Abstract
이 논문에서는 먼저 정확하게 탠덤 거품 잘 정의 된 위치 및 형상에 가까운 패턴 개별 세포의 생성을 제어하는 동일한 유리 기판 상에 금 도트 피브로넥틴 - 코팅 영역으로, 미세 유체 칩의 제작 프로토콜을 설명한다. 그런 다음 몇 마이크로 초 시간 지연 골드 도트 쌍 조명 개의 펄스 레이저를 이용하여 탠덤 기포의 생성을 보여준다. 우리는 고속 촬상하여 버블 버블 제트 상호 작용 형성을 시각화 입자 화상 속도계 (PIV)를 사용하여 생성 된 유동장의 특성. 마지막으로, 우리는 고분자 흡수와 세포막의 poration, 부착 인테그린 결합 구슬의 변위에 의해 결정 지역화 막 변형 및 비율 적 영상에서 세포 내 칼슘 응답을 포함하여 단일 세포 분석,이 기술의 일부 응용 프로그램을 제시한다. 우리의 결과는 빠르고 방향 분사 흐름이 프로임을 보여근접 성장한 세포의 표면에서 매우 국부적 전단 응력을 부과 할 수있는 탠덤 기포 작용에 의해 선보였. 또 다른 bioeffects는 탠덤 기포 셀의 유격 거리를 조정함으로써 분사 흐름의 강도를 변화시킴으로써 유도 될 수있다.
Introduction
휴대 이질성이, 유전자, 단백질 및 대사 산물의 확률 적 표현에서 발생하는 큰 세포 집단 내에 존재하는 세포의 적응과 진화 한 수 있도록 생물학의 기본 원리 역할을하는 성장 인식이 있습니다. 따라서, 개별 셀들은 상호 작용의 기능을 이해하는 인구 기반 벌크 측정을 사용하는 정확하고 신뢰할 수 없다. 단일 세포 분석을위한 새로운 기술을 개발하는 것은 따라서 생물학적 및 약리학 적 연구에서 높은 관심, 그리고 더 줄기 세포 생물학 및 암 치료 2-4의 주요 신호 전달 경로 및 과정을 이해하는데 사용될 수있다. 최근, 미세 유체 플랫폼의 등장은 크게 각 셀의 응답의 위치 설정, 처리, 및 관찰 신규 분석 전략 5 수행 된 단일 세포 분석을 용이하게하고있다.
캐비테이션 고강도 의한 암의 치료를 비롯한 생물 의학적 응용의 다양한 범위에 중요한 역할 초음파 (HIFU) 6- 집중 연극 충격파 쇄석술 의한 신장 결석의 비 침습적 단편화 (SWL) (7) 약물 또는 유전자 전달 sonoporation 8 및 유체 역학적 거품 캐비테이션 (9, 10)에 의해 세포 나 조직의 최근보고 된 파괴에 의해. 그럼에도 불구하고, 캐비테이션 버블 (들) 생체 조직과 세포와의 상호 작용의 동적 프로세스는 잘 이해되지 않았다. 이 초음파, 충격파, 지역 유압에 의해 생성 된 캐비테이션 개시 및 거품 역학의 임의성 때문이다; 또한, 특히, 단일 세포 수준에서 생체 세포의 본질적으로 복잡하고 빠르게 응답을 해결하는 기술을 가능하게 부족하다.
이러한 문제의, 그것은 놀라운 일이 아니다 때문에 거의 연구는 꿀벌을 가지고N은 잘 조절 된 실험 조건 하에서 버블 - 세포 상호 작용을 조사하는 것으로보고. 예를 들어, 각각의 세포의 세포막의 poration 서스펜션 (11)에 포획 및 인간 적혈구 (12)의 임펄스 큰 변형이 미세 채널에서 발생 된 레이저 단일 기포를 이용하여 입증되었다. 후자의 기술은, 그러나, 인해 핵 (13)의 존재에 진핵 세포에서 매우 작은 변형을 생성 할 수있다. 또한, 세포 현탁액을 처리 할 때 하류 bioeffects을 모니터하기가 어렵다. 다른 연구에서, 단일 부착 세포에서 세포막의 poration 및 / 또는 세포 칼슘 응답을 생성하는 세포 - 결합 된 미세 기포 (또는 초음파 조영제) 초음파 자극은 8보고되었다. 단일 부착 세포의 멤브레인의 poration 또한 광 흡수 트리 판 블루 용액 (14)을 포함하는 얇은 액체 층에 레이저 발생 탠덤 거품을 사용하여 제조하거나 할 수있다microchambers 15 광학적 흡수 기판을 통해 조사 마이크로 레이저 펄스에 의해 발생 된 진동에 의한 기포. 비교하면, 후자는 세포에 독성이기 때문에, 광 흡수 기판을 레이저 흡수 트리 판 블루 용액에 비해 이점을 갖는다. 더 중요한 것은, 레이저 발생하는 기포는 음향 여기 기포보다 거품의 크기 및 위치의 관점에서 더 많은 제어 가능하다. 그럼에도 불구하고, 모든 이전의 연구에서, 셀 형상, 방향, 접착 조건은 실질적으로 세포 반응 및 기계적 응력 (16)에 의해 생성 bioeffects 영향을 미칠 수있는 조절되지 않았다.
