Abstract
Bu ayrıntılı bir protokol PEGDA hidrojeller gömülü vasküler kaynaklı mikroakışkan ağlar imalatı için görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması uygulanmasını özetliyor. Burada, görüntü kılavuzluğunda lazer kontrolü için izin sanal maskeleri oluşturulmasını açıklar; mikroakışkan ağ imalat ve basınçlı odaklı akışı için uygun bir micromolded PEGDA hidrojel, fotopolimerizasyon; Bir femtosaniye darbeli Ti ile eşleştirilmiş bir piyasada mevcut lazer tarama konfokal mikroskop kurulum ve kullanım: hidrojel bozulmasını teşvik S lazer; ve fabrikasyon mikroakışkan ağların görüntüleme floresan türleri ve konfokal mikroskopi kullanılarak. Bu inceliklerini bir dizi içerir mikroakışkan imalat amaçlı ticari bir mikroskop kullanılarak çok önemli adımlar olarak protokol çok, mikroskop yazılımı ve mikroskop makronun doğru kurulumu ve uygulanması üzerine odaklanmıştır. Bu techniqu görüntü kılavuzluğunda bileşenE böylece yaratıcı mikroakışkan tasarım ve hemen hemen tüm yapılandırma karmaşık mikroakışkan sistemlerin imalatı için izin 3D görüntü yığınlarının veya kullanıcı tarafından oluşturulan 3D modelleri uygulama olanağı sağlar. Doku mühendisliği beklenen etkisiyle, bu protokolde belirtilen yöntemler organa ve insan-on-a-chip cihazlar için gelişmiş biomimetic microtissue yapılarının üretiminde yardımcı olabilir. In vivo damarların karmaşık mimarisi, eğrilik, boyut ve yoğunluk taklit ederek, temel biyolojik taşıma süreçleri ilaç farmakokinetiği ve hastalığın daha doğru in vitro modelleme neden bu yapılarda çoğaltılmış olabilir.
Introduction
lenfatik ve cardiovasculature hem oluşan damar sistemi, form besin ve oksijen taşınması için ve metabolik atıkların uzaklaştırılması için gerekli olan son derece yoğun ağlar. Buna göre, vaskülarize dokularda yaşayan hücreler daha fazla 50-100 mikron uzaklıkta bir teknenin 1 asla. In vitro, in vivo vasküler mimarisini yeniden yeteneği doğru tasarlanmış yapılar kullanılarak in vivo taşıma işlemleri modellemek için çok önemlidir. 3,4 ve hastalık modelleme 5,6 tarama yüksek verimli ilaç organ-on-a-chip cihazlar 2 geliştirmek için yeni bir sürücü ile, yöntem çizim sentetik veya doğal hidrojeller in vivo benzeri ulaşım özetlemek mikroakışkan ağlar oluşturmak için önemli ilgi. Bu cihazlarda kullanılan microtissues bir biyomimikri artırmak için, üç-dimensiona kullanan bir görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması yöntem geliştirdişablon olarak yerli damarların l (3D) görüntü yığınlarının 7 hidrojeller PEGDA gömülü vasküler kaynaklı mikroakışkan ağları oluşturmak için. Bu protokol görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması yoluyla PEGDA hidrojellerin vasküler kaynaklı, biomimetic microfluidic ağlar imal etmek bir femtosaniye darbeli lazer ile donatılmış bir piyasada mevcut lazer tarama konfokal mikroskop kullanımını özetliyor.
Hidrojeller akışkan hale getirilmesi için güncel yaklaşımlar endotelizas- 13-16 için önceden tanımlanmış kanalları oluşturmak için vaskülojenik 8-10 veya anjiyojenik 10-12 endotel hücre kendinden montaj ve mikroüretim teknikleri indüksiyon yer alıyor. Kendi kendini monte ağlar yoğunluğu ve mikrovasküler karmaşık mimarisi özetlemek olsa da, sık sık ilaç tarama uygulamaları için modelleme taşımacılığında sorunlu olabilir, in vivo ağlar 11,17,18, daha geçirgendir. Kendi kendine monte ağlar physiolog oluşmaktadırically ilgili, kılcal boyutlu gemiler, ama onlar yüzünden büyük arteriole boyutlu gemiler üreten sınırlamalara toplu sıvı akışı ile entegre etmek zor olabilir. Bu ağların montajı üzerinde doğrudan kontrolü yoktur gibi, nihai mimari tekrar tekrar aynı sıvı akışı ve ulaşım özelliklerine sahip ağları üretmek güçleştirir, numuneden numuneye değişebilir.
3D, tekrarlanabilir geometri ve iyi tanımlanmış bir mimariye sahip hidrojel gömülü mikroakışkan ağları oluşturmak için, mikroüretim bir takım teknikler modüler montaj 13, kurbanlık malzemeler 16, doğrudan yazma montaj 14 ve çok yönlü baskı 15 3D baskı da dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Bu yöntemler, mikroakışkan mimari ve bundan dolayı, sıvı akışı ve iletim özellikleri uygulama, arka arkaya bir çok yapılar arasında imal edilebilir. Bu yaklaşımların önemli bir sınırlama, ancak, mikro fiber oluşturmak için yetersizlikkılcal boyutlu özellikler luidic ağlar, 4 10 um ile 19. En çok imalat teknikleri, genellikle çapı 13,16 150 650 | im arasında değişen özelliklere sınırlıdır. Bazı mevcut teknikler doğrudan yazma montaj 14 10 mikron 300, geniş çaplı aralığında kanalları ile hiyerarşik ağlar üretme yeteneğine sahiptir ve çok yönlü baskı 15 18-600 mikron, ancak yoğun ağlar veya oluşturmak için kendi yeteneği sınırlıdır tek bir yapı 7 içinde yakın birden mikroakışkan ağları üretmek.
Bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için, biz biomimetic tekrarlanabilir üretim, in vivo mikrovasküler mimarisini özetlemek hiyerarşik mikroakışkan ağlar sağlayan bir görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması tekniği geliştirdi. Yani bir 790 nm, 140 femtosaniye (fs) 80 MHz'de çalışan darbeli lazer yapmak raster taranan iin vivo damarların görüntüleri ile tanımlanan n, bir hidrojel içinde 3D yerleri arzu. Bu su 20 genişlerken bozunma proses suyu lazer endüklenmiş bir ışıksal bozulma, elde edilen plazma oluşumu, su daha sonra hızlı bir termoelastik genişleme ve hidrojel yerel olarak bozulmasına aracılığıyla çalışır speküle. Bu mekanizma protein bazlı hidrojellerin 21-24 lazer tabanlı bozulması biraz değişir. Düşük multiphoton enine kesite sahiptir PEGDA farklı olarak, proteinler, genellikle büyük multiphoton kesite sahiptir ve bu yüzden, bir multiphoton emilimi ile indüklenen kimyasal kırılma 23 yoluyla degradasyona uğrar. Görüntü kılavuzluğunda mikroakışkan ağları oluşturmak için, lazer deklanşör mikroakışkan mimarisini tanımlayan ilgi 9 bölgelerin bir mozaik oluşur görüntü türetilmiş sanal maskeleri, tarafından kontrol edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, 3D vasküler kaynaklı biomimetic mikroakışkanlar imal yeteneğini göstermiştiramacıyla, in vivo damarların yoğun ve dolambaçlı mimarisi özetlemek ic ağlar, yerel bozulması sırasında verilen enerji miktarını değiştirerek hidrojellerin gözenekliliğini kontrol eder. Biz de yakın (15 mikron) iç içe geçmiş ancak doğrudan 7 bağlamak asla iki bağımsız mikroakışkan ağları oluşturmak mümkün olmuştur. Ayrıca, arginin-glisin-aspartik asit-serin (RGDS), endotelyal hücre yapışma ve lümen oluşumu 7 teşvik etmek için, integrini bağlanması peptid dizisi ile sonrası bozunma işlevsellik üzerinden lazer bozulmuş mikrokanallar endoteliyalize yeteneğini göstermiştir.
