Abstract
Denne detaljerede protokol skitserer gennemførelsen af billedet-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning til fremstilling af vaskulære-afledte mikrofluide netværk indlejret i PEGDA hydrogeler. Her beskriver vi skabelsen af virtuelle masker, der giver mulighed for billedet-guidet laser kontrol; fotopolymerisation af en micromolded PEGDA hydrogel, egnet til mikrofluid netværk fabrikation og trykhøjde-drevet flow; opsætning og brug af et kommercielt tilgængeligt laser konfokalt parret med en femtosekund pulserende Ti: S laser til at fremkalde hydrogel nedbrydning; og billeddannelse af jern- mikrofluide netværk under anvendelse af fluorescerende arter og konfokal mikroskopi. Meget af protokollen er fokuseret på den korrekte opsætning og implementering af makro mikroskop software og mikroskop, da disse er afgørende skridt på anvendelse af et kommercielt mikroskop for mikrofluide fabrikation formål, der indeholder en række snørklede. Billedet-styrede del af denne technique muliggør gennemførelsen af 3D billedstakke eller brugergenererede 3D-modeller, og dermed giver mulighed for kreativ mikrofluid design og til fremstilling af komplekse mikrofluide systemer af næsten enhver konfiguration. Med en forventet effekt i tissue engineering, kunne metoderne i denne protokol støtte i fremstilling af avancerede biomimetiske microtissue konstruktioner for organisationer og menneskelige-on-a-chip-enheder. Ved at efterligne komplekse arkitektur, snoning, størrelse og tæthed af in vivo vaskulatur, kan fundamentale biologiske transportprocesser gentages i disse konstruktioner, hvilket fører til mere nøjagtig in vitro modellering af farmakokinetik og sygdom.
Introduction
Det vaskulære system, der består af både lymfe og cardiovasculature, formularer meget tætte netværk, som er nødvendige for transport af næringsstoffer og ilt og til fjernelse af metaboliske affald. Derfor celler bosat i vaskulariserede væv er aldrig over 50-100 um væk fra et fartøj 1. Evnen til at reproducere in vivo vaskulær arkitektur in vitro er kritisk for nøjagtigt modellere in vivo transportprocesser ved hjælp manipulerede konstruktioner. Med en nylig drev til at udvikle orgel-on-a-chip indretninger 2 til high-throughput lægemiddel-screening 3,4 og sygdom modellering 5,6, fremgangsmåder skabe mikrofluide netværk, rekapitule- in vivo-lignende transport i syntetiske eller naturlige hydrogeler er tegning betydelig interesse. For at forbedre biomimetik af microtissues anvendes i disse enheder, udviklede vi et billede-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning metode, der udnytter tre-dimensionell (3D) billede stakke af indfødte kar som skabeloner til at generere vaskulære-afledte mikrofluide netværk indlejret i PEGDA hydrogeler 7. Denne protokol beskriver brugen af en kommercielt tilgængelig laser-konfokalt udstyret med en femtosekund pulserende laser til at fabrikere vaskulære-afledte, biomimetiske mikrofluide netværk i PEGDA hydrogeler via billede-styret, laserbaseret nedbrydning.
Aktuelle tilgange til fluidisering hydrogeler omfatter induktion af vaskulogen 8-10 eller angiogene 10-12 endotelceller selv-montage og microfabrication teknikker til at skabe foruddefinerede kanaler endothelialisering 13-16. Mens selvsamlede net rekapitulere tætheden og kompleks arkitektur Mikrovaskular, er de ofte mere permeable end in vivo net 11,17,18, som kan være problematisk i modellering transport til lægemiddelscreening applikationer. Self-samlet netværk består af physiologtisk relevant, kapillære mellemstore fartøjer, men de kan være svære at integrere med bulk-fluidstrøm grund af begrænsninger i at generere større arteriole-sized fartøjer. Da der ikke er nogen direkte kontrol over samlingen af disse netværk, kan den endelige arkitektur variere fra prøve til prøve, hvilket gør det vanskeligt at gentagne gange producerer netværk med de samme fluid flow og transport egenskaber.
For at generere 3D, hydrogel-indlejret mikrofluide netværk med gentagelig geometri og veldefineret arkitektur, har en række microfabrication teknikker blevet udviklet, herunder modulær montering 13, 3D-print af offer materialer 16, direkte-write montage 14, og rundstrålende udskrivning 15. Anvendelse af disse metoder, mikrofluid arkitektur, og derfor fluid flow og transport egenskaber, kan gentagne gange fremstilles på tværs af mange konstruktioner. En væsentlig begrænsning af disse fremgangsmåder, er imidlertid den manglende evne til at skabe microfluidic netværk med kapillar-store funktioner, 4 til 10 um 19. De fleste microfabrication teknikker er ofte begrænset til funktioner i området fra 150 til 650 um i diameter 13,16. Nogle eksisterende teknikker er i stand til at generere hierarkiske netværk med kanaler over et område bred diameter, 10 til 300 um til direkte-write enhed 14, og 18 til 600 um for omnidirektionel udskrivning 15, men de er begrænset i deres evne til at frembringe tætte netværk eller til at producere flere mikrofluide netværk i nærheden inden for en enkelt konstruktion 7.
For at overvinde nogle af disse begrænsninger, vi udviklede et billede-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning teknik, der giver gentagelig fremstilling af biomimetiske, hierarkiske mikrofluide netværk, rekapitulere arkitektur in vivo mikrovaskulatur. For at gøre dette, en 790 nm, 140 femtosekund (fs) pulserende laser arbejder ved 80 MHz er raster-scannet in ønsket 3D steder i en hydrogel, som defineret af billeder af in vivo-kar. Vi spekulere, at nedbrydningsprocessen fungerer via laser-induceret optisk opdeling af vand, det resulterende plasma formationen, efterfølgende hurtig termoelastisk udvidelse af vand, og den lokale nedbrydning af hydrogelen som vandet ekspanderer 20. Denne mekanisme varierer lidt fra laser-baserede nedbrydning af protein-baserede hydrogeler 21-24. I modsætning PEGDA, som har en lav multifoton tværsnit, proteiner har ofte et stort multifoton tværsnit og derfor nedbrydes via en multifoton absorption-induceret kemisk brud 23. For at generere billedbaserede guidet mikrofluide netværk, er laser lukker styres af billedbaserede afledt virtuelle masker, som består af en mosaik af områder af interesse 9, der definerer mikrofluid arkitektur. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi demonstreret evne til at fremstille 3D vaskulær-afledte biomimetiske mikrofluidic netværk, som rekapitulere tætte og snoede arkitektur in vivo vaskulatur, for at lokalt styre porøsiteten af hydrogeler ved at ændre mængden af energi, der leveres under nedbrydning. Vi har også været i stand til at generere to uafhængige mikrofluide net, intertwine i umiddelbar nærhed (15 pm), men aldrig direkte forbinder 7. Vi har også demonstreret evne til at endothelialize laser-nedbrudt mikrokanaler ved post nedbrydning funktionalisering med integrin ligering peptidsekvens, Arginin-glycin-asparaginsyre-serin (RGDS), for at fremme endotelcelleadhæsion og lumen dannelse 7.
