Z-steder i rullegardinlisten. Sjekk også at den første Z-plassering matcher den merkede posisjonen i "Stage" vinduet i mikroskop programvare.
MERK: Counterintuitively, vil det andre sted i rullegardinlisten være fysisk over den første plasseringen, som mikroskop makro vil arbeide seg fra bunnen av hydrogel (lengst bort fra målet) til toppen av hydrogel (nærmest objektiv). - Lagre "Channel Formation" konfigurasjon igjen, og klikk deretter på "Update" i mikroskop makro. Klikk "Nei" til "Skriv over gjeldende plassering listen?", Og klikk deretter på "Start" i mikroskop makro å begynne oppskriften.
6. Visualisering microfluidic Network
- Hvis du vil vise hydrogel og dannet microfluidic nettverket etter degradering, lukker mikroskop makro. Bytt til "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon for å vise eosin Y signal av hydrogel; degradert nettverket vises mørkt.
MERK: hydrogel degradering kan ikke bli visualisert mens mikroskopet makroen kjører. - For å vise den mikrofluid nettverk spesifikt, bruk "Hydrogel Visualisering" konfigurasjon ved en lavere lasereffekt for å muliggjøre avbildning av innførte fluorescein (FITC) -merket dekstran, som har en lysere signal enn det native eosin Y signal fra hydrogel.
- Før innføring av fluorescensmerkede dekstran, veke vann fra brønnen i hydrogelen ved hjelp av laboratorie vev. Pipetter i 10 ul av 5 mg / ml 2000 kDa FITC-merket dekstran i DI H 2 O (forhåndsfiltrert gjennom et 0,2 um sprøytefilter).
MERK: Bruk noen dekstran størrelse 2000 kDa eller større for å hindre diffusjon inn i gelen. Hvis avbildning i mer enn 30 min ved å bruke en inkubert trinn med 60% fuktighet (eller høyere) for å forhindre at hydrogelen tørking og fordampning av vann fra FITC-merket dekstran-løsning. - Fjern hydrogel ennd petriskål fra scenen og markere petriskål for å muliggjøre enkel plassering av den dannede vaskulære nettverket under senere eksperimentering.
Representative Results
For å demonstrere gjennomføringen av bildestyrt, laser-baserte hydrogel nedbrytning å generere et 3D, vaskulær-avledet mikrofluid nettverk, benyttet vi et 3D-bilde bunke med mus hjernen blodkar som ble kjøpt via kniv kanter scanning mikroskopi (KESM) 26, 27 . En valgte 3D-regionen i det større mikrovaskulær datasett ble omdannet til en serie av virtuelle masker for bildestyrt mikrofluidnettverkdannelse, slik det er beskrevet ovenfor. Etter fremstilling, ble den resulterende mikrofluid nettverk perfusert med en oppløsning av FITC-merket, 2000 kDa dekstran og avbildes via konfokal mikroskopi. Bildet stabel av in vivo vaskulaturen som definert nettverksarkitektur (figur 1 A og C) og fabrikkert mikrofluid nettverk (figur 1 B og D) ble anvendt for å danne Z-fremspring (figur 1A og B) og 3D-gjengivelser (figur 1C og D in vivo vaskulatur. Teknikken er mottagelig for fabrikasjon av nettverk inneholdende en lang rekke diametre; i Figur 1, ble kanaler som strekker seg 3,3 til 28,8 pm i diameter generert. Legg merke til at den største rektangulære strukturen i øvre venstre del av figur 1B, og i den til venstre i figur 1D er innløpskanalen for å innføre strømningen inn i nettverket.
Figur 1: Vaskulær-Avledet microfluidic Network. En rekke virtuelle masker, avledet fra et bilde stabel av musehjerne vaskulaturen (A og C), ble brukt til å Fabricate en 3D biomimetic microfluidic nettverk innebygd i en PEGDA hydrogel (B og D) via bildestyrt, laserbaserte degradering. Den microfluidic nettverket ble dynket med 2000 kDa FITC-merket dekstran og avbildes via konfokalmikroskopi. Z-anslag (A og B) og 3D-gjengivelser (C og D) av de to nettverkene vise evne til å generere microfluidic nettverk som rekapitulere tettheten, organisasjon og generelle arkitektur av in vivo blodkar. Pilen (D) markerer det rektangulære innløp opprettet for å innføre dekstranet. Målestokk representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vi har gjennomført to metoder, trykkhoder og sprøytepumper, for å initiere væske flav i disse innebygde microfluidic nettverk. For eksempel ble en 30 ved 30 um rektangulær kanal fabrikert for å forbinde to brønner i en micromolded PEGDA hydrogel (figur 2A), med fluidstrømmen drives via en trykkhodet 7. Som genereres i venstre brønnen, trykkhodet induserte strøm gjennom microchannel og inn i brønnen til høyre. I figur 2A, en første foran tetramethylrhodamine (TRITC) -merket, 70 kDa dekstran ble observert i bevegelse gjennom kanalen ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Senere, i figur 2B, en 10-mikrometer diameter fluorescerende polystyren sfære strømmet fra venstre brønnen, gjennom kanalen, til brønnen på høyre side. Med varigheten av strømningen styres av volumet av væske som er tilstede i micromolded vel ved innløpet, og strømningshastigheten reguleres ved den hydrostatiske gradienten som genereres mellom innløpet og utløpet brønnen, trykkhodet drevet strømning i micromolded hydrogeler tilveiebringer en enkel metode for flyt isjon, uten behov for et ytre hus eller en sprøytepumpe.
Figur 2: Trykk Leder-Driven Flow i en Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA ble micromolded å danne en hydrogel som inneholder to brønner koblet sammen med en innebygd microchannel. En trykkhode ble generert i den venstre godt for å initiere flyt av TRITC-merket 70 kDa-dekstran (A1-A3) og en 10-mikrometer polystyren sfære (B1-B3) gjennom en 30 ved hjelp av 30 mikrometer rektangulær kanal fra en brønn til den annen. Målestokk representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Alternativt, for å generere konstant fluidstrøm i microfluidic nettverk, sprøytepumpe drevet flav kan initieres ved photopolymerizing hydrogelen innsiden av et sekundært mikrofluid enhet med innløps- og utløpsporter for sprøytepumpe grensesnitt. I figur 3A, er en kommersielt tilgjengelig, pre-fabrikerte mikrofluidinnretningen vist med et 1-mm bånd av hydrogel fotopolymerisert over bredden av anordningen 7. Laser-baserte degradering ble iverksatt for å dikte microfluidic kanaler og nettverk i plassert hydrogeler bruker samme protokoll som er beskrevet her for frittstående hydrogeler. Sprøytepumpen-genererte strømmen kan sees i figur 3B, hvor en 20-mikrometer diameter sylindrisk kanal ble fremstilt i en hydrogel som ligger i en mikrofluidenhet. I denne 20-mikrometer diameter kanal, er individuelle 2-mikrometer fluorescerende polystyrenkuler lett løses uten væskestrøm (figur 3b1), mens når en 5 mL / s strømningshastighet er brukt, kulene bevege seg gjennom synsfeltet, som dokumentert av streaking (figur 3B2 </ Strong>). Den samme metode ble anvendt for å indusere strømning gjennom en 2D, vaskulær-avledet nettverk for å overvåke strømningen av TRITC-merket, 65 kDa dekstran gjennom nettverket og diffusjon inn i det omgivende hydrogel (figur 3C).
Figur 3: Sprøytepumpe-Driven Flow i PEGDA Hydrogeler polymerisert i mikrofluid Rammeverk. En kommersielt tilgjengelig, pre-fabrikerte mikrofluidinnretningen (A) med en 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) microchannel huser en fotopolymeriserte 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel, indikeres av svart pil. En 20 mikrometer diameter sylindrisk kanal ble nedbrutt gjennom hydrogel, og 2-um polystyrenkuler ble pumpet gjennom innretningen (B). Kulene er tydelig løst uten fluidstrømning (B1), men de ser ut som streker ved en strømningshastighet på 5 ul / s(B2). I en annen holder hydrogel, ble en 2D vaskulær-avledet nettverk fremstille og TRITC-merket, ble 65 kDa-dekstran pumpes via nettverket (C). Time-lapse mikroskopi ble anvendt for å overvåke den fluorescerende dekstranet som det fylles kanalene og diffundert inn i de omkringliggende hydrogel. Hvite piler i (B) og (C) viser retningen av fluidstrømmen. Kalibrerings bar i (C) viser intensiteten av fluorescerende dekstran. Skalaen søylene representerer 20 mikrometer i (B1) og (B2) og 50 mikrometer i (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Kritisk i overstyrer standardfunksjoner i mikroskop programvare for å muliggjøre bruk av virtuelle masker for bildestyrt, laserbaserte degradering, må mikroskop makro være oppsett og manipulert nøye. Hvordan mikroskop programvaregrensesnitt med mikroskop makro kan noen ganger være counterintuitive, og mye innsats ble investert i å bestemme de optimale innstillingene i begge programmer for å utvikle denne metoden. En generell forståelse av grunnleggende laserskanning konfokalmikroskop bruk anbefales, særlig med "Stage" og "Focus" vinduer for å finne og korrekt posisjonering av hydrogel i x-, y- og z-dimensjoner, før du prøver laserbaserte degradering. Dessuten er fremstillingen av en innløpskanal kritisk for protokollen; suspenderte fluorescerende arter må kunne gå inn i microfluidic systemer for vellykket bildebehandling og nettverk karakterisering. Det er viktig å merke seg at denne protokollen gjelder for en bestemt laser-scanning konfokalmikroskop konfigurert med en bestemt femtosecond pulset laser, kjører spesifikke versjoner av mikroskop programvare og mikroskopet makro (se detaljer i Liste over spesifikke materialer / utstyr). Vi har oppdaget at nyere versjoner av mikroskop makro mangler den nødvendige kontroll og funksjonalitet som trengs for bildestyrt laser kontroll. Mens andre mikroskop plattformer og pulsede laserkilder kan benyttes, gjelder denne protokollen spesielt til dette systemet og vil trenge modifisering i henhold til plattformen, laserkilden, og software implementert. De underliggende prinsippene i hele denne protokollen gjelder fortsatt, men.
En potensiell modifikasjon til denne protokollen innebærer endring av hydrogel sammensetning. Her benyttet vi 5 vekt%, 3,4 kDa PEGDA hydrogeler, men laserbaserte nedbrytning (for formål bortsett fra microfluidic nettverk generasjon) har blitt iverksatt for å fornedre både syntetiske og naturlige hydrogeler, inkludert PEGylert fibrinogen 21,22, hydrogeler silke proteiner 23, og kollagen 24. Justering av lasereffekt, skannehastighet, avstanden mellom Z-skiver, og antallet gjentakelser vil hjelpe til å bestemme de optimale parameterne for å fremstille microfluidic nettverk i andre hydrogel-formuleringer.
En strømbegrensning av teknikken er det samlede volumet av hydrogel som kan bli degradert i en mulig tid. Å skape åpne hulrom eller microfluidic funksjoner i hydrogel, laser dvele tiden må være på eller over 8,96 ms / pixel (eller en laserskannehastighet på 0,021 mikrometer / ps) ved bruk av en laser fluens på 37,7 nJ / mikrometer to. Med disse innstillinger, tar det 1,4 timer for å nedbryte fartøyer innenfor en 0,014 mm 3 volum (som sett i figur 1). Ved hjelp av en laser oppholdstid på 4,48 us / pixel eller under, er den energi som leveres ikke er nok for fullstendig nedbrytning av den hydrogelformulering som brukes her. Implementering av en annen hydrogelsammensetning kan overvinne denne begrensningen. Bruken av fotolabile gels som inneholder lysfølsomme komponenter 34-36 eller hydrogel som har stor multiphoton tverrsnitt 21-24 er gode alternativer som vil muliggjøre bruk av mindre energi og vil resultere i raskere nedbrytning. Med hensyn til dimensjonsbegrensninger, har funksjoner blitt fabrikkert opp til 1,5 mm dypt i hydrogel 7. Dybden kan oppnås er en funksjon av arbeidsavstanden til målet, og kan økes ved hjelp av ultra-lang arbeidsavstand mål optimalisert for in vivo avbildning. Den minste målt kanal 7 opprettet med en 20X (NA1.0) vann nedsenking objektiv hadde en bredde på 3,3 m og dybde på 8,9 mikrometer, som er på nivå med størrelsen på de minste kanalene som genereres i figur 1. Mens andre laboratorier har brukt lavere NA mål 21,23,24, forventer vi at microfluidic nettverk med mindre funksjoner kan genereres ved hjelp av høyer NA mål på bekostning av en redusert arbeidsavstand. Til syvende og sist, men er oppløsningen av teknikken en funksjon av punktspredefunksjonen for fokusert laserstråle, laserskannings egenskaper, mengden av energi som leveres av laseren, og laser absorpsjons-egenskapene til materialet som blir degradert.
Videre laser egenskaper (hastighet, fluence, avstanden mellom virtuelle masker, og antall repetisjoner) må optimaliseres på grunnlag av hydrogel-egenskaper (tverrbindingsdensitet, makromer / monomer molekylvekt, vektprosent, og typen av hydrogel og protein-baserte syntetiske vs. ), da disse vil i seg selv forandre interaksjon med laseren og således den endelige oppløsning av prosessen. Som energi levert er også påvirket av objektiv brukes, er ytterligere optimalisering nødvendig når du bytter mellom målene. Med hensyn til kostnader involvert, er tilgang til et mikroskop med en pulset laser nødvendig, og mens mange forskjellige målsettingerter kan anvendes, de med en høy NA og lang rekkevidde (for in vivo avbildning) kan være kostbart.
Utover protokollen beskrevet her, kan microfluidic nettverk generert ved hjelp av denne teknikken også funksjon med celle-lim peptider post-kanal fabrikasjon å indusere endotelcelle adhesjon og lumen dannelse 7. I tillegg kan inkorporering av celle-nedbrytbart peptid-sekvenser i bulkmaterialet 9 før kanalisere degradering muliggjøre studier av cellemigrering inn i og gjennom hydrogel. For kontinuerlig fluidisering av mikrofluid nettverk inne i hydrogelen, kan hydrogeler bli fotopolymerisert i større fluid enheter eller hus, som vist i figurene 2 og 3 7.
Den generasjonen av vaskulære nettverk via vaskulær eller angiogen selvbygging 8-12 gir en grei tilnærming til å indusere vascularization gjennom et forholdsvis stort volum hydrogel. Mens denne tilnærmingen resulterer i perfusable fluid nettverk, er det vanskelig å direkte kontrollere størrelsen, tortuosity, tetthet, og generelt nettverksarkitektur. På grunn av denne begrensning kan strømningsprofilen og skjærhastigheter i vaskulaturen varierer mellom eksperimenter. Alternativt microfabrication teknikker 13-16 tillate for direkte kontroll over nettverket arkitektur, men er ofte begrenset av deres manglende evne til å generere små kapillære store kanaler eller fabrikasjon av tette nettverk som etterligner in vivo vaskulær arkitektur. Mens laser-baserte hydrogel degradering teknikk skissert her har nylig blitt gjenbrukes microfluidic generasjon, overvinner det samtidig både arkitektonisk kontroll og størrelse baserte begrensningene i eksisterende microfabrication metoder ved å aktivere etablering av 3D biomimetic microfluidic nettverk som rekapitulere tettheten, tortuosity, størrelse område, og samlet architecture av in vivo vaskulatur. Videre kan flere fluid nettverk bli generert i en enkelt hydrogel, slik at studiet av nettovergripende transport 7. For tissue engineering applikasjoner som streber etter å nærmere replikere in vivo transportprosesser in vitro, de svært løst hydrogel-embedded microfluidic nettverk skissert her er godt egnet. Vi forventer at denne protokollen vil være nyttig i utviklingen av vev konstruksjoner som mer nøyaktig etterligne in vivo transport for bruk som narkotika screening og in vitro sykdomsmodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
