Abstract
Diese detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung von bildgeführten, laserbasierten Hydrogel Abbau zur Herstellung von vaskulären abgeleitetes mikrofluidischen Netzwerken in PEGDA-Hydrogele eingebettet. Hier beschreiben wir die Erstellung von virtuellen Masken, die für bildgesteuerte Lasersteuerung ermöglichen; die Photopolymerisation eines micromolded PEGDA Hydrogel, geeignet für mikrofluidische Netzwerk Herstellung und Druckkopf getriebenen Strömung; der Aufbau und die Verwendung eines handelsüblichen Konfokalmikroskop Laser-Scanning mit einer Femtosekundenimpuls Ti gepaart: S Laser Hydrogels Abbau zu induzieren; und die Abbildung von fabrizierten mikrofluidischen Netzwerken unter Verwendung von fluoreszierenden Spezies und konfokaler Mikroskopie. Ein großer Teil des Protokolls ist auf der richtigen Aufstellung und Umsetzung des Mikroskop-Software und Mikroskop Makro konzentriert, da diese entscheidenden Schritte sind eine kommerzielle Mikroskop für mikrofluidische Herstellungszwecke verwendet, die eine Reihe von Feinheiten enthalten. Die bildgesteuerte Komponente dieses technique ermöglicht die Durchführung von 3D-Bildstapeln oder benutzergenerierten 3D-Modellen, wodurch für kreative mikrofluidischen Design ermöglicht und für die Herstellung von komplexen mikrofluidischen Systemen praktisch jeder Konfiguration. Mit einem erwarteten Auswirkungen in Tissue Engineering, die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren könnten bei der Herstellung von fortgeschrittenen biomimetische microtissue Konstrukte unterstützen für Organ- und Menschen-on-a-Chip-Geräte. Durch Nachahmung die komplexe Architektur, die Verwindung, die Größe und Dichte der in vivo Vaskulatur können essentielle biologische Transportprozesse in diesen Konstrukten repliziert werden, was zu genaueren in vitro - Modellierung von Arzneimittel Pharmakokinetik und Krankheit.
Introduction
Das Gefäßsystem, die beide Lymph- und cardiovasculature besteht, bildet hochdichte Netzwerke, die für den Transport von Nährstoffen und Sauerstoff und zur Entfernung von Stoffwechselabfall wesentlich sind. Dementsprechend sind in bluteten Geweben mit Wohnsitz Zellen nie mehr als 50 bis 100 & mgr; m entfernt von einem Behälter 1. Die Fähigkeit , in vivo vaskuläre Architektur in vitro zu reproduzieren , ist kritisch , um genau in vivo Transportprozesse modellieren Konstrukte verwenden. Mit einer aktuellen Antriebs Orgel-on-a-Chip - Vorrichtungen 2 für Hochdurchsatz - Medikament zu entwickeln Screening 3,4 und Krankheit Modellierung 5,6, zu Methoden mikrofluidischen Netzwerken schaffen , die in vivo -ähnlichen Transport in synthetischen oder natürlichen Hydrogelen rekapitulieren zeichnen großes Interesse. Um die biomimicry von microtissues verbessern in diesen Geräten verwendet werden, entwickelten wir ein bildgeführtes, laserbasierten Hydrogel-Abbauverfahren, das drei-MASS nutztl (3D) Bildstapel von nativen Gefäß als Vorlagen in PEGDA Hydrogele 7 Gefäß abgeleiteten mikrofluidischen Netzwerken eingebettet zu erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines handelsüblichen Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit einem Femtosekundenimpulslaser ausgestattet vaskulären abgeleitetes, biomimetische mikrofluidischen Netzwerke in PEGDA-Hydrogele über bildgeführte, laserbasierten Abbau herzustellen.
Aktuelle Ansätze Hydrogele zu fluidisieren umfassen die Induktion von vaskulogenischen 8-10 oder 10-12 angiogene Endothelzelle Selbstorganisation und Mikrofabrikationstechniken vordefinierten Kanäle für 13-16 Endothelialisierung zu schaffen. Während selbstorganisierende Netzwerke die Dichte und die komplexe Architektur von microvasculature rekapitulieren, sind sie oft durchlässiger als in - vivo - Netzwerke 11,17,18, die für Wirkstoff - Screening - Anwendungen in der Modellierung Transport problematisch sein kann. Selbstorganisierende Netzwerke bestehen aus physiologtisch relevant, Kapillar große Schiffe, aber sie können bei der Erzeugung von größeren Arteriolen große Schiffe aufgrund von Einschränkungen mit Hauptfluidströmung schwierig zu integrieren sein. Da es keine direkte Kontrolle über die Anordnung dieser Netze ist, kann die endgültige Architektur von Probe zu Probe variieren, was es schwierig macht, um wiederholt Netzwerke mit den gleichen Fluidstrom und Transporteigenschaften herzustellen.
Zu erzeugen , 3D, Hydrogel eingebettet mikrofluidischen Netzwerken mit wiederholbaren Geometrie und gut definierte Architektur, eine Reihe von Mikrofabrikationstechniken wurden entwickelt, einschließlich modulare Baugruppe 13, 3D - Drucken von Opfermaterialien 16, Montage Direktschreib 14 und omnidirektionalen Druck 15. Die Anwendung dieser Methoden, mikrofluidische Architektur und damit Strömungs- und Transporteigenschaften können wiederholt über viele Konstrukte hergestellt werden. Eine große Einschränkung dieser Ansätze ist jedoch die Unfähigkeit microf zu erstellenluidic Netzwerke mit Kapillar-Größe Merkmale, 4 bis 10 um 19. 150-650 & mgr; m im Durchmesser 13,16 Bereich meisten Mikrofabrikationstechniken werden häufig auf Merkmale beschränkt. Einige existierende Techniken sind in der Lage zur Erzeugung von hierarchischen Netzwerken mit Kanälen in einem breiten Durchmesserbereich von 10 bis 300 um für die Direktschreibanordnung 14, und 18 bis 600 um für omnidirektionale Druck 15, aber sie sind in ihrer Fähigkeit begrenzt dichte Netze zu erzeugen oder mehrere Mikrofluidik - Netzwerke in der Nähe in einem einzigen Konstrukt 7 zu erzeugen.
Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine bildgeführte, laserbasierten Hydrogel Abbautechnik , die wiederholbare Herstellung von biomimetischen ermöglicht, hierarchische mikrofluidischen Netzwerken , die die Architektur der in vivo microvasculature rekapitulieren. Dazu ein 790 nm, 140 Femtosekunden (fs) gepulster Laser, der bei 80 MHz arbeitet, ist rasterabgetasteten in 3D - Positionen innerhalb eines Hydrogels gewünscht, wie es durch Bilder von in vivo Vaskulatur definiert. Wir vermuten , dass der Abbauprozess der laserinduzierten optischen Durchbruch von Wasser arbeitet durch, die resultierende Plasmabildung, die anschließende schnelle thermo Ausdehnung des Wassers und dem lokalen Abbau des Hydrogels als das Wasser 20 erweitert. Dieser Mechanismus unterscheidet sich etwas von laserbasierten Abbau von Protein-basierten Hydrogelen 21-24. Im Gegensatz PEGDA, die einen niedrigen Multiphotonen- Querschnitt hat, Proteine haben oft eine große Multiquerschnitt auf und sind daher über einen Mehrphotonen - Absorption induzierten chemischen Bruch 23 abgebaut. Zur bildgeführten mikrofluidischen Netzwerken, die Laserverschlußeinrichtung wird gesteuert durch bild abgeleitet virtuellen Masken, die aus einem Mosaik von interessierenden Bereichen 9 , die definieren , die mikrofluidische Architektur erzeugen. Mit diesem Ansatz haben wir die Fähigkeit unter Beweis gestellt biomimetische mikrofluidischen herzustellen 3D-Gefäß abgeleitetenic Netzwerke, welche die dichte und gewundene Architektur in vivo Gefäß rekapitulieren, steuern , um lokal die Porosität von Hydrogelen durch die Menge an Energie während des Abbaus geliefert zu verändern. Wir haben auch in der Lage gewesen , zwei unabhängige mikrofluidischen Netzwerken zu erzeugen , die sich in unmittelbarer Nähe verflechten (15 & mgr; m) , aber nie direkt 7 verbinden. Wir haben gezeigt , auch die Fähigkeit , Laser-abgebauten Mikrokanäle durch Post Abbau Funktionalisierung mit dem Integrin Ligieren Peptidsequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin (RGDS) zu endothelialisieren, 7 endothelialen Zelladhäsion und Lumenbildung zu fördern.
Mit diesem Protokoll wird die Erzeugung von komplexen mikrofluidischen Netzwerken in PEGDA Hydrogele möglich über die bildgesteuerte, laserbasierte Abbau eines im Handel erhältlichen Mikroskop zugänglich an vielen Universitäten verwendet. Da der Abbauprozess durch digitale, virtuelle Masken geführt wird, diese Fabricaçãotechnik ist für die kreative Gestaltung von mikrofluidischen Netzwerken zugänglich, seine Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Wir gehen davon aus, dass das hier beschriebene Verfahren am vorteilhaftesten sein wird biomimetische Organ- und Menschen-on-a-Chip - Vorrichtungen, die replizierende biologische Transportprozesse wichtig bei der Modellierung Arzneimitteltransport 2 in der Gestaltung. Diese Herstellungstechnik kann auch für die Erzeugung von in - vitro - Krankheitsmodellen von Interesse sein, einschließlich Krebsmetastasen 5,6 und Blut-Hirn - Schranke Modelle 25. Als laserbasierten Hydrogel Abbau zuvor verwendet wurde , Spuren für die Führung der neuronalen Auswachsens 21-23, die bildgeführte Erweiterung dieser Technik zu schaffen , könnten Zellen in benutzerdefinierten 3D räumlichen Anordnungen als nützlich erweisen , in Strategien Engineering Advanced Tissue zu positionieren.
Protocol
1. Erstellen von virtuellen Masken
HINWEIS: Ein 3D-Bildstapel von Mausgehirn microvasculature wurde als mikrofluidische Modell für dieses Protokoll gewählt, aus einem viel größeren Datensatzes gekeult wurden Bilder einer ganzen Mäusegehirn microvasculature enthält. Die mikrovaskuläre Bilder wurden über Zacke - Scanning - Mikroskopie (KESM) 26, 2 erworben; ähnlich sind mikrovaskulären Daten 28 der KESM Maus - Gehirn - Atlas offen zugänglich durch.
- Öffnen der Bildverarbeitungssoftware 29 und öffnen und beschneiden die 3D - TIF Bildstapel von nativem Vaskulatur so dass die gewünschte mikrofluidischen Netzwerk, um innerhalb des Hydrogels erzeugt werden, passt in einen 450 um x 450 um x 1,5 mm (x durch y von z) Fenster. Dazu ziehen so, ein Quadrat um den gewünschten Bereich und klicken Sie auf "Bild" → "Crop". Entfernen Sie die Scheiben in der z-Richtung von "Bild" → "Duplicate" und geben in einer gewünschten Scheibe klickenAngebot.
HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass die gewünschten Funktionen im Sichtfeld passen (x von y) (531,2 x 531,2 & mgr; m, wenn sie mit einer Bildgröße von 2884 x 2884 Pixeln und einem Zoom von 0,8 ein 20X (NA1.0) Wasserimmersionsobjektiv mit mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop) und der Arbeitsabstand (z) eines 20X (NA1.0) Wasserimmersionsobjektiv. Wenn bekannt, kann das Sichtfeld für andere Systeme durch den Erwerb eines Bildes mit dem gewünschten Ziel und Einstellungen festgelegt werden. - Drehen Sie den Bildstapel, so dass die Funktionen in erster Linie mit der Richtung der Rasterabtastung ausgerichtet sind, oder der x-Richtung, indem Sie auf "Bild" → "Transform" → "Drehen". Dies verringert die Zeit für die Herstellung benötigt wird.
- Skalieren des beschnittenen Bildstapel, so dass die Pixelgröße übereinstimmt oder die Einstellungen für den Abbau auf dem konfokalen Mikroskop verwendet übersteigt (0,184 & mgr; m / Pixel bei einer 20X (NA1.0) Wasserimmersionsobjektiv mit einer Bildgröße von 2884 von 2884 Pixelnund ein Zoom von 0,8). Um dies zu tun, klicken Sie auf "Bild" → "Einstellen" → "Größe" und geben Sie "2446" für "Breite" (dh 450 & mgr; m, oder die Größe des Bildes geteilt durch 0.184 & mgr; m / Pixel).
- Threshold / digitalisieren die Bildstapel von "Strg + Shift + T" eingeben. Deaktivieren Sie "Dunkler Hintergrund", und klicken Sie auf "Übernehmen" → "ok". Beenden Sie den Vorgang, indem Sie auf "Bild" → "Lookup Tables" → "Invert LUT".
- Mit Hilfe eines benutzerdefinierten Algorithmus (Quellcode ist in dem Zusatzmaterial des in Bezug genommenen Manuskript vorhanden) in der Programmiersoftware 9, passen die binarisiert (weiß) verfügt mit einem Mosaik aus einzelnen Pixel hohe Vierecke auf die Richtung der Rasterabtastung parallel (die x -Richtung) zu erzeugen Regionen von Interesse (ROIs), die die Laserposition und Shutter - Führung 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
HINWEIS: Die benutzerdefinierten Algorithmus 9 wandelt jede einzelne Ebene im TIF - Bildstapel auf eine RLS - Datei. - Ändern Sie die Dateierweiterung der RLS-Dateien zur Verwendung während des Abbaus zu .OVL.
2. Konfiguration des Laser-Scanning-Konfokalmikroskop
HINWEIS: Während andere Laserscanmikroskopen mit gepulsten Lasern ausgestattet verwendet werden kann, beschreiben die Einstellungen und das Protokoll hier die Verwendung eines Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) in Verbindung mit ihrer Software.
- Mit dem Laser-Scanning auf konfokalen Mikroskop, öffnen Sie die Mikroskop-Software, und klicken Sie auf "Start-System." Wählen Sie das Ziel "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" im "Pflegen" Registerkarte.
- Einstellen der "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration
- In der "Erwerb" im Register sicherzustellen, dass die Laserlinie (514 nm Argon-Laser) ausgewählt wird, und auf der "Laser" window. HINWEIS: Dieser Kanal Bild verwendet wird , das Hydrogel über Eosin Y Fluoreszenz zur Orientierung 7.
- In der "Imaging Setup" Fenster, stellen Sie den "Mode" auf "Channel Mode" einstellen "Switch jede Spur" auf "Frame", und wählen Sie "Track1".
- In der "Light Path" Fenster, wählen Sie nur die Ch1 Fluoreszenzdetektor, mit einem Bereich von 516 bis 735 nm; ein Hauptstrahlteiler (MBS) 458/514 Filter auf der sichtbaren Lichtlinie; und eine Platte in der unsichtbaren Lichtlinie. Deaktivieren Sie das Hellfeld-Photovervielfacherröhre Detektor, "T-PMT".
- Im "Erfassungsmodus" Fenster, überprüfen Sie, dass das richtige Ziel ausgewählt ist, und stellen Sie die "Scan-Modus" auf "Frame", die "Rahmengröße" auf "2884" in X und Y, die "Linie Step" auf "1" auf "1", das "Mittelungszahl", die "Mittelmodus" auf "Line", der "Mittelungsverfahren" auf "Mittlere", die "Bit-Tiefe "bis" 16 Bit "und die" Richtung "auf" <-> "für die bidirektionale Abtastung.
- In der "Erfassungsmodus" Fenster die "Geschwindigkeit", wie gewünscht und "Corr X" und "Y" auf "0,05" oder anzupassen, wie dies für die spezifische Mikroskop verwendet wird. Deaktivieren Sie "HDR".
- Im "Erfassungsmodus" Fenster, stellen Sie sicher, dass die "Scanbereich" zeigt eine "Bildgröße" von "531,2 um x 531,2 & mgr; m" und ein "Pixel Size" von "0,18", mit einem "Zoom" auf "0,8" ; stellen Sie alle anderen "Scanbereich" Werte auf Null.
- In der "Kanäle" Fenster, wählen Sie "Track1" als Ch1 Fluoreszenzdetektor. Wählen Sie Laserlinie "514", mit einem Prozent Leistung von "10,0", eine "Pinhole" von "1AU", ein erster "Gain (Master)" von "800", ein "Digital-Offset" von "0" und eine "Digital Gain" von4; 1 "gesetzt.
HINWEIS: Stellen Sie diese Einstellungen nach Bedarf für die spezielle Mikroskop verwendet wird. - Speichern Sie diese Konfiguration als "Hydrogele Visualisierung".
- Einstellen der "Kanalbildung" Konfiguration
- In der "Erwerb" im Register sicherzustellen, dass die Laserlinie (790 nm 140 fs gepulsten Ti: S-Laser) ausgewählt ist, und auf der "Laser" Fenster. Set "GDD Correction" bis "4000" für die maximale Ausgangsleistung bei 790 nm.
- Stellen Sie die "Imaging Setup" Fenster wie in Schritt 2.2.2 beschrieben.
- In der "Light Path" Fenster, stellen Sie sicher, dass keine Fluoreszenzdetektoren ausgewählt werden, mit einem MBS 458/514/561/633 Filter auf der sichtbaren Lichtlinie und ein MBS 760+ Filter auf der unsichtbaren Lichtlinie. Deaktivieren Sie das Hellfeld-Photovervielfacherröhre Detektor, "T-PMT".
- Im "Erfassungsmodus" Fenster, überprüfen Sie, dass das richtige Ziel aufgeführt ist. Stellen Sie die "Speed" auf "3"Und alle anderen Einstellungen, wie in Schritt 2.2.4 beschrieben.
- In der "Kanäle" Fenster, wählen Sie "Track1", wie die T-PMT-Detektor. Wählen Sie die Laserlinie "790", mit einem Prozent Kraft von "100,0", ein erster "Gain (Master)" von "800", ein "Digital-Offset" von "0" und eine "Digital Gain" von "1" .
- In der "Stage" Fenster Null auf die Bühne, indem Sie auf "Null gesetzt". Markieren Sie die Position, indem Sie auf "Mark". Dies ist entscheidend für die in Schritt 3 virtuellen Masken zum Mikroskop Makro hochladen.
- In der "Time Series" Fenster stellen "Zyklen" als "1" und "Intervall" als "0".
- In der "Bleach" Fenster, überprüfen Sie die "Start Bleaching nach # Scans" ein und legen Sie es auf einen Wert von "0 von 1". Wählen Sie den "Verschiedene Scan-Geschwindigkeit", mit einem Wert von "3" (entsprechend einem Pixel Verweilzeit von 8,96 & mgr; s / Pixel). Wählen Sie den "Safe bljeweils für GaAsP ".
- In der Laserlinie Abschnitt des "Bleach" Fenster wählen Sie die 790 Laserlinie und stellen Sie die prozentuale Leistung auf "100,0". Lassen Sie alle anderen Felder in der Bleich-Fenster nicht ausgewählt. Speichern Sie die Bleich Einstellungen im "Bleach" Fenster.
- Speichern Sie diese Konfiguration als "Kanalbildung".
HINWEIS: Der "Z-Stack", "Regionen", "Focus" und "Stage" Fenster sind auch wichtig, um dieses Protokoll, müssen aber nicht bei der ersten Konfiguration eingestellt oder angepasst werden.
3. Erstellen einer Rezept-und Hochladen von virtuellen Masken auf die Mikroskop-Software und Makro
- Mit dem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop noch läuft und die Mikroskop-Software noch auf, wählen Sie nur die "Regionen" Fenster (neben dem "Start-Experiment" Taste) in der "Kanalbildung" Konfiguration.
- Um sicherzustellen, dass die Masken zum Mikroskop Makro laden korrektly, setzen Sie in der "Kanäle" Fenster, um die prozentuale Leistung auf "0,2" und "Geschwindigkeit" im "Erfassungsmodus" Fenster in der oberen linken Ecke des Bildschirms auf "8", und klicken Sie auf "Snap".
- Überprüfen Sie, ob die Bildgröße ist immer noch "531,2 um x 531,2 & mgr; m", mit einer Pixelgröße von "0,18" in der Registerkarte "Information" des Bildes. Wenn diese Werte nicht korrekt sind, überprüfen Sie die "Rahmengröße" und "Zoom" wieder Werte.
- KRITISCH: Prüfen, ob die X- und Y-Positionen in der "Stage" Fenster werden auf Null gesetzt und die Position vor dem Öffnen des Mikroskops Makro markiert ist. Siehe 2.3.6 Schritt.
- So öffnen Sie das Mikroskop Makro, Typ "Alt + F8", klicken Sie auf "Laden", und wählen Sie die richtige Version. Details finden Sie in der Liste der spezifische Materialien / Ausrüstung. Eine lange Liste von Unter Makros werden im "Macro Control" Fenster zu öffnen.
- In der "Macro Control" Fenster, klicken Sie auf "Ausführen", um die MICR zu öffnenOscope Makro, und schließen Sie dann die "Macro Control" Fenster.
HINWEIS: Alternative Versionen des Mikroskops Makro kann nicht mit laserbasierten Hydrogel-Abbau unter Verwendung dieses Protokoll kompatibel sein. - In der "Speichern" Reiter des Mikroskops Makro, bieten eine beliebige "Basis-Dateiname", wählen Sie "Single File Output", und wählte eine "temporäre Datei" -Ordner. Stellen Sie "Öffnen Temp-Ordner" auf Position "1", wählen Sie "Single Temporäre Bildordner", und nennen Sie das Rezept in "Store / Apply-Rezept" mit "Recall Standorte Liste" ausgewählt. Klicken Sie auf "Speichern", um zunächst das Rezept erstellen.
- In der "Erwerb" Tab des Makro-Mikroskop, stellen Sie sicher, dass die "Scan-Konfiguration" den Namen an die Mikroskop-Software-Konfiguration eingestellt in Schritt 2.3 angegebenen übereinstimmt. Stellen Sie die "No von Zeitpunkten innerhalb Block" auf "1", mit einem "Interval" von "0". Stellen Sie sicher, dass "Marked Z - Top of the Z Stack "grün markiert. Alle anderen Standardeinstellungen sind in Ordnung, wie sie sind.
- In der "Timing" Reiter des Mikroskops Makro, sicherzustellen, dass "Delay Wait" wird grün hervorgehoben, stellen Sie "Experiment Wiederholungen" und "Gruppe Repetitionen" auf "1" und "Intervall Vor-Block auf den ersten Standort Warten Only" auf "0" . Alle anderen Standardeinstellungen sind in Ordnung, wie sie sind.
HINWEIS: Die "Gruppe Wiederholungen" (und nicht die "Experiment Repetitions") Feld ist , wo man die Anzahl der Male , die Laserscans über einen Bereich festlegen können (dh Wiederholungen des Rezept). - In der "Z-Liste" Registerkarte des Mikroskops Makro werden die Abbauebenen in z-Richtung angegeben. Stellen Sie den z-Abstand "dz", auf "1 & mgr; m", mit der "Anzahl der Positionen" legen Sie die Anzahl der virtuellen Masken passen verwendet werden.
- Klicken Sie auf den "Create Z-Stack", um die "Z-Liste" in der Drop-Down-Li erscheinen zu lassen "Überprüfen Sie st von Locations "in Richtung des unteren Teil des Fensters., Dass die Anzahl der Standorte und z-Abstand korrekt sind und dass die X- und Y-Position auf Null gesetzt werden.
HINWEIS: Wenn sie nicht sind, haben das Rezept nicht speichern; Schließen Sie das Mikroskop Makro, und wiederholen Sie Schritt 2.3.6, bevor das Mikroskop Makro erneut öffnen und wieder das Rezept einrichten.
HINWEIS: Anstatt 100 Masken um 1 um jeweils beispielsweise beabstandet zu haben, kann es vorteilhaft sein, 50 Masken zu haben, die jeweils zweimal eingesetzt und in einem Abstand von 1 & mgr; m, eine äquivalente mikrofluidische Struktur zu erhalten, da die einzelnen Masken zum Mikroskop Makro Beladung kann zeitaufwendig. - In der "Bleach" Reiter des Mikroskops Makro, die alle die Masken müssen mit einem bestimmten nummerierten Position in der "Liste der Standorte" geladen und angepasst werden. Um zu starten, wählen Sie die "Bleach" Box und stellen Sie sicher, dass "Config." der Name der Bleich Einstellungen in der Kurve "Bleach" Fenster im Haupt Mikroskop-Software-Bildschirm (siehe Schritt 2.3.8). Setzen Sie "Warten Delay After Bleach" auf "0", deaktivieren Sie "Spot", und lassen Sie die "ROI" leer.
- Sie nichts in der "Location" ändern, "Tile", "Grid", "Autofocus", "Bausteine" und "Optionen" Tabs von den Standardeinstellungen.
- Um Masken zum Mikroskop Makro laden, wählen Sie nur die "Regionen" Fenster in die Mikroskop-Software und öffnen Sie die "Bleach" Tab des Mikroskop-Makro. In der "Regionen" Fenster, klicken Sie auf "Laden" und wählen Sie die Datei .OVL für die Maske an der Unterseite des z-Stapel abgebaut wird.
HINWEIS: Der erste Standort in der "Z-Liste" ist der Boden des Z-Stapel, und das Mikroskop Makro seinen Weg an die Spitze des Z-Stapel oder Hydrogel. - Sobald die Liste der ROIs in der "Regions" Fenster erscheint, klicken Sie auf den Pfeil, um die ROIs der Maske im Blickfeld zu sehen (auf dem Bild in Schritt geschnappt 3.2). Stellen Sie sicher, dass die ROIs passen innerhalbdas Sichtfeld.
- Um die geladene Maske im Mikroskop Makro speichern, geben die Maske einen Namen und eine Nummer in der "Add Current Region ROI-Liste" auf der "Bleach" Registerkarte und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen Aktuelle Region ROI List" -Taste. Der Name und die Nummer wird in der "ROI" Drop-Down-Liste angezeigt mit anderen Masken (einschließlich Masken aus anderen zuvor erstellten Rezepte). Löschen Sie die Maske in der "Regions" Fenster in die Mikroskop-Software.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.14 und 3.16 zu laden und alle Masken mit dem Mikroskop Makro speichern.
- Um hochgeladene Masken zu jedem Z-Position zuweisen, markieren Sie die Position 1 in der Dropdown-Liste "Liste der Standorte". Wählen Sie den entsprechenden ROI aus dem "ROI" Drop-Down-Liste. Stellen Sie sicher, dass die "Bleach" Fach an der Spitze der "Bleach" Tab im Mikroskop Makro ausgewählt ist.
- Wiederholen Sie Schritt 3,18 für alle Positionen in der Dropdown-Liste "Liste der Standorte", und klicken Sie dann auf "Speichern" auf der &# 34; Speichern ", um die Rezeptur in seiner endgültigen Form zu speichern.
4. Photopolymerisation eine PEGDA Hydrogels
- Herstellung Sterile HEPES - gepufferte Saline (HBS) mit Triethanolamin (TEOA)
- In einem 1-Liter - Becher, 500 ml DI - H 2 O mit einem Rührstab einrühren 2,922 g Natriumchlorid, 1,196 g HEPES und 7,5 ml TEOA in einer Abzugshaube.
- Einstellen auf pH 8,3 mit 1 N Natriumhydroxid-Lösung durch tropfenweise mit einer Pasteur Pipette hinzugefügt wird.
- Sterilfilter die Lösung durch ein 0,2-um-Vakuumfiltration Becher in einen 500-ml autoklavierten Glasmedienflasche. Aliquotieren und lagern bei 4 ° C.
- Bringen Sie einen Ring von doppelseitig klebende mit Unterstützung für eine spezielle 60-mm-Petrischale mit einem 20-mm-Lochausschnitt aus dem Boden. Beim Verlassen des Träger auf dem Klebering, drücken Sie alle Luftblasen zwischen der Petrischale und dem Klebstoff.
- Bereiten Sie die Materialien. Bringen Sie die synthetisierten 33 3.4 kDa PEGDA aus dem -80 ° C Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur bringen. Schalten Sie die Weißlichtquelle mindestens 15 min vor der Photopolymerisation Hydrogelen.
- In einem Abzug, 1 ml HBS mit TEOA mit einer Folie abgedeckten, 2-mL amber Zentrifugenröhrchen (verwendet Belichtung des Fotoinitiators zu verhindern, Eosin Y). In 10 & mgr; l von 1 mM Eosin Y Dinatriumsalz in DI H 2 O.
- In einem Abzug extrahieren ein kleines Volumen von 1-Vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) in ein Becherglas mit einer Pasteur-Pipette. Von diesem Volumen Pipette 3,5 ul NVP in die Bernstein-Zentrifugenröhrchen mit der HBS, TEOA und Eosin Y.
- In einer zweiten Folie bedeckten, 2-mL-Zentrifugenröhrchen amber (verwendet errant Photoaktivierungs der Prepolymer-Lösung zu verhindern), mit 10 mg 3.4kDa PEGDA. Hinzufügen 0,2 ml der HBS, TEOA, Eosin Y, NVP-Lösung für eine 5% w / v PEGDA Präpolymerlösung. Vortex bis zum PEGDA vollständig aufgelöst ist. einen Leistungsmesser und Detektor Stab benutzen, um die Intensität des weißen li einstellenght Quelle bis 95 mW.
- Der Aufbau eines Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Mold
- Bauen Sie ein PDMS - Form 7 auf eine größere Fläche (Glas, Polystyrol - Gewebekulturschale) für eine einfache Handhabung und montieren die Formen , so dass die Form Hydrogele in einem 20 mm Durchmesser - Kreis passen.
- Um einen rechteckig geformten Hydrogel mit einer Dicke von 500 & mgr; m, Platz zwei 500 um dicke PDMS Abstandshalter auf eine PDMS-Oberfläche erzeugen, um zwei definierten Hydrogels Kanten.
- Umfassen eine 300-um-PDMS Spacer eine 300 & mgr; m tiefen Brunnen in der Oberfläche des Hydrogels zu verleihen, die für die Einführung von Flüssigkeiten nützlich ist.
- Pipette 60 ul der 5% w / v PEGDA Präpolymerlösung auf die PDMS-Form. Achten Sie darauf, keine Blasen beim Pipettieren einzuführen.
- Center und legen Sie eine [3- (Methacryloyloxy) propyl] trimethoxysilan (TMPSA) funktionalisiert 7, 40 mm Durchmesser, # 1.5 Deckglas auf der Oberseite der Lösung. Stellen Sie sicher, dass der coverslip ruht auf den 500 um PDMS Spacer. Das Hydrogel wird dem methacrylierten Deck verbinden und das Hydrogel ein Aufschwimmen in der Lösung zu verhindern.
- Legen Sie die PDMS, PEGDA Präpolymerlösung und das Deckglas der Anordnung unter der weißen Lichtquelle für 3 min.
- Strömungs DI H 2 O zwischen der Form und dem Deckglas des Hydrogels von den PDMS zu trennen. Spülen Sie das Hydrogel mit DI H 2 O. Trocknen der Kanten des Deckglases mit Laborgewebe. Achten Sie darauf, nicht zu berühren oder Docht Wasser aus dem Hydrogel.
- Nachdem der Träger von dem Klebstoff entfernt wird, das Deckglas auf die vorbereitete Petrischale anhaften und sanft von Luftblasen zwischen dem Haftmittel und dem Glas entfernen. Tauchen Sie das Hydrogel in der Petrischale mit DI H 2 O.
HINWEIS: Die PDMS - Form kann wiederverwendet werden , um zusätzliche Hydrogele zu machen , wenn mit DI H 2 O gespült, mit Stickstoff getrocknet und gehalten staubfrei.
5. Fabricating Vascular-derived Mikrofluidik-Netzwerks über laserbasierte Degradation
- Mit dem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop und Mikroskop-Software auf, wählen Sie das Ziel "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" im "Pflegen" Registerkarte. In der "Erwerb" Registerkarte, stellen Sie sicher, dass die notwendigen Laserlinien (514 nm Argon-Laser und 790 nm 140 fs gepulsten Ti: S-Laser) sind auf und erwärmt.
- Einstellen des Hydrogels auf einen Einlasskanal zum Formular
- Den Hydrogel und Petrischale auf der Bühne einfügen und legen Sie den Tischeinsatz auf dem Mikroskoptisch. Füllen Sie die Petrischale mit mindestens 5 ml DI - H 2 O - Zentrale die Hydrogel und auch Merkmale von Auge , bevor das Wasser Tauchziel in die DI H 2 O Senkung
HINWEIS: Verwenden Sie das Hydrogel mit dem Ziel-die nicht zerquetschen zwei sollte niemals berühren! - Um das Hydrogel zu finden, wechseln Sie in den "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration aus Schritt 2.2. Klicken Sie auf "Live" auf die Laserlinie zu drehen und bringen the Ziel näher an das Hydrogel, bis das Signal Eosin Y (durch die Ch1 Fluoreszenzdetektor detektiert) von der Oberseite des Hydrogels zu sehen ist.
HINWEIS: Um das Hydrogel leicht zu finden, die prozentuale Leistung erhöht werden kann oder das Pinhole geöffnet werden kann. Sobald das Ziel auf dem Hydrogel fokussiert ist, fallen jedoch die prozentuale Leistung des Fluoreszenzdetektors und verringern die Pinhole zurück zu 1AU zu vermeiden oversaturation des Detektors zu schützen und genau die Hydrogeloberfläche zu finden. - In der "Stage" Fenster markieren Sie die Stellen der Ober- und Unterseite des Hydrogels und der Boden des Bohrlochs.
HINWEIS: Die hier z-Werte bei der Bestimmung der Dicke des Hydrogels und die Tiefe des Brunnens zu helfen. - Verwenden Sie den Joystick in X und Y zu bewegen, um die Kante eines gut zu finden. Legen Sie das Hydrogel auf der rechten Seite des Bildschirms, mit dem Brunnen auf der linken Seite, oder umgekehrt. Ermöglichen das Hydrogel nicht mehr als zwei Drittel des Sichtfeldes zu füllen.
- Drop the plane der Fokus nach unten 150 & mgr; m in das Hydrogel durch die "Step Size" Einstellung im "Focus" Fenster auf "150", und klicken Sie auf den Abwärtspfeil neben dem "Z-Position" -Box. Wiederholen Sie Schritt 5.2.4, falls erforderlich.
HINWEIS: Die x, y und z-Position des Einlasses hängt nur von der Konstruktion der virtuellen Masken. - KRITISCH: Null die X- und Y-Position in der "Stage" Fenster, löschen Sie alle anderen Stellen markiert, und nur diese Position markieren.
HINWEIS: Wenn dieser Schritt nicht durchgeführt wird, wird das Mikroskop-Makro nicht richtig die Positionen in der zuvor gespeicherte Rezeptur Wiederherstellen und das Hydrogel nicht in der gewünschten Position verschlechtert werden.
- Den Hydrogel und Petrischale auf der Bühne einfügen und legen Sie den Tischeinsatz auf dem Mikroskoptisch. Füllen Sie die Petrischale mit mindestens 5 ml DI - H 2 O - Zentrale die Hydrogel und auch Merkmale von Auge , bevor das Wasser Tauchziel in die DI H 2 O Senkung
- Ausbilden eines Einlaßkanals
- "Snap" ein Bild und einen rechteckigen Bereich ziehen, dass der Einlass zu dem Gefäßnetz wird das Rechteck-Button in der "Regions" Fenster.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass ein Teil der Region erstreckt sich in den gut aus, um sicherzustellen, the Einlass wird das gut an das Gefäßnetz verbinden. - Neben dem ROI in der "Regions" Fenster erzeugt, wählen Sie "Acquisition" und "Bleach" und "Analyse" zu deaktivieren.
- Speichern Sie die "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration, deaktivieren Sie "Regions", und wechseln Sie in den "Kanalbildung" Konfiguration einrichten in Schritt 2.3. In der "Kanalbildung" Konfiguration wählen Sie "Regions" wieder.
HINWEIS: Wenn Sie zwischen dem "Hydrogels Visualisierung" und "Kanalbildung" Konfigurationen wechseln, müssen Sie Bereiche in der oberen linken Ecke des Bildschirms zu deaktivieren. Manchmal kann die Skalierung von Regionen unerwartet zwischen Konfigurationen ändern, wenn dies nicht geschieht. - In der "Kanalbildung" Konfiguration, stellen Sie sicher, dass nur "Regionen" und "Z-Stack" ausgewählt werden. In der "Z-Stack" Fenster, klicken Sie auf das "Center" Button oben und dann das "Zentrum" buttauf oben "Offset" in der Mitte des z-Stapel als die aktuelle Z-Position einzustellen. Je nachdem, wie groß der Einlass sein muss, stellen Sie die Anzahl der "Slices" mit einem "Interval" von "1". Die Größe des Z-Stapel wird unter "Range" angezeigt.
- Überprüfen Sie, ob "Speed" im "Erfassungsmodus" Fenster wird auf "3" und dass die "Prozent Power" in der "Kanäle" Fenster wird auf "100". Speichern Sie die Konfiguration und klicken Sie auf den "Start-Experiment" Taste.
HINWEIS: Das Mikroskop-Makro für den Abbau des gleichen einfachen Form auf mehreren Ebenen nicht erforderlich ist, wie hier ausgeführt einen Einlasskanal zu erzeugen. Das Makro ist nur erforderlich, wenn auf jeder einzelnen Ebene verschiedenen Regionen Erniedrigungen, und wird verwendet, um die virtuellen Masken in einem Rezept zu speichern. - Um das Hydrogel während des Abbaus sichtbar zu machen, entweder erhöhen die "Gain (Master)" in der "Kanäle" Fenster, wenn die Region in ter Sichtfeld ist schwarz, oder verringern Sie die "Gain (Master)", wenn die Region weiß ist.
HINWEIS: Die Blasenbildung ist hier ein Anzeichen für laserinduzierten Abbau Hydrogels. - Um verschlechtern sich die Einlass mehrere Male statt nur einmal, stellen Sie die "Zyklen" in der "Time Series" Fenster.
- In der "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration, klicken Sie auf "live", um sicherzustellen, dass der Einlass gebildet wurde.
- "Snap" ein Bild und einen rechteckigen Bereich ziehen, dass der Einlass zu dem Gefäßnetz wird das Rechteck-Button in der "Regions" Fenster.
- Einstellen des Hydrogels bis zu generieren , um den Mikrofluidik - Netzwerk
- In der "Regionen" Fenster laden jede .OVL Datei aus dem Z-Stapel von virtuellen Masken und klicken Sie auf den Pfeil, um die ROIs im Blickfeld zu sehen.
- Klicken Sie auf "Live", um die "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration leben scannen und mit dem Joystick oder die "Stage" Fenster, um das Hydrogel in X und Y zu positionieren, so dass der Einlass innerhalb des Gefäßnetz an die richtige Stelle verbindet.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass dieROIs der virtuellen Maske mit dem zuvor gebildeten Einlass überlappen sich geringfügig. - Löschen Sie die Fokusebene um 50 & mgr; m von der vorherigen zentriert Z-Position oder 200 & mgr; m von der Oberfläche des Hydrogels mit dem "Step Size" im "Focus" Fenster und klicken Sie auf den Abwärtspfeil neben dem "Z-Position "-Box. Dies wird die erste Position im Mikroskop Makro sein.
HINWEIS: Der tatsächliche Abstand in der z-Richtung zu bewegen, abhängig von der Netzwerk-Design. Sicherzustellen, dass das gewünschte Netzwerk nicht über die obere oder untere Oberfläche des Hydrogels in der z-Richtung erstreckt. - KRITISCH: Null die X- und Y-Positionen in der "Stage" Fenster, löschen Sie alle anderen Stellen markiert, und nur diese Position markieren.
HINWEIS: Dies ist der Ausgangspunkt in dem Mikroskop Makro sein. Das Rezept wird funktionieren seinen Weg zurück in Richtung der Oberfläche des Hydrogels. - "Snap" ein Bild in der "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration löschen und deselect "Regionen", und speichern Sie die Konfiguration.
- Die Erzeugung des Mikrofluidik - Netzwerk
- Wechseln Sie in den "Kanalbildung" Konfiguration und nur wählen Sie die "Time Series" und "Bleaching" Fenster. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für die "Time Series" und die "Bleaching" Fenster sind, wie sie zunächst in den Schritten 2.3.7 und 2.3.8 festgelegt wurden.
- Stellen Sie die "Speed" im "Erfassungsmodus" Fenster auf "8" und die prozentuale Leistung der Laserlinie auf "0,2" in der "Kanäle" Fenster. Speichern Sie die Konfiguration.
- Öffnen Sie das Mikroskop Makro folgenden Schritt 3.5. Auf der "Speichern" Registerkarte des Makros, wählen Sie die zuvor gemacht Rezept von Schritt 3 und klicken Sie auf "Übernehmen".
HINWEIS: Klicken Sie auf "Speichern" nicht oder das Rezept überschrieben! - Überprüfen Sie die Einstellungen auf allen Registerkarten und stellen Sie sicher, dass die virtuellen Masken (.OVL-Dateien) werden noch richtig mit t verbunden sinder Z-Positionen in der Dropdown-Liste. Prüfen Sie auch, dass die erste Z-Position entspricht der markierten Stelle im "Stage" Fenster der Mikroskop-Software.
HINWEIS: counterintuitively, der zweite Standort in der Dropdown-Liste wird über die erste Lage sein, physisch, wie das Mikroskop Makro seinen Weg von der Unterseite des Hydrogels arbeiten (die am weitesten vom Ziel entfernt) an die Spitze des Hydrogels (am nächsten zu den Objektiv). - Speichern Sie die "Kanalbildung" Konfiguration erneut, und klicken Sie dann auf "Update" im Mikroskop Makro. Klicken Sie auf "Nein" auf "Überschreiben Aktueller Standort Liste?", Und klicken Sie dann auf "Start" in das Mikroskop Makro, das Rezept zu beginnen.
6. Visualisierung der Mikrofluidik-Netzwerk
- Um das Hydrogel und das gebildete mikrofluidischen Netzwerk nach dem Abbau anzuzeigen, schließen Sie das Mikroskop Makro. Wechseln Sie auf die "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration der Eosin Y si anzuzeigengnal des Hydrogels; das abgebaute Netzwerk erscheint dunkel.
HINWEIS: Der Abbau Hydrogels nicht sichtbar gemacht werden, während das Mikroskop-Makro ausgeführt wird. - Um das mikrofluidische Netzwerk speziell anzuzeigen, verwenden Sie die "Hydrogels Visualisierung" Konfiguration bei einer geringeren Laserleistung die Abbildung von eingeführt Fluorescein (FITC) -markierten Dextran zu ermöglichen, die ein helleres Signal als das native Eosin Y-Signal des Hydrogels hat.
- Vor dem fluoreszenzmarkierten Dextran Einführung Docht Wasser aus dem Brunnen in dem Hydrogel Labor Gewebe verwendet wird. Pipette in 10 & mgr; l von 5 mg / mL 2,000 kDa FITC-markiertes Dextran in DI H 2 O (vorgefilterten durch ein 0,2-um - Spritzenfilter).
HINWEIS: Verwenden Sie eine beliebige Dextran Größe 2.000 kDa oder größere Diffusion in das Gel zu verhindern. Wenn Abbildungs länger als 30 min, verwenden Sie einen inkubiert Stufe mit 60% Feuchtigkeit (oder höher) Hydrogel Trocknung und Verdampfung von Wasser aus dem FITC-markiertes Dextran-Lösung zu verhindern. - Entfernen Sie das Hydrogel einnd Petrischale von der Bühne und markieren Sie die Petrischale die einfache Lage des gebildeten Gefäßnetz während der späteren Experimente zu ermöglichen.
Representative Results
Um die Implementierung von bildgeführten, laserbasierten Hydrogel Abbau zeigen ein 3D zu erzeugen, Gefäß abgeleiteten mikrofluidischen Netzwerk verwendeten wir einen 3D - Bildstapel von Maus - Gehirns Gefäßen , die über Zacke - Scanning - Mikroskopie (KESM) 26, erworben wurde 27 . Eine ausgewählte 3D-Region des größeren mikrovaskulärer Datensatz wurde in eine Reihe von virtuellen Masken für bildgesteuerte mikrofluidischen Netzwerkbildung umgewandelt, wie oben beschrieben. Nach der Herstellung wurde das resultierende mikrofluidischen Netzwerk mit einer Lösung von FITC-markiertem, 2.000 kDa Dextran und abgebildet durch konfokale Mikroskopie perfundiert. Der Bildstapel der in vivo Vaskulatur, die die Netzwerkarchitektur (1A und C) und der hergestellte mikrofluidischen Netzwerk (1B und D) definiert wurden verwendet Z-Vorsprünge (1A und B) und 3D - Renderings (Abbildung 1C zu erzeugen , und D in vivo Vaskulatur rekapitulieren. Die Technik ist zugänglich für die Herstellung von Netzwerken ein breites Spektrum von Durchmessern enthält; in Abbildung 1, angefangen Kanäle 3,3-28,8 & mgr; m im Durchmesser erzeugt wurden. Beachten Sie, dass die größere rechteckige Struktur in der oben links in Figur 1B und in der linken Ecke der Figur 1D der Einlasskanal ist Strom in das Netz einzuführen.