Bu protokol ile, PEGDA hidrojeller karmaşık mikroakışkan ağların nesil birçok üniversite kampüslerinde erişilebilir piyasada bulunan bir mikroskop kullanılarak görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması ile mümkün olmaktadır. bozulma süreci, dijital, sanal maskeleri tarafından yönlendirilir gibi, bu fabricayon tekniği geniş bir uygulama çeşitli kullanımına izin veren, mikroakışkan ağların reklam dizaynı uygun. Biz burada anlatılan yöntem modelleme ilaç taşıma 2 önemli biyolojik taşıma süreçleri kopyalayan yeteneğine biomimetic organa ve insan-on-a-chip cihazları tasarlama en avantajlı olacağını tahmin ediyoruz. Bu imalat tekniği, kanser metastazı, 5,6 ve kan-beyin bariyeri modelleri 25 de dahil olmak üzere, in vitro bir hastalık modellerinin oluşturulması için ilgi çekici olabilir. Lazer tabanlı hidrojel bozulması önceden nöronal gelişim 21-23 rehberliği için parça oluşturmak için kullanılan edildiği gibi, bu tekniğin görüntü kılavuzluğunda uzatma kullanıcı tanımlı 3D uzamsal düzenlemeler hücreleri konumlandırmak için gelişmiş doku mühendisliği stratejileri faydalı olabilir.
Protocol
1. Sanal Maskeler oluşturma
NOT: fare beyin mikrovasküler bir 3D görüntü yığını, bu protokol için mikroakışkan model olarak seçildi tüm fare beyin mikrovasküler görüntüler içeren çok daha büyük bir veri kümesi itlaf edilmiş olan. Mikrovasküler görüntüler bıçak kenarlı tarama mikroskobu (KESM) 26, 2 vasıtasıyla elde edildi; benzer mikrovasküler veriler KESM Fare Beyin Atlas 28 ile açıkça mevcuttur.
- (Z tarafından y x) 450 mm x 450 mm x 1,5 mm sığar, görüntü işleme yazılımı 29 açın ve açık ve istenen mikroakışkan ağ, hidrojel içinde elde edilecek, böylece yerli damarsal 3D TIF resim yığını kırpmak penceresi. Bunu yapmak için, istenilen bölgenin etrafında bir kare çizmek ve "Görüntü" → "Kırp" seçeneğine tıklayın. istenen dilim "Görüntü" → "Çoğalt" ve türünü tıklayarak z-doğrultusunda dilimleri Kaldıraralık.
NOT: Bu istenen özellikleri görüş alanı içinde (y x) (uygun olmasını sağlar 531,2 x 531,2 mm 2.884 x 2.884 piksel çerçeve boyutu ve 0.8 zoom ile 20X (NA1.0) suya daldırma objektif kullanarak 20X (NA1.0) suya daldırma hedefi bir lazer tarama konfokal mikroskop) ve çalışma mesafesi (z) ile. Bilinmeyen ise, diğer sistemler için görüş alanı istenilen amaca ve ayarları ile bir görüntü elde belirlenebilir. - özellikler öncelikle "Görüntü" → tıklayarak, raster tarama yönünde, ya da x-yönü ile aynı hizaya gelecek şekilde görüntü yığını Döndür → "Döndür" "Transform". Bu üretim için gerekli süreyi azaltır.
- piksel boyutu maçları ya da konfokal mikroskop bozulması için kullanılan ayarları (0.184 mm / piksel 2.884 piksel 2.884 bir çerçeve boyutu ile 20X (NA1.0) suya daldırma objektif kullanarak aşıyor ki kırpılan görüntü yığını Scaleve 0.8 zoom). Bunu yapmak için, "Görüntü" tıklayın → → "Boyut" "ayarla" ve "Genişlik" (yani, 450 mikron ya da 0.184 mm / piksel bölü görüntünün boyutu) için "2446" yazın.
- Eşik / "Ctrl + Shift + T" yazarak Görüntü yığını binarize. "Karanlık Arka Plan" seçeneğinin işaretini kaldırın ve → "Tamam" "uygulamak" butonuna tıklayınız. "Resim" → "Arama Tablolar" → "Invert LUT" tıklayarak işlemi tamamlayın.
- Özel bir algoritma kullanarak x (raster tarama yönüne paralel çiftlendirildi (beyaz) uygun tek piksel yüksek dörtgensel bir mozaik ile özellikleri, programlama yazılımı 9 (kaynak kodu başvurulan yazının ek malzemenin kullanılabilir) doğrultusu) <ilgi alanları lazer konumu ve deklanşöre 9, 7, 30, 31 rehber (ROI) oluşturmak içinsup> 32.
NOT: Özel algoritması 9, HBS dosyasına TIF resim yığını her uçağı dönüştürür. - bozunma sırasında kullanılmak üzere .OVL için HBS dosyalarının dosya uzantısını değiştirin.
2. Lazer tarama konfokal Mikroskop Yapılandırma
NOT: Darbeli lazer ile donatılmış diğer lazer tarama mikroskobu kullanılabilmesine rağmen, ayarları ve protokol burada kendi yazılımı ile birlikte bir lazer tarama mikroskobu (EKK) kullanımını açıklar.
- lazer tarama konfokal mikroskop ile, mikroskop yazılımı açın ve tıklayın "Başlat Sistemi." "Korumak" sekmesinde hedefi "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" seçeneğini seçin.
- "Hidrojel Görselleştirme" Yapılandırma Ayarı
- "Toplama" sekmesinde, ve üzerinde "Lazer" windo lazer hattı (514 nm argon lazer) seçili olduğundan emin olunw. Not: Bu kanal yönlendirme amaçlı 7 görüntüye eozin Y floresan yoluyla hidrojel kullanılır.
- "Görüntüleme Setup" penceresinde, "Mode" için "Kanal Modu", ayarlamak için "Frame" "Anahtarı her parça" ve "Track1" seçeneğini ayarlayın.
- "Işık Yolu" penceresinde, 516 nm 735 bir dizi ile, sadece Ch1 floresan dedektörü seçin; Bir ana ışın ayırıcı (MBS) görünür ışık hattında 458/514 filtre; ve görünmez ışık doğrultusunda bir tabak. parlak alan photomultiplier tüp dedektörü, "T-PMT" kaldırın.