이전 연구에서의 이러한 단점을 극복하기 위해 최근 버블 발생 세포 패터닝 버블 버블 - 세포 상호 작용 및 실시간 미세 TECHN의 독특한 조합을 이용하여 구성되는 마이크로 유체 칩 내의 세포 반응의 생물 검정을위한 실험 시스템을 개발iques. 분야의 다른 사람들로부터 우리 실험 시스템을 구별 세 가지 특징은 1) 유리 기판 상에 마이크론 크기의 금 도트 패턴은 버블 발생 17 지역화 레이저 흡수성을 활성화하는 단계; 2) 동일한 기판 상에 세포 접착 세포 외 기질 (ECM)의 마이크론 크기의 아일랜드의 패터닝 위치 및 각 셀의 구조 모두를 제어하는 단계; 3) 준 2 차원 공간에 3 차원의 기포 거품 세포 상호 작용 도메인의 치수의 압축은 모든 캡처, 유동장, 셀의 변형, 및 bioeffects 분사 거품 기포 상호 작용의 면내 시각화를 용이하게 하나의 간소화 된 영상 시퀀스 (그림 1D).
그림 1 : 미세 유체 칩과 다른 분석의 개략도. 가) 채널을 가진 조립 된 미세 유체 칩은 파란색 잉크로 가득 시각화를위한. b)는 패턴 세포와 골드 점 마이크로 유체 칩 내부 영역은 (근접에있는 두 개의 골드 점 사이의 거리)는 40 μm의입니다. 작업 단위의 다수 쌍의 채널에 배치 될 수있다. 금 도트 한 쌍의 셀 패터닝 영역에 부착 된 헬라 세포로 이루어진 단일 작업 단위의 c) 이미지. 디바이스 동작의 d) 회로도. 하나의 셀을 준수하고 피브로넥틴로 코팅 된 "H"모양의 섬에 펼쳐집니다. 역상 진동으로 캐비테이션 기포 (탠덤 기포)의 쌍은 주변 타겟 셀을 향해 이동 빠르고 국소 젯의 생성을 선도 (도 4a 참조)을 금 도트에 펄스 레이저 빔을 조사함으로써 생성된다. 세포는 변형 고분자 흡수위한 porated 및 / 또는 직렬 기포 셀의 이격 거리 (S의 d)에 따라, 칼슘 응답을 자극 할 수있다.F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 플랫폼은 또한 형광 분석법 캐비테이션 유도 bioeffects 대한 세포 표면에 부착 된 기능화 된 비드와 결합 될 수있다. 특히,이 플랫폼은 단일 세포 수준에서 신뢰성 및 정량 분석을위한 방법을 연다. 지금까지, 우리는 직렬 버블 의한 세포막 변형 셀의 poration 세포 내 흡수, 생존, 세포 사멸, 세포 내 칼슘 응답의 분석 장치를 사용했다. 다음의 프로토콜에서는, 칩 제조 공정과 상술 한 각종 bioeffects을 분석하는 과정을 설명한다. 또한, 칩의 동작은 설명한다.
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Protocol
1. 미세
참고 : 모든 미세 절차는 클린 룸에서 수행된다. 크롬 마스크는, 이전에 미세하도록 설계 그림 2 참조한다.
도 2 미세 유체 칩의 채널 디자인 및 작업 유닛의 치수의 회로도. ) (파랑 및 빨강 유리 기판 상에 정렬 된 PDMS 마이크로 채널 (녹색) 및 패턴) 마스크 디자인. 작동 부 배열의 대표 부분의 마스크 디자인 b) 확대 된 이미지. 셀 패턴 (파란색)와 골드 도트의 쌍 (빨간색)를 보여주는 하나의 작업 단위의 C) 도식. 모든 길이 스케일은 오른쪽 아래에 표시됩니다. 고맙다을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 게르 버전입니다.
- 골드 도트 패턴
주 :이 부착 개별 셀을 방지 할 정도로 기포 생성을위한 레이저 에너지를 흡수하기에 충분히 큰, 그러나 작도록 각 금 도트의 면적은 25 ~ 30 ㎛의 2 내에 있도록 설계된다. 금 도트 제조를위한 개략도도 3a에 도시되어있다.- (화학 후드) 청소 유리 슬라이드
- 이소 프로필 알코올 (IPA)이어서 아세톤으로 유리 슬라이드를 세척하고 N 2 흐름을 건조.
- 10 분 피라냐 용액 슬라이드 (: H 2 O 2 = 4 일 H 2 SO 4)을 담근다.
- 슬라이드를 꺼내 DI의 물로 씻어 후 N 2 흐름을 건조.
- 10 분 동안 120 ℃에서 열판에서 유리 슬라이드를 굽는다.
- 90의 100 W에 플라즈마 애셔에서 슬라이드를 취급합니다.
- 스핀 코팅 (스핀 코팅 후드)
- 열판의 전원을 켜고 온도가 95 ° C에서 안정 될 때까지 기다립니다.
- 코팅 절차를 따르십시오 :
500 RPM / s의 램프 5 초 동안 1,000 rpm으로;
다음 1,000 rpm으로 / s의 램프 30 초 동안 3,000 rpm으로. - 진공을 적용하여 스핀 코터 상 세정 된 유리 슬라이드에 고정한다.
- P-20와 슬라이드 표면을 덮고 코팅 레시피를 시작합니다.
- NFR-네가티브 포토 레지스트의 코팅 과정을 반복합니다.
- 60 초 동안 95 ° C에서 슬라이드 베이크 및 실온까지 냉각 될 때까지 기다린다.
- 석판 술
- 마스크 얼 라이너에 크롬 마스크를 탑재하고 패턴면이 아래로 슬라이드쪽으로 향하게되어 있는지 확인하십시오.