Abbildung 1: Vascular-Derived Mikrofluidik - Netzwerk. Eine Reihe von virtuellen Masken, abgeleitet von einem Bildstapel von Maushirn Vaskulatur (A und C), wurden verwendet Fabricaçãote ein 3D - biomimetischen mikrofluidischen Netzwerk eingebettet in einem PEGDA Hydrogel (B und D) über die bildgesteuerte, laserbasierte Abbau. Das Mikrofluidik-Netzwerk wurde mit 2.000 kDa FITC-markiertem Dextran durchbluteten und über die konfokale Mikroskopie abgebildet. Z-Vorsprünge (A und B) und 3D - Renderings (C und D) der beiden Netze zeigen die Fähigkeit mikrofluidischen Netzwerke zu erzeugen , die die Dichte, die Organisation und Gesamtarchitektur in vivo Vaskulatur rekapitulieren. Der Pfeil (D) markiert den rechteckigen Einlass geschaffen , um die Dextran einzuführen. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wir haben zwei Methoden implementiert, Druckköpfe und Spritzenpumpen, Flüssigkeits f einzuleitenniedrig in diesen eingebettet mikrofluidischen Netzwerken. Zum Beispiel wurde ein 30 um 30 & mgr; m rechteckigen Kanal hergestellt zwei Vertiefungen in einer micromolded PEGDA Hydrogel (2A) zu verbinden, mit Fluidstrom über einen Druckkopf 7 angetrieben. Erzeugt in den Brunnen links, fließen durch den Mikrokanal und in den Brunnen der Druckkopf auf der rechten Seite induziert. In 2A ist eine erste vor Tetramethylrhodamin (TRITC) -markiertem 70 kDa - Dextran wurde durch den Kanal unter Verwendung von Zeitraffermikroskopie beobachtet bewegen. Später in 2B, 10 & mgr; m Durchmesser fluoreszierende Polystyrolkugel floss aus dem Brunnen links, durch den Kanal, auf dem Brunnen auf der rechten Seite . Mit der Dauer der Strömung durch das Volumen des vorhandenen Fluids in dem Bohrloch an dem Einlass micromolded gesteuert und die Fließgeschwindigkeit durch den hydrostatischen Gradienten zwischen dem Einlaß erzeugte gesteuert und gut Auslass, Druckkopf-driven Strömung in micromolded Hydrogele bietet eine einfache Methode für die Strömung inohne die Notwendigkeit für ein externes Gehäuse oder eine Spritzenpumpe Produktion.
Bild 2: Druckkopf-Driven Fluss in einem Micromolded PEGDA Hydrogels. PEGDA wurde micromolded ein Hydrogel zu bilden, die zwei Vertiefungen durch einen eingebetteten Mikrokanal verbunden ist. Ein Druckkopf wurde in der linken und einzuleiten Fluss TRITC-markierten, 70 - kDa - Dextran (A1-A3) und 10 & mgr; m Polystyrolkugel (B1-B3) durch ein 30 um 30 & mgr; m rechteckigen Kanal von einer Vertiefung auf die erzeugten andere. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Alternativ konstanten Fluidströmung innerhalb mikrofluidischen Netzwerken zu erzeugen, Spritzenpumpe angetriebenen fNieder kann durch Photopolymerisation das Hydrogel innerhalb eines sekundären Mikrofluidikvorrichtung mit Einlass- und Auslassöffnungen für Spritzenpumpe Interfacing eingeleitet werden. In 3A wird ein handelsüblicher, wird vorgefertigte mikrofluidischen Vorrichtung mit einem 1-mm - Band aus Hydrogel über die Breite der Vorrichtung 7 photopolymerisiert gezeigt. Laser-basierten Abbau wurde implementiert, um mikrofluidische Kanäle und Netzwerke in untergebracht Hydrogele herzustellen und mit demselben Protokoll hier beschrieben für Hydrogele freistehend. Spritzenpumpe generierten Fluss kann in 3B zu sehen ist, wo eine 20-Mikrometer Durchmesser zylindrischen Kanal in einem Hydrogel in einer mikrofluidischen Vorrichtung untergebracht hergestellt wurde. In diesem 20-Mikrometer Durchmesser Kanal, individuelle 2 um fluoreszierende Polystyrolkugeln werden ohne Fluidströmung (Abbildung 3B1) leicht gelöst werden , während , wenn eine 5 & mgr; l / s Strömungsgeschwindigkeit angewendet wird, die Kugeln durch das Sichtfeld bewegen, wie durch Ausstreichen bewiesen (Abbildung 3B2 </ Strong>). Dieser gleiche Ansatz verwendet wurde Fluss durch eine 2D, Gefäß abgeleitete Netzwerk zu induzieren zu überwachen Fluss von TRITC-markierten, 65 kDa Dextran durch das Netzwerk und die Diffusion in das umgebende Hydrogel (3C).
Abbildung 3: Spritzenpumpe Getriebene Strömung in PEGDA Hydrogele Einpolymerisiertes in Mikrofluidik - Gehäuse. Ein im Handel erhältlicher, vorgefertigten Mikrofluidikvorrichtung (A) mit einem 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) Mikrokanal beherbergt eine photopolymerisierte 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA Hydrogels durch die angegebenen schwarzer Pfeil. Ein 20 & mgr; m Durchmesser zylindrischen Kanal wurde durch das Hydrogel abgebaut, und 2 & mgr; m Polystyrolkugeln wurden durch die Vorrichtung (B) gepumpt. Die Kugeln sind klar ohne Flüssigkeitsströmung (B1) gelöst, aber sie erscheinen als Streifen mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 & mgr; l / s(B2). In einem anderen untergebracht Hydrogel, ein 2D - vaskulären abgeleitetes Netzwerk hergestellt wurde und TRITC-markierten 65 kDa - Dextran wurde durch das Netzwerk (C) gepumpt. Zeitraffer-Mikroskopie wurde verwendet, um die Fluoreszenz-Dextran zu überwachen, wie es die Kanäle und diffundiert in das umgebende Hydrogel gefüllt. Weiße Pfeile in (B) und (C) zeigen die Richtung der Fluidströmung. Die Kalibrierungs bar in (C) zeigt die Intensität des fluoreszierenden Dextran. Die Skalierungsbalken stellen 20 & mgr; m in (B1) und (B2) und 50 & mgr; m in (C). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Kritisch in die Standardfunktionen des Mikroskop-Software überschreibt die Verwendung von virtuellen Masken für bildgesteuerte, laserbasierte Abbau zu ermöglichen, muss das Mikroskop Makro sorgfältig Setup und manipuliert werden. Wie die Mikroskop-Software-Schnittstellen mit dem Mikroskop Makro kann manchmal nicht eingängig sein, und viel Aufwand wurde bei der Ermittlung der optimalen Einstellungen in beiden Programmen investiert, um diese Methode zu entwickeln. Ein allgemeines Verständnis der grundlegenden Laser-Scanning-Konfokalmikroskop Verwendung wird empfohlen, insbesondere mit der "Stufe" und "Focus" Fenster für das Auffinden und die Positionierung korrekt des Hydrogels in den x, y und z-Dimensionen, vor laserbasierten Abbau versucht. Darüber hinaus ist die Herstellung eines Einlasskanals zum Protokoll kritisch; suspendiert fluoreszierende Spezies müssen die mikrofluidische Systeme für die erfolgreiche Bildgebung und Netzwerk Charakterisierung eingeben können. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll zu einem bestimmten gilt laser-konfokalen Mikroskop mit einem bestimmten Femtosekunden gepulsten Laser konfiguriert, laufen bestimmte Versionen der Mikroskop-Software und das Mikroskop-Makro (siehe Details in der Liste der spezifische Materialien / Ausrüstung). Wir haben entdeckt, dass neuere Versionen des Mikroskops Makro fehlt die notwendige Kontrolle und Funktionalität für bildgesteuerte Lasersteuerung benötigt. Während andere Mikroskop Plattformen und gepulste Laserquellen verwendet werden kann, wendet dieses Protokoll für dieses System spezifisch und Modifikation benötigen nach der Plattform Laserquelle und implementierte Software. Die zugrunde liegenden Prinzipien in diesem Protokoll gelten jedoch weiterhin.
