Abstract
Este protocolo detallado describe la aplicación de guiado por imágenes, la degradación del hidrogel basado en láser para la fabricación de redes de microfluidos vasculares derivados incrustados en hidrogeles PEGDA. Aquí, se describe la creación de máscaras virtuales que permitan el control de láser guiada por imagen; la fotopolimerización de un hidrogel PEGDA micromolded, adecuadas para la fabricación de la red de microfluidos y el flujo de cabeza impulsada por la presión; la configuración y el uso de un microscopio confocal de barrido láser disponible en el mercado junto con un femtosegundo pulsada Ti: S láser para inducir la degradación de hidrogel; y la formación de imágenes de las redes de microfluidos fabricados utilizando especies fluorescentes y microscopía confocal. Gran parte del protocolo se centra en la configuración y ejecución del software de microscopio y microscopio macro, ya que estos son pasos cruciales en el uso de un microscopio comercial para fines de fabricación de microfluidos que contienen una serie de complejidades. El componente guiada por imagen de este technique permite la implementación de las pilas de imágenes en 3D o modelos 3D generados por los usuarios, con lo que permite un diseño creativo y de microfluidos para la fabricación de sistemas de microfluidos complejas de prácticamente cualquier configuración. Con un impacto esperado en la ingeniería de tejidos, los métodos descritos en este protocolo podrían ayudar en la fabricación de construcciones avanzadas microtejidos biomiméticos para dispositivos zaciones y humanos-en-un-chip. Al imitar la compleja arquitectura, tortuosidad, el tamaño y la densidad de la vasculatura in vivo, los procesos esenciales de transporte biológicos pueden ser replicados en estas construcciones, dando lugar a más precisa de modelado in vitro de la farmacocinética de las drogas y las enfermedades.
Introduction
El sistema vascular, que consiste tanto linfático y vasos cardiovasculares, las formas de las redes de alta densidad que son esenciales para el transporte de nutrientes y oxígeno y para la eliminación de desechos metabólicos. En consecuencia, las células que residen en los tejidos vascularizados son nunca más de 50 a 100 micras de distancia de un recipiente 1. La capacidad para reproducir la arquitectura vascular in vivo in vitro es crítica para modelar con precisión los procesos de transporte en vivo usando construcciones de ingeniería. Con una reciente unidad para desarrollar dispositivos de órgano-on-a-chip 2 para drogas de alto rendimiento de detección 3,4 y 5,6 modelización de enfermedades, métodos para crear redes de microfluidos que recapitular el transporte in vivo -como en hidrogeles sintéticos o naturales están dibujo un interés significativo. Para mejorar la biomimética de microtejidos utilizados en estos dispositivos, hemos desarrollado un método de degradación de hidrogel guiada por imagen, basado en láser que utiliza tres dimensional pilas de imágenes (3D) de la vasculatura nativa como plantillas para generar redes de microfluidos vasculares derivados incrustados en PEGDA hidrogeles 7. Este protocolo describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser comercialmente disponible equipado con un láser de impulsos de femtosegundo para fabricar, redes de microfluidos biomiméticos vasculares derivados de hidrogeles PEGDA a través de, la degradación basada en láser guiada por imagen.
Los enfoques actuales para fluidificar hidrogeles incluyen la inducción de origen vascular o 8-10 10-12 técnicas de células endoteliales de autoensamblaje y microfabricación angiogénicos para crear canales pre-definidos para la endotelización 13-16. Si bien las redes autoensambladas recapitulan la densidad y la arquitectura compleja de microvasculatura, a menudo son más permeables que las redes in vivo 11,17,18, que puede ser problemático en el transporte de modelado para aplicaciones de cribado de fármacos. redes de auto-ensambladas consisten en physiologcamente relevante, los vasos capilares de tamaño, pero pueden ser difíciles de integrar en el flujo de fluido a granel debido a las limitaciones en la generación de buques de mayor tamaño de las arteriolas. Como no hay un control directo sobre el conjunto de estas redes, la arquitectura final puede variar de una muestra a otra, por lo que es difícil de producir repetidamente redes con las mismas propiedades de flujo y de transporte de fluidos.
Para generar 3D, las redes de microfluidos de hidrogel incrustado con geometría repetible y la arquitectura bien definida, un número de técnicas de microfabricación se han desarrollado, incluyendo el montaje modular 13, la impresión 3D de materiales de sacrificio 16, de montaje y escritura directa 14, y la impresión de omnidireccional 15. La aplicación de estos métodos, la arquitectura de microfluidos, y propiedades de flujo y de transporte, por tanto, de fluidos, se pueden fabricar varias veces a través de muchas construcciones. Una limitación importante de estos enfoques, sin embargo, es la incapacidad para crear microfluidic redes con características capilares de tamaño, de 4 a 10 micras 19. La mayoría de las técnicas de microfabricación a menudo se limitan a las características de 150 a 650 micras de diámetro 13,16. Algunas de las técnicas existentes son capaces de generar redes jerárquicas con canales a través de un rango de diámetro de ancho, 10 a 300 micras para el montaje y escritura directa 14, y 18 a 600 micras para la impresión omnidireccional 15, pero están limitados en su capacidad de generar redes densas o para producir múltiples redes de microfluidos en estrecha proximidad dentro de un mismo constructo 7.
Para superar algunas de estas limitaciones, se desarrolló una, técnica de degradación de hidrogel basado en láser guiada por imagen que permite la fabricación repetible de biomimético, redes de microfluidos jerárquicas que recapitular la arquitectura de la microvasculatura en vivo. Para ello, un 790 nm, 140 femtosegundos (fs) de láser pulsado que funciona a 80 MHz es la trama i-escaneadan deseada ubicaciones 3D dentro de un hidrogel, como se define por las imágenes de la vasculatura in vivo. Especulamos que el proceso de degradación opera a través de la descomposición inducida por láser óptico de agua, la formación de plasma resultante, la posterior expansión termoelástica rápido de agua, y la degradación local de la hidrogel como el agua se expande 20. Este mecanismo varía ligeramente de degradación basado en láser de hidrogeles a base de proteínas 21-24. A diferencia de PEGDA, que tiene una sección transversal multifotónica bajo, las proteínas tienen a menudo una sección transversal de multifotónica grande y por lo tanto se degradan a través de una multifotónica absorción inducida por la rotura química 23. Para generar redes de microfluidos guiados por imagen, el obturador de láser se controla por las máscaras virtuales imagen derivada, que consisten en un mosaico de regiones de interés 9 que definen la arquitectura de microfluidos. Con este enfoque, hemos demostrado la capacidad de fabricar 3D microfluidos biomimético vasculares derivadasredes ic, que recapitulan la arquitectura densa y tortuosa de la vasculatura in vivo, a fin de controlar localmente la porosidad de los hidrogeles mediante la alteración de la cantidad de energía suministrada durante la degradación. También hemos sido capaces de generar dos redes independientes de microfluidos que se entrelazan en las proximidades (15 micras), pero nunca se conectan directamente 7. También hemos demostrado la capacidad de endothelialize microcanales láser degradada a través funcionalización degradación post con la secuencia del péptido ligando de integrina, arginina-glicina-ácido aspártico-serina (MFG), para promover la adhesión de las células endoteliales y la formación del lumen 7.
