Abstract
Denna detaljerade protokoll beskriver genomförandet av bildstyrd, laserbaserade hydrogel nedbrytning för tillverkning av vaskulära härrörande mikroflödes nätverk inbäddade i PEGDA hydrogeler. Här beskriver vi skapandet av virtuella masker som möjliggör bildstyrd laserstyrning; fotopolymerisation av en micromolded PEGDA hydrogel, som lämpar sig för mikroflödes nätverk tillverkning och tryckhöjd driven strömning; installationen och användning av en kommersiellt tillgänglig laserskanning konfokalmikroskop parat med en femtosecond pulsad Ti: S laser för att framkalla hydrogel nedbrytning; och avbildning av fabricerade mikroflödes nätverk med fluorescerande ämne och konfokalmikroskopi. En stor del av protokollet är inriktad på korrekt installation och genomförande av mikroskop programvara och mikroskop makro, eftersom dessa är viktiga steg i att använda en kommersiell mikroskop för mikroflödestillverkningsändamål som innehåller ett antal invecklade. Den bildstyrd del av denna technique medger för genomförandet av 3D-bildstaplar eller användargenererade 3D-modeller, vilket gör det möjligt för kreativ mikrofluidisk design och för tillverkning av komplexa mikroflödessystem av praktiskt taget vilken som helst konfiguration. Med en förväntad inverkan på vävnadsteknik, kan de metoder som beskrivs i detta protokoll underlätta tillverkning av avancerade biomimetiska microtissue konstruktioner för orga- och mänskliga-on-a-chip-enheter. Genom att imitera komplex arkitektur, slingrighet, storlek och täthet in vivo kärl kan väsentliga biologiska transportprocesser replikeras i dessa konstruktioner, vilket leder till mer exakt in vitro modellering av farmakokinetik och sjukdoms drog.
Introduction
Kärlsystemet, som består av både lymfatiska och cardiovasculature, blanketter mycket täta nätverk som är nödvändiga för transport av näringsämnen och syre och för avlägsnande av metaboliska avfall. Följaktligen celler som bor i vaskulariserade vävnader är aldrig mer än 50-100 um bort från ett fartyg 1. Förmågan att reproducera in vivo kärl arkitektur in vitro är avgörande för att noggrant modellera in vivo transportprocesser med hjälp av manipulerade konstruktioner. Med en ny enhet för att utveckla organ-on-a-chip anordningar 2 för hög genomströmning drog screening 3,4 och sjukdom modellering 5,6, metoder skapa mikroflödes nätverk som rekapitulera in vivo-liknande transport i syntetiska eller naturliga hydrogeler ritar stort intresse. För att öka biomimicry av microtissues används i dessa enheter, har vi utvecklat en bildstyrd, laserbaserad metod hydrogel nedbrytning som utnyttjar tredimensionellal (3D) bild högar av infödda kärl som mallar för att generera kärl härrörande mikroflödes nätverk inbäddade i PEGDA hydrogeler 7. Detta protokoll beskriver användningen av en kommersiellt tillgänglig laserskanning konfokalmikroskop utrustad med en femtosecond pulsad laser för att tillverka kärl härrörande, biomimetiska mikroflödes nätverk i PEGDA hydrogeler via bildstyrd, laserbaserad nedbrytning.
Nuvarande metoder för att fluidisera hydrogeler inkluderar induktion av vaskulär 8-10 eller angiogena 10-12 endotelceller själv monterings- och mikrotillverkningstekniker för att skapa fördefinierade kanaler för endotelisering 13-16. Även om självmonterade nätverk sammanfatta densiteten och komplex arkitektur av mikrovaskulaturen, de är ofta mer genomsläpplig än in vivo nätverk 11,17,18, vilket kan vara problematiskt vid modellering transport för drogscreening applikationer. Själv monterade nätverk består av physiologtiskt relevant, kapillär stora fartyg, men de kan vara svåra att integrera med bulkvätskeflöde på grund av begränsningar i att generera större arteriole stora fartyg. Eftersom det inte finns någon direkt kontroll över sammansättningen av dessa nätverk, kan den slutliga arkitekturen variera från prov till prov, vilket gör det svårt att upprepade gånger producera nätverk med samma vätskeflöde och transportegenskaper.
För att generera 3D, hydrogel-inbäddade mikroflödes nätverk med repeterbar geometri och väldefinierade arkitektur, har ett antal mikrotillverkningstekniker utvecklats, inklusive modulanordning 13, 3D-utskrifter av offermaterial 16, direktskriv montering 14, och rundstrålande utskrift 15. Tillämpa dessa metoder, mikroflödes arkitektur, och därför vätskeflöde och transportegenskaper, kan upprepade gånger tillverkas i många konstruktioner. En viktig begränsning av dessa tillvägagångssätt är emellertid oförmågan att skapa microfluidic nätverk med kapillära stora funktioner, 4 till 10 | im 19. De flesta mikrotillverkningstekniker är ofta begränsade till funktioner som sträcker sig från 150 till 650 mikrometer i diameter 13,16. Vissa befintliga tekniker kan generera hierarkiska nät med kanaler inom en rad bred diameter, 10-300 um för direktskrivenheten 14, och 18 till 600 pm för rundstrålande utskrift 15, men de är begränsade i sin förmåga att generera täta nätverk eller att producera flera mikroflödes nätverk i närheten inom en enda konstruktion 7.