- "Toplama Modu" penceresinde, "1", "Hat Adım" "Tarama Modu" için "Frame", "Çerçeve boyutu" için "2884" X ve Y, doğru hedef seçildiğini kontrol edin ve ayarlayın "Averaging Sayı" "1", "Averaging Modu" "Çizgi", "Averaging Yöntemi" "," Mean "için içinBit Derinliği "için" 16 Bit "ve" Yön "için" - çift yönlü tarama için "<>.
- "Toplama Modu" penceresinde, istenen ve "Corr X" ve "Y" için "0,05" ya da belirli mikroskop kullanılmak üzere gerektiği şekilde ayarlayın belirtilen "Speed" olarak ayarlayın. "HDR" seçeneğinin işaretini kaldırın.
- "Toplama Modu" penceresinde, "Tarama Alanı" set "zoom" ile "531,2 mm x 531,2 um" bir "Resim Boyutu" ve "0.18" bir "Piksel Boyutu", görüntüler sağlamak için "0.8" ; sıfıra diğer bütün "Tarama Alanı" değerleri ayarlayın.
- "Kanallar" penceresinde, Ch1 floresan dedektörü olarak "Track1" i seçin. "800" nin "10.0" bir yüzde gücüyle seçiniz lazer çizgisi "514", "1AU" bir "Pinhole", bir ilk "Kazanç (Master)", "0" nin "Dijital Ofset" ve "Dijital Kazanç" nin4; 1 ".
NOT: Belirli mikroskop için gerekli bu ayarları kullanılıyor. - "Hidrojel Görselleştirme" olarak bu yapılandırmayı kaydedin.
- "Kanal Oluşumu" Yapılandırma Ayarı
- "Lazer" penceresinde seçili olduğundan ve: "Toplama" sekmesinde, lazer çizgisi (S lazer Ti atımlı 790 nm 140 fs) emin olun. 790 nm maksimum güç çıkışı için "4000" için "GDD Düzeltme" olarak ayarlayın.
- Adım 2.2.2 de belirtildiği gibi "Görüntüleme Setup" penceresi ayarlayın.
- "Işık Yolu" penceresinde, hiçbir floresan dedektörleri görünür ışık hattı üzerinde MBS 458/514/561/633 filtre ve 760+ filtre görünmez ışık hattı üzerinde bir MBS ile seçili olduğundan emin olun. parlak alan photomultiplier tüp dedektörü, "T-PMT" kaldırın.
- "Toplama Modu" penceresinde, doğru hedef listede olup olmadığını kontrol edin. 3 "için" Hız "Set"Ve adım 2.2.4 de belirtildiği gibi tüm diğer ayarlar.
- "Kanallar" penceresinde, T-PMT dedektörü olarak "Track1" i seçin. Bir "0" "Dijital Ofset", "800" nin "100,0" bir yüzde gücü, bir başlangıç "Kazanç (Master)" ile, lazer çizgisini "790" seçin ve "1" "Dijital Kazanç" .
- "Sahne" penceresinde, "sıfır set" tıklayarak sahne sıfır. "Mark" tıklayarak yeri işaretlemek. Bu adım 3'te mikroskop makro sanal maskeler yüklemek için kritik öneme sahiptir.
- "Zaman Serisi" penceresinde, "0" olarak "1" ve "Aralık" olarak "Cycles" olarak ayarlayın.
- "Bleach" penceresinde, kutu "# taramaları sonra Başlat Bleaching" kontrol ve "0 1" değerine ayarlayın. (8.96 us / piksel piksel bekleme süresi tekabül eden) "3" bir değere sahip, "Farklı tarama hızı" i seçin. "Güvenli bl seçinGaasp her ".
- "Bleach" Pencerenin lazer çizgisi bölümünde, "100.0" yüzde gücü 790 lazer satırı seçin ve ayarlayın. seçilmemiş ağartıcı penceresindeki tüm diğer kutuları bırakın. "Bleach" penceresinde çamaşır suyu ayarları kaydedin.
- "Kanal Formasyonu" olarak bu yapılandırmayı kaydedin.
NOT: "Z-Stack", "Bölgeler", "Focus" ve "Sahne" pencereler de bu protokol için önemli olan, ancak ilk yapılandırma sırasında ayarlamak veya ayarlanması gerekmez.
3. Bir Reçete Oluşturma ve Mikroskop Yazılım ve makro Sanal maskeler yükleme
- "Kanal Oluşumu" yapılandırmada hala çalışıyor lazer tarama konfokal mikroskop ve halen mikroskop yazılımı seçin (bir sonraki "Deneme Başlat" düğmesine) Sadece "Bölgeler" penceresi ile.
- maskeler doğru mikroskop makro için yük sağlamak içinly, "Acquisition Modu" penceresine "8" in "Kanallar" penceresine "0,2" ve "Hız" yüzde gücünü ayarlamak ve ekranın sol üst köşesinde "Yapış" tıklayın.
- Görüntünün "Bilgi" sekmesinde, "0.18" bir piksel boyutuna sahip, görüntü boyutu "531,2 mm x 531,2 mm" hala olup olmadığını kontrol edin. Bu değerler doğru değilse, yine "Çerçeve boyutu" ve "Zoom" değerleri kontrol edin.
- KRİTİK: "Sahne" penceresinde X ve Y konumları Sıfırlı olduğunu ve pozisyon mikroskop makro açmadan önce işaretli olup olmadığını kontrol edin. 2.3.6 adıma bakın.
- mikroskop makro yazın "Alt + F8" açmak için "Load" tıklayın ve doğru sürümü seçin. Belirli Malzemeleri / Ekipman Listesi ayrıntılara bakın. alt makrolar uzun bir liste "Makro Denetim" penceresi açılacaktır.
- "Makro Denetim" penceresinde MICR açmak için "Çalıştır" a tıklayınMakro Oscope ve sonra "Makro Denetim" penceresini kapatın.
NOT: mikroskop makro alternatif versiyonları bu protokolü kullanarak lazer tabanlı hidrojel bozulması ile uyumlu olmayabilir. - mikroskop makro "Tasarruf" sekmesinde, "Tek Dosya Output" seçeneğini, keyfi bir "Temel Dosya Adı" sağlamak ve "Geçici Dosya" klasörünü seçti. , Konumu "1" "Open Temp Klasörü" Set "Tek Geçici Görüntü Klasör" seçin ve seçilen "Geri Çağırma Mekanlar Listesi" ile "Mağaza / tarifi uygula" in tarifi adlandırın. Başlangıçta tarifi oluşturmak için "Mağaza" tıklayın.
- mikroskop makro "Toplama" sekmesinde, "Tarama Yapılandırma" Adım 2.3 ayarlanan mikroskop yazılım yapılandırması verilen adı ile eşleştiğini emin olun. "0" bir "Aralığı" ile "1" "Blok içinde Yakın Zamanda Noktalar" olarak ayarlayın. Bu "İşaretli Z sağlamak - Z Stac Başı"Yeşil renkli olarak vurgulanır k. Tüm diğer varsayılan ayarlar oldukları gibi gayet iyi.
- mikroskop makro "Zamanlama" sekmesinde, "Gecikme bekle" emin olun, yeşil vurgulanan "1" ve "0" "Sadece İlk Konumda Blok önce Aralığı bekleyin" için "Deneme Tekrarlari" ve "Grup Tekrarlari" ayarlanır . Diğer tüm varsayılan ayarları oldukları gibi gayet iyi.
NOT: "Grup Tekrarlari" (ve "Deney Tekrarlar") biri bölgede kez lazer taramaları sayısını ayarlayabilirsiniz nerede kutu (yani, tarifi tekrarlar). - mikroskop makro "Z Listesi" sekmesinde, z-yönünde bozulma uçakları belirtilmiştir. kullanılacak sanal maskelerinin sayısını eşleşecek şekilde ayarlayın "Pozisyonlar sayısı" z-aralık, "DZ", "1 mikron", ayarlayın.
- "Açılır görünen Li" Z Listesi "yapmak için" Z Stack oluştur "düğmesine tıklayınPencerenin altına doğru yerler "st. konumları ve Z-aralığı sayısı doğru olup olmadığını kontrol edin ve X ve Y konumları sıfırlanır söyledi.
NOT: Eğer değillerse, tarifi tutmayın; mikroskop makro kapatın ve mikroskop makro re-opening ve tekrar tarifi kurmadan önce adımı 2.3.6 tekrarlayın.
Not: 1 yerine um her biri tarafından aralanmış 100 maske yerine, örneğin, her bir mikroskop makro için ayrı ayrı maskeleri yükleme gibi, eşdeğer bir mikroakışkan yapı elde etmek için, 1 mikron ile iki kez kullanılabilir ve aralıklı, 50 maske sahip olmak avantajlı olabilir, can zaman alıcı olabilir. - mikroskop makro "Bleach" sekmesinde, maskeler tüm yüklenmiş olmalıdır ve "yerler listesi" belli bir numaralı konuma sahip eşleşti. Başlamak için, "Bleach" kutusunu işaretleyin ve emin olun "Yapılandırma." Ana mikroskop yazılım ekranında "Bleach" penceresinde ağartıcı ayarları adı (2. adıma bakınız maçları.3.8). seçimini, "0" "Bleach sonra Gecikme bekleyin" Set "nokta" ve "ROI" boş bırakın.
- "Yer" bir şey değiştirmez, "Çini", "Izgara", "Otofokus", "Bloklar" ve varsayılan ayarları "Seçenekler" sekmeleri.
- mikroskop makro için maske yüklemek için, mikroskop yazılımı sadece "Bölgeler" pencereyi seçin ve mikroskop makro "Bleach" sekmesini açın. "Bölgeler" penceresinde, "Load" linkine tıklayın ve bozulmuş olan z-yığının altında maskesi için .OVL dosyasını seçin.
NOT: "Z listesinde" ilk konum z yığının alt ve mikroskop makro z yığın ya da hidrojel üstüne yolunda çalışır. - ROI listesi "Bölgeler" penceresinde göründüğünde, (resim adım 3.2 tersledi üzerine) görüş alanı içinde maske İB'leri görüntülemek için ok düğmesini tıklatın. ROI sığacak emin olunGörüş alanı.
- Daha sonra, mikroskop makro yüklü maske kaydetmek "Bleach" sekmesine "ROI Listesine Güncel Bölge Ekle" kutusuna maskeye bir ad ve numara vermek ve için "ROI Listesine Güncel Bölge Ekle" düğmesine tıklayın. isim ve numara (diğer önceden oluşturulan tarifleri maskeler dahil) başka maskelerle "ROI" açılır listesinde görünecektir. mikroskop yazılımı "Bölgeler" penceresinde maskeyi silin.
- Tekrarlayın mikroskop makro için tüm maskeleri yüklemek ve kaydetmek için 3.14 ve 3.16 adımları.
- her Z-yere yüklenen maskeleri atamak için, açılır "yerler listesi" konumda 1. vurgulayın. "ROI" açılır listesinden uygun ROI seçin. "Bleach" kutu mikroskop makroda "Bleach" sekmesinin üst kısmında seçili olduğundan emin olun.
- Daha sonra tekrarlayın "yerler listesi" açılan tüm pozisyonlar için adım 3.18 ve & üzerinde "Mağaza" tıklayın# 34; Tasarrufu "sekmesi son haliyle tarifi kaydetmek için.
4. PEGDA Hidrojel polimerizasyonu
- Yapımı Steril HEPES Tamponlu Salin Triethanolamin ile (HBA) (TEOA)
- 1 L'lik bir beher içinde, sodyum klorür 2.922 g, HEPES 1.196 g ve davlumbaz TEOA 7.5 mL ilave edin, bir karıştırma çubuğu ile 500 ml DI H2O ekleyin.
- Pasteur pipeti ile damla damla eklenerek 1 N sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 8.3'e ayarlayın.
- Steril filtre 500 mL'lik otoklavlanmış cam ortam şişeye 0.2 mikron vakum filtreleme kap aracılığıyla çözüm. 4 ° C'de kısım ve mağaza.
- altından bir 20-mm delik kesim ile özel 60 mm Petri kabı desteğiyle çift taraflı yapışkan bir halkasını takın. Yapışkan halka üzerinde destek bırakarak, Petri kabı ve yapıştırıcı arasında herhangi bir hava kabarcığı dışarı basın.
- malzemeleri hazırlayın. Sentezlenen 33 3 getirin.4 kDa PEGDA -80 ° C derin dondurucuda dışarı ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. hidrojeller polimerizasyonu önce beyaz ışık kaynağına en az 15 dakika çevirin.
- Bir duman başlığı içinde, (Y, eosin foto-başlatıcı ışık maruz kalmasını önlemek için kullanılan), bir folyo kaplı, 2 mL'lik bir kehribar santrifüj tüpüne TEOA olan HBS'de 1 ml. DI H 2 O Y disodyum tuzu eozin 1 mM 10 uL ekleyin
- Bir çeker ocak içinde, bir Pasteur pipeti ile bir cam behere 1-vinil-2-pirolidinon (NVP) küçük bir hacim elde. Bu birimdeki, pipet 3.5 NVP uL HBS, TEOA ile kehribar santrifüj tüpüne ve eosin Y. içine
- ikinci bir folyo kaplı, 2 mL'lik bir kehribar santrifüj tüpünde 3.4kDa PEGDA 10 mg, ekleme (ön-polimer çözeltisi hatalı foto-aktifleşmesini önlemek için kullanılır). Y, / V PEGDA pre-polimer çözeltisi% 5 w NVP çözeltisi, eosin HBS, TEOA 0.2 mL ekleyin. PEGDA kadar vorteksleyin tamamen çözülür. Bir güç ölçer ve dedektör değnek kullanarak, beyaz li yoğunluğunu ayarlayın95 mW GHT kaynağı.
- Bir poli (dimetilsiloksan) yapı (PDMS) Kalıp
- Kullanım kolaylığı için daha büyük bir yüzeye (cam, polistiren doku kültürü çanak) bir PDMS kalıp 7 oluşturmak ve kalıplı hidrojeller 20 mm çaplı daire içinde sığacak kalıplar gibi monte edin.
- 500 um kalınlığında bir dikdörtgen şekilli hidrojel oluşturmak için, iki tanımlı hidrojel kenarları oluşturmak için bir PDMS yüzeyi üzerine iki adet 500 mikron kalınlığında PDMS aralayıcılar yerleştirin.