Med denne protokol, er generering af komplekse mikrofluide netværk i PEGDA hydrogeler muliggjort via billede-styret, laser-baserede nedbrydning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt mikroskop tilgængelig på mange universiteter. Som nedbrydningsprocessen er styret af digitale, virtuelle masker, denne fabrication teknik er modtagelig for kreative design af mikrofluide netværk, hvilket tillader dets anvendelse i en lang række anvendelser. Vi forventer, at den her beskrevne fremgangsmåde vil være mest fordelagtig i design biomimetiske organisationer og menneskelige-on-a-chip indretninger stand til at replikere biologiske transportprocesser vigtige i modellering lægemiddeltransport 2. Denne fabrikation teknik kan også være af interesse til generering af in vitro sygdomsmodeller, herunder kræft metastase 5,6 og blod-hjerne-barrieren modeller 25. Som laserbaseret hydrogel nedbrydning tidligere er blevet brugt til at skabe spor for vejledning af neuronal udvækst 21-23, kunne billedet-guided udvidelse af denne teknik vise sig nyttig i avancerede vævsmanipuleringsindretninger strategier til position celler i brugerdefinerede 3D rumlige arrangementer.
Protocol
1. Generering Virtuelle Masker
BEMÆRK: En 3D-billede stak af musehjerne mikrovaskulatur blev valgt som mikrofluid model for denne protokol, er blevet hentet fra en meget større datasæt indeholder billeder af en hel musehjerne mikrovaskulaturen. Mikrovaskulære billeder blev erhvervet via knivskarpe scanning mikroskopi (KESM) 26, 2; lignende mikrovaskulære data er åbent tilgængelige via KESM Mouse Brain Atlas 28.
- Åbn billedbehandlingssoftware 29 og åbne og beskære 3D TIF billedstak af nativ vaskulatur således at den ønskede mikrofluid netværk, der skal genereres i hydrogelen, passer i en 450 um x 450 um x 1,5 mm (x ved y ved z) vindue. For at gøre dette, trække en firkant omkring det ønskede område, og klik på "Image" → "Crop". Fjern skiver i z-retningen ved at klikke på "Image" → "Duplicate", og skriv en ønsket skiverækkevidde.
BEMÆRK: Dette sikrer, at de ønskede funktioner passer inden for synsfeltet (x ved y) (531,2 x 531,2 um, når du bruger en 20X (NA1.0) nedsænkning i vand objektiv med en ramme størrelse på 2.884 x 2.884 pixels og en zoom på 0,8 med en laser-konfokalt) og arbejdsafstand (z) af en 20X (NA1.0) nedsænkning i vand mål. Hvis ukendt, kan synsfeltet for andre systemer bestemmes ved at erhverve et billede med det ønskede mål og indstillinger. - Roter stak billedet, så funktionerne er primært rettet ind efter retningen af raster scanning, eller x-retningen, ved at klikke på "Image" → "Transform" → "Roter". Dette reducerer den nødvendige tid til fabrikation.
- Skaler beskårne billede stak så pixelstørrelse kampe eller overstiger de anvendes til nedbrydning af konfokal mikroskop indstillinger (0,184 um / pixel, når du bruger en 20X (NA1.0) nedsænkning i vand objektiv med en ramme størrelse på 2884 med 2.884 pixelsog en zoom på 0,8). For at gøre dette, klik på "Image" → "Adjust" → "Size" og skriv "2446" for "Bredde" (dvs. 450 um, eller størrelsen af billedet divideret med 0,184 um / pixel).
- Threshold / binarize stak billedet ved at skrive "Ctrl + Shift + T". Fravælg "Mørk baggrund", og klik på "anvende" → "ok". Afslut processen ved at klikke på "billede" → "opslagstabeller" → "Inverter LUT".
- Ved hjælp af en brugerdefineret algoritme (kildekode er tilgængelig i den supplerende materiale refereres manuskript) i programmeringssoftwaren 9, så det passer til binariseres (hvid) funktioner med en mosaik af enkelt pixel-høje firkanter parallelt med retningen af raster scanning (x -retning) for at generere regioner af interesse (ROIs), der guider laser position og lukker 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
BEMÆRK: Den brugerdefinerede algoritme 9 konverterer hver enkelt fly i TIF billedstak til en RLS-fil. - Ændre udvidelse af RLS filer fil til .OVL til brug under nedbrydning.
2. Konfiguration af Laser-konfokalt
BEMÆRK: Selv om der kan anvendes andre laserscanningmikroskoper udstyret med pulserende lasere, indstillinger og protokol her beskriver anvendelsen af en laser scanning mikroskop (LSM), sammenholdt med dens software.
- Med laser-konfokalt på Åbn mikroskop software, og klik på "Start System." Vælg målet "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" i fanen "Vedligehold".
- Indstilling af "Hydrogel Visualisering" Konfiguration
- I "Acquisition" fanen, at laser linje (514 nm Argon laser) er valgt, og videre i "Laser" window. BEMÆRK: Denne kanal bruges til billedet hydrogelen via eosin Y fluorescens til orientering formål 7.
- I "Imaging Setup" vinduet, skal du indstille "Mode" til "Channel Mode", sæt "Skift spor hver" til "Frame", og vælg "Track1".
- I "Light Path" vinduet, skal du vælge kun Ch1 fluorescerende detektor, med en vifte af 516-735 nm; fjernlys splitter (MBS) 458/514 filter på synligt lys linje; og en plade i den usynlige lys linje. Fravælg lyse-field fotomultiplikatorrør detektor, "T-PMT".