- 마스크와 유리 기판을 정렬 빠르게 UV 노출과 9의 하드 노출 모드에 포토 리소그래피 법을 설정하고.
- 자외선 노출을 수행 한 후, 95에서 슬라이드를 구워6; C 1 분 동안 한 후 실온까지 냉각하자.
- 개발
- 60 초 동안 현상액에서 슬라이드에 패턴을 개발합니다.
- 개발자에서 슬라이드를 제거 DI 물로 세척하고, N 2 흐름을 건조.
- 현미경으로 패턴 형상을 확인하고 측정 기능의 크기를 기록한다.
- 금 증착 (E-빔 증발) 및 리프트 오프
- 5 분 동안 120 ° C에서 슬라이드를 구워, 실온까지 냉각하자.
- 500 Torr 내지 100 W. 90 (S)에 대한 반응성 이온 에칭 (RIE) 장치의 플라즈마 슬라이드를 청소
- 금고의 Ti 5 nm이고, 전자빔 증착기 (17)를 이용하여 슬라이드에 Au로 15 내지.
- 레지스트 NFR의 상단에 금 휴식을 제거하는 용매 포토 레지스트 제거를 포함하는 유리 비커에 밤새 슬라이드를 만끽 해보세요.
- 슬라이드를 검색, 플러시 전아세톤 IPA t는 다음과 N 2 흐름을 건조.
- 90 초 동안 100 W의 산소 플라즈마 애셔 그것을 청소하기 전에 115 ° C에서 핫 플레이트에 슬라이드를 건조시킵니다.
- (화학 후드) 청소 유리 슬라이드
- 리프트 오프 (lift-off)에 의해 분자 조립 패턴 (MAPL)
주 : 각 피브로넥틴 피복 섬의 면적은 700-900 μm의 2 섬 응집 여러 셀의 가능성을 최소화하면서 사각형 영역 확산 적절한 헬라 세포를 용이 내에 설정된다. 세포 패터닝 섬의 제조를위한 개략도도 3b에 도시된다.- 스핀 코팅
- 1.1.2 단계를 반복하지만, S1813은 양성 포토 레지스트를 115 ℃의 온도를 사용한다.
- 정렬 된 포토 리소그래피
- 마스크 얼 라이너에 크롬 마스크를 탑재하고 패턴 측면이와 슬라이드를 향해 아래로 향하게되어 있는지 확인골드 점.
- UV 노출의 9의 하드 노출 모드에 포토 리소그래피 레시피를 설정합니다.
- 공간적 기준으로서, 상기 마스크의 에지 주변에 위치 정렬 마크를 사용하여 하단의 슬라이드 상부 마스크 정렬.
- 마스크의 중앙 부분을 확인하고 패턴 기능이 제대로 정렬되어 있는지 확인합니다.
- 후 베이킹없이 자외선 노출을 완료합니다.
- 개발
- 1.1.3하지만 개발의 45 초와 핫 플레이트에 건조 및 N 2 저장소에 보존 이전 단계를 반복합니다.
- 스핀 코팅
- 화학 처리
- 패시베이션 솔루션을 준비 : 0.5 밀리그램 / 10 mM의 HEPES 버퍼 mL의 PLL-g-PEG.
- N 2 저장 부로부터 슬라이드를 검색하여 파라미터 설정으로 RIE를 이용하여 청소 : 500 Torr의 압력, 100 W 전력, 및 90의 기간.
- 파라핀 필름의 조각에 솔루션을 패시의 피펫 한 방울. </ 리>
- 패턴이있는 쪽이 필름을 향해 아래로 향하게되는 기능을 확인하고, 필름과 슬라이드 솔루션을 샌드위치; 버블의 형성을 피한다.
- 영화에서 슬라이드를 제거하기 전에 45 분 동안 기다립니다.
- 포토 레지스트 제거, 포토 레지스트 제거 및 DI 물 (1 : 1)로 연속해서 슬라이드 담근 및 DI 물, 각각의 침지 90 초 동안 초음파 욕을 교반.
- 데시 케이 터를 밀봉하여 냉장고에 보관하기 전에 수분을 제거하고, 핫 플레이트상에서 슬라이드를 건조.
- 칩 어셈블리
- 반복 1.1.1-1.1.4 단계 있지만 SU8-2025 네거티브 포토 레지스트 및 파라미터 설정에 포토 마스크와 실리콘 몰드를 제조 상기 MICROCHEM 프로토콜 (18)라고 함.
- PDMS 마이크로 채널 (40mm X 25mm X 5mm, L x 폭 x 높이)와 소프트 리소그래피를 사용하여 작은 PDMS의 슬래브 (800 μm의 넓은 홈 구조)를 제작.
- microchanne 펀치유체 액세스 포트 리터와 깨끗하게 테이프로 다음 IPA와.
- PDMS의 슬래브와 유리 기판의 패턴 화 영역을 보호하고, RIE를 적용 (100 W, 500 mTorr 이하, 60 초)이 주변 영역에서 PLL-g-PEG를 제거한다.
- RIE (25 W, 500 mTorr로 (25)들)의 감소 된 복용량 마이크로 치료하고 (제거 작은 PDMS 슬래브로) 패터닝 된 유리 기판에 정렬; 마이크로 및 입체경 아래 등각 접촉 패터닝 된 유리 기판을 가지고.
