Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

Published: January 10, 2017 doi: 10.3791/55106
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

Abstract

בכתב היד הזה, אנחנו ראשונים מתארים את פרוטוקול הייצור של שבב microfluidic, עם נקודות זהב ואזורים מצופים פיברונקטין על מצע הזכוכית אותו, כי בדיוק שולט הדור של בועות טנדם תאים בודדים בדוגמת סמוכה עם במקומות מוגדרים היטב צורות. לאחר מכן, אנו מדגימים את הדור של בועות טנדם באמצעות שני לייזרים פעמו ומאיר זוג נקודות זהב עם שהייה כמה המיקרו. אנו לדמיין את אינטראקצית בועת הבועה והיווצרות סילון ידי הדמיה מהירה ולאפיין את שדה הזרימה כתוצאה באמצעות velocimetry תמונת חלקיקים (PIV). לבסוף, אנו מציגים כמה יישומים של הטכניקה הזו לניתוח תא בודד, כולל poration קרום תא עם ספיגת מקרומולקולה, דפורמציה קרום המקומי שקבעה ההתקות של חרוזי integrin המחייב מצורפים, ותגובת סידן תאיים הדמית ratiometric. התוצאות שלנו מראות כי תזרים טיסות הללו מהיר כיוונית הוא פרוduced ידי אינטראקצית בועת טנדם, אשר יכול להטיל מאמץ גזירה מקומית מאוד על פני השטח של תאים גדלים בסמיכות. יתר על כן, יכול להיגרם bioeffects שונים על ידי שינוי עוצמת הזרם הטיסות הללו על ידי התאמת המרחק תיקו מהתא אל בועות טנדם.

Introduction

יש הכרה גוברת כי ההטרוגניות הסלולר, הנובעים ביטוי סטוכסטיים של גנים, חלבונים, מטבוליטים, קיימת בתוך אוכלוסיית תאים גדולה ומשמשות כעיקרון יסוד בביולוגיה כדי לאפשר הסתגלות תא אבולוצית 1. לכן, הוא לעתים קרובות לא מדויק ולא אמין להשתמש מדידות בתפזורת מבוססת אוכלוסייה להבין את תפקידם של תאים בודדים ואת האינטראקציות ביניהם. פיתוח טכנולוגיות חדשות לניתוח-תא בודד ולכן הוא בעל עניין רב במחקר ביולוגי תרופתי, והוא יכול לשמש, למשל, להבין את מסלולי איתות מפתח טוב יותר תהליכים בביולוגיה תא גזע וסרטן טיפול 2-4. בשנים האחרונות, את הופעתה של פלטפורמות microfluidic יש להקל מאוד ניתוח תא בודד, שבו המיצוב, טיפול, והתצפית על תגובת תאים בודדים בוצעו עם אסטרטגיות האנליטי חדישות 5.

Cavitation ממלא תפקיד חשוב במגוון רחב של יישומים ביו, כולל לטיפול בסרטן על ידי-ממוקד בעוצמה גבוהה אולטרסאונד (HIFU) 6, הפיצול לא פולשנית של אבנים בכליות על ידי lithotripsy גל הלם (SWL) 7, משלוח סמים או גנים על ידי sonoporation 8, והרס דיווחה לאחרונה של תאים או רקמות ידי 9,10 cavitation בועה הידרודינמית. למרות זאת, התהליכים הדינמיים של בועת cavitation (ים) אינטראקציות עם רקמות ביולוגיות ותאים לא הובנו היטב. זאת בשל אקראית בדינמיקת ייזום בועת cavitation המיוצרת על ידי אולטרסאונד, גלי הלם, ואת לחץ הידראולי מקומי; יתר על כן, קיים חוסר המאפשר טכניקות לפתרון תגובות מורכבות ומהירות מיסודו של תאים ביולוגיים, במיוחד ברמת התא הבודד.

בגלל האתגרים הללו, אין זה מפתיע כי מחקרים מעטים יש דבורהn דיווח לחקור אינטראקציות תאי בועה בתנאים ניסיוניים מבוקרים היטב. לדוגמא, poration הממברנה של תאים בודדים לכודי השעית 11 ואת העיוות הגדולה אימפולסיבית של תאי דם אדומים אדם 12 הודגמה באמצעות בועות יחידות שנוצר ליזר בערוצי microfluidic. הטכניקה השנייה, לעומת זאת, יכולה לייצר רק עיוות קטנה מאוד בתאים איקריוטיים בגלל הנוכחות של הגרעין 13. יתר על כן, קשה לפקח bioeffects במורד הזרם כאשר מטפלים התאים בתרחיף. במחקרים אחרים, עירור אולטרסאונד של microbubble כלוא (או חומר ניגוד אולטרסאונד) להפקת poration קרום ו / או תשובות סידן תאי בתאי חסיד יחידים דווח 8. Poration ממברנה של תאים חסידים יחידים יכול גם להיות מיוצר באמצעות בועות טנדם שנוצר ליזר בשכבת נוזל דקה המכיל פתרון הכחול Trypan קליטת אור 14, אועל ידי בועת גז נדנוד שנוצרה על ידי פעימות ליזר המיקרו irradiating דרך מצע סופג אופטי ב microchambers 15. כשמשווה, המצע הקליט האופטי יש יתרון על פני הפתרון הכחול הליזר סופג Trypan משום שהאחרון הוא רעיל לתאים. יתרה מכך, בועות שנוצרו ליזר יותר לשליטה מבחינת גודל בועה ומיקום מ בועות נרגשות מבחינה אקוסטית. אף על פי כן, בכל המחקרים הקודמים הללו, תא הצורה, הנטייה, ותנאי ההידבקות לא נשלטו, אשר עשויים להשפיע באופן משמעותי את תגובת תא bioeffects המיוצר על ידי מכני מדגיש 16.

כדי להתגבר על חסרונות אלה במחקרים קודמים, פתחנו לאחרונה מערכת ניסיונית עבור דור בועה, דפוסי תא, אינטראקציות בועת בועת תאים, ו- bioassays בזמן אמת של תגובת תא שבב microfluidic נבנה באמצעות שילוב ייחודי של techn microfabricationiques. שלושה מאפיינים עיקריים להבחין המערכת הניסיונית שלנו מאחרים בתחום הם: 1) הדפוסים של נקודות זהב בגודל מיקרון על מצע הזכוכית כדי לאפשר קליטת ליזר מקומית לייצור בועה 17; 2) דפוסים של איים בגודל מיקרון של תאי מטריקס (ECM) עבור הידבקות התא על פני המצע אותו לשלוט הן את המיקום ואת הגיאומטריה של תאים בודדים; ו -3) דחיסה של הממד של תחום האינטראקציה בועות תאים בועה מ 3D למרחב מעין-2D כדי להקל ב-המטוס להדמיה של אינטראקציות בועה בועה, jetting שדות זרימה, עיוות התא, bioeffects, כל שנתפסו אחד רצף הדמיה יעיל (איור 1D).