- I "Acquisition Mode" vinduet, skal du kontrollere, at den korrekte mål er valgt, og indstil "Scan Mode" til "Frame", den "Frame Size" til "2884" i X og Y, den "Linie Step" til "1" , "Antal Gennemsnit" til "1", den "Gennemsnitsberegnings mode" til "line", den "Gennemsnit Method" til "Mean", den "Bit Depth "til" 16 bit ", og" Retning "til" <-> "til tovejskommunikation scanning.
- I "Acquisition Mode" vinduet, indstille "Speed" som ønsket, og sæt "Corr X" og "Y" til "0,05" eller justere det er nødvendigt for at blive brugt den specifikke mikroskop. Fravælg "HDR".
- I "Acquisition Mode" vinduet, sikre, at "Scan Area" viser en "Image Size" af "531,2 um x 531,2 um" og en "Pixel Size" af "0,18", med en "Zoom" indstillet til "0,8" ; sætte alle andre "Scan Area" værdier til nul.
- I "Channels" vinduet, vælg "Track1" som Ch1 fluorescerende detektor. Vælg laserlinje "514", med en procent magt "10,0", en "Pinhole" af "1AU", en indledende "Gain (Master)" af "800", en "Digital Offset" af "0", og en "Digital Gain" af4; 1 ".
BEMÆRK: Juster disse indstillinger efter behov for det specifikke mikroskop, der bruges. - Gem denne konfiguration som "Hydrogel Visualisering".
- Indstilling af "Channel Formation" Konfiguration
- I "Acquisition" fanen, at laser linje (790 nm 140 fs pulserende Ti: S laser) er valgt, og videre i "Laser" vinduet. Indstil "GDD Correction" til "4000" for den maksimale effekt ved 790 nm.
- Indstil "Imaging Setup" vinduet som beskrevet i trin 2.2.2.
- I "Light Path" vinduet, sikre, at ingen fluorescerende detektorer er valgt, med en MBS 458/514/561/633 filter på synligt lys linje og en MBS 760+ filter på den usynlige lys linje. Fravælg lyse-field fotomultiplikatorrør detektor, "T-PMT".
- I "Acquisition Mode" vinduet, skal du kontrollere, at den korrekte mål er noteret. Indstil "Speed" til "3"Og alle andre indstillinger som beskrevet i trin 2.2.4.
- I "Channels" vinduet, vælg "Track1" som T-PMT-detektor. Vælg laserlinien "790", med en procent magt "100,0", en indledende "Gain (Master)" af "800", en "Digital Offset" af "0", og en "Digital Gain" af "1" .
- I "Stage" vinduet, nulstille scenen ved at klikke på "set nul". Markér placeringen ved at klikke på "Mark". Dette er kritisk for at uploade virtuelle masker til mikroskopet makro i trin 3.
- I "Time Series" vinduet, sæt "Cycles" som "1" og "Interval" som "0".
- I "Bleach" vinduet, skal du kontrollere "Start Blegning efter # scanninger" boksen og sæt den til en værdi på "0 af 1". Vælg "Different scanningshastighed", med en værdi på "3" (svarende til en pixel opholdstid på 8,96 mikrosekunder / pixel). Vælg "Safe blhver for Gaasp ".
- I afsnittet laser linje i "Bleach" vinduet, skal du vælge 790 laserlinje og indstil procent magt til "100,0". Lad alle andre felter i blegemiddel vinduet fravalgt. Gem indstillingerne blegemiddel i "Bleach" vinduet.
- Gem denne konfiguration som "Channel Formation".
BEMÆRK: "Z-Stack", "Regioner", "Focus", og "Stage" vinduer er også vigtigt at dette protokol, men behøver ikke at være indstillet eller justeres under den første konfiguration.
3. Oprettelse af en opskrift og Upload Virtuelle masker til mikroskop Software og Makro
- Med laser-konfokalt kører stadig og mikroskopet softwaren stadig på, vælge kun "Regioner" vinduet (ved siden af knappen "Start eksperiment") i "Channel Formation" konfiguration.
- For at sikre, at maskerne indlæse til mikroskopet makro korrektely, indstille procent strøm i "Channels" vinduet til "0,2" og "Speed" i "Acquisition Mode" vinduet til "8", og klik på "Snap" i øverste venstre hjørne af skærmen.
- Kontroller, at billedstørrelsen er stadig "531,2 um x 531,2 um", med en pixelstørrelse på "0,18", i "Information" fanen af billedet. Hvis disse værdier ikke er korrekte, skal du kontrollere "Frame Size" og "Zoom" værdier igen.
- KRITISK: Kontroller, at X og Y steder i "Trin" vinduet er nulstillet, og at position er markeret, inden du åbner mikroskop makro. Se trin 2.3.6.
- For at åbne mikroskop makro, skriv "Alt + F8", klik på "Load", og vælg den korrekte version. Se detaljer i Liste over specifikke materialer / udstyr. En lang liste af sub-makroer vil åbne i "Macro Control" vindue.
- I "Macro Control" vinduet, klik på "Kør" for at åbne microscope makro, og luk derefter "Macro Control" vinduet.
BEMÆRK: Alternative versioner af mikroskop makro er muligvis ikke kompatible med laser-baserede hydrogel nedbrydning ved hjælp af denne protokol. - I "Lagring" fanen af mikroskopet makro, giver en vilkårlig "Base Filnavn", vælg "Single File Output", og valgte en "midlertidig fil" mappe. Indstil "Åbn Temp Folder" til placering "1", vælg "Single Midlertidig billedmappe", og navngive opskrift i "Gem / Anvend opskrift" med "Recall Locations List" valgt. Klik på "Store" i første omgang at skabe opskriften.
- I "Acquisition" fanen af mikroskopet makro, sørge for, at "Scan Configuration" svarer til navnet givet til mikroskopet softwarekonfigurationen indstillet i trin 2.3. Indstil "Nej of Time Points inden Block" til "1", med et "Interval" af "0". Sørg for, at "Markant Z - Top af Z StacK "er fremhævet grøn. Alle andre standardindstillinger er fine som de er.
- I "Timing" fanen af mikroskopet makro, sikre, at "Wait Delay" er fremhævet grøn, sæt "Eksperiment Gentagelser" og "Group Gentagelser" til "1" og "Vent Interval Før blok på First Location Only" til "0« . Alle andre standardindstillinger er fine som de er.
BEMÆRK: "Group Gentagelser" (og ikke "Eksperiment Gentagelser") kasse er, hvor man kan indstille antallet af gange, laser scanner over en region (dvs. gentagelser af opskriften). - I "Z List" fanen af mikroskopet makro, er nedbrydningsprodukterne fly i z-retningen angivet. Indstil z-spacing, "dZ", til "1 um", med "Antal positioner" indstillet til at matche antallet af virtuelle masker, der skal anvendes.
- Klik på knappen "Opret Z Stack" for at gøre det "Z List" vises i dropdown "List af Locations "mod bunden af vinduet. Kontroller, at antallet af steder og z-afstand er korrekte, og at X og Y steder nulstilles.
BEMÆRK: Hvis de ikke er, gemmer ikke opskriften; lukke mikroskop makro og gentag trin 2.3.6 før genåbning mikroskopet makro og opsætning af opskriften igen.
BEMÆRK: I stedet for at have 100 masker adskilt med 1 um hver, for eksempel, kan det være fordelagtigt at have 50 masker, hver ansat to gange og adskilt med 1 um, for at få en tilsvarende mikrofluidsystem struktur, som lastning enkelte masker til mikroskopet makro kan være tidskrævende. - I "Bleach" fanen af mikroskopet makro, skal alle maskerne skal lastes og matches med en bestemt nummereret beliggenhed i "Liste over Locations". For at starte, skal du markere feltet "Bleach", og sikre, at "Config." svarer til navnet på de blegemiddel indstillingerne i "Bleach" vinduet i hovedsagen mikroskop software skærmen (se trin 2.3.8). Indstil "Vent Forsinkelse Efter Bleach" til "0", skal du fravælge "spot", og lade "ROI" tom.
- Må ikke ændres noget i "Placering", "Tile", "Grid", "Autofokus", "blokke", og "Options" faner fra standardindstillingerne.
- For at indlæse masker til mikroskop makro, vælge kun "Regioner" vinduet i mikroskopet software og åbne "Bleach" fanen af mikroskopet makro. I "Regioner" vinduet, klik på "Load" og vælg .OVL filen for masken i bunden af z-stakken blive nedbrudt.
BEMÆRK: Den første placering i "Z liste" er bunden af z-stakken, og mikroskopet makro arbejder sig vej til toppen af Z-stakken, eller hydrogel. - Når listen over ROIs vises i "Regioner" vinduet, skal du klikke på pileknappen for at se ROI'er af masken inden for synsfeltet (på billedet knækkede i trin 3.2). Kontroller, at ROIs passer indensynsfeltet.
- Hvis du vil gemme belastede maske i mikroskopet makro, giver masken et navn og nummer i boksen "Tilføj Aktuel region for at ROI List" på "Bleach" fanen, og klik derefter på "Føj Aktuel region for at ROI List" -knappen. Navn og nummer vises i "ROI" dropdown liste med andre masker (herunder masker fra andre tidligere oprettede opskrifter). Slet masken i "Regioner" vinduet i mikroskopet software.
- Gentag trin 3.14 og 3.16 for at uploade og gemme alle masker til mikroskopet makro.
- For at tildele uploadede masker til hver Z-placering, fremhæve position 1 i dropdown "Liste over Locations". Vælg den relevante ROI fra "ROI" dropdown listen. Sørg for, at boksen "Bleach" er valgt i toppen af "Bleach" fanen i mikroskopet makro.
- Gentag trin 3.18 for alle positioner i dropdown "Liste over Steder", og klik derefter på "Store" den &# 34; Lagring "fanen for at gemme opskriften i sin endelige form.
4. fotopolymerisering en PEGDA Hydrogel
- Gør Sterile HEPES saltvand (HBS) og triethanolamin (TEOA)
- I en 1-liters bægerglas, tilsættes 500 ml Dl H2O Med en omrører, røre i 2,922 g natriumchlorid, 1,196 g HEPES og 7,5 ml TEOA i et stinkskab.
- Juster til pH 8,3 med 1 N natriumhydroxidopløsning ved dråbevis tilsætning med en Pasteur-pipette.
- Steril filter opløsningen gennem et 0,2-um vakuumfiltrering kop i en 500-ml autoklaveret glas medier flaske. Alikvot og opbevares ved 4 ° C.
- Vedhæft en ring af dobbeltsidet klæbende med opbakning til et specialiseret 60-mm petriskål med en 20-mm hul skåret ud af bunden. Forlader bagside på den klæbende ring, tryk ud eventuelle luftbobler fra mellem petriskålen og klæbemidlet.
- Forbered materialerne. Bring det syntetiserede 33 3.4 kDa PEGDA ud af -80 ° C fryser og lad den opnå stuetemperatur. Tænd hvidlyskilde mindst 15 minutter før fotopolymerisering hydrogeler.
- I et stinkskab tilsættes 1 ml HBS med TEOA til en folie-dækket, 2-ml rav centrifugerør (bruges til at forhindre lys eksponering af fotoinitiatoren, eosin Y). Tilsæt 10 uL af 1 mM Eosin Y dinatriumsalt i DI H 2 O.
- I et stinkskab, udtrække et lille volumen 1-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) i et glas bæger med en Pasteur-pipette. Fra denne volumen, pipette 3,5 pi NVP i rav centrifugerør med HBS, TEOA, og eosin Y.
- I en anden folie-dækket, 2-ml rav centrifugeglas (bruges til at forhindre vildfaren fotoaktivering af præpolymeropløsningen), tilsættes 10 mg 3.4kDa PEGDA. Tilsæt 0,2 ml HBS, TEOA, eosin Y, NVP løsning for en 5% vægt / volumen PEGDA pre-polymeropløsningen. Vortex indtil PEGDA er helt opløst. Ved hjælp af en power meter og detektor tryllestav, justere intensiteten af den hvide light kilde til 95 mW.
- Opbygning af en Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Mold
- Byg en PDMS form 7 på et større flade (glass, polystyren vævskulturskål) for at lette opbevaring og samle formene, således at de støbte hydrogeler passer ind i en cirkel med en diameter på 20 mm.
- For at generere et rektangulært formet hydrogel med en tykkelse på 500 um, placere to 500 um tykke PDMS afstandsstykker på en PDMS overflade for at oprette to definerede hydrogel kanter.
- Inkluderer en 300-um PDMS spacer at overføre en 300 um-dyb brønd i overfladen af hydrogelen, som er nyttig til indføring fluider.
- Pipetter 60 pi af 5% vægt / volumen PEGDA præpolymer opløsningen på PDMS formen. Pas på ikke at indføre nogen bobler under pipettering.
- Center og placere et [3- (methacryloyloxy) propyl] trimethoxysilan (TMPSA) funktionaliseret 7, 40-mm diameter, # 1.5 dækglas på toppen af opløsningen. Sørg for, at coverslip hviler på 500 um PDMS afstandsstykker. Hydrogelen vil binde til methacrylerede dækglas og forhindre hydrogelen i at flyde i opløsningen.
- Placer PDMS, PEGDA pre-polymeropløsningen og dækglasset samlingen under den hvide lyskilde i 3 min.
- Flow DI H2O mellem formen og dækglasset for at adskille hydrogelen fra PDMS. Skyl hydrogel med DI H2O Tør kanterne af dækglasset med lab væv. Pas på ikke at røre eller væge vand fra hydrogel.
- Efter fjernelse af belægningen fra limen, klæbe dækglasset til den klargjorte petriskål og forsigtigt fjerne luftbobler fra mellem klæbemidlet og glasset. Sænk hydrogelen i petriskålen med DI H2O
BEMÆRK: PDMS skimmel kan genbruges til at foretage yderligere hydrogeler hvis skyllet med DI H2O, tørret med nitrogen og holdes fri for støv.
5. Fabricating Vaskulær-afledte Mikrofluid Networks via Laser-baserede Nedbrydning
- Med laser-konfokalt og mikroskop software på, skal du vælge det mål "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" i fanen "Vedligehold". I "Acquisition" fanen, skal du sørge for de nødvendige laser linjer (514 nm Argon laser og 790 nm 140 fs pulserende Ti: S laser) er tændt og varmet op.
- Opsætning af Hydrogel til formular en Inlet Channel
- Monter hydrogel og petriskål på scenen indsætte og placere scenen indsatsen på mikroskopet scenen. Fyld petriskål med mindst 5 ml DI H 2 O. center de hydrogel og godt funktioner ved øjet, før sænke nedsænkning i vand mål i DI H 2 O.
BEMÆRK: Du må ikke knuse hydrogel med målet-de to bør aldrig røre! - For at finde den hydrogel, skifte til "Hydrogel Visualisering" konfiguration fra trin 2.2. Klik på "Levende" for at slå laseren linje på og bringe the objektiv tættere på hydrogel indtil eosin Y-signalet (detekteret ved CH1 fluorescerende detektor) af toppen af hydrogelen kan ses.
BEMÆRK: For at finde hydrogel nemt kan procent magt øges eller pinhole kan åbnes. Når målet er fokuseret på hydrogelen imidlertid slip procent magt til at beskytte den fluorescerende detektor og formindske pinhole tilbage til 1AU at undgå overmætning af detektor og til nøjagtigt at finde hydrogelen overflade. - I "Trin" vinduet, vise placeringen af top og bund af hydrogelen og af bunden af brønden.
BEMÆRK: z-værdierne her, vil hjælpe til at bestemme tykkelsen af hydrogelen og dybden af brønden. - Brug joysticket til at bevæge sig i X og Y at finde kanten af en brønd. Placer hydrogel til højre på skærmen, med brønden til venstre eller omvendt. Tillad hydrogelen til at fylde mere end to tredjedele af synsfeltet.
- Drop den plane af fokus ned 150 um i hydrogelen ved at indstille "Trin Size" til "150" i "Focus" vinduet og klikke på pil ned ud for feltet "Z-position". Gentag trin 5.2.4, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: x, y og z position af indløbet afhænger udelukkende af udformningen af de virtuelle masker. - KRITISK: Nul X- og Y-placering i "Stage" vinduet, slette alle andre markerede steder, og markere kun denne placering.
BEMÆRK: Hvis dette trin ikke udføres, vil mikroskopet makroen ikke korrekt genoprette de steder i den tidligere gemte opskrift, og hydrogelen vil ikke blive nedbrudt i den ønskede placering.
- Monter hydrogel og petriskål på scenen indsætte og placere scenen indsatsen på mikroskopet scenen. Fyld petriskål med mindst 5 ml DI H 2 O. center de hydrogel og godt funktioner ved øjet, før sænke nedsænkning i vand mål i DI H 2 O.
- Danner en indløbskanal
- "Snap" et billede og tegne et rektangulært område, som vil være indløbet til det vaskulære netværk ved hjælp af knappen rektangel i "Regioner" vinduet.
BEMÆRK: Sørg del af regionen strækker sig ud i brønden for at sikre, at the indløb forbinder brønden til det vaskulære netværk. - Ved siden af ROI genereret i "Regioner" vinduet, vælg "Acquisition" og fravælge "Bleach" og "analyse".
- Gem "Hydrogel Visualisering" konfiguration, fravælge "Regioner", og skifte til "Channel Formation" konfiguration, der blev oprettet i trin 2.3. På "Channel Formation" konfiguration, skal du vælge "Regioner" igen.
BEMÆRK: Når du skifter mellem "Hydrogel Visualisering" og "Channel Formation" konfigurationer, skal du sørge for at fravælge områder i øverste venstre hjørne af skærmen. Undertiden skalering af regionerne kan skifte uventet mellem konfigurationer, hvis dette ikke sker. - I "Channel Formation" konfiguration, skal du sørge for, at kun "regioner" og "Z-Stack" er valgt. I "Z-Stack" vinduet, skal du klikke på knappen "Center" øverst og derefter på "Center" røvpå ovenstående "Offset" til at indstille midten af z-stak som den aktuelle Z-position. Afhængigt af hvor stor fjorden skal være, skal du indstille antallet af "Skiver" med en "Interval" af "1". Størrelsen af Z-stakken vises nedenunder "Range".
- Kontroller, at "Speed" i "Acquisition Mode" vinduet er indstillet til "3", og at "Procent Power" i "Channels" vinduet er indstillet til "100". Gem konfigurationen, og klik på "Start Experiment" knappen.
BEMÆRK: Mikroskopet makro er ikke nødvendig for at nedbryde den samme simple form på flere planer, som udføres her for at generere en indløbskanal. Makroen er kun påkrævet, når nedværdigende forskellige regioner på hver enkelt plan, og det bruges til at gemme de virtuelle masker inden for en opskrift. - For at visualisere hydrogel under nedbrydning, enten øge "Gain (Master)" i "Channels" vinduet, hvis regionen i than synsfelt er sort, eller mindske "Gain (Master)", hvis regionen er hvid.
BEMÆRK: bobledannelse her er en indikation af laser-induceret hydrogel nedbrydning. - For at nedbryde indløbet flere gange i stedet for bare en gang, justere de "cykler" i "Time Series" vinduet.
- I "Hydrogel Visualisering" konfiguration, skal du klikke på "live" for at sikre, at fjorden blev dannet.
- "Snap" et billede og tegne et rektangulært område, som vil være indløbet til det vaskulære netværk ved hjælp af knappen rektangel i "Regioner" vinduet.
- Opsætning af Hydrogel at generere den Mikrofluid Network
- I "Regioner" vinduet, indlæse nogen .OVL fil fra z-stak af virtuelle masker og klik på pilen knappen at se ROI'er i synsfeltet.
- Klik "Levende" at leve scanne "Hydrogel Visualisering" konfiguration og bruge joysticket eller "Trin" vinduet for at placere hydrogelen i X og Y, således at indløbet forbinder til den korrekte placering inde i det vaskulære netværk.
BEMÆRK: Sørg for, atROIs af den virtuelle maske overlapper lidt med den tidligere dannede indløb. - Drop flyet af fokus ned 50 um fra den tidligere centreret Z-placering eller 200 um fra overfladen af hydrogel, ved hjælp af "Step Size" i "Focus" vinduet og klikke på pil ned ved siden af "Z-position "kassen. Dette vil være den første position i mikroskopet makro.
BEMÆRK: Den faktiske afstand at bevæge sig i Z-retningen afhænger af netværk design. Sikre, at det ønskede netværk ikke strækker sig ud over toppen eller bunden overflade af hydrogelen i z-retningen. - KRITISK: Zero X og Y steder i "Trin" vinduet, slette alle andre markerede steder, og markere kun denne placering.
BEMÆRK: Dette vil være udgangspunktet i mikroskopet makro. Opskriften vil arbejde sig tilbage mod overfladen af hydrogelen. - "Snap" et billede i "Hydrogel Visualisering" konfiguration, slette og deselect "Regioner", og gemme konfigurationen.
- Generering af Mikrofluid Network
- Skift til "Channel Formation" konfiguration, og kun vælge "Time Series" og "Blegning" vinduer. Kontroller, at indstillingerne for "Time Series" og "Blegning" vinduer er som de oprindeligt blev sat i trin 2.3.7 og 2.3.8.
- Indstil "Speed" i "Acquisition Mode" vindue til "8" og den procentvise effekt af laseren linje til "0,2" i "Channels" vinduet. Gem konfiguration.
- Åbn mikroskop makro følgende trin 3.5. På "Lagring" fanen af makroen, skal du vælge den tidligere opskrift fra trin 3 og klik på "Anvend".
BEMÆRK: Klik ikke på "Store" eller opskriften vil blive overskrevet! - Kontroller indstillingerne på alle faner, og kontrollere, at de virtuelle masker (.OVL filer) stadig er korrekt forbundet med than Z-steder i rullelisten. Kontroller også, at den første Z-placering matcher den markante placering i "Trin" vinduet af mikroskopet software.
BEMÆRK: counterintuitively, vil den anden placering i rullemenuen være fysisk over den første placering, som mikroskopet makro vil arbejde sig fra bunden af hydrogelen (længst væk fra målet) til toppen af hydrogelen (nærmest objektiv). - Gem "Channel Formation" konfiguration igen, og derefter klikke på "Opdater" i mikroskopet makro. Klik på "Nej" til "Overskriv aktuel lokalitet List?", Og derefter klikke på "Start" i mikroskopet makroen til at begynde opskriften.
6. Visualisere den Mikrofluid Network
- For at se hydrogel og dannede mikrofluid netværk efter nedbrydning, lukke mikroskop makro. Skift til "Hydrogel Visualisering" konfiguration for at se eosin Y signal af hydrogelen; den forringede netværk vises mørke.
BEMÆRK: hydrogel nedbrydning kan ikke visualiseres mens mikroskopet makro kører. - For at se mikrofluid netværk specifikt bruge "Hydrogel Visualisering" konfiguration ved en lavere laser magt til at gøre det muligt at billeddannelse af indførte fluorescein (FITC) -mærket dextran, som har en lysere signal end den native eosin Y-signalet af hydrogel.
- Forud for indførelse af fluorescensmærket dextran, væge vand fra brønden i hydrogelen under anvendelse lab væv. Afpipetteres i 10 pi 5 mg / ml 2,000 kDa FITC-mærket dextran i DI H2O (præ-filtreret gennem et 0,2-um sprøjtefilter).
BEMÆRK: Brug en dextran størrelse 2000 kDa eller større for at forhindre diffusion ind i gelen. Hvis billedbehandling i længere tid end 30 minutter, skal du bruge en inkuberes scene med 60% luftfugtighed (eller højere) for at forhindre hydrogel tørring og fordampning af vand fra den FITC-mærkede dextran løsning. - Fjern hydrogelen ennd petriskål fra scenen og markere petriskålen at muliggøre nem placering af det dannede vaskulære netværk under senere eksperimenter.
Representative Results
For at demonstrere implementeringen af billedet-styret, laser-baserede hydrogel nedbrydning til at generere en 3D, vaskulær-afledte mikrofluid netværk, vi udnyttet et 3D-billede stak af musehjerne kar, der blev erhvervet via knivskarpe scanning mikroskopi (KESM) 26, 27 . En udvalgt 3D region af større mikrovaskulære datasæt blev konverteret til en række virtuelle masker til billedbehandling-guided mikrofluid netværksdannelse, som beskrevet ovenfor. Efter fremstilling, blev den resulterende mikrofluid netværk perfunderet med en opløsning af FITC-mærket, 2.000 kDa dextran og afbildes via konfokal mikroskopi. Billedet stak af in vivo kar, der definerede netarkitekturen (figur 1A og C), og fabrikerede mikrofluid netværk (figur 1B og D) blev anvendt til frembringelse Z-fremspring (figur 1A og B) og 3D-gengivelser (figur 1C og D in vivo vaskulatur. Teknikken kan underkastes fremstilling af net, der indeholder en bred vifte af diametre; inden figur 1, blev kanalerne i området fra 3,3 til 28.8 um i diameter genereret. Bemærk, at større rektangulære struktur i øverst til venstre i figur 1B og i det venstre hjørne af figur 1 D er indløbskanalen at indføre strøm i nettet.