그림 3 : 마이크로 칩 어셈블리의 개략도. 유리 기판 상에 금 도트) 패턴. MAPL을 통해 세포 패터닝 용 유리 기판의 b)의 제조. 다) 플라즈마 본딩과 미세 유체 채널의 조립. 오 정의에 대한 자료 목록을 참조하십시오약어 F. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 세포 부착
주 : HeLa 세포는 통상적으로 세포 배양 인큐베이터에서 10 % FBS, 1 % 항생제 / 항 유사 분열 용액이 보충 된 DMEM에서 유지된다. 칩 어셈블리 및 세포 부착에 대한 개략도,도 3c에 도시된다.- 프라임 1 μL / 분에서 30 분 동안 PBS로 칩을 다음 주입 피브로넥틴 용액 (PBS 중 50 μg의 / ㎖, 1 μL / 분)을 45 분 동안.
- 0.25 % 트립신 EDTA와를 Trypsinize 세포 배양을 기다리는 동안 배양액을 원심 분리 각 셀을 세척하고, 5 × 106 세포 / ㎖로 예열 된 (37 ℃) 배양 배지에서 세포 현탁액을 재구성한다.
- PBS로 피브로넥틴 솔루션을 교체하고 5 분 동안 10 μL / min으로 칩을 세척하십시오.
- 주사칩으로 제조 된 세포 현탁액은 흐름을 정지 출구를 고정하고, 30 분 동안 세포 배양 용 인큐베이터에 칩을 유지한다.
- 출구 릴리스 5 분 동안 10 μL / 분에서 세포 배양 배지로 세척 칩. 0.75 μL / 분 배양액 관류 유량을 줄이고 배양기에서 2 시간 동안 세포 배양을 유지한다.
2. 거품 생성과 흐름 시각화
참고 실험 장치의 개략적 인 탠덤 버블 발생 및 미세 유체 채널에 가까운 자라는 단일 세포로 생성 된 유동 상호 작용도 4a에 도시된다.
- 직렬의 발생이 레이저와 타이밍 제어 거품
- 거꾸로 현미경의 무대에서 마이크로 유체 칩을 놓고 두 개의 펄스 노스 다코타의 초점 정렬 : 패턴 골드 점 분리 (b)의 한 쌍의 YAG 레이저 (λ = 532 nm의, 5-ns의 펄스 지속 시간)y를 40 μm의.
- 금 점에서 개시 개의 기포를 생성하도록 약 2.5 μS 시간 지연 두 레이저를 트리거 디지털 딜레이 생성기를 사용한다.
- 50 ± 2 ㎛의 내 기포의 최대 직경을 생성하는 레이저 출력 에너지 (~ 10 μJ)를 조정한다.
- 레이저로 고속 카메라 (200 NS 노출 초당 200 만 프레임 (fps))를 동기화하고 버블 팽창 붕괴 버블 버블 상호 작용 제트 형성의 동역학을 캡처.
- 제트 속도의 정량화
- 제 버블 (B 1)과 B (1)의 선단부의 기단부에 상기 분사 팁 (J 1)의 위치를 기록한 제 버블 (B 2)의 발생에서 시작 J의 터치로 끝나는 B (1)의 선단부를 향해 1; 도 5a에서 회로도를 참조하십시오.
- 선형 로봇에 대한 위치의 시간 경과에 맞게시간 근위 (제트 팁) 및 말단부. 근위 단부는 분사 속도를 결정하기 위해 대 시간 곡선 선단 위치의 경사를 계산한다. 두 줄의 교차점은 제트 터치 다운 시간을 나타냅니다. 더 자세한 내용은 참조 (19)에서 찾을 수 있습니다.
- 탠덤 거품에 의한 유동장의 시각화
- DI 물에 1 μm의 폴리스티렌 (PS) 비드 서스펜션과 미세 유체 칩에 구슬을 주입 (/ V w 2.6 %)을 준비합니다.
- 단계 2.1.1-2.1.3에 기술 된 바와 같이 직렬 거품을 생성합니다.
- 100 NS 노출 시간 5 M fps의 프레임 율로 고속 비디오 카메라를 사용하여 탠덤 버블 역학을 기록한다.
- 상업 PIV 소프트웨어에 획득 한 이미지 시퀀스를 업로드합니다.
- 75 % 오버랩 16 × 16 화소 (픽셀)의 작은 심문 창에 각각의 이미지를 나눈다.
- 속도 장 계산의 오류를 줄이기 위해 멀티 패스 반복 및 지역 필터를 적용하고,출력 속도 벡터 맵의 결과.
그림 4 : 실험 장치 및 영상 기록의 도식. 탠덤 거품 생성을위한) 실험 설정. b) 시계열 이미징 수집의 종류에 사용. FL : 형광 현미경, BF : 시야, IFT : 간 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 단일 세포 분석 및 Bioeffects
주 : 탠덤 버블 표적 세포 옆에 생성되고, 생성 된 bioeffects는 유격 거리 의존적으로 다룬다. 화상 취득의 다른 유형의 시간 시퀀스는도 4b에 도시되어있다.
- 멤브레인의 poration 및 고분자 흡수
주 : 표적 세포에 세포 거대 분자의 흡수는 세포막에의 poration 사이트를 통해 막 impermeant 요오드화 프로피 듐의 점진적 확산 (PI)을 특징으로한다.- 단계 150에 이어, 실험 내내 0.5 μL / 분의 관류 유량 실행 PI 용액 (DMEM 100 μg의 / mL)로 일반 배지 (즉, DMEM)를 교체한다.
- 자동 200 밀리 초의 노출 시간으로 형광 이미지를 캡처하기 위해 PI 형광 여기와 CCD 카메라 시점을 회전 터릿의 PI 형광 큐브를 선택하고 동기화 현미경 제어 소프트웨어 프로그램.