איור 1
איור 1: השבב ו שרטוטי microfluidic של מבחנים שונים. א) שבב microfluidic התאסף עם ערוצים מלא דיו כחול לשם ויזואליזציה. ב) באזור בתוך השבב microfluidic עם תאים בדוגמת נקודות זהב (המרחק בין שתי נקודות זהב בסמיכות הוא 40 מיקרומטר). זוגות רבים של יחידות עבודה ניתן לארגן בתוך ערוץ. ג) תמונה מקרוב של יחידת עבודה, מורכב של זוג נקודות זהב ו תא הלה דבק באזור תא-הדפוסים. ד) סכמטי של פעולת המכשיר. תא בודד דבק ומתפשט על האי "H" -shaped מצופה פיברונקטין. זוג בועות cavitation (בועת טנדם) עם תנודה אנטי שלב מיוצר על-ידי הארת קרן ליזר פעמה על נקודות הזהב (ראה תרשים 4 א), שמובילה את הדור של מטוס מהיר מקומי נע לכיוון תא המטרה סמוך. התא עלול להיות מעווה, porated לספיגת macromolecular, ו / או מגורה עם תגובת סידן, בהתאם למרחק התיקו (ד S) של התא לבועה טנדם.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פלטפורמה זו ניתן לשלב נוסף עם מבחני קרינה וחרוזים פונקציונליים המחוברים אל פני השטח של תא bioeffects נגרמת cavitation. בפרט, פלטפורמה זו סוללת את הדרך עבור מבחני אמין וכמותיים ברמת התא הבודד. עד עכשיו, יש לנו השתמשתי במכשיר לניתוח דפורמציה קרום תא הנגרמת בועת טנדם, poration תא ספיג תאי, כדאיות, אפופטוזיס, ותגובת סידן תוך תאים. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את תהליך ייצור שבבי ההליך לניתוח bioeffects השונה המוזכר לעיל. יתר על כן, הפעילות של השבב גם מתוארת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfabrication

הערה: כל נהלי microfabrication מבוצעים חדר נקי. מסכת כרום נועדה לפני microfabrication, רואה איור 2.

איור 2
איור 2: סכמטי של עיצוב ערוץ השבב microfluidic ואת הממדים של יחידות עבודה. א) עיצוב מסכה של microchannels PDMS מזדהה (הירוק) לבין הדפוסים על מצע הזכוכית (כחול ואדום). ב) תמונה המוגדלת של עיצוב מסכת קטע מייצג של המערכים יחידי עבודה. ג) סכמטי של יחידה אחת עבודה מראה דפוס תא (כחול) וזוג נקודות זהב (אדום). כל סולמות אורך מוצגים בצד ימין למטה. אנא לחץ כאן כדי להציג את העדפתהגרסת ger של נתון זה.