Figur 1: Vaskulær-afledt Mikrofluid Network. En række virtuelle masker, afledt fra et billede stak af musehjerne vaskulatur (A og C), blev anvendt til at fabricate en 3D biomimetiske mikrofluid netværk indlejret i en PEGDA hydrogel (B og D) via billede-styret, laserbaseret nedbrydning. Den mikrofluid netværket blev perfunderet med 2000 kDa FITC-mærket dextran og filmede via konfokal mikroskopi. Z-projektioner (A og B) og 3D-gengivelser (C og D) af de to netværk demonstrerer evnen til at generere mikrofluide netværk, rekapitulere tæthed, organisation og overordnede arkitektur af in vivo kar. Pilen (D) markerer den rektangulære indløb skabt til at indføre dextranen. Skalaen søjle repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi har implementeret to metoder, tryk hoveder og sprøjtepumper, at indlede væske flav i disse indlejrede mikrofluide netværk. For eksempel blev en 30 ved 30 um rektangulær kanal fremstillet til at forbinde to brønde i en micromolded PEGDA hydrogel (figur 2A), med fluidstrøm drives via en trykhoved 7. Frembragt i venstre godt, lederen tryk induceret strømning gennem mikrokanalen og ned i brønden til højre. I figur 2A, en indledende foran tetramethylrhodamin (TRITC) -mærket, blev 70 kDa dextran observerede bevæger sig gennem kanalen ved hjælp time-lapse mikroskopi. Senere, i figur 2B, 10 um diameter fluorescerende polystyren sfære flød fra venstre godt, gennem kanalen, til brønden til højre. Med varigheden af flowstyret med volumenet af fluid til stede i micromolded godt ved indløbet, og strømningshastigheden kontrolleres af den hydrostatiske gradient genereres mellem indløbet og udløbet godt, trykhøjde-drevet strømning i micromolded hydrogeler giver en enkel metode for strømning iproduktion, uden behov for en ydre indeslutning eller sprøjtepumpe.
Figur 2: Pressure Head-Driven Flow i en Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA blev micromolded til dannelse af en hydrogel indeholdende to brønde er forbundet med en indlejret mikrokanal. En presset hoved blev genereret i venstre godt at initiere strøm af TRITC-mærket, 70 kDa dextran (A1-A3) og en 10-um polystyren kugle (B1-B3) gennem en 30 med 30 um rektangulær kanal fra én brønd til andre. Skalaen søjle repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Alternativt til at generere konstant fluidstrømning inden mikrofluide netværk, sprøjtepumpe-drevet flav kan initieres ved fotopolymerisering hydrogelen indersiden af en sekundær mikrofluidanordning med tilgangs- og afgangsåbninger for sprøjtepumpe interfacing. I figur 3A, er et kommercielt tilgængeligt, præfabrikeret mikrofluidanordning vist med en 1-mm bånd af hydrogel fotopolymeriseres tværs over bredden af indretningen 7. Laser-baserede nedbrydning blev gennemført for at fabrikere mikrofluide kanaler og netværk i huse hydrogeler bruger den samme protokol beskrevet her til fritstående hydrogeler. Sprøjtepumpe-genererede strøm kan ses i figur 3B, hvor en 20-um cylindrisk diameter kanal blev fremstillet i et hydrogel huse i en mikrofluidapparat. I denne kanal 20-um diameter, er individuelle 2-um fluorescerende polystyrenkugler let løses uden væskestrøm (fig 3B1), hvorimod når en 5 pl / s strømningshastighed anvendes, kuglerne bevæger sig gennem synsfeltet, hvilket fremgår af striber (Figur 3B2 </ Strong>). Denne samme fremgangsmåde blev anvendt til at inducere strømning gennem et 2D, vaskulær-afledte netværk til at overvåge strømningen af TRITC-mærkede, 65 kDa dextran gennem netværket og diffusion ind i den omgivende hydrogel (figur 3C).
Figur 3: Syringe Pumpedrevne Flow i PEGDA Hydrogeler polymeriseret Mikrofluid huse. Et kommercielt tilgængeligt, præfabrikeret mikrofluidanordning (A) med en 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) mikrokanalplade huser en fotopolymeriseret 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel, angivet ved sort pil. En 20-um cylindrisk diameter kanal blev nedbrudt gennem hydrogelen, og 2-um polystyrenkugler blev pumpet gennem indretningen (B). Kuglerne er klart løses uden væskestrøm (B1), men de vises som striber med en strømningshastighed på 5 ul / s(B2). I en anden opstaldet hydrogel blev en 2D vaskulær-afledt netværk fremstillet og TRITC-mærkede, blev 65 kDa dextran pumpes gennem netværket (C). Time-lapse mikroskopi blev anvendt til at overvåge fluorescerende dextran som det fyldes kanalerne og diffust ind i de omgivende hydrogel. Hvide pile i (B) og (C) indikerer retningen af fluidstrømmen. Kalibreringen bar i (C) angiver intensiteten af det fluorescerende dextran. Skalaen søjler repræsenterer 20 um i (B1) og (B2) og 50 um i (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Kritisk i tvingende standard funktioner i mikroskop software til at muliggøre brugen af virtuelle masker til billedet-styret, laserbaseret nedbrydning, skal mikroskop makro sættes op og manipuleres omhyggeligt. Hvordan mikroskop software grænseflader med mikroskop makro kan undertiden være ulogisk, og blev investeret mange kræfter i at bestemme de optimale indstillinger i begge programmer til at udvikle denne metode. En generel forståelse af grundlæggende laser-konfokalt brug anbefales, især med "Trin" og "Focus" vinduer til at finde og korrekt placere hydrogel i x, y og z dimensioner, før du prøver laserbaseret nedbrydning. Derudover fremstillingen af en indgang kanal er afgørende for den protokol; suspenderede fluorescerende arter skal kunne indtaste mikrofluide systemer for en vellykket billedbehandling og netværk karakterisering. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol gælder for en bestemt laser-konfokalt konfigureret med en specifik femtosekund pulserende laser, der kører bestemte versioner af mikroskop software og mikroskop makro (se detaljer i Liste over specifikke materialer / udstyr). Vi har opdaget, at nyere versioner af mikroskopet makro mangler den nødvendige kontrol og funktionalitet er nødvendig for billedet-styret laser kontrol. Selv om der kan benyttes andre mikroskop platforme og pulserende laser kilder, denne protokol gælder specifikt til dette system og skal ændring i henhold til den platform, laser kilde, og software implementeret. De grundlæggende principper i hele denne protokol gælder stadig, dog.