- 2 개의 레이저 초점 옆 탠덤 거품 처리 전의 표적 세포 기록 밝은 필드 (BF) 모두 형광 (FL) 이미지 금 도트의 한 쌍의 정렬 된 후.
- 즉시에 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여잠시 후 PI 흡수의 역사를 캡처하는 2.1 단계 대상 셀의 시간 경과 형광 영상 녹화를 시작합니다.
- 멤브레인 변형
- 1 μm의 구슬 (V / w 1 %, 수용성 카르 보디이 미드 활성화)를 준비하고 펩타이드-2000 (PBS 100 μg의 / mL)로 그들을 기능화.
- 단계 150 후, 30 분 동안 37 ° C에서 1 × 9 비드 / ㎖의 밀도로 작용 구슬 부착 된 세포를 배양한다.
- 반복 단계 2.1 표적 세포 옆 탠덤 기포 생성 및 초고속 카메라 5,000,000 fps의 프레임 레이트로 실행하는 세포 변형을 기록한다.
- 실험을하는 동안 이미징 비행기에 남아 3 구슬의 화음을 확인하고 자신의 위치 (× 1, Y 1) (× 2, Y 2)를 컴파일하고 (× 3, y를 3) 실험의 좌표.
- 전에 AF 트라이어드의 면적을 계산수식을 사용하여 직렬 거품 치료를 다 운 :
- 지역의 피로를 같이 계산한다 :
- 이전과 탠덤 거품 처리 후의 3 개의 꼭지점의 좌표에 기초하여, 설정된 프로토콜 20,21 다음 로컬 주 변형률과 변형률 공간을 계산한다.
- 생존과 사멸
참고 : FITC 넥신 V가 포스파티딜 세린 (녹색 형광)의 외부화를 통해, 세포 사멸 포함 해 세포를 레이블. PI는 괴사 세포 (적색 형광)의 핵을 레이블. 밝은 필드 이미징은 세포 형태를 문서화하고, 세포 생존과 사멸의 식별을 지원하는 데 사용됩니다.- 도 2b를 참조 채널에 주소 라벨에 의해 용이하게 미세 유체 채널 (각 처리 된 셀의 위치를 기록
- 15 분 동안 FITC 넥신 V 용액 칩을 관류하기 전에 또 다른 2 시간 동안 세포 배양액에서 처리 된 세포를 인큐베이션. 양성 세포는 녹색 형광을 표시합니다.
- 24 시간 탠덤 거품 처리 후 단계를 반복 3.3.2 표적 세포에서 장기 bioeffects을 연구한다.
- 칼슘 응답
- 승 3 μL 10 %와의 Fura-2 오전 원액의 3 μL (DMSO 1 ㎎ / ㎖)를 혼합 / 플루로 닉 F-127 최종 라벨링 솔루션 (6 μM)를 준비 감소 혈청 배지 500 μL에 V.
- 단계 150 후, 라벨링 용액으로 세포 배지를 교체하고 40 분 (1 μL / 분으로 관류 속도)에 어두운 곳에서 실온 하에서 배양한다.
- 세포 실험을 시작하기 전에 감소 된 혈청 배지 (0.75 μL / 분으로 관류 속도)와 채널 리필.
- 비율 적 영상을 시작 (파장 : 380분의 340 나노 미터, 50-MS 노출)표적 세포의 상업적 PTI 시스템을 사용.
- 휴식 수준에서 세포의 비율 계량 이미징, 단계 2.1에서와 같이 직렬 거품을 생산의 10 초 후, 1 분 동안 0.1 초의 간 시간 (IFT)와 첫 번째 레코드는 다음 다른 분 1 초에 IFT을 증가시키고, 2 분 후 5 초에 추가로 증가.
- 세포 내 칼슘 농도에 비례하는 관심 영역 (ROI)의 비 R = F340 / F380을 계산 PTI 소프트웨어를 사용한다.
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Representative Results
이 연구에 기술 된 미세 기포 플랫폼 기포 상호 작용을 조사하기 위해 상기 단일 세포 수준에서 캐비테이션 유도 bioeffects의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 우리의 실험 시스템에서 수행 될 수 실험 연구 및 생물 검정의 다양한 입증하는 몇 가지 예를 제시한다. 먼저 제트의 형성, 생성 된 유동장의 시각화 및 분사 속도 (도 5a)의 계산 탠덤 기포의 일시적인 상호 작용을 설명 할 것이다. 우리는 직렬의 다음 본 실시 예 지역화 세포막 변형 기포 인한 것이다 (도 5B), PI 흡수 (도 5c), 및 세포 내 칼슘 응답 (도 5D)와 정확히 멤브레인의 poration. 이러한 세포 생존 및 아폽토시스 분석과 같은 다른 실시 예는, 참조 번호 (22)에서 찾을 수있다.
"1">도 5a 고속 촬상에 의해 캡처 제트 형성 및 PIV 계시 결과 유동장과 탠덤 버블 상호 작용의 예를 도시한다. 구체적으로는, 그 최대 팽창 다음, (0 μS에서 제조) 제 버블 B (1)의 붕괴는 "위쪽"의 형성으로 이어지는 (2.5 μS에서 제조) 제 버블 B (2)의 신속한 팽창에 의해 비대칭 왜곡 5.4 μS에 도시 3.4 μS에서 제트 (J 1) 이후의 분사 흐름. 평균 분출 속도가 터치 전의 B (1)의 기단 (자극)의 위치에 장착하는 직선의 기울기에 의해 결정된다 (즉, B (1)의 말단부와 접촉) 대 시간. 평균 분출 속도 때 B의 최대 직경이 40 내지 60 μm의 증가는 20 내지 58 m / 초에서 증가하는 것으로된다. PIV 분석은 TAND 주위 방향 분사 흐름의 결과에 기초EM 거품 10m / 초 정도이다 및가 10μm 정도의 폭에 한정된다. 이는 인근 성장 표적 세포에 충동과 국부적 전단 응력과 응력 구배의 제조 이렇게 할 수있다.
도 5b에 도시 된 다른 예는 탠덤 제조 방향 및 지역화 분사 흐름에 의해 유도 된 세포막 변형 이격 거리 S의 D = 40 ㎛의 거품에 나타낸다. 멤브레인 변형 회복 세포막의 선단에 부착 된 (황색 점선) 기능화 비드의 변위에 의해 강조된다. 근거리 균주 인접한 비드 트라이어드의 좌표로부터 계산 될 수있다. 세포 표면상의 서로 다른 위치에서 상기 계산 된 최대 면적 변화의 개략 중간에 나타낸다. 첨단 주로, (녹색 동그라미 참조) 늘어 트레일 링 에지 또는 위도 동안(적색 원으로 표시됨) 셀 대한 일반적인 측면은 직렬 유도 버블 제트 흐름에 의해 생성 된 세포 변형에 이질성을 나타내는 압축된다. 셀 선단부의 영역 균주의 시간적 변화가 오른쪽에 도시되어있다. 그것은 약 100 μS (FWHM) 및 몇 ms의 시간 간격에 후속하는 점진적인 회복 큰 지속적인 신장 뒤에 처음 몇 급속한 진동들로 구성된다.
또한 도시 된 바와 같이, 대 면적 변형 셀의 불가분 균주 선단이 작아 S d를 관찰 세포막의 poration 책임이있다 도 5c. 작은 S d 개에서 (즉, 10 μm의, 또는 일부의 경우, 20 μm의에서) 중간 S d를 (즉, 20, 30 μm의 대부분), 지역화 막 파괴는 세포 외 PI의 핀 포인트 흡수로 이어지는, 유도세포질. 셀 내부의 PI 강도가 포화없이 증가 계속되면 괴사가 발생합니다. 파이 강도가 크기 순서는 낮고 탠덤 거품 처리 다음 10 초 내에 고원에 도달하면 비교, 가능성이 세포 생존과 수리의 poration은 또한 세포 형태의 최소한의 변화에 의해 지원되는, 발생합니다. 큰 S d를 (즉, 40 μm의)에서 무시할 PI 흡수는 무시할 비의 poration을 나타내는, 탠덤 거품 치료를 다음과 발견된다. 세포는 일정한 성장과 증식 (22) 살아남을 수 있습니다. 전반적으로, 결과는 S D ≈ 20 ~ 40 μm의 범위의 비의 poration에 수리 멤브레인의 poration을 통해 괴사에서 세포 반응에 분명한 변화를 보여준다.
마지막으로, 우리는 다른 S에서 각 셀 직렬 기포에 의해 유도 세포 내 칼슘 응답 비율 적 촬상 결과를 보여D, 특히 S (D)의 치사 범위 = 30 ~ 50 μm의 (그림 5D). 강도 비는 세포 내 칼슘의 양에 비례한다. 작은 S d 번째 (즉, 30 ㎛의은 또는 일부의 경우 40 ㎛의 단위)의 후단에 전연으로부터 주행 칼슘 웨이브 명확 탠덤 거품 처리 다음 몇 초 내에 관찰된다. 세포 내 칼슘 농도가 피크에 도달 한 후, 서서히 다시 몇 분 이내에 휴식 레벨 소멸. 대조적으로, 큰 S의 D에서 (즉, 50 ㎛의 대부분 또는 일부 경우에는 40 μm의)은 세포 내 칼슘의 증가는 매우 온화한, 그리고 더 명확하게 볼 주행 칼슘 파를 식별 할 수있다. 이들 두 개의 서로 다른 칼슘 응답은 피크 레벨을 쉬고에서 강도 비 및 상승 시간의 피크 진폭의 큰 차이와, 그들의 강도 비 대 시간 프로파일을 구별 할 수있다값. 더 큰 S d 개 (즉, 60 ㎛의 위)에, 어떠한 칼슘 응답이 관찰 될 수 없다. 각종의 S D 칼슘 응답을 표시하는 HeLa 세포의 비율도 5d (오른쪽)에 요약되어있다.
전부, 우리의 결과는 분사 흐름의 강도를 변경 (또는 S d를 변경)함으로써 bioeffects 다양한가 아마도 크기 및 지속 시간과 상관 유사한 배양 조건하에 개별 HeLa 세포에서 생산 될 수 있음을 보여 주었다 세포막 (22)에 부과 된 기계적 변형.