För att övervinna några av dessa begränsningar, har vi utvecklat en bildstyrd, laserbaserad teknik hydrogel nedbrytning som möjliggör repeterbar tillverkning av biomimetisk, hierarkiska mikroflödes nätverk som rekapitulera arkitektur in vivo mikrocirkulation. För att göra detta, en 790 nm, 140 femtosecond (fs) pulsad laser som arbetar vid 80 MHz är raster-avsöks in önskad 3D platser inom en hydrogel, enligt definitionen i bilder av in vivo kärl. Vi spekulerar att nedbrytningsprocessen fungerar via laserinducerad optisk uppdelning av vatten, den resulterande plasmabildningen, den efterföljande snabba termoelastisk expansion av vatten, och den lokala nedbrytning av hydrogelen som vattnet expanderar 20. Denna mekanism varierar något från laserbaserad nedbrytning av proteinbaserade hydrogeler 21-24. Till skillnad PEGDA, som har en låg multifoton tvärsnitt, proteiner har ofta en stor multifoton tvärsnitt och därför bryts ned via en multifoton absorption-inducerad kemisk brott 23. För att generera bildstyrd mikroflödes nätverk, är laser slutare styrs av bild härrör virtuella masker, som består av en mosaik av regioner av intresse 9 som definierar mikroflödes arkitektur. Med hjälp av denna metod, har vi visat förmåga att tillverka 3D vaskulär härrörande biomimetisk mikrofluidic nätverk, som sammanfatta den täta och slingrande arkitekturen i in vivo kärlsystem, i syfte att styra lokalt porositeten hos hydrogeler genom att förändra den mängd energi som avges under nedbrytning. Vi har också kunnat generera två oberoende mikroflödes nätverk som flätas samman i omedelbar närhet (15 pm) men aldrig direkt ansluta 7. Vi har också visat förmåga att endothelialize laser nedbrutna mikrokanaler genom inlägget funktionalise nedbrytning med integrinet ligering peptidsekvensen, Arginine-Glycine-Aspartic Acid-serin (RGDS), för att främja endotelcellsadhesion och lumenbildning 7.
Med detta protokoll är generering av komplexa mikroflödes nätverk i PEGDA hydrogeler möjliggörs via bildstyrd, laserbaserad nedbrytning med användning av en kommersiellt tillgänglig mikroskop tillgänglig på många universitetsområden. Som nedbrytningsprocessen styrs av digitala, virtuella masker, denna Fabricaringsteknik är mottaglig för den kreativa utformningen av mikroflödes nätverk, vilket gör att dess användning i en mängd olika tillämpningar. Vi räknar med att den metod som beskrivs här kommer att vara mest fördelaktiga i att utforma biomimetiska organismer och mänskliga-on-a-chip anordningar som kan replikera biologiska transportprocesser viktiga i modellering läkemedelstransport 2. Denna tillverkningsteknik kan också vara av intresse för generering av modeller in vitro sjukdom, inklusive cancer metastaser 5,6 och blod-hjärnbarriären modeller 25. Som laserbaserade hydrogel nedbrytning har tidigare använts för att skapa spår för ledning av neuronal utväxt 21-23, kunde bildstyrd förlängning av denna teknik vara användbar i avancerade vävnadsteknik strategier för att positionera celler i användardefinierade 3D rumsliga arrangemang.
Protocol
1. Generera Virtuella Masker
OBS: En 3D-bild bunt mushjärna mikrocirkulation valdes som mikroflödesmodell för detta protokoll, ha gallrats från en mycket större datamängd som innehåller bilder av en hel mus hjärna mikrocirkulation. Mikrovaskulära bilder förvärvades via eggvassa svepmikroskop (KESM) 26, 2; liknande mikrovaskulära data öppet tillgänglig via KESM Mouse Brain Atlas 28.
- Öppna bildbehandlingsprogram 29 och öppen och beskära 3D TIF bildstapel av infödda kärl så att den önskade mikroflödes nätverk, som ska genereras i hydrogel, passar i en 450 pm x 450 pm x 1,5 mm (x av y med z) fönster. För att göra detta, dra en fyrkant runt önskat område och klicka på "Bild" → "Crop". Ta bort skivor i z-riktningen genom att klicka på "Bild" → "duplicate" och skriv in en önskad skivaräckvidd.
OBS: Detta säkerställer att de önskade egenskaperna passar inom synfältet (x av y) (531,2 x 531,2 pm när du använder en 20X (NA1.0) nedsänkning i vatten mål med en bildstorlek på 2,884 x 2,884 pixlar och en zoom på 0,8 med en laserskanning konfokalmikroskop) och arbetsavståndet (z) av en 20X (NA1.0) nedsänkning i vatten mål. Om okänd, kan synfältet för andra system bestämmas genom att förvärva en bild med det önskade målet och inställningar. - Rotera bilden stacken så att funktioner i första hand inriktade med riktningen för rasterskanning, eller x-riktningen, genom att klicka på "Bild" → "Trans" → "Rotera". Detta minskar den tid som behövs för tillverkning.
- Skala beskurna bilden stacken så att pixelstorlek lika med eller överstiger de inställningar som används för nedbrytning på konfokalmikroskop (0,184 um / pixel när du använder en 20X (NA1.0) nedsänkning i vatten mål med en bildstorlek på 2884 med 2,884 pixlaroch en zoom på 0,8). För att göra detta, klicka på "Bild" → "Justera" → "Size" och skriv in "2446" för "Bredd" (dvs 450 pm, eller storleken på bilden delat med 0,184 um / pixel).
- Tröskel / binärisera bilden stacken genom att skriva "Ctrl + Skift + T". Avmarkera "mörk bakgrund", och klicka på "Apply" → "OK". Avsluta processen genom att klicka på "Bild" → "uppslagstabeller" → "Invertera LUT".
- Med hjälp av en anpassad algoritm (källkoden är tillgänglig i det kompletterande materialet av den refererade manuskriptet) i programmeringsprogrammet 9, montera binäriseras (vit) har med en mosaik av enstaka pixel hög quadrilaterals parallellt med riktningen av rasterskanning (x -riktningen) för att generera områden av intresse (ROI) som styr laserläge och slutaren 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
OBS: Den anpassade algoritm 9 omvandlar varje enskild plan i TIF bildstapel till en RLS-fil. - Ändra filen förlängning av RLS-filer till .OVL för användning under nedbrytning.
2. Konfigurera Laser-scanning konfokalmikroskop
OBS: Även om andra laserskanningsmikroskop utrustade med pulsade lasrar kan användas, inställningar och protokoll här beskriver användningen av en laserskanning mikroskop (LSM) i samband med sin programvara.
- Med laserskanning konfokalmikroskop, öppna mikroskop programvara, och klicka på "Start System." Välj målet "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" i fliken "Behåll".
- Ställa in "Hydrogel Visualization" Konfiguration
- I "Förvärv" -fliken, se till att laserlinjen (514 nm argonlaser) väljs och i "Laser" window. OBS: Denna kanal används för att avbilda hydrogel via eosin Y fluorescens för orienteringsändamål 7.
- I "Imaging Setup" fönstret, ställ in "Mode" till "Channel Mode", ställ in "Switch spåra varje" till "Frame", och välj "Track1".
- I "Light Path" fönstret väljer endast Ch1 fluorescerande detektor, med en räckvidd på 516-735 nm; helljus splitter (MBS) 458/514 filter på synligt ljus linje; och en platta i osynligt ljus linje. Avmarkera den ljusa fält fotomultiplikatorrör detektor, "T-PMT".
- I "Acquisition Mode" fönster, kontrollera att rätt mål väljs och ställ in "Scan Mode" till "Frame", den "Frame Size" till "2884" i X och Y, "Line Step" till "1" , "Antal medelvärde" till "1", den "medelvärde Mode" till "Line", den "genomsnittsmetoden" till "Mean", den "Bitdjup "till" 16 bit "och" Direction "till" <-> "för dubbelriktad skanning.
- I "Acquisition Mode" fönstret, ställ in "Speed" som önskas och ställ in "Corr X" och "Y" till "0,05" eller justera vid behov för den specifika mikroskop som används. Nollställ "HDR".
- I "Acquisition Mode" fönster, se till att "Scan Area" visar en "Image Size" av "531,2 um x 531,2 um" och "Pixel storlek" av "0,18", med en "Zoom" inställt på "0,8" ; ställa in alla andra "Scan området" värden till noll.
- I "kanaler" fönstret, välj "Track1" som fluorescerande detektor Ch1. Välj laserlinjen "514", med en procent makt "10,0", en "Pinhole" av "1AU", en initial "Gain (Master)" av "800", en "Digital Offset" av "0", och en "Digital Gain" av4; 1 ".
OBS: Justera inställningarna efter behov för den specifika mikroskop som används. - Spara denna konfiguration som "Hydrogel Visualization".
- Ställa in "kanalbildning" Konfiguration
- I "Förvärv" -fliken, se till att laserlinjen (790 nm 140 fs pulsade Ti: S laser) väljs och i "Laser" fönstret. Ställ in "GDD Correction" till "4000" för maximal uteffekt på 790 nm.
- Ställ in "Imaging Setup" fönstret som beskrivs i steg 2.2.2.
- I "Light Path" fönster, se till att inga fluorescerande detektorer väljs med en MBS 458/514/561/633 filter på synligt ljus linje och en MBS 760+ filter på osynligt ljus linje. Avmarkera den ljusa fält fotomultiplikatorrör detektor, "T-PMT".
- I "Acquisition Mode" fönster, kontrollera att rätt mål är noterat. Ställ in "Speed" till "3"Och alla andra inställningar som beskrivs i steg 2.2.4.
- I "kanaler" fönstret, välj "Track1" som T-PMT detektor. Välj laserlinjen "790", med en procent makt "100,0", en initial "Gain (Master)" av "800", en "Digital Offset" av "0", och en "Digital Gain" av "1" .
- I "Stage" fönstret, noll scenen genom att klicka på "set noll". Markera platsen genom att klicka på "Mark". Detta är avgörande för att ladda upp virtuella masker till mikroskopet makrot i steg 3.
- I "Time Series" fönster, ange "Cykler" som "ett" och "Interval" som "0".
- I "Bleach" fönstret, kryssa i "Start Blekning efter # skannar" rutan och ställ in den till ett värde av "0 av 1". Välj "Olika skanningshastighet", med ett värde av "3" (motsvarande en pixel uppehållstid av 8,96 ps / pixel). Välj "Safe blvarje för GaAsP ".
- I laserlinjen delen av "Bleach" fönstret väljer 790 laserlinjen och ställ in procent makt att "100,0". Låt alla andra rutor i blekmedel fönstret omarkerat. Spara bleknings inställningarna i "Bleach" fönstret.
- Spara denna konfiguration som "kanalbildning".
OBS! "Z-Stack", "Regioner", "Fokus" och "Stage" fönster är också viktigt att detta protokoll, men behöver inte ställas in eller justeras under den första konfigurationen.
3. Skapa en recept och ladda upp virtuella Masker till mikroskop programvara och makro
- Med laserskanning konfokalmikroskop fortfarande igång och mikroskop programmet fortfarande på, välj bara "regioner" fönstret (bredvid knappen "Starta Experiment") i "kanalbildning" konfiguration.
- För att säkerställa att maskerna ladda till mikroskopet makro korrektly, ställ procent makten i "kanaler" fönstret "0,2" och "Speed" i "Förvärv Mode" fönstret "8", och klicka på "Snap" i övre vänstra delen av skärmen.
- Kontrollera att bildstorleken är fortfarande "531,2 um x 531,2 um", med en pixelstorlek på "0,18" i "Information" fliken i bilden. Om dessa värden inte är korrekta, kontrollera "Frame Size" och "Zoom" värden igen.
- KRITISK: Kontrollera att X och Y platser i "Stage" fönster nollställs och att läget är markerat innan du öppnar mikroskop makro. Se steg 2.3.6.
- För att öppna mikroskop makro, typ "Alt + F8", klicka på "Load" och välj rätt version. Se detaljer i den förteckning över särskilda material / utrustning. En lång lista med under makron öppnas i "Macro Control" fönstret.
- I "Macro Control" fönstret, klicka på "Kör" för att öppna MICRoscope makro, och stäng sedan "Macro Control" fönstret.
OBS: Alternativ versioner av mikroskop makro kanske inte är kompatibla med laserbaserad hydrogel nedbrytning med användning av detta protokoll. - I "Spara" fliken mikroskop makro ger en godtycklig "Basfilnamn", välj "Single File Output", och valde en "temporär fil" mappen. Ställ in "Öppna Temp mapp" på plats "1", välj "Single Tillfällig Image mapp", och namnge recept i "Store / Applicera recept" med "Recall Platser List" vald. Klicka på "Spara" för att initialt skapa receptet.
- I "Förvärv" fliken mikroskop makro, se till att "Scan Configuration" matchar namnet på mikroskopet programvarukonfiguration som i steg 2,3. Ställ in "No tidpunkter inom Block" till "1", med en "Interval" av "0". Se till att "Marked Z - Top of the Z Stack "är grönmarkerad. Alla andra standardinställningar är bra som de är.
- I "Timing" fliken mikroskop makro, se till att "Vänta Delay" är grönmarkerad, ställ "Experiment Upprepningar" och "Group Upprepningar" till "1" och "Vänta intervall före Block på First läge bara" till "0" . Alla andra standardinställningar är bra som de är.
OBS: "Group Upprepningar" (och inte "experiment Upprepningar") rutan är där man kan ställa in antalet gånger laserskanningar över ett område (dvs, upprepningar av receptet). - I "Z List" fliken av mikroskopet makro, är nedbrytnings plan i z-riktningen anges. Ställ in z-avstånd, "dZ", att "en um", med "Antal positioner" som för att matcha antalet virtuella masker som ska användas.
- Klicka på knappen "Skapa Z Stack" att göra "Z List" visas i rullgardinsmenyn "List platser "mot botten av fönstret. Kontrollera att antalet platser och z-avstånd är korrekta och att X- och Y-platser nollställs.
OBS: Om de inte, inte lagra recept; Stäng mikroskop makro- och upprepa steg 2.3.6 innan de öppnar mikroskop makro- och inrätta receptet igen.
OBS: I stället för att ha 100 masker åtskilda av en xm vardera, till exempel, kan det vara fördelaktigt att ha 50 masker, varje anställd två gånger och åtskilda med en ^ m, för att få en motsvarande mikrofluidstruktur, som fyller på enskilda masker till mikroskopet makro kan vara tidskrävande. - I "Bleach" fliken mikroskop makro måste alla maskerna laddas och matchas med en specifik numrerad plats i "Förteckning över platser". För att starta, välj "Bleach" rutan och se till att "Config". matchar namnet på blekmedels inställningarna i "Bleach" fönster i huvud mikroskop programvara skärmen (se steg 2.3.8). Ställ in "Vänta Delay Efter Bleach" till "0", avmarkera "spot", och lämna "ROI" tom.
- Ändra inte något i "Plats", "Tile", "Grid", "Autofokus", "Block", och "Options" flikar från standardinställningarna.
- För att ladda masker till mikroskop makro, välj bara "regioner" fönster i mikroskop programvara och öppna "Bleach" fliken mikroskop makro. I "regioner" fönstret, klicka på "Load" och välj .OVL fil för masken i botten av z-stack försämras.
OBS: Den första platsen i "Z listan" är botten av z-stack, och mikroskopet makrot arbetar sig till toppen av den z-stack, eller hydrogel. - När listan över ROI visas i "regioner" fönstret, klicka på pilen för att visa ROI av masken inom synfältet (på bilden fästs i steg 3,2). Kontrollera att ROI passar inomsynfältet.
- För att spara den inlästa mask i mikroskop makro ge masken ett namn och nummer i "Lägg aktuella regionen till ROI List" rutan på "Bleach" -fliken, och klicka sedan på "Lägg till aktuella regionen till ROI List" -knappen. Namnet och numret visas i "ROI" rullgardinslistan med andra masker (inklusive masker från andra tidigare skapat recept). Ta bort masken i "regioner" fönster i mikroskop programvara.
- Upprepa steg 3,14 och 3,16 för att ladda upp och spara alla masker till mikroskop makro.
- Att tilldela uppladdade masker till varje Z-läge, markera position 1 i rullgardins "lista med platser". Välj lämplig ROI från "ROI" rullgardinslistan. Se till att "Bleach" är markerad på toppen av den "Bleach" -fliken i mikroskop makro.
- Upprepa steg 3,18 för alla positioner i rullgardins "Lista över platser", och klicka sedan på "Store" på &# 34; Spara "fliken för att spara receptet i sin slutliga form.
4. Photopolymerizing en PEGDA Hydrogel
- Göra Steril HEPES saltlösning (HBS) med Trietanolamin (TEOA)
- I en 1-L bägare, tillsätt 500 ml DI H2O med en omrörare, rör i 2,922 g natriumklorid, 1,196 g HEPES och 7,5 ml TEOA i ett dragskåp.
- Justera till pH 8,3 med 1 N natriumhydroxidlösning genom att tillsätta droppvis med en Pasteur-pipett.
- Sterilt filter lösningen genom ett 0,2-pm vakuumfiltrering bägaren i en 500 ml autoklaveras glasmedieflaska. Alikvotera och förvara vid 4 ° C.
- Fäst en ring av dubbelsidig självhäftande med stöd till en specialiserad 60-mm petriskål med en 20-mm hål utskurna i botten. Lämnar underlag på bindemedelsringen, pressa ut eventuella luftbubblor från mellan petriskålen och limmet.
- Förbereda materialen. Ta den syntetiserade 33 3.4 kDa PEGDA ur -80 ° C frys och låt den anta rumstemperatur. Slå på den vita ljuskällan i minst 15 min före photopolymerizing hydrogeler.
- I ett dragskåp, tillsätt 1 ml HBS med TEOA till en folietäckt, 2-ml bärnstensfärgad centrifugrör (används för att förhindra ljusexponering av fotoinitiatorn, eosin Y). Tillsätt 10 mikroliter av en mM Eosin Y dinatriumsalt i DI H2O
- I ett dragskåp, extrahera en liten volym av en-vinyl-2-pyrrolidinon (NVP) i en glasbägare med en Pasteur-pipett. Från denna volym, pipett 3,5 mikroliter av NVP i den gula centrifugrör med HBS, TEOA och eosin Y.
- I en andra folietäckt, 2 ml bärnsten centrifugrör (används för att förhindra vandrande fotoaktivering av prepolymeren lösning), tillsätt 10 mg 3.4kDa PEGDA. Tillsätt 0,2 ml av HBS, TEOA, eosin Y, NVP lösning för en 5% vikt / volym PEGDA pre-polymerlösning. Vortex tills PEGDA är helt upplöst. Med hjälp av en kraftmätare och detektor trollspö, justera intensiteten av den vita light källa till 95 mW.
- Att bygga en Poly (dimetylsiloxan) (PDMS) Mögel
- Bygga en PDMS formen 7 på en större yta (glas, polystyren vävnadsodlingsskål) för enkel hantering och montera formarna, så att de formade hydrogeler passa inom en cirkel 20-mm diameter.
- För att generera en rektangulär hydrogel med en tjocklek av 500 pm, placera två 500 pm tjocka PDMS distanser på en PDMS yta för att skapa två definierade hydrogel kanter.
- Inkluderar en 300-um PDMS spacer för att ge en 300 | j, m-djup brunn i ytan av hydrogelen, vilket är användbart för införande av fluider.
- Pipettera 60 | il av den 5% vikt / volym PEGDA pre-polymerlösningen på PDMS formen. Var noga med att inte införa några bubblor under pipettering.
- Center och placera en [3- (metakryloyloxi) propyl] trimetoxisilan (TMPSA) funktion 7, 40 mm diameter, # 1,5 täckglas ovanpå lösningen. Säkerställa att den coverslip vilar på 500 pm PDMS distanser. Hydrogelen kommer att binda till den metakrylerad täckglas och förhindra hydrogelen från att flyta i lösningen.
- Placera PDMS, PEGDA pre-polymerlösningen och täckglas monteringen under den vita ljuskällan i 3 min.
- Flödes DI H2O mellan formen och täckglas för att separera hydrogelen från PDMS. Skölj hydrogelen med DI H2O Torka kanterna på täckglas med lab vävnad. Var noga med att inte röra eller veke vatten från hydrogelen.
- Efter avlägsnande av skyddspapperet från klistret, fästa täck till den förberedda petriskål och försiktigt bort luftbubblor från mellan limmet och glaset. Dränka hydrogelen i petriskålen med DI H2O
OBS: PDMS formen kan återanvändas för att göra ytterligare hydrogeler om sköljdes med DI H2O, torkades med kväve, och hålls fri från damm.
5. Fabricating Vascular-härledda mikroflödes Networks via laserbaserade Nedbrytning
- Med laserskanning konfokalmikroskop och mikroskop programvara på, välj målet "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" i fliken "Behåll". I "Förvärv" -fliken, se till att de nödvändiga laserlinjer (514 nm argonlaser och 790 nm 140 fs pulsade Ti: S laser) är på och värmas upp.
- Uppställning av Hydrogel för att bilda en inloppskanal
- Montera hydrogel och petriskål på scenen insatsen och placera scenen insatsen på mikroskop scenen. Fyll petriskål med åtminstone 5 ml DI H2O Center hydrogel och väl funktioner från ögat innan sänka nedsänkning i vatten mål i DI H2O
OBS: inte krossa hydrogel med målet, de två ska aldrig röra! - För att hitta hydrogel, växla till "Hydrogel Visualization" konfiguration från steg 2,2. Klicka på "Live" för att stänga av laserlinjen på och ta the mål närmare hydrogelen tills eosin Y-signal (som detekteras av den fluorescerande detektorn Ch1) av toppen av hydrogelen kan ses.
OBS: För att hitta hydrogelen lätt kan procent makt ökas eller hål kan öppnas. När målet är fokuserat på hydrogelen emellertid släppa procent makt för att skydda den fluorescerande detektorn och minska pinhole tillbaka till 1AU för att undvika övermättnad av detektorn och för att exakt hitta hydrogelen ytan. - I "Stage" fönster, ange var toppen och botten av hydrogelen och av botten av brunnen.
OBS: De z-värden här kommer att bidra till att bestämma tjockleken hos hydrogelen och djupet av brunnen. - Använd joysticken för att flytta i X och Y för att hitta kanten av en brunn. Placera hydrogelen på höger på skärmen, med den väl till vänster, eller vice versa. Låt hydrogel att fylla inte mer än två tredjedelar av synfältet.
- Släpp plane fokus ned 150 pm i hydrogelen genom att ställa in "Step Size" till "150" i "Focus" fönstret och klicka på nedåtpilen bredvid "Z-position" box. Upprepa steg 5.2.4, om det behövs.
OBS: x, y och z-positionen av inlopps beror enbart på utformningen av de virtuella masker. - KRITISK: Noll X- och Y-läge i "Stage" fönstret, ta bort alla andra markerade platser och markera bara den här platsen.
OBS: Om detta steg inte utförs, kommer mikroskopet makrot inte riktigt återställa platser i den tidigare sparade recept, och hydrogelen kommer inte brytas ned i önskad plats.
- Montera hydrogel och petriskål på scenen insatsen och placera scenen insatsen på mikroskop scenen. Fyll petriskål med åtminstone 5 ml DI H2O Center hydrogel och väl funktioner från ögat innan sänka nedsänkning i vatten mål i DI H2O
- Bildande en inloppskanal
- "Snap" en bild och rita ett rektangulärt område som kommer att vara inloppet till det vaskulära nätverket med rektangeln knappen i "regioner" fönstret.
OBS: Se till att en del av regionen sträcker sig ut i brunnen för att se till att the inlopp ansluter väl till det vaskulära nätverket. - Bredvid ROI genereras i "regioner" fönstret, välj "Förvärv" och avmarkera "Bleach" och "analys".
- Spara "Hydrogel Visualization" konfiguration, avmarkera "Regioner", och ändra till "kanalbildning" konfiguration, inrättades steg 2,3. I "kanalbildning" konfiguration, välj "Regioner" igen.
OBS: När du växlar mellan "Hydrogel Visualization" och "kanalbildning" konfigurationer, se till att avmarkera regioner i det övre vänstra hörnet av skärmen. Ibland skalningen av regioner kan ändras oväntat mellan konfigurationer om detta inte görs. - I "kanalbildning" konfiguration, se till att endast "Regioner" och "Z-Stack" väljs. I "Z-Stack" fönstret, klicka på "Center" knappen längst upp och sedan "Center" buttpå ovan "Offset" för att ställa in mitten av z-stack som den aktuella Z-positionen. Beroende på hur stor inloppet måste vara, ställa in antalet "skivor" med ett "intervall" av "1". Storleken på Z-stack kommer att visas under "Range".
- Kontrollera att "Speed" i "Förvärv Mode" fönstret är inställt på "3" och att "Procent Power" i "kanaler" fönster är satt till "100". Spara konfigurationen och klicka på "Starta Experiment" -knappen.
OBS: Mikroskopet makro krävs inte för att försämra den samma enkel form på flera plan, såsom den utförs här för att generera en inloppskanal. Makrot endast när förnedrande olika regioner på varje enskild plan, och det används för att lagra de virtuella masker inom ett recept. - Att visualisera hydrogel under nedbrytning, antingen öka "Gain (Master)" i "kanaler" fönstret om regionen than synfält är svart, eller minska "Gain (Master)" om regionen är vit.
OBS: Bubbelbildning här är en indikation på laserinducerad hydrogel nedbrytning. - Att försämra inloppet flera gånger i stället för bara en gång, justera "Cykler" i "Time Series" fönstret.
- I "Hydrogel Visualization" konfiguration, klicka på "live" för att säkerställa att inloppet bildades.
- "Snap" en bild och rita ett rektangulärt område som kommer att vara inloppet till det vaskulära nätverket med rektangeln knappen i "regioner" fönstret.
- Ställa in Hydrogel att generera mikroflödes Network
- I "regioner" fönster, ladda någon .OVL filen från z-stack virtuella masker och klicka på pilen för att se ROI i synfältet.
- Klicka på "Live" att leva skanna "Hydrogel Visualization" konfiguration och använd joystick eller "Stage" fönstret för att placera hydrogel i X och Y, så att inloppet ansluter till rätt plats i det vaskulära nätverket.
OBS: Se till attROI av den virtuella masken lappar något med det tidigare bildade inloppet. - Släpp fokalplanet ned 50 pm från tidigare centrerad Z-läge, eller 200 pm från ytan av hydrogel, med hjälp av "Step Size" i "Focus" fönstret och klicka på nedåtpilen bredvid "Z-position " låda. Detta kommer att vara den första positionen i mikroskop makro.
OBS: Den faktiska avståndet att röra sig i z-riktningen är beroende av nätverksdesign. Säkerställa att den önskade nätverket inte sträcker sig förbi den övre eller nedre ytan av hydrogelen i z-riktningen. - KRITISK: Zero X och Y platser i "Stage" fönstret, ta bort alla andra markerade platser och markera bara den här platsen.
OBS: Detta kommer att vara utgångspunkten i mikroskopet makro. Receptet kommer att arbeta sin väg tillbaka mot ytan av hydrogelen. - "Snap" en bild i "Hydrogel Visualization" konfiguration, ta bort och deselect "Regioner", och spara konfigurationen.
- Generera mikroflödes Network
- Byt till "kanalbildning" konfiguration, och bara välja "Time Series" och "Bleknings" fönster. Kontrollera att inställningarna för "Time Series" och "Bleknings" fönster är som de ursprungligen sattes i steg 2.3.7 och 2.3.8.
- Ställ in "Speed" i "Förvärv Mode" fönstret "8" och den procentuella effekt laserlinjen till "0,2" i "kanaler" fönstret. Spara konfigurationen.
- Öppna mikroskop makro följande steg 3,5. På "Saving" fliken makrot markerar du tidigare gjort receptet från steg 3 och klicka på "Apply".
OBS: Klicka inte på "Spara" eller receptet kommer att skrivas över! - Kontrollera inställningarna på alla flikar och kontrollera att de virtuella masker (.OVL filer) fortfarande är korrekt i samband med than Z-platser i rullgardinsmenyn. Kontrollera även att den första Z-plats matchar den markerade platsen i "Stage" fönster mikroskop programvara.
OBS: Counterintuitively, kommer den andra platsen i rullgardinslistan vara fysiskt ovanför den första plats, som mikroskopet makro kommer att arbeta sin väg från botten av hydrogelen (längst bort från målet) till toppen av hydrogelen (närmast mål). - Spara "kanalbildning" konfiguration igen, och klicka sedan på "Update" i mikroskop makro. Klicka på "Nej" till "Ersätt aktuell platslista?", Och klicka sedan på "Start" i mikroskop makro för att börja receptet.
6. Visualisera mikroflödessystem nätverket
- Att visa hydrogel och den bildade mikroflödes nätverket efter nedbrytning stänger mikroskop makro. Växla till "Hydrogel Visualization" konfiguration för att visa eosin Y signal av hydrogelen; det försämrade nätet visas mörka.
OBS: hydrogel nedbrytning kan inte visualiseras medan mikroskopet makrot är igång. - Om du vill visa mikroflödes nätverk specifikt använda "Hydrogel Visualization" konfiguration vid en lägre lasereffekt för att möjliggöra avbildning av infört fluorescein (FITC) -märkt dextran, som har en ljusare signal än den nativa eosin Y signal av hydrogel.
- Innan man inför fluorescensmärkt dextran, veke vatten från brunnen i hydrogelen med hjälp av lab vävnad. Pipett i 10 | il av 5 mg / ml 2000 kDa FITC-märkt dextran i DI H2O (pre-filtrerades genom ett 0,2-jim sprutfilter).
OBS: Använd någon dextran storlek 2000 kDa eller större för att förhindra diffusion in i gelén. Om avbildning längre än 30 minuter, använd en inkuberade scen med 60% luftfuktighet (eller högre) för att förhindra hydrogel torkning och avdunstning av vatten från FITC-märkt dextran lösning. - Ta bort hydrogel ennd petriskål från scenen och markera petriskålen för att möjliggöra enkel placering av den bildade vaskulära nätverket under senare experiment.
Representative Results
För att demonstrera genomförandet av bildstyrd, laserbaserad hydrogel nedbrytning för att generera en 3D, vaskulär härrörande mikroflödes nätverk, utnyttjade vi en 3D-bild bunt mushjärna kärl som förvärvades via eggvassa svepmikroskop (KESM) 26, 27 . En vald 3D region av större mikrovaskulär dataset omvandlades till en serie av virtuella masker för bildstyrd mikroflödesnätverksbildning, såsom beskrivits ovan. Efter tillverkning, den erhållna mikroflödesnätet perfusion med en lösning av FITC-märkt, 2000 kDa dextran och avbildas via konfokalmikroskopi. Bild stapel av den in vivo kärlsystem som definieras nätarkitekturen (Figur 1A och C) och den tillverkade mikroflödesnätet (figur 1B och D) användes för att generera Z-projektioner (Figur 1A och B) och 3D-återgivningar (Figur 1C och D in vivo kärl. Tekniken är mottaglig för tillverkning av nät som innehåller ett brett intervall av diametrar; inom figur 1, har kanaler som sträcker sig från 3,3 till 28,8 mikrometer i diameter genereras. Observera att större rektangulära strukturen i det övre vänstra hörnet i figur 1B och i vänstra hörnet i figur 1D är inloppskanalen att införa flöde in i nätverket.