  1. דפוסי נקודת זהב
    הערה: שטח כל נקודת זהב נועדה להיות בתוך 25-30 מיקרומטר 2, כך שהוא גדול מספיק כדי לספוג אנרגית ליזר לייצור בועה, אך קטן מספיק כדי למנוע תאים בודדים שדבקו בו. תרשים סכמטי עבור ייצור נקודת זהב מוצג באיור 3 א.
    1. שקופיות זכוכית ניקוי (במנדף כימי)
      1. לשטוף את השקופית זכוכית עם אצטון ואחריו אלכוהול איזופרופיל (IPA), ולאחר מכן לייבש אותו עם זרם N 2.
      2. משרים את השקופית בתמיסה פיראניה (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) במשך 10 דקות.
      3. קח את השקופית, לשטוף אותו עם מים די, ולאחר מכן לייבש אותו עם זרם N 2.
      4. אופה את שקופיות זכוכית על פלטה חמה ב 120 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
      5. פנקו את השקופית asher הפלזמה 100 וואט במשך 90 s.
    2. ספין-ציפוי (ספין-ציפוי מכסה מנוע)
      1. הפעל על פלטה חמה ולהמתין עד לטמפרטורה יציבה על 95 מעלות צלזיוס.
      2. בצע את הליך הציפוי:
        סל"ד 1,000 עבור 5 ימים עם רמפת 500 סל"ד / s;
        אז 3,000 סל"ד למשך 30 שניות עם רמפה 1,000 סל"ד / s.
      3. תקן את שקופיות זכוכית לנקות על coater הספין ידי החלת ואקום.
      4. מכסה את פני שטח שקופיות עם P-20 ולהתחיל את מתכון הציפוי.
      5. חזור על תהליך ציפוי עבור photoresist שלילית-NFR.
      6. אופים את השקופיות על 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות ולחכות עד שהוא מתקרר לטמפרטורת החדר.
    3. פוטו-ליתוגרפיה
      1. הר מסכת הכרום על aligner המסכה ולוודא שצד הדפוס פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה.
      2. הגדר את המתכון photolithography למצב חשיפה קשה עם 9 s החשיפה ל- UV ובמהירות ליישר את מצע זכוכית עם מסכה.
      3. לאחר ביצוע חשיפת UV, לאפות את השקופיות ב 956; צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
    4. התפתחות
      1. לפתח את הדפוס בשקופית בתמיסת מפתח עבור 60 s.
      2. להסיר את השקופית מן היזם, לשטוף אותו במים DI, ולייבש אותו עם זרם N 2.
      3. בדוק את גיאומטרית הדפוס תחת מיקרוסקופ, ולמדוד ולהקליט את גודל התכונה.
    5. בתצהיר זהב (אידוי קורה E) ולהרים פעמי
      1. אופים את השקופיות על 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
      2. נקו את השקופית עם פלזמה בתחריט יון תגובתי המכונה (ורי) למשך 90 שניות ב -500 Torr ו 100 W.
      3. ננומטר הפקדה 5 של Ti ו -15 ננומטר של Au לשקופית באמצעות המאייד E-קרן 17.
      4. משרים את השקופיות לילה בכוס זכוכית המכיל מסיר photoresist ממס להסיר את מנוחתם זהב על גבי NFR להתנגד.
      5. אחזר את השקופית, אני סומקt עם אצטון ואחריו IPA, ולייבש אותו עם זרם N 2.
      6. יבש את השקופית על צלחת חמה ב 115 מעלות צלזיוס לפני ניקויו של asher פלזמה חמצן ב -100 W עבור 90 s.
  2. דפוסים מולקולרי הרכבה ידי המראה (MAPL)
    הערה: שטח כל האי פיברונקטין המצופה מוגדר להיות בתוך 700-900 מיקרומטר 2 כדי להקל תא הלה נאות מתפשט באזור כיכר תוך מזעור הסיכוי מספר תאי צבירה באי. תרשים סכמטי לעריכת איי דפוסי תא מוצג איור 3B.
    1. ציפוי ספין
      1. חזור על שלב 1.1.2, אבל להשתמש photoresist S1813-חיובי בטמפרטורה של 115 מעלות צלזיוס.
    2. photolithography מיושר
      1. הר מסכת הכרום על aligner המסכה ולוודא שהצד עם הדפוס פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה עםנקודות זהב.
      2. הגדר את המתכון photolithography למצב חשיפה קשה עם 9 s החשיפה ל- UV.
      3. יישר את המסכה העליונה עם השקופיות התחתונות באמצעות סימני יישור, ממוקמים מסביב לקצה של המסכה, כהתייחסות מרחבית.
      4. בדוק את החלק המרכזי של המסכה ולוודא כי תכונות הדפוס מיושרות כהלכה.
      5. השלם את החשיפה לקרינת UV ללא לאפות פוסט.
    3. התפתחות
      1. חזור על שלב 1.1.3 אבל עם 45 שניות של פיתוח לפני ייבוש על פלטה חמה ושימור באחסון 2 N.
  3. טיפול כימי
    1. הכן את הפתרון passivating: 0.5 מ"ג / מ"ל ​​PLL-ז-PEG ב 10 חיץ HEPES מ"מ.
    2. תחזר את השקופית מאחסון N 2 ולנקות אותו באמצעות ורי עם הגדרת הפרמטר: 500-Torr לחץ, כוח 100-W, ו 90-s משך.
    3. אחד פיפטה טיפת passivating פתרון על חתיכת סרט פרפין. </ Li>
    4. סנדוויץ הפתרון עם הסרט ואת השקופיות, מוודא שהצד עם דפוס התכונות פונה כלפי מטה לכיוון הסרט; למנוע היווצרות של בועות.
    5. חכו 45 דקות לפני הסרת שקופיות מהסרט.
    6. משרים את השקופיות ברצף במסיר photoresist, מסיר photoresist ומים DI (1: 1), ומים DI, להתסיס אותו באמבט אולטרסאונד עבור 90 s לכל לספוג.
    7. יבש את השקופית על פלטה חמה כדי להסיר את הלחות לפני שהוא סגר אותו בתוך תא ייבוש ואחסון אותו במקרר.
  4. צ'יפ הרכבה
    1. חזור על שלבי 1.1.1-1.1.4, אבל עם photoresist SU8-2025 השלילי ואת הגדרת הפרמטר מצוינת שנקרא פרוטוקול Microchem 18, להכין תבנית סיליקון עם photomask.
    2. לפברק microchannel PDMS (40 מ"מ x 25 מ"מ x 5 מ"מ, גובה X אורך x רוחב), פרוסת PDMS קטנה (800 מבנה חריץ מיקרומטר רחב) באמצעות ליתוגרפיה רך.
    3. אגרוף microchannel עבור יציאות גישה נוזלות ונקי אותו בנייר ואז עם IPA.
    4. מגן באזור בדוגמת של מצע זכוכית עם לוח PDMS, ולהחיל ורי (100 W, 500 mTorr, 60 שניות) כדי להסיר PLL-ז-PEG מאזור הפריפריה.
    5. פנקו את microchannel עם מינון מופחת של ורי (25 W, 500 mTorr, 25 שניות), ולאחר מכן יישר אותו מצע זכוכית בדוגמת (עם לוח PDMS קטן הסיר); להביא את microchannel ואת מצע זכוכית בדוגמת במגע קונפורמי תחת stereoscope.

איור 3
איור 3: דיאגרמות סכמטי להרכבת microfabrication שבב. א) תבנית של נקודות זהב על מצע זכוכית. ב) הכנת מצע הזכוכית עבור דפוסי תא באמצעות MAPL. ג) האסיפה של ערוץ microfluidic עם מליטה פלזמה. עיין ברשימת חומרי ההגדרות of את הקיצורים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. מצורף נייד
    הערה: תאים הלה נשמרות באופן שגרתי DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% / אנטיביוטיקה פתרון antimitotic בתוך תרבית תאים חממה. תרשים סכמטי עבור מצורף שבב הרכבת תא מוצג איור 3c.
    1. ראש השבב עם PBS למשך 30 דקות ב 1 μL / דקה, ולאחר מכן להשרות פתרון פיברונקטין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS, 1 μL / min) במשך 45 דקות.
    2. בזמן ההמתנה, trypsinize תרבית תאים עם 0.25% טריפסין- EDTA, לשטוף אותם במדיום תרבות, תאים בודדים צנטריפוגות, ולגבש מחדש את ההשעיה תא מחומם מראש (37 ° C) בינוני התרבות ב 5x10 6 תאים / מ"ל.
    3. החלף את הפתרון פיברונקטין עם PBS ולשטוף את השבב ב -10 μL / דקה 5 דקות.
    4. לְהַזרִיקהשעית התא המוכנה לתוך השבב, לעצור את הזרם, מהדקת את לשקע, ולשמור על השבב בתוך תרבית תאי חממה למשך 30 דקות.
    5. שחרר את לשקע ולשטוף את השבב עם תרבית תאים בינוניים ב 10 μL / דקה 5 דקות. הפחת את קצב הזרימה זלוף של המדיום תרבות ל -0.75 μL / min ולשמור על תרבית תאים עבור 2 שעות בחממה.

2. דור בועה ויזואליזציה הזרימה

הערה: סכמטי של הגדרת הניסוי מוצג באיור 4 א עבור דור בועת טנדם ואינטראקצית הזרימה כתוצאה עם תא בודד גדל סמוך ערוץ microfluidic.