Eine mögliche Änderung dieses Protokoll beinhaltet die Änderung der Hydrogel-Zusammensetzung. Hier verwendeten wir 5 Gew%, 3,4 kDa PEGDA Hydrogele, aber laserbasierten Abbau (für die Zwecke abgesehen von mikrofluidischen Netzwerk Generation) implementiert wurde sowohl synthetische als auch natürliche Hydrogele abzubauen, einschließlich pegyliertes Fibrinogen 21,22, Seidenprotein Hydrogele 23 und Kollagen 24. Die Einstellung der Laserleistung, Abtastgeschwindigkeit, den Abstand zwischen den Z-Scheiben, und die Anzahl der Wiederholungen wird bei der Bestimmung der optimalen Parameter unterstützen zu mikrofluidischen Netzwerken in anderen Hydrogel-Formulierungen herzustellen.
Eine Strombegrenzung der Technik ist das Gesamtvolumen des Hydrogels, das in einem durchführbar Zeitspanne abgebaut werden kann. Um offene Hohlräume oder mikrofluidischen Funktionen innerhalb des Hydrogels schaffen, wohnen die Laserzeit muss bei oder über 8,96 & mgr; s / Pixel (oder eine Laser - Scan - Geschwindigkeit von 0,021 & mgr; m / & mgr; s) , wenn ein Laser - Fluenz von 37,7 nJ / & mgr; m 2 verwendet wird . Mit diesen Einstellungen, dauert es 1,4 h Gefäße zu degradieren innerhalb eines 0,014 mm 3 Volumen (wie in Abbildung 1 zu sehen ist ). Mit einem Laser Verweilzeit von 4,48 & mgr; s / Pixel oder unten, lieferte die Energie ist nicht genug für die vollständige Abbau des Hydrogels Formulierung hier verwendet. Die Implementierung eines unterschiedlichen HydrogelZusammensetzung könnte diese Einschränkung zu überwinden. Die Verwendung von photolabilen Gele , die lichtempfindlichen Komponenten 34-36 oder Hydrogele enthalten , die große Mehrphotonenquerschnitte 21-24 sind gute Möglichkeiten, die die Verwendung von weniger Energie ermöglichen würde und zu einem schnelleren Abbau führen würde. Im Hinblick auf Maßbegrenzungen wurden Merkmale bis 1,5 mm tief in das Hydrogel 7 hergestellt werden. Die Tiefe erzielbar ist eine Funktion des Arbeitsabstands der Objektiv und kann mit extrem großen Arbeitsabstand Ziele für in vivo Bildgebung optimiert werden erhöht. Der kleinste gemessene Kanal 7 erstellt ein 20X (NA1.0) Wasserimmersionsobjektiv mit hatte eine Breite von 3,3 & mgr; m und einer Tiefe von 8,9 um, die mit der Größe der kleinsten Kanäle auf einer Stufe erzeugt wird in Abbildung 1. Während andere Labore niedriger NA Ziele 21,23,24 verwendet haben, erwarten wir , dass mikrofluidischen Netzwerken mit kleineren Merkmalen hohe erzeugt werden kann unter Verwendung voner NA Ziele auf Kosten eines reduzierten Arbeitsabstand. Letztlich aber die Auflösung der Technik ist eine Funktion der Punktverteilungsfunktion des fokussierten Laserstrahls, die Laserscan Eigenschaften, die Menge an Energie, die durch den Laser geliefert, und die Laserabsorptionseigenschaften des Materials verschlechtert wird.
Proteinbasis gegen synthetische: Weiterhin Lasereigenschaften (Geschwindigkeit, Fluenz, der Abstand zwischen der virtuellen Masken und die Anzahl der Wiederholungen) sind basierend auf Hydrogeleigenschaften (Vernetzungsdichte, Makromer / Monomer-Molekulargewicht, Gewichtsprozent, und der Art des Hydrogels optimiert wie diese), werden von Natur aus Interaktionen mit dem Laser zu verändern und damit die endgültige Auflösung des Prozesses. Da die zugeführte Energie auch durch das Ziel verwendet wird, zusätzliche Optimierungs beeinflusst wird erforderlich, wenn zwischen den Zielsetzungen Schalt. Im Hinblick auf die damit verbundenen Kosten, der Zugang zu einem Mikroskop mit einem gepulsten Laser erforderlich ist, und während viele verschiedene objectiven kann verwendet werden, können solche mit einer hohen NA und langen Arbeitsabstand (für in vivo imaging) teuer sein.
Darüber hinaus das Protokoll hier detailliert, erzeugt mikrofluidischen Netzwerken unter Verwendung dieser Technik kann auch mit zelladhäsive Peptide post-Kanal Fertigung funktionalisiert werden 7 Endothelzelladhäsion und Lumenbildung zu induzieren. Zusätzlich könnte der Einbau von zell abbaubares Peptidsequenzen in das Schüttgut 9 vor Degradation zu Kanal für die Untersuchung der Zellwanderung erlauben , in und durch das Hydrogel. Für eine kontinuierliche Fluidisierung des Mikrofluidik - Netzes innerhalb des Hydrogels können Hydrogele in größeren fluidischen Vorrichtungen oder Gehäuse photopolymerisiert werden, wie 7 in den Figuren 2 und 3 gezeigt.
Die Erzeugung von Gefäßnetze über vaskulogener oder angiogenen Selbstorganisation 8-12 bietet einen einfachen Ansatz va zu induzierenscularization über einen relativ großen Volumen Hydrogels. Während dieser Ansatz in perfundierbaren fluidische Netzwerke ergibt, ist es schwierig, direkt die Größe zu steuern, Tortuosität, Dichte und Gesamtnetzarchitektur. Aufgrund dieser Einschränkung kann das Strömungsprofil und die Scherraten in der Vaskulatur zwischen den Experimenten unterscheiden. Alternativ erlauben Techniken Mikro 13-16 für die direkte Kontrolle über die Netzwerk - Architektur werden jedoch oft begrenzt durch ihre Unfähigkeit , kleine, Kapillar-Größe Kanäle oder die Herstellung von dichten Netzen zu erzeugen , die in vivo Gefäßarchitektur nachahmen. Während der Laser-basierten Hydrogel Abbautechnik skizzierte hat für mikrofluidische Generation repurposed neu ist, überwindet sie gleichzeitig sowohl die architektonische Kontrolle und größenbasierte Grenzen der bestehenden Mikrofabrikationsmethoden durch die Erstellung von 3D biomimetische mikrofluidischen Netzwerken ermöglicht, die die Dichte, die Verwindung rekapitulieren, Größenbereich, und die allgemeine architecture von in vivo Vaskulatur. Darüber hinaus können mehrere fluidische Netzwerke in einem Hydrogel erzeugt werden, so dass die Untersuchung von Internetzwerktransport 7. Für Tissue - Engineering - Anwendungen , die mehr replizieren eng in vivo Transportprozesse in vitro streben danach, die hochaufgelöste Hydrogel eingebettet mikrofluidischen Netzwerken hier skizziert sind gut geeignet. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll in Entwicklungsgewebekonstrukte nützlich sein wird , dass genauer nachahmen in vivo Transport für die Verwendung als Arzneimittel - Screening - Geräte und In - vitro - Krankheitsmodellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
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