- sıvıları tanıtmak için yararlı hidrojel, yüzeyinde 300 mikron-derin kuyu vermek için 300 mikron PDMS ayırıcı ekleyin.
- PEGDA pre-polimer çözeltisi / hacim PDMS kalıp üzerine% 5 Pipet 60 uL. pipetleme sırasında herhangi bir kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
- Merkezi ve [propil 3- (metakriloyloksil)] trimetoksısılandır (TMPSA) bir koyun çözümün üstünde 7, 40 mm çap, # 1.5 cam lamel fonksiyonlaşmış. coversl emin olunip 500 mikron PDMS aralama dayanmaktadır. hidrojel metakrile lamel bağ ve çözelti içinde yüzen hidrojel önleyecektir.
- PDMS, PEGDA pre-polimer solüsyonu yerleştirilir ve 3 dakika boyunca beyaz bir ışık kaynağı altında montaj lamel.
- Akış DI H 2 kalıp ve PDMS gelen hidrojel ayırmak için lamel arasındaki O. Laboratuar dokusu ile lamel kenarlarını kurutun DI H 2 O. ile hidrojel durulayın. hidrojel gelen dokunma veya fitil su için dikkatli olun.
- yapıştırıcıdan desteğini çıkardıktan sonra, hazırlanan Petri kabı lamel yapışır ve nazikçe yapıştırıcı ve cam arasında hava kabarcıkları. DI H 2 O. ile Petri kabındaki hidrojel Batmak
NOT: azot ile kurutulur DI H2O, ile durulanır, ve tozdan muhafaza edilmesi durumunda PDMS kalıp ek hidrojeller yapmak için yeniden kullanılabilir.
5. İmal Vasküler türetilmiş mikroakışkan ağLazer tabanlı Bozulması yoluyla s
- lazer tarama konfokal mikroskop ve mikroskop yazılımı ile "Bakım" sekmesinde hedefi "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" seçeneğini seçin. üzerinde ve ısındı: "Toplama" sekmesinde, gerekli lazer çizgileri (S lazer 514 nm argon lazer ve Ti atımlı 790 nm 140 fs) emin olun.
- Hidrojel ayarlama bir giriş kanal oluşturmak üzere
- sahne uç üzerindeki hidrojel ve Petri kabı oturtun ve mikroskop sahnede sahne insert yerleştirin. DI H 2 O. içine suya daldırma hedefi indirmeden önce en az 5 ml DI H 2 O Merkezi gözle hidrojel ve iyi özellikleri Petri kabı dolduracak
NOT: nesnel-dokunma asla iki ile hidrojel ezmeyin! - hidrojel bulmak için, adım 2.2 "Hidrojel Görselleştirme" yapılandırmasına geçin. lazer çizgisini açmak ve inci getirmek için "Canlı" tıklayınE hidrojel üst (Ch1 floresan dedektörü tarafından tespit) eozin Y sinyaline kadar hidrojel objektif yakın görülebilir.
NOT: kolayca hidrojel bulmak için, yüzde gücü artırılabilir veya iğne deliği açılabilir. Amaç hidrojel odaklanmış sonra, ancak, floresan dedektör korumak ve dedektörün doyma önlemek ve doğru bir hidrojel yüzeyini bulmak için geri 1AU için iğne deliği azaltmak için yüzde gücünü bırakın. - "Aşama" penceresinde, hidrojelin ve de alt kısmının üst ve alt konumlar işaretleyin.
NOT: Burada z değerleri hidrojel kalınlığı ve iyi derinliğini belirlemede yardımcı olacaktır. - Bir kuyunun kenarına bulmak için X ve Y taşımak için joystick'i kullanın. Tam tersi solda kuyuda ile, ekranın sağ tarafında hidrojel yerleştirin veya. hidrojel görüş alanının en fazla üçte ikisini dolduracak izin verin.
- pl Bırakodak aşağı 150 mikron "Focus" penceresinde için "150" "Adım Boyut" ayarı ve "Z-Position" kutusunun yanındaki aşağı oka tıklayarak hidrojel içine bir ane. Adımı tekrarlayın 5.2.4 gerekirse.
Not: girişinin X, Y ve Z konumu yalnızca sanal maskeleri tasarımına bağlıdır. - KRİTİK: Sıfır "Sahne" penceresinde X ve Y konumu, diğer tüm işaretli yerleri silmek, ve sadece bu yeri işaretlemek.
NOT: Bu adım gerçekleştirilmez ise, mikroskop makro düzgün önceden kaydedilmiş tarifi yerleri geri vermez ve hidrojel istenen konuma bozulmuş olmaz.
- sahne uç üzerindeki hidrojel ve Petri kabı oturtun ve mikroskop sahnede sahne insert yerleştirin. DI H 2 O. içine suya daldırma hedefi indirmeden önce en az 5 ml DI H 2 O Merkezi gözle hidrojel ve iyi özellikleri Petri kabı dolduracak
- Bir giriş kanalı oluşturan
- "Yakala" bir görüntü ve "Bölgeler" penceresinde dikdörtgen düğmesini kullanarak damar ağına giriş olacak dikdörtgen bir bölge çizin.
NOT: Bölgenin emin olun kısmı inci emin olmak için kuyuya dışarı uzanıre giriş damar ağına iyi bağlanacaktır. - Sonraki "Bölgeler" penceresinde oluşturulan YG, "Toplama" seçin ve "Bleach" ve "Analiz" işaretini kaldırın.
- "Bölgeler" seçimini, "Hidrojel Görselleştirme" yapılandırmayı kaydedin ve adım 2.3 kurmak "Kanal Oluşumu" konfigürasyonunda, değiştirin. "Kanal Oluşumu" konfigürasyonunda, "Bölgeler" tekrar seçin.
NOT: "Hidrojel Görselleştirme" ve "Kanal Oluşumu" yapılandırmaları arasında geçiş yaparken, ekranın sol üst köşesinde bölgeleri seçimini emin olun. Bu yapılmaz ise bazen bölgelerin ölçeklendirme konfigürasyonları arasında beklenmedik değiştirebilir. - "Kanal Oluşumu" konfigürasyonunda, sadece "Bölgeler" ve "Z-Stack" seçili olduğundan emin olun. "Z-Stack" penceresinde, ardından üst ve "Merkezi" popo kısmındaki "Merkezi" butonuna tıklayınYukarıdaki geçerli Z-pozisyon olarak z-yığınının merkezini ayarlamak için "Offset". giriş olması gerekir ne kadar büyük bağlı olarak, "1" bir "Aralığı" ile "Dilimleri" sayısını ayarlayın. Z-yığını büyüklüğü "Range" altında görüntülenir.
- "Toplama Modu" penceresinde "Hız" "3" ve "Kanallar" penceresindeki "Yüzde Güç" "100" olarak ayarlanmış olduğundan emin ayarlanmış olduğundan emin olun. yapılandırmayı kaydedin ve "Deneme Başlat" düğmesini tıklayın.
NOT: bir giriş kanalı oluşturmak için burada gerçekleştirilen şekilde mikroskop makro, çoklu düzlemlerde aynı basit şekli aşağılayıcı için gerekli değildir. her düzlemde farklı bölgeleri aşağılayıcı makro sadece gereklidir ve bunun bir reçete içinde sanal maskeleri depolamak için kullanılır. - bozunma sırasında hidrojel görselleştirmek, ya "Kanallar" penceresindeki "Kazanç (Master of)" artırmak için ise t bölgesiGörüş o alan siyah ya da bölge beyaz ise "Kazanç (Master of)" azaltın.