도 5 : 탠덤 거품 상호 작용, 세포막 변형이 멤브레인의 poration 칼슘 응답 분석의 결과. A) 유체 운동과 제트탠덤 거품의 상호 작용에 의해 유도. 왼쪽 : 선택된 프레임이 제트 형성 탠덤 거품 상호 작용을 보여주는 PIV에 의해 밝혀 필드 흐름. 두 방울의 최대 직경은 약 ± 2 ~ 50㎛이다. 중간 : 분사 탠덤 거품의 회로도, 제 버블 B (1)의 중심 축, 좌표 (O)의 원점과 근위 및 원위 단부 (또는 자극)을 도시. 오른쪽 : 근위 및 B 1의 선단에서 (오차 = ± 1 ㎛) 측정 극 위치. b) 세포막 변형. 왼쪽 : 황색 점선은 로컬 막 변형 회복을 나타내는 세포막의 선단에 부착 된 PS 비드의 변위 라벨. 중간 : 개략의 피크 면적을 도시 좌측에 도시 된 세포 표면의 서로 다른 위치에서 균주. 오른쪽 : 셀 선단부의 중앙 영역 균주의 시간 과정. Δ의 ε이 지역의 긴장 계산 지어져있다주요 균주에 에드와 Δ Δ는 트라이어드 형상 변화에 기초하여 계산 된 영역 변형이다. 지역 스트레인 계산 및 오류 분석에 대한 자세한 내용은 참조 (22) 다) 세포막의 poration에 설명되어 있습니다. 왼쪽 : 명 시야 이미지 이전과 PI 흡수 (0 ~ 120 초)의 직렬 거품 처리 및 시간 경과 형광 이미지 후. 백색 화살표는 분사 흐름 방향을 나타낸다. 중동 : 세포 내부의 평균 PI 강도 대 시간의 전형적인 변화. 오른쪽 : 다른 S (D)에서의 괴사 (적색), 수리의 poration (청색), 및 비의 poration (녹색)을 겪고 세포의 비율의 통계적 결과. 세포의 수는 치료 : N = 9, 14, 14 및 S의 D = 10, 20, 30 8, 40은 각각. 통계 오차는 ± 1 / √ N.의 d)에 세포 내 칼슘 반응이다. 왼쪽 : 개별 세포의 세포 내 칼슘 응답을 도시 비율 적 이미지 시퀀스30 μm의 50 μm의의 S의 D에서의. 빨간색 화살표는 제트의 방향을 나타냅니다. 중동 : 다른 S d 개에서 전형적인 반응 프로파일 (비 - 시간 곡선). 오른쪽 : 다른 S (D)에서의 칼슘 반응의 가능성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유격 거리 (S d 개) (μm의) | 레이놀즈 수 (재) | YZ 평면의 전단 응력 (아빠)를 평균 |
| (20) | 206.96 | 618.64 |
| (30) | 354.8 | 709.69 |
| (40) | 378.78 | 657.22 |
| (50) | 163.85 | 323.61 |
| (60) | 105.08 | 42.21 |
표 1 : PIV 결과에서 흐름 물리학에 대한 매개 변수의 목록입니다. 레이놀즈 수를 추정 상이한 이격 거리 (S의 d)에 대한 전단 응력을 평균. YZ 평면은 채널 폭 x 높이 평면을 말한다. 채널의 셀 높이가 약 6-7 ㎛의 평균이기 때문에, 전단 응력은 채널 아래에서 0 7.7 μm의 높이에서 추정된다.
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Discussion
단일 세포 분석은 살아있는 세포 영상과 함께 크게 같은 표현형 개발 및 면역 반응 (23)과 같은 개별 셀에서 동적 종종 가변 과정에 대한 이해를 강화하고있다. 접시 또는 플라스크 종래 세포 배양액과 대조적으로, 미세 유체 시스템은 실시간으로 다운 단일 세포 수준으로 미세의 정확한 제어를 활성화. 따라서, 미세 유체 기술의 진보 및 기술은 대부분 단일 셀 분석 처리량 및 재현성을 향상하고있다. 소프트 리소그래피 및 표면 패터닝을 통합함으로써 마이크로 유체 시스템은 상기 시공간 변수 자극의 복잡한 패턴으로 하나의 셀의 응답에 대한 심층 분석을 용이하게하기 위해 설계 될 수있다. 예를 들어, 과도 화학적 또는 기계적 큐 성공적 생물학적 또는 기계적 응답을 자동으로 기록하는 동안 단 전지로 전달하고이 분석 된4. 이 일반적인 경향에도 불구하고, 세포 수준에서 캐비테이션 유도 bioeffects을 분석하는 마이크로 유체의 적용은 매우 제한되었다. 특히, 그것은 단지 micropillars (11)에 의해 포획 된 현탁액 개별 셀의 거품에 의한 멤브레인의 poration에 적용되었습니다. 부착 세포에 대한 연구의 대부분에서, 동적 거품 세포 상호 작용의 일관성을 유지하는 세포 형태를 제어하는 장점 중 하나를 사용할 수 없거나 거의 무시된다.
우리는 정확하게 개시 이후의 확장, 캐비테이션 기포의 붕괴 역학을 제어하는 마이크로 유체 시스템을 개발 하였다; 제트 형성 버블 버블 상호 작용; 따라서 재현성 분사 흐름을 허용 셀 형상, 방향, 접착 패턴과 기포로부터 이격 거리가 잘 조절 된 실험 조건에 따라 각 셀에인가된다. 이 소설 마이크로 유체 시스템은 기본적인 일을 수행하기에 적합하다캐비테이션 버블 (들)에 udies는 SWL, HIFU 및 sonoporation으로 치료 초음파 응용 프로그램의 다양한 범위와 관련된 상호 작용을 -cell. 우리는 마이크로 유체 시스템은보다 재현성으로 제어 가능한 방법으로 세포막 변형이 멤브레인의 poration, 생존 및 칼슘을 포함한 다양한 반응 캐비테이션 유도 bioeffects을 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 특히, 탠덤 거품에 의해 생성 된 방향 분사 흐름은 잘 특징되지 않은 높은 변형 속도에서 개별 셀의 기계적 특성과 칼슘 반응을 조사하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 이러한 분사 흐름에 의해 생성 된 국부 충동 기계적 응력은 종래의 마이크로 피펫 연신 등 흡인 25 방법 및 광 (26)의 사용과 자기 핀셋 (27)에 의해 달성 될 수 없다. 또한, 초음파 조영제 8,28-30 또는 사용 이전 연구와 대조적으로, 레이저를 유도 하나 BUbbles 31, 32, 우리의 마이크로 유체 시스템은 따라서 세포 반응과 bioeffects 16 일 자신의 실질적인 효과를 감소 셀 형상과 접착 조건의 더 나은 제어를 제공합니다.