  1. הדור של טנדם בועות עם שני לייזרים ושליטה העיתוי
    1. מניחים את שבב microfluidic על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה וליישר מוקדים של שני פעמו Nd: YAG לייזר (λ = 532 ננומטר, משך הדופק 5-NS) על זוג נקודות זהב בדוגמת ב מופרדיםy 40 מיקרומטר.
    2. השתמש גנרטור עיכוב דיגיטלי להפעיל שני לייזרים עם השהיה על 2.5 מיקרו-שניות לייצר שתי בועות יזם על נקודות זהב.
    3. התאם את האנרגיה פלט ליזר (~ 10 μJ) לייצר קוטר מרבי של הבועות בתוך 50 ± 2 מיקרומטר.
    4. סנכרון מצלמה במהירות גבוהה (חשיפת 200-NS ו -2 מיליון פריימים לשנייה (fps)) אל הלייזרים ללכוד את הדינמיקה של התפשטות בועה, התמוטטות, אינטראקצית בועת בועה, והיווצרות סילון.
  2. כימות של מהירות סילון
    1. להקליט את המיקום של קצה הסילון (J 1) בסוף הפרוקסימלי של הבועה הראשונה (B 1), ואת הקצה הדיסטלי של B 1, החל מ הדור של בועת השני (B 2) וכלה את הנחיתה של J 1 לקראת סוף דיסטלי של B 1; לראות את סכמטית ציור 5a.
    2. באופן ליניארי להתאים את מהלך הזמן של מיקום עבור בוטh הפרוקסימלי (טיפ סילון) ואת הקצוות דיסטלי. חשב את השיפוע של עמדת קצה לעומת עקומת זמן לסוף הפרוקסימלי כדי לקבוע את מהירות סילון. הצטלבות שני הקווים מציינת את זמן נחיתת מטוס. ניתן למצוא פרטים נוספים הפניה 19.
  3. ויזואליזציה של שדה זרימת טנדם הנגרמת בועה
    1. כן 1 מיקרומטר קלקר השעיה חרוזה (PS) במי DI (2.6% w / v) ולהזריק את החרוזים לתוך שבב microfluidic.
    2. צור בועות טנדם כמתואר בשלב 2.1.1-2.1.3.
    3. רשום את דינמיקת בועת טנדם באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה בשיעור מסגור של 5 M fps עם זמן חשיפה של 100 ננו-שניות.
    4. העלה את התמונה ברצף רכש לתוך תוכנת PIV מסחרית.
    5. מחלקים כל תמונה לתוך חלונות חקירה קטנים של 16 x 16 פיקסלים (px) עם חפיפה של 75%.
    6. החל איטרציה מרובה עוברים ומסננים אזוריים להפחית את טעויות חישוב שדה מהיר, ופלט תוצאות מפת וקטור מהירות.

איור 4
איור 4: סכמטי של הגדרת הניסוי והקלטת תמונה. א) התקנה ניסיונית עבור דור בועת טנדם. ב) רצף זמן לשמש עבור סוגים שונים של רכישות הדמיה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי, BF: FL שדה בהיר, IFT: זמן interframe. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח 3. תאים בודדים Bioeffects

הערה: בועת טנדם מיוצרת ליד תאי היעד, ואת bioeffects כתוצאה נלמד באופן מרחק תלויות תיקו. רצף הזמן עבור סוגים שונים של רכישות תמונה מתואר איור 4 ב.

  1. Poration ממברנה ספיגת macromolecular
    הערה: הספיגה של מולקולות תאיות לתוך תא המטרה מתאפיינת דיפוזיה המתקדמת של יודיד propidium קרום impermeant (PI) דרך אתר poration על קרום התא.
    1. בעקבות צעד 1.5, להחליף את המדיום תרבות קבוע (כלומר, DMEM) עם פתרון PI (100 מיקרוגרם / מ"ל DMEM) פועל בקצב זרימה זלוף של 0.5 μL / דקה לאורך הניסוי.
    2. לתכנת את תוכנת בקרת מיקרוסקופ כדי לבחור את קוביית PI הניאון אוטומטי על הצריח מסתובב לתזמן את הזמנים של מצלמת CCD עם עירור קרינת PI ללכוד תמונות קרינה עם זמן חשיפה של 200 ms.
    3. לאחר שני מוקדי הליזר מיושרים זוג נקודות זהב ליד תא המטרה, שיא הוא בתחום בהיר (BF) ו פלואורסצנטי (פל) תמונות לפני טיפול בועת טנדם.
    4. השתמש בתוכנת שליטה מיקרוסקופ מידלהתחיל הקלטת תמונת קרינת הזמן לשגות של תא המטרה זמן קצר לאחר צעד 2.1 כדי ללכוד את ההיסטוריה של ספיגת PI.
  2. עיוות ממברנה
    1. כן חרוזים 1 מיקרומטר (1% w / v, מופעל עם carbodiimide מסיס במים) ו functionalize אותם עם-2000 פפטיד (100 מיקרוגרם / מיליליטר PBS).
    2. בעקבות צעד 1.5, דגירת התאים המצורפים עם החרוזים הפונקציונליים בצפיפות של 1x10 9 חרוזים / מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. חזור על שלב 2.1 לייצר בועות טנדם ליד תא המטרה ולהקליט את העיוות תא עם מצלמת אולטרה-גבוהה מהירות הריצה בקצב מסגור של 5 מיליון fps.
    4. זהה את השלישיה של 3 חרוזים שנותרו במישור הדמיה לאורך הניסוי ולעבד עמדותיהם כמו (x 1, y 1) (x 2, y 2) ו- (x 3, y 3) בניסוי קואורדינטות.
    5. לחשב את השטח של השלישיה לפני after טיפול בועת טנדם באמצעות הנוסחא:
      משוואה 1
    6. חשב את המתח באזור כמו:
      משוואה 2
    7. בהתבסס על הקואורדינטות של השלושה קודקודים לפני ואחרי טיפול בועת טנדם, לחשב את המתח לכאבה המקומי העיקרי בא פרוטוקולים הוקמו 20,21.
  3. כדאיות אפופטוזיס
    הערה: FITC Annexin V תוויות בתאים, כולל אלה אפופטוטיים, דרך ההחצנה של phosphatidylserine (פלואורסצנטי ירוק). PI תוויות הגרעינים של תאי נימקים (אדום פלואורסצנטי). הדמיה שדה מוארת משמש לתעד מורפולוגיה תאים כדי לסייע בזיהוי של כדאיות התא אפופטוזיס.
    1. רשום את המיקום של כל תא מטופל הערוץ microfluidic (בהנחייתם של תוויות כתובת בערוץ, ראה איור 2b
    2. דגירה בתאים שטופלו במדיום תרבית תאים עבור 2 שעות אחרות לפני מרוססת השבב עם פתרון FITC Annexin V במשך 15 דקות. תאים חיוביים להציג פלואורסצנטי ירוק.
    3. חזור על שלב 3.3.2 24 שעות לאחר טיפול בועת טנדם ללמוד את bioeffects לטווח ארוך התאים הממוקדים.
  4. בתגובה סידן
    1. מערבבים 3 μL של פתרון פורעה-2 לפני הצהריים המניה (1 מ"ג / מ"ל ​​ב DMSO) עם 3 μL של 10% w / v Pluronic F-127 ב 500 μL של מדיום סרום מופחת להכין את הפתרון תיוג הסופי (6 מיקרומטר).
    2. בעקבות צעד 1.5, להחליף את תרבית תאים בינוניים עם הפתרון תיוג דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 40 דקות (1 שיעור זלוף μL / min).
    3. מלא את הערוץ עם מדיום הסרום המופחת (0.75 שיעור זלוף μL / min) לפני תחילת ניסוי התא.
    4. התחל הדמיה ratiometric (אורך גל: 340/380 ננומטר, 50-ms חשיפה)של תא המטרה באמצעות מערכת PTI המסחרית.
    5. לאחר 10 שניות של הדמית ratiometric של התא ברמה מנוחה, לייצר בועות טנדם כמו בשלב 2.1; תקליט ראשון עם זמן interframe (IFT) של 0.1 s דקות 1, ולאחר מכן להגדיל את IFT עד 1 s עבור דקות אחרות, עלייה נוספת עד 5 שניות לאחר 2 דקות.
    6. השתמש בתוכנת PTI לחשב את יחס R = F340 / F380 באזור של עניין (ROI), אשר עומד ביחס לריכוז סידן תוך תאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פלטפורמת microfluidic המתוארת בעבודה זו יכולה לשמש כדי לחקור אינטראקציות בועת בועה וכדי לנתח מגוון של bioeffects נגרמת cavitation ברמת התא הבודד. כאן, אנו מציגים מספר דוגמאות להפגין מגוון של מחקרים ניסויים ו- bioassays שניתן לבצע במערכת הניסוי שלנו. נדגים את האינטראקציות החולפות ראשון של בועות בד בבד עם היווצרות הסילון, ההדמיה של שדה הזרימה כתוצאה, ואת חישוב מהירות סילון (איור 5 א). אנו דוגמאות אז נוכחיות של טנדם בועה הנגרמת דפורמציה קרום תא מקומית (איור 5 ב '), poration קרום אתר עם ספיגת PI (5c איור), ותגובת סידן תוך תאים (איור 5D). דוגמאות אחרות, כגון מבחני כדאיות התא אפופטוזיס, ניתן למצוא סימוכין 22.