Not: Kabarcık oluşumu burada lazer kaynaklı hidrojel bozulmasının bir göstergesidir. - , Giriş yerine sadece bir kez birden fazla kez aşağılamak "Zaman Serileri" penceresinde "Cycles" ayarlamak için.
- "Hidrojel Görselleştirme" konfigürasyonunda, giriş kuruldu emin olmak için "canlı" düğmesine tıklayın.
- "Yakala" bir görüntü ve "Bölgeler" penceresinde dikdörtgen düğmesini kullanarak damar ağına giriş olacak dikdörtgen bir bölge çizin.
- Hidrojel Kurma mikroakışkan Ağ oluşturmak için
- "Bölgeler" penceresinde, sanal maskeleri z-stack'teki .OVL dosyasını yüklemek ve görüş alanında İB'leri görmek için ok düğmesini tıklatın.
- "Hidrojel Görselleştirme" yapılandırmayı tarama yaşamak ve giriş damar ağı içinde doğru konuma bağlayan şekilde X ve Y, içinde hidrojel konumlandırmak için joystick veya "Sahne" penceresini kullanmak için "Canlı" tıklayın.
NOT: emin olunSanal maske ROI önceden oluşturulan girişi ile hafifçe üst üste. - "Focus" penceresinde "Adım Boyutu" seçeneğini kullanarak ve "Z-Position yanındaki aşağı oku tıklayarak, aşağı odak düzlemini önceki merkezli Z-yerden 50 mikron ya da hidrojel yüzeyinden 200 mikron Bırak "kutu. Bu mikroskop makro ilk pozisyon olacaktır.
NOT: Gerçek mesafe z-yönünde hareket etmek için ağ tasarımı bağlıdır. İstenilen ağ z-yönünde hidrojel üst veya alt yüzeye taşmadığından emin olun. - KRİTİK: "Sahne" penceresinde X ve Y yerleri Sıfır, diğer tüm işaretli yerleri silmek, ve sadece bu yeri işaretlemek.
NOT: Bu mikroskop makro başlangıç noktası olacaktır. Reçete hidrojel yüzeyine doğru geri yolunda çalışacaktır. - "Yakala" "Hidrojel Görselleştirme" konfigürasyonunda bir görüntü, silmek ve deselect "Bölgeler" ve yapılandırmayı kaydetmek.
- Mikroakışkan Ağ oluşturuluyor
- "Kanal Formasyonu" yapılandırmasına değiştirin ve sadece "Zaman Serileri" ve "Bleaching" pencereleri seçin. onlar başlangıçta adımlar 2.3.7 ve 2.3.8 ayarlanmış gibi "Zaman Serisi" ve "Beyazlatma" pencere ayarları olduğundan emin olun.
- "8" için "Acquisition Modu" penceresindeki "Hız" ve "Kanallar" penceresindeki lazer çizgisine "0,2" yüzde gücünü ayarlayın. yapılandırmayı kaydedin.
- Adım 3.5 Aşağıdaki mikroskop makro açın. makro "Tasarruf" sekmesinde, 3. adımda daha önce yapılmış tarifi seçin ve "Uygula" butonuna tıklayınız.
NOT: "Mağaza" tıklamayın ya da reçete yazılır! - tüm sekmelerde ayarlarını kontrol edin ve sanal maskeler (.OVL dosyaları) hala doğru t ile ilişkili olduğunu doğrulamakO açılır listeden Z-yerleri. Ayrıca ilk Z-konum mikroskop yazılımı "Sahne" penceresinde belirgin bir konuma uyup uymadığını kontrol.
NOT: mikroskop makro hidrojel altından kendi yolunu bulmak gibi Sezgilere açılır listesinde ikinci konum (yakın (en uzak hedeften) hidrojel üstüne, ilk konuma yukarıda fiziksel olacak amaç). - Yine "Kanal Oluşumu" yapılandırmayı kaydedin ve sonra mikroskop makro "Update" i tıklayın. Click "Hayır" tarifi başlamak için mikroskop makroda "Başlat" ve ardından "? Bulunduğu Yer listesi üzerine yaz", ve.
6. mikroakışkan Ağ görselleştirme
- hidrojel ve yıkımı sonrasında oluşan mikroakışkan ağını görüntülemek için, mikroskop makro kapatın. eozin Y si görüntülemek için "Hidrojel Görselleştirme" konfigürasyonuna geçmekhidrojelin gnal; Bozulmuş ağ karanlık görünür.
NOT: mikroskop Makro çalışırken hidrojel bozulması görüntülenmiştir edilemez. - Özellikle mikroakışkan ağını görüntülemek için, hidrojel yerli eozin Y sinyali daha parlak bir sinyal var tanıtıldı floresein (FITC) -etiketli dekstran, bir görüntüleme sağlamak için daha düşük bir lazer güçte "Hidrojel Görselleştirme" yapılandırmayı kullanın.
- floresan etiketli dekstran tanıtan önce, laboratuvar dokusu kullanılarak hidrojel kuyudan su fitil. 5 mg, 10 uL pipetle / ml 2,000 kDa H2 DI dekstran FITC işaretli O (0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilerek önceden süzüldü).
NOT: Herhangi bir dekstran kullanın jel içine yayılmasını önlemek için 2000 kDa veya daha büyük ölçekli. Görüntüleme daha uzun, 30 dakika için, FITC-işaretli dekstran çözeltiden hidrojel kurutma ve su buharlaşmasını önlemek için% 60 nem (veya daha yüksek) olan bir kuluçkalanmıştır sahne kullanın. - hidrojel a kaldırnd aşamasından Petri kabı ve daha sonra deney sırasında oluşan damar ağının kolay yerini etkinleştirmek için Petri kabı işaretleyin.
Representative Results
3D, vasküler kaynaklı mikroakışkan ağını oluşturmak için görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı hidrojel bozulması uygulanmasını göstermek için, bıçak kenarlı tarama mikroskobu (KESM) 26, 27 üzerinden satın alınmıştır fare beynin damarsal bir 3D görüntü yığını kullanılan . Yukarıda açıklandığı gibi büyük mikrovasküler veri kümesi A seçilmiş 3D bölgesi, görüntü kılavuzluğunda mikroakışkan ağ oluşumu için sanal maskeleri bir dizi haline getirilmiştir. imalattan sonra elde edilen mikro-akışkan ağ FITC işaretli, 2.000 kDa dekstran çözeltisi ile perfüze edildi ve konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir. Ağ mimarisi (Şekil 1 A ve C) ve imal mikroakışkan ağı (Şekil 1B, D) gibi tanımlanmıştır, in vivo damar görüntü yığını Z çıkıntılar (Şekil 1 A ve B) ve 3D render (Şekil 1C üretilmesi için kullanılmıştır ve D in vivo damarların karmaşık mimarisi özetlemek 3D biomimetic microfluidic ağların imalat sağlar göstermektedir. tekniğin geniş bir çap aralığı içeren ağların üretimi için uygun olduğu; Şekil 1 içinde, 3.3 ile çapı 28,8 um arasında değişen kanal oluşturulmuştur. Şekil 1B sol üst ve Şekil 1D sol köşesinde büyük dikdörtgen yapı ağına akışını tanıtmak için giriş kanalı olduğunu unutmayın.