En potentiel ændring til denne protokol indebærer ændre hydrogel sammensætning. Her udnyttede vi 5 vægt%, 3,4 kDa PEGDA hydrogeler, men laserbaseret nedbrydning (til formål, bortset fra mikrofluid netværk generation) er blevet gennemført for at nedbryde både syntetiske og naturlige hydrogeler, herunder PEGyleret fibrinogen 21,22, silke protein hydrogeler 23, og kollagen 24. Justering af lasereffekten, scanningshastighed, afstand mellem Z-skiver, og antallet af gentagelser vil hjælpe med at afgøre de optimale parametre for at fabrikere mikrofluide netværk i andre hydrogelformuleringer.
En strømbegrænsning af teknikken er den samlede mængde af hydrogel, der kan nedbrydes i en gennemførlig mængde tid. For at skabe åbne hulrum eller mikrofluide funktioner i hydrogel, laseren dvæle tid skal være på eller over 8,96 mikrosekunder / pixel (eller en laser scanning hastighed på 0,021 um / uS) ved brug af en laser fluens på 37,7 nJ / um 2. Med disse indstillinger, det tager 1,4 timer til at nedbryde fartøjer inden for en 0,014 mm 3 volumen (som set i figur 1). Ved hjælp af en laser opholdstid på 4,48 mikrosekunder / pixel eller derunder, leverede energi er ikke nok for fuld nedbrydning af hydrogel formulering, der anvendes her. Implementering af en anden hydrogelSammensætningen kunne overvinde denne begrænsning. Brugen af fotolabile geler, der indeholder lysfølsomme komponenter 34-36 eller hydrogeler, der har store multifoton tværsnit 21-24 er gode muligheder, der ville gøre det muligt at anvende mindre energi og ville resultere i hurtigere nedbrydning. Med hensyn til dimensionelle begrænsninger, har funktioner blevet fremstillet op til 1,5 mm dybt i hydrogelen 7. Dybden opnåelige er en funktion af arbejdsmiljøet afstand af målet, og kan forøges ved brug ultra-lange mål arbejdstid distance optimeret til in vivo billeddannelse. Den mindste målte kanal 7 skabt ved hjælp af en 20X (NA1.0) nedsænkning i vand mål havde en bredde på 3,3 m og dybde på 8,9 um, hvilket er på niveau med størrelsen af de mindste kanaler genereret i figur 1. Mens andre laboratorier har brugt mindre NA mål 21,23,24, forventer vi, at mikrofluide netværk med mindre funktioner kan genereres ved hjælp af højER NA mål på bekostning af en reduceret arbejdsafstand. Men i sidste ende opløsningen af teknikken er en funktion af punktspredningsfunktion af den fokuserede laserstråle, idet laserscanningen egenskaber, mængden af energi, der leveres af laseren, og laseren absorptionsegenskaber af materialet nedbrydes.
Endvidere laser egenskaber (hastighed, fluens, afstand mellem virtuelle masker, og antallet af gentagelser) skal optimeres baseret på hydrogel egenskaber (tværbindingsdensitet, makromer / monomer molekylvægt vægtprocent, og typen af hydrogel: protein-baserede vs. syntetisk ), da disse i sig selv vil ændre interaktioner med laseren og dermed den endelige beslutning af processen. Som den energi der leveres også er påvirket af det mål, der anvendes, er yderligere optimering kræves, når du skifter mellem mål. Med hensyn til omkostningerne, er adgang til et mikroskop med en pulserende laser påkrævet, og mens mange forskellige målsættiver kan anvendes, dem med en høj NA og lang arbejdsafstand (til in vivo billeddannelse) kan være dyre.
Ud over protokollen beskrevet her, kan mikrofluide netværk dannet ved anvendelse af denne teknik også være funktionaliseret med celle-klæbende peptider post-kanal fabrikation at inducere endotelcelleadhæsion og lumen dannelse 7. Derudover kunne inkorporeringen af celle-nedbrydeligt peptidsekvenser i bulkmaterialet 9 før kanalisere nedbrydning muliggøre studiet af cellemigrering ind i og gennem hydrogelen. Til kontinuerlig fluidisering af mikrofluid netværk indenfor hydrogel, kan hydrogeler fotopolymeriseres i større fluide enheder eller huse, som vist i figur 2 og 3 7.
Frembringelsen af vaskulære netværk via vaskulogen eller angiogene selvsamling 8-12 giver en enkel tilgang til at fremkalde vascularization hele en relativt stor hydrogel volumen. Mens denne fremgangsmåde resulterer i perfusable fluide net er det vanskeligt direkte styre størrelsen, snoning, tæthed og samlet netværksarkitektur. På grund af denne begrænsning, kan strømmen profil og forskydningshastigheder i vaskulaturen varierer mellem eksperimenter. Alternativt microfabrication teknikker 13-16 muliggør direkte kontrol over netværksarkitektur men er ofte begrænset af deres manglende evne til at generere små, kapillære størrelse kanaler eller fremstillingen af tætte netværk, der efterligner in vivo vaskulær arkitektur. Mens laser-baserede hydrogel nedbrydning teknik skitseret her er for nylig blevet repurposed for mikrofluid generation, den samtidig overvinder både den arkitektoniske kontrol og størrelse-baserede begrænsninger eksisterende microfabrication metoder ved at muliggøre skabelsen af 3D biomimetiske mikrofluide netværk, rekapitulere tæthed, snoning, størrelsesorden, og samlede architecture af in vivo kar. Endvidere kan flere fluide netværk genereres i samme hydrogel, hvilket tillader undersøgelse af inter-net transport 7. For vævsdyrkningsapplikationer der stræber efter at tættere replikere in vivo transportprocesser i vitro, de meget løst hydrogeldannende indlejret mikrofluide netværk beskrives her, er velegnede. Vi forventer, at denne protokol vil være nyttigt i at udvikle væv konstruktioner, som mere præcist efterligne in vivo transport til brug som narkotika screening udstyr og in vitro sygdomsmodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