n-page = "1"> איור 5 א מציג דוגמה של אינטראקציה בועה בד בבד עם היווצרות סילון, שנתפסו על ידי הדמיה במהירות גבוהה, ואת שדה הזרימה כתוצאה המתגלים PIV. באופן ספציפי, לאחר הרחבתו מקסימלי, קריסת בועת הראשון ב 1 (מיוצר ב 0 מיקרו-שניות) מעוות סימטרית על ידי התרחבות מהירה של בועת השני B 2 (המיוצר על 2.5 מיקרו-שניות), המוביל להיווצרות של "מעלה" סילון (J 1) על 3.4 מיקרו-שניות ואת זרימת הטיסות הללו עוקבות הראו ב -5.4 מיקרו-שניות. מהירויות הסילון הממוצעות נקבעו על ידי השיפוע של קו מצויד עבור המיקום של סוף הפרוקסימלי (או המוט) של B 1 לפני הנחיתה (כלומר, מגע עם הקצה הדיסטלי של B 1) לעומת זמן. מהירות סילון הממוצע נמצא לעלות מ 20 ל 58 מ '/ s כאשר הקוטר המרבי של B 2 עולה מ 40 ל 60 מיקרומטר. בהתבסס על תוצאות ניתוח PIV, זרימת הטיסות הללו כיוונית ברחבי tandבועת em היא בסדר גודל של 10 מ '/ s והוא הכלוא בתוך רוחב בסדר גודל של 10 מיקרומטר. זהו אפוא מסוגלים לייצר מתח גזירה אימפולסיבית נקודות שיפוע לחץ על תא היעד גדל בקרבת מקום.

דוגמא נוספת שמוצגת באיור 5b ממחישה את עיוות קרום התא הנגרמת על ידי זרימת הטיסות הללו כיוונית ונקודות היוצר על ידי טנדם בועות ב ד S המרחק תיקו = 40 מיקרומטר. דפורמציה הקרום וההתאוששות מודגשות על ידי הוצאתו של חרוז פונקציונלי (מסומן על ידי הקו המקווקו הצהוב) מחוברי הקצה המוביל של קרום התא. זן התקשורת המקומי ניתן לחשב את הקואורדינטות של שלישייה של חרוזים סמוכים. סכמטי של שינוי השטח המרבי מחושב במקומות שונים על פני התא מוצג באמצע. הקצה המוביל נמתח בעיקר (ראה את העיגולים הירוקים), בעוד נגרר לקצה או latצדדי eral של התא הם דחוסים (כפי שצוינו על ידי העיגולים האדומים), מציין ההטרוגניות לעיוות תא המיוצר על ידי זרימת הטיסות הללו המושרה בועת טנדם. הווריאציה הזמנית של המתח באזור בחוד החנית התא מודגמת מימין. היא מורכבת כמה תנודות מהירות בהתחלה, ואחריו מתיחה גדולה המתמשכת במשך כ -100 מייקרו-שניות (FWHM) והתאוששות הדרגתית עוקבת על ציר זמן של כמה מילישניות.