우리의 기술은 신뢰성과 재현성이지만, 하나는 실험 시스템이 충실하게 재현되어 있는지 확인하기 위해 조심스럽게 프로토콜을 준수해야합니다. 마이크로 채널 내의 표면의 패턴의 품질은 버블 - 버블 - 세포 상호 작용의 재현성 하류 bioeffects의 캐스케이드 주로 담당한다. 예를 들어, HeLa 세포, 각 금 도트의 면적이 부착 세포를 억제하면서 안정된 기포 생성을 위해 약 25 내지 30 ㎛의 2이어야한다. 한편, 각 피브로넥틴 코팅 섬의 면적은 섬 응집체를 형성하는 복수의 셀의 가능성을 감소시키면서 적절한 정사각형의 단일 셀의 확산을 촉진하기 위해 약 700-900 ㎛의 2이어야한다. 조정금 도트 피브로넥틴 피복 섬 사이 정확하게 1 ° 0.5 μm의 내부 축 오차 내의 각도 오차를 유지하는 마스크 얼 라이너의 도움으로 수행되어야한다. (: μS 세포 변형 : MS 멤브레인의 poration : S, 아폽토시스 : H 등 거품 역학) 또한,이 실험 시스템은 시간 크기 순서로 변화 스케일 일련의 이벤트를 감시하는 기능성을 제공한다. 따라서, 정확하게 (디지털 딜레이 생성기에 의해 제어되는) 상기 트리거 신호를 미세하게 조정하여 각 시퀀스의 이미지 획득 및 기록 타이밍을 제어하는 것이 중요하다. 단일 세포 배양 웰 표현형 세포 간 변동을 최소화하는 마이크로 유지되어야한다 (대부분 형태라고 함). 따라서, 최소 2 시간 배양은 세포 부착에 필요한 및 다운 스트림 세포 치료를 진행하기 전에 섬에 확산되고있다. 항상 microchann의 유속을 유지하도록 권장그래서 3 μL / 분 이하, EL은, 셀의 순환 배양액에 의해 생성 된 유동 전단 응력은 생리 학적 범위 내이다.
우리의 기술의 하나의 전류 제한은 금 도트가 레이저 조사에 의해 절제되기 때문에 탠덤 기포 작용하고, 생성 된 분사 흐름은 한 번만 표적 세포에 적용 할 수 있다는 것이다. 이러한 단점은 종종 세포 캐비테이션 이벤트에 노출되는 초음파 치료에 의해 생성 bioeffects을 모방 우리 실험 시스템의 능력을 제한한다. 그러나, 이러한 시간 제한은 상기 액체 (15)에 직접 노출 금 도트를 보호하는 실리콘 이산화물의 다른 박막을 도포에 의해 완화 될 수있다. 전반적으로, 우리의 마이크로 유체 시스템은 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용에서 생성 된 bioeffects을 조사하기 위해 잘 조절 된 실험 조건을 제공하며, 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 먼저, 크기 및 캐비테이션의 위치 모두가 우리의 예에서 거품xperimental 시스템 정확하게 금 도트로 흡수 된 입사 레이저 에너지를 조정함으로써 제어 할 수있다. 둘째, 각 셀의 구조와의 밀착성이 더욱 재현 가능한 결과를 초래 세포 반응과 bioeffects에 미치는 영향을 최소화하기 위해 셀 패터닝에 의해 표준화된다. 셋째, 미세 유체 칩 설계 병렬 작업 단위는 각각의 셀이 어드레싱 개별적으로 모니터링 될 수 있기 때문에이 가능한 이러한 캐비테이션 노광 후의 세포 성장, 증식, 잠재적 유전자 발현뿐만 하류 bioeffects을 연구 할 수 있습니다. 요약하면, 우리의 마이크로 유체 시스템 및 방법은 개선 된 정밀 개별 셀의 bioeffects을 연구하는 신뢰할 수있는 버블 버블 상호 작용을 만들 수 있습니다.
현재의 칩을 각각의 HeLa 세포의 분석을 위해 설계된다. 그러나, 다른 포유 동물 세포 라인 패턴 제도의 변형도 가능하다. 일부 개선은 상기 응용 프로그램, 범위를 확장하도록 할 수있다칩의 NS. 예를 들어, PLL-g-PEG 분자의 대체품 후에도 24 시간 마이그레이션 개별 패터닝 셀 탐색을 중지 할 수있다. 예컨대 형광 마커 또는 독성 시약 화학 만 칩의 다른 영역에서의 세포에 영향을주지 않고, 특정 위치에 적용될 수 있도록 또한, 마이크로 유체 밸브 새로운 칩 디자인은 세포의 국소 미세 환경을 제어하기 위해 탐색 될 수있다 . 이러한 개선으로, 여기에 제시된 미세 유체 시스템은 캐비테이션 노출 또는 충동적인 흐름에 의해 생산 된 기계적 자극에 다음과 같은 대사, 분리, 분화, 유전자 발현 등 단일 세포의 장기 bioeffects을 연구 할 수있는 기회를 제공 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
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