Şekil 1: mikroakışkan Ağı Vasküler-Türetilmiş. Fare beyin damar (A ve C) bir görüntü yığını elde edilen sanal maskelerinin bir dizi, Fabrica'ya kullanıldıgörüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması üzerinden PEGDA hidrojel (B ve D) gömülü bir 3D biomimetic microfluidic ağı te. mikroakışkan ağ 2.000 kDa FITC etiketli dekstran ile perfüze ve konfokal mikroskobu ile görüntülendi. Z-projeksiyonları (A ve B) ve iki ağların 3D render (C ve D) yoğunluğu, organizasyon ve in vivo damarların genel mimarisini özetlemek mikroakışkan ağları oluşturmak için yeteneğini göstermek. Ok (D) dekstran tanıtmak için oluşturulan dikdörtgen giriş işaretler. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Biz sıvı f başlatmak için iki yöntem, basınç kafaları ve şırınga pompaları, hayata geçirdikBu gömülü mikroakışkan ağlarda düşük. Örneğin, 30 30 ile um dikdörtgen kanal basınç kafası 7 üzerinden tahrik edilen akışkan akışı, bir micromolded PEGDA hidrojel iki kuyu (Şekil 2A) bağlamak için imal edilmiştir. iyi sol oluşturulan basınç kafasının sağda mikrokanal yoluyla ve kuyuya akışını kaynaklı. Şekil 2A, tetrametilrodamin (TRITC) bir başlangıç ön -etiketli olarak, 70 kDa dekstran zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak kanal üzerinden hareket gözlenmedi. Sağdaki kuyuya, kanaldan, iyi soldan Daha sonra, Şekil 2B'de, 10 mikron çaplı floresan polistiren küre aktı. girişinde de micromolded sıvı mevcut hacmi kontrol akış süresi ve giriş arasında üretilen hidrostatik gradyanı ile kontrol edilen akış oranı ile ve de çıkış, micromolded hidrojellerin basınçlı tahrik akımı basit bir yöntem sağlar akış içintim, bir dış gövde ve bir şırınga pompası gerek olmadan.
Şekil 2: Micromolded PEGDA Hidrojel Basınç Baş-Driven Akış. PEGDA gömülü mikrokanal ile bağlı iki kuyu içeren bir hidrojel oluşturmak üzere micromolded edildi. Bir basınç iyi bir ila 30 ile 30 um, dikdörtgen kanal boyunca akışını başlatmak için de sol TRITC-etiketli, 70 kDa, dekstran (A1-A3) ve 10 mikron polistiren küre (B1-B3) 'de oluşturulan diğer. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Alternatif olarak, mikroakışkan ağlar içinde sabit sıvı akışını oluşturmak için, şırınga pompası odaklı fDüşük şırınga pompası arabirim için giriş ve çıkış delikleri ile ikincil bir mikroakışkan cihazın içine hidrojel polimerizasyonu yoluyla başlatılabilir. Şekil 3A'da, bir ticari olarak temin edilebilir, önceden imal mikroakışkan cihaz, 7 genişliği boyunca foto polimerize hidrojelin bir 1 mm bir bant ile gösterilmiştir. Lazer tabanlı bozulma hidrojeller solo için burada açıklanan aynı protokolü kullanarak ev sahipliği hidrojellerin mikroakışkan kanalları ve ağları imal etmek uygulanmıştır. Şırınga pompası tarafından üretilen akım, 20 mikron çaplı silindir şeklindeki kanal mikroakışkan cihaz içine yerleştirilmiş bir hidrojel imal edilmiştir Şekil 3B, görülebilir. 5 uL / s debi uygulandığında, küreler görüş alanı içinde hareket ise çizgiler ile kanıtlandığı gibi bu 20 mikron çaplı kanalında, bireysel 2 mikron floresan polistiren küreler kolayca, sıvı akışı olmadan (Şekil 3B1) çözümlenir (Şekil 3B2 </ Strong> '). Aynı yaklaşım, TRITC etiketli akışını izlemek için bir 2D, vasküler türetilmiş ağ akışı başlatmak için kullanılmıştır, çevredeki hidrojel (Şekil 3C), ağ ve difüzyon yoluyla 65 kDa dekstran.
Şekil 3: mikroakışkan Konutlar PEGDA Hidrojellerinin Polimerize Şırınga Pompası-Driven Akış. 17 x 3.8 x 0.53 mm (x, y, z) mikrokanal ile ticari olarak temin edilebilen, önceden imal edilmiş mikro-akışkan cihazı (A) ile belirtilen bir Fotopolimerize 1 x 3.8 x 0.53 mm (x, y, z) PEGDA hidrojel, ev siyah ok. Bir 20 mikron çaplı silindirik bir kanal hidrojel ile hazmedilmiştir ve 2-mikron polistiren küreler aygıtı (B) aracılığıyla pompalanmıştır. Küreler açıkça sıvı akışı (B1) olmadan çözümlenir, ancak 5 uL / s akış hızında çizgiler olarak görünür(B2). Başka bir yer hidrojel, 2B vasküler türetilmiş ağı imal edilmiş ve TRITC-etiketli, 65 kDa dekstran ağı (C) ile pompalanmıştır. Time-lapse mikroskopi bu kanalları doldurdu ve çevredeki hidrojel içine yayılmış olarak floresan dekstran izlemek için kullanılmıştır. (B) ve (C) 'de beyaz oklar sıvı akış yönünü göstermektedir. (C) kalibrasyon çubuğu floresan dekstran yoğunluğunu gösterir. Ölçek çubukları (C) 'de (B1)' de 20 um ve (B2) ile 50 um temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
görüntü kılavuzluğunda, lazer tabanlı bozulması için sanal maskeler kullanımını etkinleştirmek için mikroskop yazılımı standart fonksiyonları geçersiz kılma Kritik, mikroskop makro kurulumu ve dikkatle manipüle olmalıdır. Nasıl mikroskop makro ile mikroskop yazılım arayüzleri bazen sezgilere aykırı olabilir ve çok çaba bu yöntemi geliştirmek için her iki programda en iyi ayarları belirlenmesinde yatırım oldu. Temel lazer tarama konfokal mikroskop kullanımı genel bir anlayış özellikle "Sahne" ve bulma ve doğru lazer tabanlı bozulması başlamadan önce, x, y ve z boyutlarında hidrojel konumlandırılması için "Focus" pencereler ile tavsiye edilir. Ayrıca, bir giriş kanalının imalat protokolü için kritiktir; asma floresan türlerin başarılı görüntüleme ve ağ karakterizasyonu için mikroakışkan sistemleri girmek gerekir. Protokol, spesifik bir geçerli olduğu not etmek önemlidir, lazerlitarama konfokal mikroskop özel mikroskop yazılımı sürümlerini ve mikroskop makro (Belirli Malzemeleri / Ekipman Listesi ayrıntılarını görmek) çalıştıran, belirli bir femtosaniye darbeli lazer ile yapılandırılmış. Biz mikroskop makro yeni sürümleri görüntü kılavuzluğunda lazer kontrolü için gerekli olan gerekli kontrol ve işlevsellik eksikliği olduğunu keşfettiler. Diğer mikroskop platformları ve darbeli lazer kaynaklar kullanılabilir olsa da, bu protokol bu sistem özellikle geçerlidir ve uygulanan bir platform, lazer kaynağı ve yazılımlara göre değişiklik gerekir. Bu protokol boyunca temel ilkeleri Fakat hala uygulanır.