Figur 1: Vascular-Derived mikroflödes Network. En serie av virtuella masker, som härrör från en bild stapel av mushjärna vaskulatur (A och C), användes för att fabricate en 3D biomimetiska mikroflödesnätverk inbäddad i en PEGDA hydrogel (B och D) via bildstyrd, laserbaserad nedbrytning. Den mikroflödessystem nätverket perfusion med 2000 kDa FITC-märkt dextran och avbildas via konfokalmikroskopi. Z-projektioner (A och B) och 3D-renderingar (C och D) i de båda nätverken visa förmåga att generera mikroflödes nätverk som rekapitulera densiteten, organisation och övergripande arkitektur in vivo kärl. Pilen (D) markerar den rektangulära inlopp skapats för att införa dextran. Skalan stapel representerar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi har genomfört två metoder, tryckhuvuden och sprutpumpar, för att initiera vätske flåg i dessa inbäddade mikrofluidiska nätverk. Till exempel, var en 30 av 30 | j, m rektangulär kanal tillverkad för att ansluta två brunnar i en micromolded PEGDA hydrogel (Figur 2A), med vätskeflöde som drivs via en tryckhuvudet 7. Genereras i den vänstra väl, tryckhöjden inducerat flöde genom mikrokanalen och in i brunnen till höger. I figur 2A, en initial framför tetrametylrodamin (TRITC) -märkta var 70 kDa dextran observerade rör sig genom kanalen med time-lapse mikroskopi. Senare, i figur 2B, flöt en 10-um diameter fluorescerande polystyren sfär från vänster väl, genom kanalen, till brunnen till höger. Med varaktigheten av flödet kontrolleras av volymen av vätska närvarande i micromolded väl vid inloppet, och flödeshastigheten styrs av det hydrostatiska gradienten alstras mellan inloppet och utloppet väl, tryckhöjd driven strömning i micromolded hydrogeler tillhandahåller en enkel metod för strömning ition, utan behov av ett yttre hus eller en sprutpump.
Figur 2: Tryckhuvud driven strömning i en Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA var micromolded att bilda en hydrogel innehållande två brunnar förbundna genom en inbäddad mikro. En tryckhuvud genererades i den vänstra väl för att initiera flöde av TRITC-märkt, 70 kDa dextran (A1-A3) och en 10-um polystyren sfären (B1-B3) genom en 30 av 30 | j, m rektangulär kanal från en brunn till den andra. Skalan stapel representerar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Alternativt, för att generera konstant vätskeflöde inom mikroflödes nätverk, sprutpump driven flåg kan initieras genom photopolymerizing hydrogelen insidan av en sekundär mikrofluidikanordning med inlopps- och utloppsportar för sprutpump gränssnitt. I figur 3A är en kommersiellt tillgänglig, prefabricerade mikroflödessystem enhet visas med en 1-mm band av hydrogel fotopolymeriserade över bredden av anordningen 7. Laserbaserad nedbrytning genomfördes för att tillverka mikroflödessystem kanaler och nätverk i inrymt hydrogeler använder samma protokoll som beskrivs här för fristående hydrogeler. Sprutpump-genererade flödet kan ses i figur 3B, där en 20-fim diameter cylindrisk kanal tillverkades i en hydrogel inrymt i en mikrofluidanordning. I denna kanal 20-fim diameter, enskilda 2-im fluorescerande polystyren sfärer enkelt lösas utan vätskeflöde (figur 3B1), medan när en 5 pl / s flöde tillämpas sfärerna rör sig genom synfältet, vilket framgår av strimmor (Figur 3B2 </ Strong>). Denna samma tillvägagångssätt användes för att inducera flöde genom en 2D, vaskulär härledda nätverk för att övervaka flödet av TRITC-märkt, 65 kDa dextran genom nätverket och diffusion in i den omgivande hydrogel (Figur 3C).
Figur 3: sprutpump driven strömning i PEGDA Hydrogeler polymeriseras i Mikroflödes kåpor. En kommersiellt tillgänglig, prefabricerade mikroflödesanordning (A) med ett 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) mikrokanal inrymmer en fotopolymeriserad 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel, som indikeras av svart pil. En 20-fim diameter cylindrisk kanal bröts ned genom hydrogelen, och polystyren sfärer 2-im pumpades genom anordningen (B). Sfärerna är tydligt lösas utan fluidumflöde (B1), men de visas som strimmor vid en flödeshastighet av 5 ul / s(B2). I en annan inrymt hydrogel framställdes en 2D vaskulär härledda nät tillverkades och TRITC-märkt, var 65 kDa dextran pumpas genom nätverket (C). Time-lapse mikroskopi användes för att övervaka det fluorescerande dextran, såsom den fyllde de kanaler och diffunderar in i de omgivande hydrogel. Vita pilar i (B) och (C) anger riktningen för fluidflöde. Kalibrerings bar i (C) anger intensiteten av det fluorescerande dextran. Skal staplar representerar 20 pm i (B1) och (B2) och 50 | j, m i (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kritisk i åsidosätta standardfunktioner för mikroskop programvara för att möjliggöra användningen av virtuella masker för bildstyrd, laserbaserad nedbrytning, måste mikroskopet makro ställas in och manipuleras noggrant. Hur gränssnitt mikroskop programvara med mikroskop makro ibland kan vara bakvända och mycket möda har investerats i att bestämma de optimala inställningarna i båda programmen för att utveckla denna metod. En allmän förståelse för grundläggande laserskanning konfokalmikroskop användning rekommenderas, särskilt med "Stage" och "Focus" fönster för att hitta och korrekt placering av hydrogel i x, y och z dimensioner innan laserbaserad nedbrytning. Dessutom är tillverkningen av en inloppskanal kritisk för protokollet; suspenderade fluorescerande arter måste kunna ange mikroflödessystem för framgångsrik avbildning och nätverkskarakterisering. Det är viktigt att notera att detta protokoll gäller en specifik laser-skanning konfokalmikroskop konfigureras med en specifik femtosecond pulsad laser, kör specifika versioner av mikroskop programvara och mikroskopet makrot (se detaljer i den förteckning över specifika material / utrustning). Vi har upptäckt att nyare versioner av mikroskop makro saknar nödvändig kontroll och funktionalitet som krävs för bildstyrd laserstyrning. Medan andra mikroskop plattformar och pulsade laserkällor kan användas, detta protokoll gäller specifikt för detta system och kommer att behöva ändras i enlighet med plattformen, laserkällan, och programvara genomförs. De underliggande principerna i hela detta protokoll gäller dock fortfarande.