יתר על כן, זן השטח הגדול ומתח בלתי נפרד אל תא קצה מוביל עשויים להיות אחראי poration קרום תא שנצפה ד S הקטן, כפי שמוצגים 5c איור. ב- S ד קטן (כלומר, 10 מיקרומטר, או במקרים מסוימים, 20 מיקרומטר) ו ד S ביניים (כלומר, הרוב המכריע של 20 ו -30 מיקרומטר), שיבוש קרום מקומי מושרה, שמוביל ספיגת נקודתית של PI תאיים לתוךcytosol. אם עוצמת PI בתוך התא ממשיכה להגדיל ללא רוויה, נימק מתרחש. לשם השוואה, אם עוצמת PI היא בסדר גודל נמוך ומגיעה רמה בתוך 10 שניות לאחר טיפול בועת טנדם, poration לתיקון עם הישרדות תא סבירה יתרחש, אשר נתמך גם על ידי השינוי המזערי מורפולוגיה תא. בשעת ד S הגדול (כלומר, 40 מיקרומטר), ספיגת PI זניחה נמצאה לאחר טיפול בועת טנדם, מציין זניח או-poration שאינו. התא יכול לשרוד עם צמיחה קבועה ושגשוגם 22. בסך הכל, התוצאות מראות מעבר ברור בתגובת תא מפני נימק, דרך poration קרום בר תיקון ל-poration שאינו בטווח של S ד ≈ 20-40 מיקרומטר.

לבסוף, אנו מראים את התוצאות של הדמית ratiometric תגובת סידן תאיים שהושרה על ידי בועות טנדם בתאים בודדים בבית השונה Sד, במיוחד בטווח sublethal של S ד = 30-50 מיקרומטר (איור 5D). היחס העוצם עומד ביחס ישר לכמות הסידן תאי. בשעת ד S הקטן (כלומר, 30 מיקרומטר או, במקרים מסוימים, 40 מיקרומטר), גל סידן נסיעת המקצה שמוביל נגרר לקצה הוא ציין בבירור בתוך כמה שניות לאחר טיפול בועת טנדם. לאחר סידן תאיים מגיע ריכוז שיא, זה דועך לאיטו חזרה לרמת המנוחה תוך מספר דקות. לעומת זאת, ב ד S הגדול (כלומר, ברוב של 50 מיקרומטר, או במקרים מסוימים, 40 מיקרומטר), העלייה של סידן תוך תאים היא הרבה יותר מתונה, ולא ברור גל סידן גלוי נסיעה ניתן לזהות. שני אלה תגובות סידן שונות יכולות גם להבחין בין הפרופילים לעומת זמן יחס עצמה שלהם, עם הבדלים משמעותיים את המשרעת השיא של היחס העוצם וזמן העלייה מ נח רמת השיאערך. במכירה ד S אפילו גדולה יותר (כלומר, מעל 60 מיקרומטר), חוסר תגובת סידן ניתן לצפות. אחוז התאים הלה מוצגים תגובות סידן ב ד S השונה מסוכם איור 5D (מימין).

בסיכומו של דבר, התוצאות שלנו הראו כי, על ידי שינוי העוצם זרם הטיסות הללו (או שינוי ד S), מגוון של bioeffects ניתן לייצר תאים הלה בודדים בתנאי תרבות דומים, מתואם הנראה עם משרעת והמשך של העיוות המכנה מוטלות על קרום התא 22.

איור 5
איור 5: תוצאות מאינטראקצית בועת טנדם, דפורמציה קרום תא, poration קרום, מבחנים בתגובת סידן. א) ותנועה חלקה ואת הסילוןהנגרם על ידי אינטראקצית בועת טנדם. משמאל: מסגרות נבחרות מראות אינטראקציות בועה בד בבד עם היווצרות הסילון וזרימת שדה נחשף על ידי PIV. בקטרים ​​המקסימאליים של שתי הבועות הם כ -50 ± 2 מיקרומטר. תיכון: סכמטי של בועות טנדם הטיסות הללו, הממחיש את ציר המרכז, מקורו של הקואורדינטות (o), וסמוך ומסתיים דיסטלי (או מוטות) של B 1 הבועה הראשונה. עמדות מוט נמדד (עם שגיאה = ± 1 מיקרומטר) בבית הפרוקסימלית ומ הקצה הדיסטלי של B 1: נכון. ב) דפורמציה קרום התא. משמאל: הקו המקווקו הצהוב תוויות הוצאתו של חרוז PS המצורף הקצה המוביל של קרום התא, המציין את עיוות הקרום המקומית והתאוששות. תיכון: סכמטי המציג את אזור שיא זנים במקומות שונים על פני התא יוצגו בפינה השמאלית. משמאל: קורסים בזמן של הזנים באזור באמצע הקצה המוביל התא. Ε Δ הוא זן אזור bas מחושבאד על זני קרן Δ Δ הוא זן האזור המחושב על בסיס שינוי גיאומטרית השלישייה. פרטים נוספים על חישוב המתח באזור וניתוח שגיאה מתועדים הפניה 22. ג) poration קרום התא. משמאל: תמונות שדה בהירות לפני ואחרי תמונות קרינת טיפול בועת טנדם הזמן לשגות של ספיגת PI (0 ו -120 ימים). החצים הלבנים מצביעים על כיוון זרימת הטיסות הללו. תיכון: השינוי הטיפוסי של עוצמת PI הממוצעת לעומת זמן בתוך התאים. תוצאות סטטיסטיות של אחוז התאים שעברו נימק (אדום), poration לתיקון (כחולה), ולא poration (ירוק) ב ד S השונה: נכון. מספר תאים שטופלו: N = 9, 14, 14, ו -8 עבור ד S = 10, 20, 30, ו -40, בהתאמה. השגיאה הנתונה היא ± 1 / √ נ ד) בתגובת סידן תאיים. רצפים של תמונות ratiometric מראים את תגובות סידן תוך תאים של תא יחיד: שמאלים ב S ד של 30 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר. החיצים האדומים מציינים את כיוון הסילון. תיכון: פרופילי תגובה טיפוסיים (עקומות בזמן יחס) ב ד S השונה. מימין: הסתברות תגובת סידן ב- S ד השונה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מרחק תיקו (S ד) (מיקרומטר) ריינולדס מספר (Re) בממוצע מאמץ הגזירה (Pa) במישור YZ
20 206.96 618.64
30 354.8 709.69
40 378.78 657.22
50 163.85 323.61
60 105.08 42.21