Bu protokole olası değişiklik hidrojel kompozisyonunu değiştirerek içerir. PEG'lenmiş fibrin dahil sentetik ve doğal hidrojeller, hem de aşağılamak için uygulamaya konmuştur Burada 5 ağırlıkça% 3.4 kDa PEGDA hidrojeller, kullanılan ama (mikroakışkan ağ nesil kenara amaçlar için) lazer tabanlı bozulma21,22 ogen, ipek proteini 23 hidrojeller ve kollajen 24. lazer gücü, tarama hızı, Z-dilimleri arasındaki aralık ve tekrarlama sayısının ayarlanması diğer hidrojel formülasyonlarda mikroakışkan ağları imal etmek en uygun parametrelerin belirlenmesinde yardımcı olacaktır.
tekniğin bir akım sınırlama zaman uygun bir miktarda parçalanabilir hidrojel genel hacmidir. Açık boşlukları veya hidrojel içinde mikroakışkan özellikleri oluşturmak için, lazer 37.7 nJ / mikron 2 bir lazer dozu kullanırken zaman (/ ms veya 0.021 mikron bir lazer tarama hızı) veya 8.96 us / piksel üzerinde olmalıdır yaşamak. (Şekil 1'de görüldüğü gibi) bu ayarlar ile, 0.014 mm 3 hacmi içindeki damarları aşağılamak için 1.4 saat sürer. Aşağıdaki 4.48 us / piksel veya bir lazer bekleme süresi kullanılarak, iletilen enerji burada kullanılan hidrojel formülasyonunun tam bozulması için yeterli değildir. Farklı hidrojel uygulanmasıkompozisyon bu sınırlamanın üstesinden gelebilir. Işığa duyarlı bileşenler 34-36 veya büyük multiphoton kesitleri 21-24 olan hidrojeller ihtiva fotolabil jellerin kullanılması daha az enerji kullanılmasını sağlayacak ve daha hızlı düşmesine neden olur iyi seçeneklerdir. Boyutsal kısıtlamalar ile ilgili olarak, özellikler, hidrojel 7 derin 1.5 mm'ye kadar imal edilmiştir. Derinlik elde objektif çalışma mesafesi bir fonksiyonudur ve in vivo görüntüleme için optimize edilmiş ultra uzun çalışma mesafesi hedefleri kullanarak arttırılabilir. Küçük ölçülen kanal 7 20X (NA1.0) suya daldırma hedefi Şekil 1'de oluşturulan küçük kanalların büyüklüğü ile eşit olan 8.9 um 3.3 mikron genişliği ve derinliği vardı kullanarak oluşturdu. Diğer laboratuarları düşük NA hedeflerini 21,23,24 kullanmış olsa da, biz daha küçük özelliklere sahip mikroakışkan ağlar yüksek kullanılarak oluşturulabilir tahminazaltılmış çalışma mesafesi pahasına er NA hedefleri. Sonuç olarak, bununla birlikte, teknik çözümü odaklanmış lazer ışınının nokta dağılım fonksiyonunun bir fonksiyonudur, lazer tarama özellikleri, lazer tarafından sağlanan enerji miktarı ve malzemenin, lazer emme özellikleri düşürmektedir.
sentetik genel protein bazlı: Bundan başka, lazer özellikleri (hız, akıcılık sanal maskeleri ve tekrar sayısı arasındaki mesafe) (çapraz bağlanma yoğunluğu, makromer / monomer molekül ağırlığı, ağırlıkça yüzde ve hidrojel hidrojel özelliklerine göre optimize edilmelidir ), bu doğal lazer ve böylece sürecin nihai kararı ile etkileşimlerini değiştirmek gibi. teslim enerjisi de kullanılır amaç etkilenir olarak hedefleri arasında geçiş yaparken, ek optimizasyon gereklidir. masrafları ile ilgili olarak, darbeli bir lazer ile mikroskop erişim gereklidir ve birçok farklı objec isetives yüksek Na ve (in vivo görüntüleme için) uzun bir çalışma mesafesi olan pahalı olabilir, kullanılabilir.
Yukarıda ve burada ayrıntılı protokol ötesinde, bu teknik kullanılarak üretilebilir mikroakışkan ağlar da endotelyal hücre yapışma ve lümen oluşumu 7 uyarılması için hücreye yapışan peptidlerin sonrası kanal üretim fonksiyonalize edilebilir. Ayrıca, bozulmasını kanal dökme malzemenin 9 öncesinde hücre-bozunur peptid dizilerinin birleştirilmesi içine ve hidrojel yoluyla hücre göç çalışma için izin verebilir. Şekil 2 ve 3'te 7 gösterildiği gibi hidrojel içinde mikroakışkan ağ sürekli akışkan hale getirme için, hidrojel, daha büyük bir akışkan cihazları veya yuvalara foto polimerize edilebilir.
Vaskülojenik veya anjiyojenik kendini montaj 8-12 yoluyla vasküler ağların nesil va ikna etmek için basit yaklaşım sağlarnispeten büyük bir hidrojel hacmi boyunca scularization. Bu yaklaşım, perfusable akışkan ağlar neden olsa da, doğrudan boyutu, eğrilik, yoğunluğu ve genel olarak ağ mimarisi kontrol etmek zordur. Bu sınırlama nedeniyle, damarsal akış profili ve kesme hızları deneyler arasında farklılık gösterebilir. Alternatif olarak, imalat teknikleri 13-16 ağ mimarisi üzerinde doğrudan kontrol için izin ancak genellikle küçük, kılcal ölçekli kanallar veya in vivo vasküler mimarisinde taklit yoğun ağların imalat üretmek için kendi yetersizlik ile sınırlıdır. Burada özetlenen lazer tabanlı hidrojel bozulması tekniği yeni mikroakışkan nesil için repurposed olsa da, aynı anda, mimari kontrol ve yoğunluğu, kıvrımlı özetlemek 3D biomimetic microfluidic ağlarının oluşturulmasını sağlayarak mevcut mikroüretim yöntemlerinin boyutu tabanlı sınırlamaları hem üstesinden boyut aralığı ve genel architecturin vivo damar örn. Ayrıca, birden fazla akışkan ağlar arası ağ taşıma 7 çalışma sağlayan tek bir hidrojel oluşturulabilir. Daha yakından in vitro, in vivo taşıma süreçlerinde çoğaltmak için çalışıyoruz doku mühendisliği uygulamaları için, burada özetlenen yüksek çözülmesi hidrojel gömülü mikroakışkan ağlar uygundur. Biz bu protokol doku yapıları geliştirilmesinde yararlı olacağını tahmin uyuşturucu tarama cihazları gibi ve in vitro hastalık modellerinde kullanılmak üzere daha doğru taklit in vivo ulaşım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