Con este protocolo, se hace posible la generación de redes complejas de microfluidos en hidrogeles PEGDA vía, la degradación basada en láser guiada por imagen utilizando un microscopio disponible comercialmente accesibles en muchos campus universitarios. A medida que el proceso de degradación se guía por las máscaras digitales, virtuales, esta fabricatécnica de la es susceptible para el diseño creativo de redes de microfluidos, permitiendo su uso en una amplia variedad de aplicaciones. Anticipamos que el método descrito aquí será más ventajosa en el diseño de dispositivos zaciones y humanos-on-a-chip biomiméticos capaces de replicar los procesos de transporte biológicos importantes en el transporte de drogas de modelado 2. Esta técnica de fabricación también puede ser de interés para la generación de modelos de enfermedades in vitro, incluyendo la metástasis del cáncer 5,6 y modelos de la barrera hematoencefálica 25. Como la degradación de hidrogel basado en láser anteriormente se ha utilizado para crear pistas para la guía de excrecencia neuronal 21-23, la extensión guiada por imagen de esta técnica podría resultar útil en estrategias avanzadas de ingeniería de tejidos para colocar las células en disposiciones espaciales en 3D definidos por el usuario.
Protocol
1. La generación de máscaras virtuales
NOTA: Una pila de imágenes en 3D de la microvasculatura cerebral del ratón fue elegido como el modelo de microfluidos para este protocolo, después de haber sido entresacado de un conjunto de datos mucho más grande que contiene las imágenes de toda una microvasculatura cerebral del ratón. Microvasculares imágenes fueron adquiridas a través de microscopía de barrido filo de cuchillo (KESM) 26, 2; son abiertamente dispone de datos microvasculares similares a través del cerebro de ratón KESM Atlas 28.
- Abra el software de procesamiento de imágenes 29 y abierto y recortar la pila de imágenes en 3D TIF de vasculatura nativa de modo que la red de microfluidos deseada, que se genera dentro del hidrogel, cabe en un 450 micras x 450 micras x 1,5 mm (x por y por z) ventana. Para ello, dibujar un cuadrado alrededor de la región deseada y haga clic en "Imagen" → "Recortar". Retire las rodajas en la dirección z haciendo clic en "Imagen" → "Duplicar" y escriba un trozo deseadodistancia.
NOTA: Esto asegura que las características deseadas encajan dentro del campo de visión (x por y) (531,2 x 531,2 micras cuando se utiliza un 20X (NA1.0) objetivo de inmersión en agua con un tamaño de fotograma de 2.884 x 2.884 píxeles y un zoom de 0,8 con un láser de microscopio confocal de barrido) y la distancia de trabajo (z) de un 20X (NA1.0) objetivo de inmersión en agua. Si se desconoce, el campo de visión para otros sistemas se puede determinar mediante la adquisición de una imagen con el objetivo y la configuración deseada. - Gire la pila de modo que las características están alineados principalmente con la dirección de la exploración de trama, o en la dirección x, haciendo clic en "Imagen" → "Transform" → "Rotar". Esto disminuye el tiempo necesario para la fabricación.
- Escalar la pila imagen recortada de manera que los partidos de tamaño de píxel o excede los parámetros utilizados para la degradación en el microscopio confocal (0,184 m / píxel cuando se utiliza un 20X (NA1.0) objetivo de inmersión en agua con un tamaño de fotograma de 2.884 por 2.884 píxelesy un zoom de 0,8). Para ello, haga clic en "Imagen" → "Ajustes" → "Tamaño" y escriba "2446" para "Ancho" (es decir, 450 micras, o el tamaño de la imagen dividida por 0,184 m / píxel).
- Umbral / binarización en la pila de imágenes escribiendo "Ctrl + Shift + T". Anule la selección de "fondo oscuro", y haga clic en "aplicar" → "ok". Termina el proceso haciendo clic en "Imagen" → "tablas de búsqueda" → "Invertir LUT".
- El uso de un algoritmo personalizado (código fuente está disponible en el material complementario del manuscrito de referencia) en el software de programación 9, se ajusta a la binarizada (blanco) cuenta con un mosaico de simples cuadriláteros de píxeles de alta paralela a la dirección de exploración de trama (la x -dirección) para generar las regiones de interés (ROI) que guían la posición del láser y el obturador 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
NOTA: El algoritmo personalizado 9 convierte cada plano individual en la imagen TIF pila a un archivo de SPI. - Cambie la extensión de archivo de los archivos del SPI a .OVL para su uso durante la degradación.
2. Configuración del escaneo láser confocal Microscopio
NOTA: Mientras que otros microscopios de barrido láser equipados con láseres pulsados se pueden utilizar, la configuración y el protocolo aquí describen el uso de un microscopio de barrido láser (LSM) en conjunción con su software.
- Con el láser confocal de barrido microscopio, abra el software de microscopio, y haga clic en "Inicio del sistema." Seleccione el objetivo "W Plan-Apocromático 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 de 75 mm" en la pestaña de "Mantener".
- Ajuste de la configuración de "hidrogel de Visualización"
- En la pestaña "Adquisición", asegúrese de que se selecciona la línea de láser (514 nm láser de argón) y en la Windo "Laser"w. NOTA: Este canal se utiliza para obtener imágenes del hidrogel a través de fluorescencia eosina Y para fines de orientación 7.
- En la ventana de "Configuración de imagen", establecer el "Modo" para "Modo de canal", ajuste "aguja de cambio cada" a "Marco", y seleccione "Track1".
- En la ventana "Light Path", seleccione sólo el detector fluorescente Ch1, con un rango de 516 a la 735 nm; un divisor de haz principal (MBS) 458/514 filtro en la línea de la luz visible; y una placa en la línea de luz invisible. Anular la selección del detector de tubo fotomultiplicador de campo brillante, "T-PMT".
- En la ventana "Modo de adquisición", compruebe que se ha seleccionado el objetivo correcto y establecer el "modo de escaneado" de la "ventana", el "Tamaño de fotograma" a "2884" en las direcciones X e Y, la "Línea de paso" a "1" , el "número promedio de" a "1", el "Modo promedio" en "Line", el "método de promedio" a "media", la "Profundidad de bits "a" 16 bits ", y el" sentido "a" <-> "para el escaneado bidireccional.
- En la ventana "Modo de adquisición", establecer la "velocidad" como se desee y ajuste "Corr X" e "Y" a "0,05" o ajustar según sea necesario para que se utiliza el microscopio específico. Anule la selección de "HDR".
- En la ventana "Modo de adquisición", asegúrese de que el "área de escaneado" muestra un "Tamaño de imagen" de "531,2 micras x 531,2 m" y un "tamaño del pixel" de "0,18", con un "Zoom" en "0.8" ; establecer todos los demás valores "área de escaneado" a cero.
- En la ventana "Canales", seleccione "Track1" como el detector de fluorescencia Ch1. Seleccione la línea láser "514", con una potencia por ciento de "10,0", un "agujero de alfiler" de "1 AU", una inicial "Ganancia (Maestro)" de "800", un "offset digital" de "0", y una "ganancia digital" de4; 1 ".
NOTA: Ajuste estos valores según sea necesario para el microscopio específico que se utiliza. - Guardar esta configuración como "hidrogel de visualización".
- Ajuste de la configuración de "Canal de Formación"
- En la pestaña "Adquisición", asegúrese de que la línea de láser (790 nm a 140 fs pulsadas Ti: S láser) está seleccionado y en la ventana "láser". Ajuste "Corrección GDD" a "4000" para la salida de potencia máxima a 790 nm.
- Establece la ventana "Configuración de imagen" como se indica en el paso 2.2.2.
- En la ventana "Light Path", aseguran que no hay detectores fluorescentes se seleccionan, con un filtro de 458/514/561/633 MBS en la línea de la luz visible y 760+ filtro en la línea de luz invisible a MBS. Anular la selección del detector de tubo fotomultiplicador de campo brillante, "T-PMT".
- En la ventana "Modo de adquisición", compruebe que el objetivo correcto aparece. Establecer la "velocidad" a "3"Y todos los demás ajustes como se indica en el paso 2.2.4.
- En la ventana "Canales", seleccione "Track1" como el detector de T-PMT. Seleccione la línea láser "790", con una potencia por ciento de "100,0", una inicial "Ganancia (Maestro)" de "800", un "offset digital" de "0", y un "Digital Gain" de "1" .
- En la ventana "Etapa", poner a cero el escenario haciendo clic en "set cero". Marque la ubicación haciendo clic en "Marca". Esto es crítico para subir máscaras virtuales a la macro microscopio en el paso 3.
- En la ventana "Time Series", establecer "Ciclos" como "1" y "Intervalo" como "0".
- En la ventana de "Bleach", compruebe el "Inicio del blanqueo # exploraciones después de" caja y se establece en un valor de "0 de 1". Seleccione la "velocidad de exploración diferente", con un valor de "3" (que corresponde a un tiempo de permanencia de píxel de 8,96 mu s / píxel). Seleccione el "bl Seguracada uno para GaAsP ".
- En la sección de línea láser de la ventana de "Bleach", seleccione la línea de láser 790 y ajustar la potencia por ciento al "100,0". Deje todas las otras cajas en la ventana de la lejía no seleccionados. Guardar la configuración de blanqueo en la ventana de "Bleach".
- Guardar esta configuración como "formación de canal".
NOTA: El "Z-Stack", "Regiones", "Focus", y las ventanas "etapa" también son importantes a este protocolo, pero no necesitan ser instalados o ajustados durante la configuración inicial.
3. Creación de una receta y Carga de máscaras virtuales para el Software Microscopio y Macro
- Con el microscopio láser confocal de barrido-aún en marcha y el software del microscopio en pie, seleccionar sólo las "regiones" de la ventana (al lado del botón "Inicio Experimento") en la configuración de "formación de canal".
- Para asegurarse de que las máscaras se cargan a la macro microscopio correctaLy, ajustar la potencia por ciento en los "canales" de la ventana de "0,2" y la "velocidad" en la ventana "Modo de adquisición" a "8", y haga clic en "Snap" en la parte superior izquierda de la pantalla.
- Compruebe que el tamaño de la imagen sigue siendo "x 531,2 m 531,2 m", con un tamaño de píxel de "0,18", en la pestaña "Información" de la imagen. Si estos valores no son correctos, compruebe el "Tamaño de fotograma" y los valores de "Zoom" de nuevo.
- CRÍTICA: Compruebe que las ubicaciones X e Y en la ventana de "etapa" se ponen a cero y que la posición está marcada antes de abrir la macro microscopio. Consulte el paso 2.3.6.
- Para abrir la macro microscopio, tipo "Alt + F8", haga clic en "Load" y seleccione la versión correcta. Consulte los detalles en la Lista de materiales específicos / Equipo. Una larga lista de sub-macros se abrirá en la ventana "Control Macro".
- En la ventana "Control Macro", haga clic en "Ejecutar" para abrir el microscope macro, a continuación, cierre la ventana "Control Macro".
NOTA: Alternativa versiones de la macro microscopio pueden no ser compatibles con la degradación del hidrogel basado en láser usando este protocolo. - En la pestaña de "ahorro" de la macro microscopio, proporcionar una arbitraria "Nombre de archivo base", seleccionar "Archivo de salida individual", y eligió una carpeta "archivos temporales". Ajuste "carpeta Temp abierto" a la posición "1", seleccione "Carpeta temporal de imagen individual", y el nombre de la receta en la "tienda / Aplicar la receta" con la "Lista de Puntos de Recall" seleccionado. Haga clic en "Guardar" para crear inicialmente la receta.
- En la pestaña de "adquisición" de la macro microscopio, asegúrese de que la "configuración de escaneo" coincide con el nombre dado a la configuración del software del microscopio ajustado en el paso 2.3. Establecer los "Sin Tiempo de puntos dentro del bloque" a "1", con un "intervalo" de "0". Asegúrese de que "Z Marcada - Parte superior de la Z StacK "se resaltan en color verde. Todos los demás valores predeterminados están bien como están.
- En la ficha "Tiempo de espera" de la macro microscopio, asegúrese de que "Espera retardo" se resaltan en color verde, ajuste "Las repeticiones del experimento" y "Grupo Repeticiones" a "1" y "Esperar intervalo antes de Block en primer lugar la ubicación Sólo" a "0" . Todos los demás valores predeterminados están bien como están.
NOTA: El "Grupo Repeticiones" (y no las "repeticiones") Experimento cuadro es donde se puede establecer el número de veces que los escáneres láser sobre una región (es decir, la repetición de la receta). - En la pestaña "Lista Z" de la macro microscopio, se especifican los planos de degradación en la dirección z. Establecer el z-separación ", dZ", a "1 micra", con el "Número de posiciones" establecido para que coincida con el número de máscaras virtuales para ser utilizado.
- Haga clic en el botón "Crear Z Pila" para hacer la "Lista Z" aparecerá en el menú desplegable "List de Ubicaciones "hacia la parte inferior de la ventana. Compruebe que el número de lugares y z-espacio son correctos y que las posiciones X e Y se pone a cero.
NOTA: Si no es así, no guarde la receta; cierre la macro microscopio y repetir el paso 2.3.6 antes de volver a abrir la macro microscopio y la creación de la receta de nuevo.
NOTA: En lugar de tener 100 máscaras espaciados por 1 m cada uno, por ejemplo, puede ser ventajoso tener 50 máscaras, cada empleado dos veces y separados por 1 m, para obtener una estructura de microfluidos equivalente, como la carga de máscaras individuales a la macro microscopio puede consumir mucho tiempo. - En la pestaña "blanqueo" de la macro microscopio, todas las máscaras deben cargarse y emparejado con una ubicación numerada específica en la "Lista de Ubicaciones". Para empezar, seleccione la casilla de "Bleach" y asegurar que "Config." coincide con el nombre de la configuración de blanqueo en la ventana de "Bleach" en la pantalla principal del software del microscopio (consulte el paso 2.3.8). Ajuste "Espere Retardo después de Bleach" a "0", anule la selección de "punto", y dejar el "retorno de la inversión" vacía.
- No cambie nada en el "Lugar", "Mosaico", "Red", "enfoque automático", "Bloques", y las fichas "Opciones" en la configuración predeterminada.
- Para cargar las máscaras a la macro microscopio, seleccione sólo la ventana "Regiones" en el software de microscopio y se abre la pestaña "blanqueo" de la macro microscopio. En la ventana de "Regiones", haga clic en "Load" y seleccione el archivo .OVL para la máscara en la parte inferior de la pila Z se degrade.
NOTA: La primera ubicación en la lista de "Z" es la parte inferior de la pila Z, y la macro microscopio se abre camino a la parte superior de la pila Z, o hidrogel. - Una vez que la lista de regiones de interés aparece en la ventana "Regiones", haga clic en el botón de flecha para acceder a las regiones de interés de la máscara dentro del campo de visión (en la imagen se rompió en el paso 3.2). Compruebe que las regiones de interés encajan dentro deel campo de visión.
- Para guardar la máscara cargado en la macro microscopio, dar la máscara de un nombre y un número en el cuadro "Agregar Región actual a la lista de retorno de la inversión" en la pestaña de "Bleach", y luego haga clic en el botón "Añadir a la lista actual Región retorno de la inversión". El nombre y el número aparecerá en el "retorno de la inversión" lista desplegable con otras máscaras (incluyendo máscaras de otras recetas creadas anteriormente). Eliminar la máscara en la ventana de "Regiones" en el software de microscopio.
- Repita los pasos 3.14 y 3.16 para cargar y guardar todas las máscaras a la macro microscopio.
- Para asignar máscaras subidos a cada Z-ubicación, posición 1 en el menú desplegable "Lista de ubicación de" poner de relieve. Seleccione el retorno de la inversión apropiada de la lista desplegable "retorno de la inversión". Asegúrese de que la casilla de "Bleach" se selecciona en la parte superior de la pestaña de "Bleach" en la macro microscopio.
- Repita el paso 3.18 para todas las posiciones en el menú desplegable "Lista de Ubicaciones" y haga clic en "Guardar" en el enlace &# 34; ahorro de energía "ficha para guardar la receta en su forma final.
4. fotopolimerización de un hidrogel de PEGDA
- Haciendo estéril HEPES solución salina tamponada (HBS) con trietanolamina (TEOA)
- En un vaso de precipitados de 1 l, añadir 500 ml de H2O DI con una barra de agitación, se agita en 2.922 g de cloruro de sodio, 1.196 g de HEPES y 7,5 ml de TEOA en una campana extractora.
- Ajustar a pH 8,3 con solución de hidróxido de sodio 1 N mediante la adición gota a gota con una pipeta Pasteur.
- Filtro estéril la solución a través de un vacío taza de filtración 0,2-m en una botella de vidrio de medios autoclave de 500 ml. Alícuota y almacenar a 4 ° C.
- Coloque un anillo de adhesivo de doble cara con el respaldo de una especializada placa de 60 mm de Petri con un agujero de corte de 20 mm de la parte inferior. Dejando el respaldo en el anillo adhesivo, presione cualquier burbuja de aire de entre la placa de Petri y el adhesivo.
- Preparar los materiales. Llevar el sintetizada 33 3.4 kDa PEGDA fuera del congelador a -80ºC y espere hasta que alcance la temperatura ambiente. Encienda la fuente de luz blanca al menos 15 minutos antes de la fotopolimerización de hidrogeles.
- En una campana de extracción, añadir 1 ml de HBS con TEOA a una, 2-ml tubo de centrífuga de color ámbar forrada con papel aluminio (utilizado para prevenir exposición a la luz del fotoiniciador, eosina Y). Añadir 10 l de 1 mM de sal disódica eosina Y en H2O DI
- En una campana de humos, extraer un pequeño volumen de 1-vinil-2-pirrolidinona (NVP) en un vaso de precipitados de vidrio con una pipeta Pasteur. De este volumen, pipeta de 3,5 l de NVP en el tubo de centrífuga de color ámbar con la EPF, TEOA, y eosina Y.
- En un segundo, ml 2 tubo de centrífuga de ámbar lámina de cubierta (usado para prevenir la fotoactivación errante de la solución de prepolímero), añadir 10 mg de 3.4kDa PEGDA. Añadir 0,2 ml de la HBS, TEOA, eosina Y, la solución de NVP de un 5% w / v solución de prepolímero PEGDA. Vortex hasta que el PEGDA se haya disuelto completamente. El uso de un medidor de potencia y varita detector, ajustar la intensidad de la li blancofuente de lucha a 95 mW.
- La construcción de un poli (dimetilsiloxano) (PDMS) Molde
- Construir un molde de PDMS 7 sobre una superficie más grande (de vidrio, placa de cultivo tisular de poliestireno) para facilidad de manejo y de montar los moldes de tal manera que los hidrogeles moldeados encajan dentro de un círculo de 20 mm de diámetro.
- Para generar un hidrogel de forma rectangular con un espesor de 500 micras, colocar dos espaciadores de PDMS 500 micras de espesor sobre una superficie de PDMS para crear dos bordes de hidrogel definidos.
- Incluir un PDMS espaciador 300-micras para impartir un pozo 300 micras de profundidad en la superficie del hidrogel, que es útil para la introducción de líquidos.
- Pipetear 60 l de la 5% w / v solución de prepolímero PEGDA sobre el molde de PDMS. Tenga cuidado de no introducir burbujas durante el pipeteado.
- Center y colocar un [3- (metacriloiloxi) propil] trimetoxisilano (TMPSA) funcionalizados 7, diámetro 40 mm, # 1.5 cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la solución. Asegúrese de que el coverslIP se basa en los separadores de PDMS de 500 micras. El hidrogel se adhiere a la cubreobjetos metacrilado y evitar que el hidrogel de flotando en la solución.
- Coloque el PDMS, solución de pre-polímero y un cubreobjetos PEGDA el conjunto bajo la fuente de luz blanca durante 3 min.
- Flow DI H 2 O entre el molde y el cubreobjetos para separar el hidrogel a partir de los PDMS. Enjuague el hidrogel con DI H 2 O. Se secan los bordes del cubreobjetos con el tejido de laboratorio. Tenga cuidado de no tocar o agua mecha del hidrogel.
- Después de retirar la lámina del adhesivo, adherir el cubreobjetos a la placa de Petri preparadas y suavemente eliminar las burbujas de aire entre el adhesivo y el vidrio. Sumergir el hidrogel en la placa de Petri con H2O DI
NOTA: El molde de PDMS se puede reutilizar para hacer hidrogeles adicionales si se enjuaga con DI H2O, se secó con nitrógeno, y se mantiene libre de polvo.
5.-vascular derivada Fabricación de red de microfluidoss a través de la degradación basada en láser
- Con el microscopio confocal de escaneo láser y software de microscopio sobre, seleccione el objetivo "W Plan-Apocromático 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 de 75 mm" en la pestaña de "Mantener". En la pestaña "Adquisición", asegúrese de que las líneas necesarias láser (514 nm láser de argón y 790 nm 140 fs pulsadas Ti: S láser) están encendidas y se calentó.
- Configuración del Hidrogel para Formar un canal de entrada
- Montar el hidrogel y la placa de Petri en el prospecto del escenario y colocar el inserto etapa en la platina del microscopio. Llene la placa de Petri con al menos 5 ml de H2O DI Centro de las características de hidrogel y así por el ojo antes de bajar el objetivo de inmersión en agua en el H2O DI
NOTA: No aplaste el hidrogel con el objetivo a los dos nunca debe tocar! - Para encontrar el hidrogel, cambiar a la configuración de "hidrogel de Visualización" desde el paso 2.2. Haga clic en "vivo" para activar la línea de láser y acerque THe objetivo más cerca del hidrogel hasta que la señal eosina Y (detectada por el detector fluorescente Ch1) de la parte superior del hidrogel puede ser visto.
NOTA: Para encontrar el hidrogel con facilidad, el porcentaje de potencia se puede aumentar o el agujero se puede abrir. Una vez que el objetivo se centra en el hidrogel, sin embargo, la caída de la potencia por ciento para proteger el detector fluorescente y disminuir el agujero de alfiler de nuevo a 1AU para evitar la sobresaturación del detector y para encontrar con exactitud la superficie del hidrogel. - En la ventana "Etapa", marque la ubicación de la parte superior e inferior del hidrogel y de la parte inferior del pozo.
NOTA: Los valores z aquí ayudarán a la hora de determinar el espesor del hidrogel y la profundidad del pozo. - Utilice el joystick para mover en las direcciones X e Y para encontrar el borde de un pozo. Coloque el hidrogel a la derecha de la pantalla, con el bien a la izquierda, o viceversa. Permitir que el hidrogel para llenar no más de dos tercios de la campo de visión.
- La caída de la plane de foco hacia abajo 150 micras en el hidrogel estableciendo el "Tamaño de paso" a "150" en la ventana "Focus" y haciendo clic en la flecha hacia abajo junto al cuadro "Z-Posición". Repita el paso 5.2.4, de ser necesario.
NOTA: El x, y, y la posición z de la entrada depende únicamente en el diseño de las máscaras virtuales. - CRÍTICA: Zero X e Y ubicación en la ventana de "etapa", elimine todos los demás lugares marcados, y marca sólo esta ubicación.
NOTA: Si no se realiza este paso, la macro microscopio no restaurará correctamente las ubicaciones en la receta previamente guardada, y el hidrogel no se degrada en el lugar deseado.
- Montar el hidrogel y la placa de Petri en el prospecto del escenario y colocar el inserto etapa en la platina del microscopio. Llene la placa de Petri con al menos 5 ml de H2O DI Centro de las características de hidrogel y así por el ojo antes de bajar el objetivo de inmersión en agua en el H2O DI
- La formación de un canal de entrada
- "Snap" una imagen y dibujar una región rectangular que será la entrada a la red vascular usando el botón rectángulo en la ventana de "Regiones".
NOTA: Hacer parte segura de la región se extiende a cabo en el pozo para asegurar que THe de entrada se conectará el pozo hasta la red vascular. - Al lado del retorno de la inversión generada en la ventana de "Regiones", seleccione "Adquisición" y anule la selección de "Bleach" y "Análisis".
- Guarde la configuración "hidrogel de visualización", anule la selección de "Regiones", y cambiar a la configuración de "Formación de canales", creado en el paso 2.3. En la configuración de "formación de canal", seleccione "Regiones" de nuevo.
NOTA: Cuando se cambia entre la "Visualización de hidrogel" y las "configuraciones de la formación de canales", asegúrese de anular la selección de las regiones en la parte superior izquierda de la pantalla. A veces la escala de las regiones puede cambiar de forma inesperada entre las configuraciones si esto no se hace. - En la configuración de "Formación de canales", asegúrese de que sólo las "regiones" y "Z-Stack" se seleccionan. En la ventana de "Z-Stack", haga clic en el botón de "Centro" en la parte superior y luego el "centro" a topeen por encima de "Offset" para ajustar el centro de la pila Z como el Z-posición actual. Dependiendo del tamaño de la entrada tiene que ser, establecer el número de "cortes" con un "intervalo" de "1". El tamaño de la pila Z se mostrará debajo de "Rango".
- Compruebe que "velocidad" en la ventana "Modo de adquisición" se establece en "3" y que el "Porcentaje de energía" en la ventana "Canales" está ajustado en "100". Guarde la configuración y haga clic en el botón "Inicio de experimentación".
NOTA: No se requiere la macro microscopio para degradar la misma forma simple en múltiples planos, tal como se realizó aquí para generar un canal de entrada. La macro sólo es necesario cuando la degradación de las diferentes regiones en cada plano individual, y se utiliza para almacenar las máscaras virtuales dentro de una receta. - Para visualizar el hidrogel durante la degradación, ya sea aumentar la "ganancia (Maestro)" en la ventana "Canales" si la región en tque el campo de visión es de color negro, o disminuir la "Ganancia (Maestro)" si la región es de color blanco.
NOTA: La formación de burbujas aquí es una indicación de la degradación del hidrogel inducida por láser. - Para degradar la entrada varias veces en lugar de una sola vez, ajustar los "Ciclos" en la ventana "Time Series".
- En la configuración "Visualización de hidrogel", haga clic en "vivo" para asegurarse de que se formó la entrada.
- "Snap" una imagen y dibujar una región rectangular que será la entrada a la red vascular usando el botón rectángulo en la ventana de "Regiones".
- Configuración del hidrogel para generar la red de microfluidos
- En la ventana de "Regiones", cargar cualquier archivo .OVL de la z-pila de máscaras virtuales y haga clic en el botón de flecha para ver las regiones de interés en el campo de visión.
- Haga clic en "vivo" para vivir escanear la configuración de "hidrogel de visualización" y utilizar la ventana de la "Etapa" joystick o para posicionar el hidrogel en X e Y, de tal manera que la entrada se conecta a la ubicación correcta dentro de la red vascular.
NOTA: Asegúrese de que elROIs de la máscara virtual se solapan ligeramente con la entrada previamente formada. - Caída del plano de enfoque hasta 50 micras de la anterior Z-ubicación centrada, o 200 micras desde la superficie del hidrogel, usando el "Tamaño de Paso" en la ventana "Focus" y haciendo clic en la flecha hacia abajo junto a la "Z-Posición " caja. Esta será la primera posición en la macro microscopio.
NOTA: La distancia real se mueva en la dirección z depende del diseño de la red. Asegúrese de que la red deseada no se extiende más allá de la superficie superior o inferior del hidrogel en la dirección z. - CRÍTICA: Zero las ubicaciones X e Y en la ventana de "etapa", elimine todos los demás lugares marcados, y marca sólo esta ubicación.
NOTA: Este será el punto de partida en la macro microscopio. La receta trabajará su camino de vuelta hacia la superficie del hidrogel. - "Snap" una imagen en la configuración de "hidrogel de visualización", eliminar y deselect "Regiones", y guardar la configuración.
- Generación de la Red de microfluidos
- Cambiar a la configuración "Formación de canales", y sólo seleccionar la opción "Time Series" y "ventanas" para blanquear. Compruebe que la configuración para el "Time Series" y las "ventanas" de blanqueo son como se establecieron inicialmente en los pasos 2.3.7 y 2.3.8.
- Establecer la "velocidad" en la ventana "Modo de adquisición" a "8" y el poder de la línea láser a "0,2" por ciento en la ventana "Canales". Guardar la configuración.
- Abra la macro microscopio siguiente paso 3.5. En la ficha "ahorro" de la macro, seleccione la receta hecha previamente en el paso 3 y haga clic en "Aplicar".
NOTA: No haga clic en "Guardar" o se sobrescribe la receta! - Compruebe los ajustes en todas las fichas y verifique que las máscaras virtuales (archivos .OVL) todavía están asociados correctamente con tque Z-lugares en la lista desplegable. Compruebe también que el primer Z-ubicación coincide con la posición marcada en la ventana de "etapa" del software microscopio.
NOTA: Contraintuitivamente, la segunda ubicación en la lista desplegable será físicamente por encima de la primera ubicación, como el macro microscopio se abrirá camino desde la parte inferior del hidrogel (más alejado del objetivo) a la parte superior del hidrogel (la más cercana a la objetivo). - Guarde la configuración de "formación de canal" de nuevo y, a continuación, haga clic en "Actualizar" en la macro microscopio. Haga clic en "No" para "Sobrescribir actual lista de ubicaciones?", Y luego haga clic en "Inicio" en la macro microscopio para empezar la receta.
6. La visualización de la Red de microfluidos
- Para ver el hidrogel y la red de microfluidos formada después de la degradación, cierre la macro microscopio. Cambiar a la configuración de "hidrogel de visualización" para ver si la eosina Ygnal del hidrogel; la red degradada aparecerá oscuro.
NOTA: La degradación de hidrogel no se puede visualizar mientras que el macro microscopio se está ejecutando. - Para ver la red de microfluidos específicamente, utilice la configuración "hidrogel Visualización" en una potencia de láser inferior para permitir la obtención de imágenes de fluoresceína introducido (FITC) marcado con dextrano, que tiene una señal más brillante que la señal de eosina Y nativo del hidrogel.
- Antes de la introducción de dextrano marcado con fluorescencia, Wick agua del pozo en el hidrogel utilizando tejido de laboratorio. Pipetear en 10 l de 5 mg / ml 2000 kDa de dextrano marcado con FITC en DI H 2 O (pre-filtrada a través de un filtro de jeringa de 0,2-m).
NOTA: Utilice cualquier tamaño dextrano 2000 kDa o mayor para evitar la difusión en el gel. Si la imagen durante más de 30 min, utilice una etapa se incubaron con 60% de humedad (o superior) para evitar el secado de hidrogel y la evaporación del agua de la solución de dextrano marcado con FITC. - Retire el hidrogel unand placa de Petri de la etapa y marca la placa de Petri para permitir la fácil localización de la red vascular formado durante la experimentación posterior.
Representative Results
Para demostrar la aplicación de las guiada por imagen, la degradación del hidrogel a base de láser para generar una red de microfluidos 3D, vascular deriva, se utilizó una pila de imágenes en 3D de la vasculatura del cerebro de ratón que fue adquirida a través de microscopía de barrido filo de cuchillo (KESM) 26, 27 . Una región 3D seleccionado del conjunto de datos más grande microvascular se convirtió en una serie de máscaras virtuales para la formación de la red de microfluidos guiada por imagen, como se describió anteriormente. Después de la fabricación, la red de microfluidos resultante se perfundió con una solución de marcado con FITC, 2000 kDa de dextrano y la imagen a través de microscopía confocal. La pila de imágenes de la vasculatura in vivo que define la arquitectura de red (Figura 1 A y C) y la red de microfluidos fabricado (Figura 1B y D) se utilizaron para generar Z-proyecciones (Figura 1A y B) y representaciones en 3D (Figura 1C y re in vivo. La técnica es susceptible de fabricación de redes que contienen una amplia gama de diámetros; dentro de la figura 1, se generaron los canales que van desde 3,3 hasta 28,8 m de diámetro. Tenga en cuenta que la estructura rectangular más grande en la parte superior izquierda de la figura 1B y en la esquina izquierda de la figura 1D es el canal de entrada para introducir el flujo en la red.
Figura 1: Vascular-Derivado de microfluidos red. Una serie de máscaras virtuales, derivado de una pila de imágenes de la vasculatura de cerebro de ratón (A y C), se utilizaron para fabricate una red de microfluidos biomimético 3D incrustado en un hidrogel PEGDA (B y D) a través de, la degradación basada en láser guiada por imagen. La red de microfluidos se perfundió con dextrano marcado con FITC 2.000 kDa y fotografiado a través de microscopía confocal. Z-proyecciones (A y B) y representaciones en 3D (C y D) de las dos redes demuestran la capacidad de generar redes de microfluidos que recapitular la densidad, la organización y la arquitectura general de la vasculatura in vivo. La flecha (D) marca la entrada rectangular creada para introducir el dextrano. La barra de escala representa 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Hemos implementado dos métodos, cabezales de presión y bombas de jeringa, para iniciar el fluido fbaja en estas redes de microfluidos integrados. Por ejemplo, un canal rectangular 30 por 30 micras se fabricó para conectar dos pozos en un hidrogel PEGDA micromolded (Figura 2A), con el flujo de fluido conducido a través de un cabezal de presión 7. Generada en el pozo a la izquierda, la carga de presión inducida por el flujo a través del microcanal y en el pozo a la derecha. En la figura 2A, un frente inicial de tetrametilrodamina (TRITC) -etiquetados, 70 kDa dextrano se observó en movimiento a través del canal mediante microscopía de lapso de tiempo. Más tarde, en la Figura 2B, un diámetro de 10 micras de poliestireno fluorescente esfera fluyó desde el pozo a la izquierda, a través del canal, para el bien de la derecha. Con la duración del flujo controlado por el volumen de fluido presente en el micromolded bien en la entrada, y la velocidad de flujo controlada por el gradiente hidrostática generada entre la entrada y salida, así, el flujo de cabeza impulsada por presión en hidrogeles micromolded proporciona un método sencillo para el flujo enproducción, sin la necesidad de un alojamiento externo o una bomba de jeringa.
Figura 2: Flujo Presión Head-Driven en un Micromolded PEGDA de hidrogel. PEGDA se micromolded para formar un hidrogel que contiene dos pozos conectados por un microcanal incrustado. Una cabeza de presión se genera en el marcado con TRITC izquierda bien para iniciar el flujo de, 70 kDa dextrano (A1-A3) y una esfera de poliestireno 10 mm (B1-B3) a través de un canal rectangular 30 por 30 m de un pozo a la otro. La barra de escala representa 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Alternativamente, para generar un flujo constante de fluido dentro de las redes de microfluidos, bomba impulsada jeringa fbaja puede ser iniciado por la fotopolimerización del hidrogel en el interior de un dispositivo de microfluidos secundaria con los puertos de entrada y salida para la conexión de la bomba de jeringa. En la Figura 3A, un dispositivo de microfluidos pre-fabricados comercialmente disponible se muestra con una banda de 1 mm de hidrogel fotopolimerizar través de la anchura del dispositivo 7. la degradación basada en láser se implementó para fabricar canales de microfluidos y redes en hidrogeles alojados utilizando el mismo protocolo descrito aquí por autoportante hidrogeles. Flujo generado bomba de jeringa se puede ver en la Figura 3B, donde un canal cilíndrico de diámetro de 20 micras se fabricó en un hidrogel situado en un dispositivo de microfluidos. En este canal 20-m de diámetro, esferas de poliestireno fluorescentes 2-micras individuales se resuelven fácilmente sin flujo de fluido (Figura 3B1), mientras que cuando se aplica a / s caudal de 5 l, las esferas se mueven a través del campo de visión, como se evidencia por las rayas (Figura 3B2 </ Strong>). Este mismo enfoque se utilizó para inducir el flujo a través de una red 2D, vascular derivados para controlar el flujo de TRITC marcado con, 65 kDa de dextrano a través de la red y la difusión en el hidrogel circundante (Figura 3C).
Figura 3: Flujo-Driven bomba de jeringa en PEGDA hidrogeles polimerizado en carcasas de microfluidos. A, dispositivo disponible comercialmente pre-fabricados de microfluidos (A) con un microcanal 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) alberga un fotopolimerizado 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hidrogel, indicada por el flecha negro. Un canal cilíndrico de diámetro de 20 micras se degradó a través del hidrogel, y esferas de poliestireno-2 micras se bombea a través del dispositivo (B). Las esferas se resuelven claramente y sin flujo de fluido (B1), pero aparecen como rayas a un caudal de 5 mu l / s(B2). En otro hidrogel alojada, una red de origen vascular 2D fue fabricado y marcado con TRITC, 65 kDa dextrano se bombea a través de la red (C). La microscopía de lapso de tiempo se utiliza para controlar el dextrano fluorescente ya que llena los canales y se difunde en el hidrogel circundantes. Las flechas blancas en (B) y (C) indican la dirección del flujo de fluido. La barra de calibración en (C) indica la intensidad del dextrano fluorescente. Las barras de escala representan 20 micras de (B1) y (B2) y 50 micras de (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Crítico en anulando las funciones estándar del software de microscopio para permitir el uso de máscaras virtuales para, la degradación basada en láser guiada por imagen, la macro microscopio debe ser configurado y manipulado con cuidado. ¿Cómo las interfaces de software microscopio con la macro microscopio a veces puede ser contrario a la intuición, y mucho esfuerzo se ha invertido en la determinación de la configuración óptima en ambos programas para desarrollar este método. Se recomienda un conocimiento general de escaneo láser confocal básica uso del microscopio, especialmente con la "Etapa" y "ventanas" Focus para la búsqueda y el posicionamiento del hidrogel en las x, y, z y dimensiones, antes de intentar la degradación basada en el láser correctamente. Además, la fabricación de un canal de entrada es crítica para el protocolo; especies fluorescentes suspendidos deben ser capaces de entrar en los sistemas de microfluidos para obtener imágenes de éxito y la caracterización de la red. Es importante señalar que este protocolo se aplica a una específica lásermicroscopio confocal de barrido configurado con un láser pulsado de femtosegundo específica, con versiones específicas del software de microscopio y la macro microscopio (ver detalles en la Lista de materiales específicos / Equipo). Hemos descubierto que las nuevas versiones de la macro microscopio carecen de la funcionalidad necesaria de control y necesaria para el control de láser guiada por imagen. Mientras que otras plataformas de microscopio y las fuentes de láser de impulsos se pueden utilizar, este protocolo se aplica específicamente a este sistema y necesitará modificación de acuerdo con la plataforma, fuente de láser, y el software implementado. Los principios que subyacen a lo largo de este protocolo se siguen aplicando, sin embargo.
Una modificación potencial de este protocolo consiste en cambiar la composición de hidrogel. Aquí, se utilizó 5% en peso, 3.4 hidrogeles kDa PEGDA, pero la degradación basada en láser (para fines aparte de la generación de la red de microfluidos) ha sido implementado para degradar ambos hidrogeles sintéticos y naturales, incluyendo PEGilado fibrina21,22 fibrinógeno, proteína de seda hidrogeles de 23, 24 y colágeno. El ajuste de la potencia del láser, velocidad de exploración, el espaciamiento entre Z-rebanadas, y el número de repeticiones ayudará a determinar los parámetros óptimos para fabricar redes de microfluidos en otras formulaciones de hidrogel.
Una limitación actual de la técnica es el volumen global de hidrogel que puede ser degradado en una cantidad factible de tiempo. Para crear huecos abiertos o características de microfluidos dentro del hidrogel, el láser el tiempo de permanencia debe ser igual o superior a 8,96 mu s / píxel (o una velocidad de barrido de láser de 0,021 m / microsiemens) cuando se utiliza una fluencia del láser de 37,7 nj / m 2. Con estos ajustes, se tarda 1,4 h para degradar los vasos dentro de un volumen 0.014 mm 3 (como se ve en la Figura 1). El uso de un láser de tiempo de permanencia de 4,48 mu s / píxel o por debajo, la energía suministrada no es suficiente para la completa degradación de la formulación de hidrogel utilizado aquí. La implementación de un hidrogel diferentecomposición podría superar esta limitación. El uso de geles fotolábiles que contienen componentes sensibles a la luz 34-36 o hidrogeles que tienen gran multifotónica secciones transversales 21-24 son buenas opciones que permitan el uso de menos energía y daría lugar a una degradación más rápida. Con respecto a las limitaciones dimensionales, las características se han fabricado hasta 1,5 mm de profundidad en el hidrogel 7. El alcanzable profundidad es una función de la distancia de trabajo del objetivo y se puede aumentar usando objetivos distancia de trabajo ultra-largas optimizados para formación de imágenes in vivo. El canal más pequeño medido 7 creado usando un 20X (NA1.0) objetivo de inmersión en agua tenía una anchura de 3,3 m y la profundidad de 8,9 m, la cual está a la par con el tamaño de los canales más pequeños generados en la Figura 1. Mientras que otros laboratorios han utilizado objetivos inferiores NA 21,23,24, anticipamos que las redes de microfluidos con características más pequeñas se pueden generar utilizando altaer objetivos de NA, a expensas de una distancia de trabajo reducida. En última instancia, sin embargo, la resolución de la técnica es una función de la función de dispersión de punto del haz de láser enfocado, las propiedades de exploración láser, la cantidad de energía suministrada por el láser, y las propiedades de absorción de láser del material que está siendo degradado.
Además, las propiedades de láser (velocidad, fluencia, el espaciamiento entre las máscaras virtuales, y el número de repeticiones) deben optimizarse basándose en las propiedades de hidrogel (densidad de reticulación, / peso macrómero monómero molecular, por ciento en peso, y el tipo de hidrogel: proteína de base sintética vs. ), ya que estos inherentemente alterar las interacciones con el láser y por lo tanto la resolución final del proceso. A medida que la energía entregada también se ve influida por el objetivo utilizado, se requiere una optimización adicional cuando se cambia entre objetivos. Con respecto a los costos involucrados, se requiere el acceso a un microscopio con un láser de impulsos, y mientras muchos objec diferentetantes se pueden utilizar, los que tienen un alto NA y larga distancia de trabajo (para formación de imágenes in vivo) puede ser costoso.
Por encima y más allá del protocolo detallado aquí, las redes de microfluidos generados utilizando esta técnica también se pueden funcionalizar con péptidos de células adhesivo post-canal de fabricación para inducir la adhesión de células endoteliales y la formación del lumen 7. Además, la incorporación de secuencias de péptidos de células degradable en el material a granel 9 antes de canalizar la degradación podría permitir para el estudio de la migración de células en y a través del hidrogel. Para la fluidización continua de la red de microfluidos en el hidrogel, los hidrogeles se pueden fotopolimerizar en dispositivos fluídicos o carcasas más grandes, como se demuestra en las figuras 2 y 3 7.
La generación de redes vasculares a través de auto-ensamblaje de origen vascular o angiogénico 8-12 proporciona un enfoque sencillo para inducir VAscularization lo largo de un volumen relativamente grande de hidrogel. Si bien este enfoque resulta en redes de fluidos perfusable, es difícil de controlar directamente el tamaño, tortuosidad, la densidad, y la arquitectura general de la red. Debido a esta limitación, el perfil de flujo y velocidades de cizallamiento en la vasculatura pueden diferir entre los experimentos. Alternativamente, las técnicas de microfabricación 13-16 permiten el control directo sobre la arquitectura de red, pero a menudo están limitados por su incapacidad para generar canales pequeñas, capilares de tamaño o la fabricación de redes densas que imitan la arquitectura vascular in vivo. Mientras que la técnica de degradación de hidrogel basado en láser descrito aquí ha sido recientemente reutilizados para la generación de microfluidos, simultáneamente supera tanto el control de la arquitectura y limitaciones basadas en el tamaño de los métodos de microfabricación existentes al permitir la creación de 3D redes de microfluidos biomiméticos que recapitular la densidad, tortuosidad, rango de tamaño, y Architectur generale de la vasculatura in vivo. Además, múltiples redes de fluidos pueden ser generados en un solo hidrogel, lo que permite el estudio de transporte inter-red 7. Para aplicaciones de ingeniería de tejidos que se esfuerzan por reproducir más de cerca en los procesos de transporte in vivo in vitro, las redes de microfluidos de hidrogel incrustado altamente resueltos descritos aquí son muy adecuados. Anticipamos que este protocolo será útil en el desarrollo de construcciones de tejido que más de reproducir fielmente el transporte in vivo para su uso como dispositivos de detección de drogas y en modelos in vitro de enfermedades.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