טבלה 1: רשימת הפרמטרים לפיזיקה זרימת מתוצאות PIV. מספר משוער ריינולדס והעמיד ממוצעים של מאמץ גזירה ביחס מרחקי תיקו שונים (S ד). המטוס YZ מתייחס למישור x גובה רוחב הערוץ. מאמץ הגזירה בממוצע מוערך מגובה של 0 עד 7.7 מיקרומטר מתחתית הערוץ כיון גובה התא בערוץ הוא בסביבות 6-7 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח מתא בודד, בשילוב עם הדמיה לחיות תאים, שיפרה מאוד את הבנתנו של תהליכים דינמיים ולעיתים קרובות משתנה בתאים בודדים, כגון פיתוח פנוטיפ התגובה החיסונית 23. בניגוד תרבית התא הקונבנציונלי במנות או צלוחיות, מערכות microfluidic לאפשר שליטה מדויקת של microenvironment, עד לרמת התא הבודד, בזמן אמת. כתוצאה מכך, התפתחות טכנולוגית microfluidic וטכניקות בעיקר שפרו את התפוקה ואת השחזור של ניתוח תא בודד. על ידי שילוב דפוסים ליתוגרפיה משטח רכים, מערכות microfluidic יכולות להיות מתוכננות נוספת כדי להקל על הניתוח המעמיק של תגובת תא בודד כדי תבניות מורכבות של גירויים משתנים spatiotemporally. לדוגמא, כימי חולף או רמזים מכאניים הועברו בהצלחת תאים בודדים ואילו התגובות הביולוגיות או מכאניות שלהן נרשמו אוטומטית ונותח 24. למרות מגמה כללית זו, היישום של מיקרופלואידיקה לניתוח bioeffects הנגרמת cavitation ברמה התאית הוגבל מאוד. ראוי לציון במיוחד הוא יושם רק poration קרום-induced בועה של תאים בודדים השעיה לכודים על ידי micropillars 11. ברוב המכריע של מחקרים על תאים חסידים, לטובת שליטת מורפולוגיה תאים לשמור על עקביויות אינטראקציות בועת תאים דינמיות אינה זמינה או הוזנח.

פיתחנו מערכת microfluidic לשלוט ייזום בדיוק, הרחבת עוקבות ודינמיקה קריסת בועות cavitation; אינטראקציות בועה בועה עם היווצרות סילון; ו צורת תא, נטייה, הדבקת דפוס, ומרחק תיקו מן הבועות, ובכך מאפשרת זרימת טיסות הללו לשחזור לחול על תאים בודדים תחת תנאי ניסוי מבוקרים היטב. מערכת microfluidic הרומן הזה הוא אידיאלי לביצוע רח היסודudies על בועת cavitation (ים) דו תאי אינטראקציות שרלוונטיות מגוון רחב של יישומים אולטרסאונד טיפוליים, כגון SWL, HIFU, ו sonoporation. אנחנו הוכחנו כי מערכת microfluidic שלנו יכולה לשמש כדי לחקור bioeffects cavitation מושרה שונה, כולל עיוות קרום תא, קרום poration, כדאיות ותגובת סידן, באופן יותר לשליטה לשחזור. בעיקר, את זרימת הטיסות הללו כיוונית המיוצרת על ידי בועות טנדם מאפשרת לנו לחקור את תגובת הרכוש וסידן מכנה בתאים בודדים תת שיעורי זן גבוהים שלא היה מאופיינים היטב. המדינה המקומית, לחץ המכאני אימפולסיבית המיוצר על ידי כגון זרימת טיסות הללו לא ניתן להשיג על ידי שיטות קונבנציונליות מתיחות, כגון שאיפת micropipette 25 והשימוש אופטי 26 ו פינצטה המגנטית 27. יתר על כן, בניגוד למחקרים קודמים באמצעות סוכנים בניגוד אולטרסאונד 8,28-30 או מושרה ליזר יחיד bubbles 31,32, מערכת microfluidic שלנו מציעה שליטה טובה יותר של תנאי גיאומטרית הידבקות תא, ובכך להקטין ההשפעה המהותית על תגובה תאית bioeffects 16.

בעוד הטכניקה שלנו היא אמינה לשחזור, אחד חייב לעקוב אחר הפרוטוקול בזהירות על מנת להבטיח כי המערכת הניסיונית משוחזרת בנאמנות. איכות דפוסי פני שטח microchannel היא אחראית בעיקר על השחזור של אינטראקציות בועת בועת התאים ומערך bioeffects במורד הזרם. לדוגמא, עבור תאי הלה, באזור של כל נקודת זהב חייב להיות סביב 25-30 מיקרומטר 2 על מנת להבטיח דור בועה יציב תוך מניעת התאים דבקים. מצד השני, כאשר שטח כל אי צופה פיברונקטין צריך להיות סביב 700-900 מיקרומטר 2 כדי להקל על הנאות מתפשט של תא בודד בתוך ריבוע תוך צמצום הסיכוי של מספר תאים ויוצרי אגרגטים באי. יישורבין נקודות זהב והאיים מצופה פיברונקטין חייב להתבצע דווקא עם לעזרת aligner מסכה לשמור על שגיאה זוויתי בתוך 1 ° והשגיאה צירית בתוך 0.5 מיקרומטר. יתר על כן, מערכת ניסיונית זו מספקת צדדית ניטור סדרה של אירועים, עם ציר הזמן שלהם מגוון על ידי סדר הגודל (למשל, דינמיקת בועה: מייקרו-שניות, עיוות תא: ms, poration קרום: שניות, אפופטוזיס: ח). לכן, חשוב לשלוט בעיתוי מדויק של רכישת תמונה והקלטה של ​​כל רצף ידי כיוון עדין אותות ההדק (בשליטת גנרטור עיכוב דיגיטלי). תרבות התא הבודד חייב להישמר היטב microchannel למזער תא אל תא וריאצית פנוטיפ (בעיקר המכונה מורפולוגיה). לכן, דגירת 2-h מינימום נדרש מצורף תא והפצה באיים לפני שתמשיך עם טיפול בתאי במורד זרם. מומלץ תמיד לשמור על קצב הזרימה של microchannאל מתחת ל 3 μL / דקה, כך לחץ זרימת הגזירה היוצר על ידי מדיום התרבות במחזור על התא נמצא בטווח הפיזיולוגי.