En potentiell modifiering av detta protokoll innebär att förändra hydrogelkompositionen. Här, vi utnyttjade 5 vikt%, 3,4 kDa PEGDA hydrogeler, men laserbaserade nedbrytning (för ändamål bortsett från mikroflödes nätverk generationen) har genomförts för att försämra både syntetiska och naturliga hydrogeler, inklusive PEGylerat fibrinogen 21,22 hydrogeler silkesprotein 23, och kollagen 24. Justering av lasereffekten, skanningshastighet, avståndet mellan Z-skivor, och antalet repetitioner kommer att hjälpa att bestämma de optimala parametrar för att tillverka mikroflödes nätverk i andra hydrogel formuleringar.
En strömbegränsning av tekniken är den totala volymen av hydrogel som kan brytas ned i en genomförbar tid. Att skapa öppna hålrum eller mikroflödes funktioner i hydrogel, laser uppehållstid måste vara vid eller över 8,96 ps / pixel (eller en laserskanningshastighet på 0,021 pm / iS) när man använder en laser fluens av 37,7 nJ / um 2. Med dessa inställningar, tar det 1,4 timmar att bryta ned fartyg inom en 0,014 mm 3 volym (som visas i figur 1). Med användning av en laser uppehållstid av 4,48 | is / pixel eller lägre, är den energi som levereras inte tillräckligt för full nedbrytning av hydrogelen formuleringen som användes här. Implementera en annan hydrogelsammansättning skulle kunna övervinna denna begränsning. Användningen av fotolabila geler som innehåller ljuskänsliga komponenter 34-36 eller hydrogeler som har stora multifoton tvärsnitt 21-24 är bra alternativ som skulle göra det möjligt att använda mindre energi och skulle resultera i snabbare nedbrytning. När det gäller dimensionsbegränsningar, har funktioner tillverkats upp till 1,5 mm djupt i hydrogelen 7. Djupet uppnås är en funktion av arbetsavståndet av målet och kan ökas med hjälp av ultralångdistans mål arbets optimerade för in vivo imaging. Den minsta uppmätta kanalen 7 skapas med hjälp av en 20X (NA1.0) nedsänkning i vatten mål hade en bredd av 3,3 pm och djup av 8,9 pm, vilket är i nivå med storleken av de minsta kanalerna genereras i figur 1. Medan andra labb har använt lägre NA mål 21,23,24, räknar vi med att mikroflödes nätverk med mindre funktioner kan genereras med höger NA mål på bekostnad av en minskad arbetsavstånd. Men i sista hand är upplösningen av tekniken en funktion av punktspridningsfunktionen hos den fokuserade laserstrålen, varvid laseravsökningsegenskaper, mängden energi som utvecklas av lasern, och de laser absorptionsegenskaperna hos materialet försämras.
Vidare laser egenskaper (hastighet, fluens, avståndet mellan virtuella masker, och antalet repetitioner) måste optimeras baserat på hydrogel egenskaper (tvärbindningsdensitet, makromer / monomer molekylvikt, viktprocent, och typ av hydrogel: proteinbaserade kontra syntetisk ), eftersom dessa kommer att till sin natur förändra interaktioner med lasern och därmed det slutliga utfallet av processen. Som den energi som levereras är också påverkas av objektiv som används, är ytterligare optimering krävs när du växlar mellan målen. När det gäller kostnaderna, krävs tillgång till ett mikroskop med en pulsad laser, och medan många olika objektivttanter kan användas, de med ett högt NA och långa arbetsavstånd (för in vivo imaging) kan vara dyra.
Utöver det protokoll som beskrivs här, kan mikroflödes nätverk som genereras med den här tekniken också funktionaliseras med cell lim peptider efter kanaltillverkning att inducera endotelcellsadhesion och lumen bildning 7. Dessutom kan inkorporering av cell nedbrytbart peptidsekvenser i bulkmaterialet 9 före kanalisera nedbrytning möjliggöra för studier av cellmigration in i och genom hydrogelen. För kontinuerlig fluidisering av mikroflödes nätverk inom hydrogelen, kan hydrogeler fotopolymeriseras i större fluidanordningar eller höljen, såsom visas i figurerna 2 och 3 7.
Genereringen av vaskulära nätverk via vaskulär eller angiogen självorganisering 8-12 ger en enkel metod för att inducera vascularization hela en relativt stor hydrogel volym. Även om detta tillvägagångssätt resulterar i perfusable fluidic nätverk, är det svårt att direkt styra storleken, tortuosity, densitet och totala nätverksarkitekturen. På grund av denna begränsning, kan flödesprofil och skjuvhastigheter i kärlsystemet skilja mellan experimenten. Alternativt, mikrotillverkningstekniker 13-16 möjliggör direkt kontroll över nätverksarkitektur, men begränsas ofta av deras oförmåga att generera små, kapillära stora kanaler eller tillverkning av täta nätverk som efterliknar in vivo kärl arkitektur. Medan laserbaserade hydrogel teknik nedbrytning beskrivs här har nyligen repurposed för mikroflödes generation, samtidigt övervinner det både den arkitektoniska kontroll och storleksbaserade begränsningar av befintliga metoder mikrotillverknings genom att möjliggöra skapandet av 3D biomimetiska mikroflödes nätverk som rekapitulera densiteten, slingrighet, storleksintervall, och allmänt architecture av in vivo kärl. Dessutom kan flera fluid nätverk genereras i en enda hydrogel, vilket gör att studier av transport mellan nätverk 7. För vävnadstekniska program som strävar efter att närmare replikera in vivo transportprocesser in vitro, de mycket löst hydrogel inbäddade mikroflödes nätverk som beskrivs här är väl lämpade. Vi räknar med att detta protokoll kommer att användas för att utveckla vävnadskonstruktioner som bättre efterliknar in vivo transport för användning som drogtestutrustning och in vitro sjukdomsmodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