מגבלה נוכחית אחד הטכניקה שלנו היא שאינטראקצית בועת טנדם ואת זרימת jetting כתוצאה יכולות להיות מיושמות רק לתא יעד פעם, משום נקודות הזהב תהיה ablated ידי הקרנת הליזר. חיסרון זה מגביל את היכולת של מערכת הניסוי שלנו לחקות את bioeffects המיוצר על ידי אולטרסאונד טיפולי, שבו התאים נחשפים לעתים קרובות לאירועים cavitation. עם זאת, ההגבלה הזמנית הזה ניתן להקל על ידי יישום אחר שכבה דקה של צורן דו-חמצנים על מנת להגן על נקודות זהב מפני חשיפה ישירה ב -15 הנוזלים. בסך הכל, מערכת microfluidic שלנו מציעה תנאי ניסוי מבוקרים היטב כדי לחקור את bioeffects המופק בועת cavitation (ים) אינטראקציות דו תאים ויש לו כמה תכונות ייחודיות. ראשית, הוא את הגודל ואת המיקום של cavitation בועות בדואר שלנומערכת xperimental ניתן לשלוט במדויק על ידי התאמת אנרגיה לייזר האירוע נקלט על ידי נקודות זהב. שנית, גיאומטרית ההידבקות של תאים בודדים הם טופלו ע"י דפוסי תא כדי למזער את ההשפעות שלהם על תשובות תא bioeffects, מה שהובילו לתוצאות לשחזור יותר. שלישית, יחידות עבודה במקביל בתכנון שבב microfluidic לעשות את זה אפשרי ללמוד bioeffects במורד הזרם, כגון צמיחת תאים, התפשטות, ביטוי גנים פוטנציאלי, לאחר חשיפת cavitation, מאז בכל תא ניתן לטפל ומפוקחים בנפרד. לסיכום, המערכת ומתודולוגיה microfluidic שלנו ליצור אינטראקציות בועת בועה אמינות ללמוד את bioeffects של תאים בודדים עם דיוק משופר.

השבב הנוכחי שלנו נועד לניתוח של תאי הלה פרט. עם זאת, שינוי של הדפוס איים על שורות תאים של יונקים אחרים גם אפשרי. ניתן לבצע מספר שיפורים להרחיב את אפליקציות נוספותNS של השבב. לדוגמא, תחליפים של מולקולות PLL-ז-PEG יכולים להיחקר להפסיק תאים בדוגמת בודדים נודדים אפילו אחרי 24 שעות. בנוסף, עיצובי שבב חדשים עם שסתומי microfluidic עשויים להיחקר לשלוט microenvironment המקומית של התאים, כך כימיקלים כגון סמני קרינה או חומרים כימיים רעילים יוחלו רק למקום מסוים, מבלי להשפיע על התאים באזורים אחרים של השבב . הודות לשיפורים אלה, המערכת microfluidic המוצג כאן עשויה לספק הזדמנויות ללמוד את bioeffects ארוכת הטווח של תאים בודדים, כמו חילוף חומרים, הפרדה, בידול, ביטוי גנים, בעקבות חשיפת cavitation או גירויים מכניים המיוצרים על ידי זרימה אימפולסיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Materials
75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides Corning 2947-75X38
Acetone Sigma Aldrich, Co. 320110 ACS reagent, ≥99.5%
Isopropyl alcohol Sigma Aldrich, Co. W292907 ≥99.7%, FCC, FG
Sulfuric acid Sigma Aldrich, Co. 320501 ACS reagent, 95.0-98.0%
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich, Co. 216763 30 wt.% in H2O
Primer P-20 Microchem MCC Primer 80/20
NFR photoresist JSR NFR016D2
Photomask Photoplotstore N/A 4x4 Direct write mask
MF-319 Developer Shipley (Rohm and Haas) Microposit MF-319
1165 Photoresist Remover Dow Chemical, Co. DEM-10018073 1-methyl-2-pyrrolidinone based
S1813 photoresist Shipley (Rohm and Haas) S1813
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Paraffin film HACH 251764
SU-2025 photoresist Microchem SU-2025
PDMS Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Microbore Tubing Saint-Gobain PPL Corp. S-54-HL
Metal pins New England Small Tube NE-1300-01 Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long
HeLa cells Duke Cell Culture Facility (307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) buffer ThermoFisher Scientific 14190144
DMEM culture medium ThermoFisher Scientific 11995065
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher Scientific 33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1x) ThermoFisher Scientific 25200056
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P21493
Carboxylate Microspheres 1.00 μm Polysciences, Inc 08226-15
Carboxylate Microspheres 2.00 μm Polysciences, Inc 18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) ThermoFisher Scientific 22980
Sulfo-NHS Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) 24510
Peptite-2000 Advanced BioMatrix 5020-5MG
FITC Annexin V ThermoFisher Scientific A13199
Fura-2, AM ThermoFisher Scientific F1221
DMSO Sigma Aldrich, Co. D2650
F-127 invitrogen P6866 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)
Reduced serum media  ThermoFisher Scientific 11058021
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Plasma asher Emitech K-1050X O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials
Mask aligner SUSS MicroTec  Karl Suss MA6/BA6
E-beam evaporator CHA Industries CHA Industries Solution E-Beam
RIE Trion Technology  Trion Technology Phantom II (oxide/ nitride/ polymer) etching
Stereoscope AmScope American Scope SM-4TZ-FRL Stereo Microscope
Syringe pump Chemyx Inc NanoJet
Cell culture incubator NuAire AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator
Biological Safety Cabinets NuAire NU-425-400
Water bath VWR 1122s
Centrifuge IEC Centra CL2
Microscope Zeiss Axio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1) New Wave Research Tempest
Nd:YAG laser  (laser 2) New Wave Research Orion
Delay generator Berkeley Nucleonics  BNC 565-8c
Flash lamp Dyna-Lite ML1000 fiber-coupled flashtube
high speed camera DRS Hadland  Imacon 200
high speed  camera Shimadzu HPV-X
high speed camera Vision Research Phantom V7.3
PIV software LaVision DaVis 7.2
camera Zeiss AxioCam MRc 5
software Zeiss AxioVision
PTI system Horiba S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software Horiba Easy Ratio Pro 2 version 2.3.125.86
63× objective Zeiss LD Plan Neofluar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  4. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
  5. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  6. Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
  7. Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
  8. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  9. Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
  10. Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
  11. Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  12. Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
  13. Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
  14. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
  15. Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
  16. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  17. Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
  18. Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
  19. Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
  20. Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
  21. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  22. Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
  23. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
  24. Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  25. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
  26. Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
  27. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
  28. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
  29. van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
  30. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  31. Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
  32. Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).

Tags

Bioengineering גיליון 119 מיקרופלואידיקה ניתוח תא בודד cavitation טיפטוף התא זרימת jetting poration קרום דפורמציה הממברנה בתגובה סידן
מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, F., Yuan, F., Sankin, G., Yang,… More

Li, F., Yuan, F., Sankin, G., Yang, C., Zhong, P. A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)–Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level. J. Vis. Exp. (119), e55106, doi:10.3791/55106 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter