Abstract
Neste artigo, vamos primeiro descrever o protocolo de fabricação de um chip microfluídico, com pontos de ouro e regiões revestidas com fibronectina no mesmo substrato de vidro, que controla com precisão a geração de bolhas em tandem e células individuais estampados nas proximidades, com locais e formas bem definidas. Nós, então, demonstrar a geração de bolhas em tandem usando dois lasers pulsados iluminando um par de pontos do ouro com um atraso de poucos microssegundos. Nós visualizar a interação bolha-bolha e formação de jato de imagem de alta velocidade e caracterizar o campo de fluxo resultante utilizando velocimetria de imagem de partículas (PIV). Por fim, apresentamos algumas aplicações desta técnica para a análise de uma única célula, incluindo a formação de poros da membrana celular com a captação de macromolécula, deformação da membrana localizada determinada pelos deslocamentos de contas de ligação de integrina conectados e resposta de cálcio intracelular da imagem raciométrica. Nossos resultados mostram que um fluxo de jacto rápido e direcional é proproduzida pela interacção de bolha em tandem, o qual pode impor uma tensão de corte altamente localizada na superfície de uma célula cultivada em estreita proximidade. Além disso, diferentes efeitos biológicos podem ser induzida através da alteração da força do fluxo de jacto, ajustando a distância de afastamento a partir da célula para as bolhas em tandem.
Introduction
Há um reconhecimento crescente de que a heterogeneidade celular, resultante da expressão estocástica de genes, proteínas e metabolitos, existe dentro de uma população de células grandes e serve como um princípio fundamental na biologia para permitir a adaptação de células e uma evolução. Portanto, é muitas vezes imprecisas e pouco confiáveis para se utilizar medidas a granel de base populacional para entender a função das células individuais e suas interações. O desenvolvimento de novas tecnologias para a análise de uma única célula é, portanto, de grande interesse na investigação farmacológica e biológica, e pode ser usado, por exemplo, para melhor compreender as principais vias de sinalização e processos em biologia das células estaminais e terapia do cancro 2-4. Em anos recentes, o surgimento de plataformas de microfluidos tem grandemente facilitado a análise de uma única célula, em que o posicionamento, o tratamento, e da observação da resposta a partir de células individuais foram realizados com novas estratégias analíticas 5.
Cavitação desempenha um papel importante numa grande variedade de aplicações biomédicas, incluindo o tratamento de cancros com correntes de alta intensidade ultra-som focalizado (HIFU) 6, a fragmentação não-invasivo de pedras nos rins por litotripsia de onda de choque (SWL) 7, a entrega de drogas ou gene por sonoporação 8, e a destruição recentemente relatado de células ou tecidos por hidrodinâmico 9,10 bolha de cavitação. Apesar disso, os processos dinâmicos de bolha (s) cavitação interacções com o tecido biológico e as células não foram bem compreendidas. Isto é devido a aleatoriedade na cavitação de iniciação e de bolhas produzidas pela dinâmica do ultra-som, as ondas de choque, e a pressão hidráulica local; Além disso, há uma falta de permitir técnicas para resolver as respostas inerentemente complexa e rápida de células biológicas, especialmente ao nível de uma única célula.
Devido a estes desafios, não é surpreendente que muito poucos estudos têm a abelhan relatado para investigar interacções célula-bolha, em condições experimentais bem controladas. Por exemplo, a formação de poros de membrana de células individuais em suspensão presas 11 e a grande deformação impulsivo de células vermelhas do sangue humano 12 foram demonstradas utilizando bolhas individuais gerado por laser em canais de microfluidos. A última técnica, no entanto, só pode produzir muito pequena deformação em células eucarióticas por causa da presença do núcleo 13. Além disso, é difícil monitorizar os efeitos biológicos a jusante quando o tratamento de células em suspensão. Em outros estudos, o ultra-som de excitação de uma microbolha ligada à célula (ou agente de contraste de ultra-sons) para a produção de formação de poros da membrana e / ou respostas de cálcio intracelular em células aderentes individuais foi avaliado 8. Membrana de formação de poros de células aderentes individuais também pode ser produzido utilizando bolhas em tandem gerado por laser com uma camada líquida fina contendo solução azul de Tripano de absorção de luz 14, oupor uma bolha de gás oscilante gerado por pulsos de laser microssegundo irradiando através de um substrato opticamente absorvente em microchambers 15. Quando comparados, o substrato opticamente absorvente tem uma vantagem sobre a solução de azul de tripano de absorção de laser, porque este último é tóxico para as células. Mais importante, bolhas gerado pelo laser são mais controlável em termos de tamanho da bolha e localização de bolhas acusticamente excitado. No entanto, em todos estes estudos anteriores, a forma celular, orientação e condições de adesão não foram controlados, o que pode influenciar substancialmente a resposta celular e bioeffects produzidos por tensões mecânicas 16.
Para ultrapassar estas desvantagens em estudos anteriores, nós desenvolvemos recentemente um sistema experimental para a geração de bolhas, padronização de células, as interacções célula-bolha de espuma, e em tempo real bioensaios de resposta de células em um chip de microfluidos construído usando uma combinação única de Techn microfabricaçãoiques. Três características principais que distinguem o nosso sistema experimental de outros no campo são: 1) o padrão de pontos do ouro tamanho mícron-no substrato de vidro para permitir a absorção do laser localizada para geração de bolhas 17; 2) o padrão de ilhas micronizadas de matriz extracelular (ECM) para a adesão de células no mesmo substrato para controlar tanto a localização e a geometria das células individuais; e 3) a compressão da dimensão do domínio de interacção de células de espuma de bolha de 3D para um espaço quase-2D para facilitar a visualização no plano de interacções bolha-bolha, jacto de campos de fluxo, deformação celular e efeitos biológicos, capturados em uma sequência de imagens aerodinâmico (Figura 1D).
Figura 1: O chip microfluídico e esquemas de ensaios diferentes. a) Um chip microfluídico montado com canais preenchidos com tinta azul para visualização. b) Uma região dentro do chip de microfluidos com células padronizadas e de pontos de ouro (a distância entre os dois pontos de ouro na proximidade é de 40 uM). Muitos pares de unidades de trabalho podem ser dispostas num canal. c) A imagem do Close-up de uma única unidade de trabalho constituído por um par de pontos do ouro e uma de células HeLa adere a região da célula-padronização. d) Esquema de funcionamento do dispositivo. Uma única célula adere a e se espalha sobre o "H" em forma de ilha revestido com fibronectina. Um par de bolhas de cavitação (bolha) em tandem com oscilação anti-fase são produzidos por iluminante raios laser pulsados sobre os pontos de ouro (ver Figura 4a), que conduz à geração de um jacto rápido e localizada avançar para a célula alvo próximo. A célula pode ser deformado, rado para a absorção de macromoléculas, e / ou estimulado com uma resposta de cálcio, dependendo da distância de afastamento (S d) da célula para a bolha em tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Esta plataforma pode ser ainda combinada com os ensaios de fluorescência e esferas funcionalizadas ligados à superfície da célula para os efeitos biológicos induzida por cavitação. Em particular, esta plataforma abre o caminho para ensaios de confiabilidade e quantificáveis ao nível de uma única célula. Até agora, foi utilizado o dispositivo para a análise de deformação induzida por bolha em tandem da membrana celular, a formação de poros e absorção intracelular de células, viabilidade, apoptose e resposta de cálcio intracelular. No protocolo seguinte, descreve-se o processo de fabricação de chips e o procedimento para analisar os diversos efeitos biológicos mencionados acima. Além disso, também estão descritas as operações do chip.
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Protocol
1. Microfabricação
Nota: Todos os procedimentos de microfabricação são realizadas em uma sala limpa. Uma máscara de cromo é concebido antes da microfabricação, ver Figura 2.
Figura 2: Representação esquemática da criação de canais no chip de microfluidos e as dimensões das unidades de trabalho. a) Projeto da máscara dos microcanais alinhados PDMS (verde) e os padrões sobre o substrato de vidro (azul e vermelho). b) imagem ampliada do projeto da máscara em uma seção representativa das matrizes de unidade de trabalho. c) Representação esquemática de uma unidade de trabalho que mostra um padrão de células (azul) e um par de pontos do ouro (vermelho). Todas as escalas de comprimento são mostradas na parte inferior direita. Por favor clique aqui para ver um larversão ger desta figura.
- Padronização do ponto de ouro
NOTA: A área de cada ponto de ouro é concebido para estar dentro de 25-30? M 2, de modo que seja suficientemente grande para absorver a energia laser para a geração de bolhas, mas suficientemente pequena para evitar a células individuais que aderem a ele. Um diagrama esquemático para a fabricação de pontos de ouro é mostrado na Figura 3a.- Lâmina de vidro de limpeza (em uma capa química)
- Lave a lâmina de vidro com acetona seguido de álcool isopropílico (IPA), e, em seguida, seque-o com um fluxo de N2.
- Embeber o slide em solução piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) durante 10 min.
- Retire o slide, lave-o com água DI, em seguida, seque-o com um fluxo de N2.
- Cozer a lâmina de vidro numa placa de aquecimento a 120 ° C durante 10 min.
- Tratar o slide em uma Asher plasma a 100 W durante 90 s.
- Spin coating (hood spin-coating)
- Ligue a placa e esperar até que a temperatura é estável a 95 ° C.
- Siga o procedimento de revestimento:
1000 rpm durante 5 s com um / s rampa 500 rpm;
em seguida, 3.000 rpm durante 30 s com um / s rampa de 1.000 rpm. - Fixar a lâmina de vidro limpa para o revestidor por rotação aplicação de um vácuo.
- Cobrir a superfície da lâmina com a P-20 e começar a receita de revestimento.
- Repetir o processo de revestimento para fotorresistente NFR-negativo.
- Asse o slide a 95 ° C durante 60 s e espere até que arrefeça à temperatura ambiente.
- Fotolitografia
- Monte a máscara de cromo para o alinhador de máscara e se certificar de que lado o padrão está voltada para baixo em direção ao slide.
- Definir a receita fotolitografia para o modo de exposição duro com 9 s de exposição aos raios UV e rapidamente alinhar o substrato de vidro com a máscara.
- Após a realização da exposição aos raios UV, cozer o slide a 956; C durante 1 min, e depois deixe esfriar à temperatura ambiente.
- Desenvolvimento
- Desenvolver o padrão no slide na solução reveladora por 60 s.
- Remova a lâmina do desenvolvedor, lave-o com água DI, e seque com um fluxo de N2.
- Verifique a geometria do padrão sob um microscópio e medir e registrar a dimensão do traço.
- Deposição do ouro (evaporação E-beam) e levante-off
- Asse o slide a 120 ° C por 5 min, e deixe esfriar à temperatura ambiente.
- Limpar a lâmina com plasma na máquina gravação iónica reactiva (RIE) durante 90 s a 500 Torr e 100 W.
- Depósito de 5 nm de Ti e 15 nm de Au sobre a lâmina utilizando um evaporador E-feixe 17.
- Embeber a corrediça durante a noite em um copo de vidro contendo removedor fotorresistente solvente para remover o ouro repouso no topo da NFR resistir.
- Recuperar o slide, i rentet com acetona seguido de IPA, e secá-lo com um fluxo de N2.
- Seque o slide em uma placa quente a 115 ° C antes de limpá-lo na Asher plasma de oxigênio a 100 W durante 90 s.
- Lâmina de vidro de limpeza (em uma capa química)
- Modelação molecular-montagem por lift-off (MAPL)
Nota: A área de cada uma das ilhas revestidas com fibronectina é ajustado para estar dentro de 700-900 ^ M de 2 a facilitar a propagação de células HeLa adequado numa região quadrado, enquanto minimiza as possibilidades de várias células de agregação na ilha. Um diagrama esquemático para a preparação de ilhas de células-padronização é mostrado na Figura 3b.- Spin coating
- Repetir o passo 1.1.2, mas usar fotorresistente S1813-positiva e uma temperatura de 115 ° C.
- fotolitografia alinhados
- Monte a máscara de cromo para o alinhador de máscara e certificar-se de que o lado com o padrão está voltada para baixo para o slide com opontos do ouro.
- Definir a receita fotolitografia para o modo de exposição duro com 9 s de exposição aos raios UV.
- Alinhar a máscara de topo com a lâmina inferior, utilizando marcas de alinhamento, localizada em torno da borda da máscara, como uma referência espacial.
- Verifique a porção central da máscara e verificar que as características do padrão são alinhadas correctamente.
- Complete a exposição aos raios UV, sem um post-bake.
- Desenvolvimento
- Repita o passo 1.1.3, mas com 45 s de desenvolvimento antes de secar sobre uma placa quente e preservar no armazenamento N2.
- Spin coating
- O tratamento químico
- Preparar a solução de passivação: 0,5 mg / mL de PLL-G-PEG em tampão HEPES 10 mM.
- Recuperar o slide do armazenamento N 2 e limpá-lo usando RIE com a definição de parâmetro: 500 Torr de pressão, potência de 100 W e 90 s de duração.
- Pipeta uma gota de passivating solução sobre um pedaço de filme de parafina <./ Li>
- Sanduíche da solução com o filme eo slide, certificando-se de que o lado com o padrão de recursos é voltado para baixo para o filme; evitar a formação de bolhas.
- Espere por 45 minutos antes de remover a lâmina do filme.
- Embeber o slide consecutivamente no removedor de fotorresistente, removedor de fotorresistente e água desionizada (1: 1), e água desionizada, e agitá-lo num banho de ultra-sons durante 90 s para cada imersão.
- Seque o slide sobre uma placa quente para remover a umidade antes de selar-lo num exsicador e armazená-lo no frigorífico.
- montagem Chip
- Repita os passos 1.1.1-1.1.4, mas com fotorresiste SU8-2025-negativo e a definição do parâmetro refere chamado de protocolo Microchem 18, para preparar um molde de silicone com uma fotomáscara.
- Fabricar um microcanal PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x W x H) e uma pequena laje de PDMS (800 estrutura ranhura mm de largura), utilizando litografia macia.
- Perfurar o microchannel para portas de acesso de fluidos e limpe-o com fita adesiva e, em seguida, com o IPA.
- Proteger a área modelado do substrato de vidro com a laje de PDMS, e aplicar RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) para remover PLL-G-PEG a partir da zona periférica.
- Tratar o microcanal com uma dose reduzida de RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), e, em seguida, alinhá-lo para o substrato de vidro modelado (com a pequena placa de PDMS removidos); trazer o microcanal e o substrato de vidro modelado em contato conformado sob um estereoscópio.
Figura 3: diagramas esquemáticos para microfabricação e chip montagem. a) padrão de pontos de ouro no substrato de vidro. b) Preparação do substrato de vidro para padronização de células através da MAPL. c) O conjunto do canal microfluídico com ligação plasma. Consulte a Lista de Materiais para as definições of as abreviaturas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- fixação das células
NOTA: As células HeLa são mantidas rotineiramente em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de solução de antibiótico / anti-mitótico, numa incubadora de cultura de células. Um diagrama esquemático para o acessório de montagem de chips e de células é mostrada na Figura 3C.- Primeiro o chip com PBS durante 30 min a 1 mL / min, e, em seguida, infundir solução de fibronectina (50 ug / mL em PBS, 1 mL / min) durante 45 min.
- Enquanto espera, trypsinize cultura de células com 0,25% de tripsina-EDTA, lavar em meio de cultura, as células individuais de centrífuga, e reconstituir a suspensão de células em meio de cultura pré-aquecido (37 ° C) a 5x10 6 células / ml.
- Substituir a solução de fibronectina com PBS e lave o chip a 10 mL / min durante 5 min.
- Injetara suspensão de células preparada para o chip, parar o fluxo, fixar a tomada, e manter o chip numa incubadora de cultura de células durante 30 min.
- Libertar a saída de descarga e o chip com meio de cultura de células a 10 mL / min durante 5 min. Reduzir a taxa de fluxo de perfusão do meio de cultura a 0,75 mL / min e manter a cultura de células durante 2 horas na incubadora.
2. Geração de bolha and Flow Visualization
NOTA: Um esquema da montagem experimental é mostrado na Figura 4a para a geração de bolhas em tandem e a interacção com o fluxo resultante de uma única célula cultivada nas proximidades de um canal microfluídico.
- Geração de conjunto bolhas com dois lasers e controle de tempo
- Colocar o chip de microfluidos com a fase de um microscópio invertido e alinhar os focos de dois pulsados Nd: YAG (λ = 532 nm, 5-ns duração do pulso) sobre um par de pontos do ouro modeladas separadas By 40 uM.
- Usar um gerador de atraso digital para accionar os dois lasers com um atraso de tempo cerca de 2,5 mS para produzir duas bolhas iniciadas para os pontos de ouro.
- Ajustar a energia de saída do laser (~ 10 μJ) para produzir um diâmetro máximo das bolhas dentro de 50 ± 2 uM.
- Sincronizar uma câmera de alta velocidade (exposição de 200 ns e 2 milhões de quadros por segundo (fps)) para os lasers e capturar a dinâmica de expansão da bolha, colapso, a interação bolha-bolha, e formação de jato.
- Quantificação da velocidade do jacto
- Grave a posição da ponta do jacto (J 1) na extremidade proximal da primeira bolha (B 1) e a extremidade distal de B 1, a partir da geração da segunda bolha (B 2) e terminando com o touchdown de J 1 para a extremidade distai de um B; veja o esquema na Figura 5a.
- Linearmente encaixar o curso de tempo de posição para o both proximal (jet ponta) e as extremidades distais. Calcular o declive da posição da ponta versus a curva do tempo para a extremidade proximal para determinar a velocidade do jacto. A intersecção das duas linhas indica o tempo jet touchdown. Mais detalhes podem ser encontrados na referência 19.
- A visualização do campo de escoamento induzido pela bolha em tandem
- Prepare 1 uM de poliestireno (PS) suspensão de pérolas em água Dl (2,6% w / v) e injectar os grânulos para o chip de microfluidos.
- Gerar bolhas em tandem, tal como descrito no passo 2.1.1-2.1.3.
- Grave a dinâmica de bolhas conjunto usando uma câmera de vídeo de alta velocidade com velocidades de registo de 5 M fps com um tempo de exposição de 100 ns.
- Faça o upload da sequência de imagens adquiridas em um software PIV comercial.
- Dividir cada imagem em janelas de interrogação mais pequenas de 16 x 16 pixels (px) com uma sobreposição de 75%.
- Aplicar iteração multi-pass e filtros regionais para reduzir os erros no cálculo campo de velocidade eoutput os resultados em um mapa vetor velocidade.
Figura 4: Representação esquemática da montagem experimental e gravação de imagem. a) a configuração experimental para geração de bolhas tandem. b) sequência de tempo utilizado para diferentes tipos de aquisições de imagem. FL: microscopia de fluorescência, BF: Campo brilhante, IFT: o tempo entre quadros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. célula única análise e Efeitos Biológicos
NOTA: O conjunto de espuma é produzido junto às células alvo, e os efeitos biológicos resultantes são estudados de uma forma dependente da distância de afastamento. A sequência de tempo para diferentes tipos de aquisição de imagem está representado na Figura 4b.
- Poração membrana e absorção de macromoléculas
NOTA: A absorção de macromoléculas extracelulares para dentro da célula alvo é caracterizada pela progressiva difusão de iodeto de membrana impermeabilizante propídio (PI) através do local de formação de poros na membrana celular.- Seguindo o passo 1.5, substituir o meio de cultura regular (por exemplo, DMEM) com uma solução de PI (100 ug / ml em DMEM) funcionando a uma taxa de fluxo de perfusão de 0,5 mL / min durante todo o experimento.
- Programar o software de controlo do microscópio para seleccionar automaticamente o cubo fluorescente PI na torre rotativa e sincronizar a velocidade da câmara CCD com a excitação de fluorescência de PI para capturar imagens de fluorescência com um tempo de exposição de 200 ms.
- Depois de os dois focos de laser são alinhados com um par de pontos do ouro ao lado de uma célula alvo, tanto ficha de campo claro (BF), e as imagens de fluorescência (FL) antes do tratamento bolha em tandem.
- Use software de controle de microscópio para imediatamenteiniciar um lapso de tempo de gravação de imagem de fluorescência da célula alvo logo após o passo 2.1 para capturar a história de absorção de PI.
- deformação da membrana
- Prepare os grânulos 1-um (1% w / v, activados com carbodiimida solúvel em água) e funcionalizar-los com Péptido-2000 (100 ug / ml em PBS).
- A seguir ao passo 1,5, incubar as células ligadas com as esferas funcionalizadas com uma densidade de 1x10 9 contas / ml a 37 ° C durante 30 min.
- Repita o passo 2.1 para produzir bolhas em tandem ao lado da célula alvo e gravar a deformação celular com uma câmera ultra-alta velocidade rodando a velocidades de registo de 5.000.000 fps.
- Identificar uma tríade de 3 esferas que permanecem sobre o plano de imagem ao longo da experiência e compilar as suas posições como (x 1, y 1) (X 2, Y 2), e (X 3, Y 3) no experimento de coordenadas.
- Calcula-se a área da tríade antes e afo ter que o tratamento bolha conjunto utilizando a fórmula:
- Calcula-se a estirpe como a área de:
- Com base nas coordenadas dos três vértices antes e após o tratamento bolha tandem, calcular a principal estirpe e área de tensão local na sequência de protocolos estabelecidos 20,21.
- Viabilidade e apoptose
NOTA: FITC A anexina V rotula células, incluindo os apoptóticos, através da externalização de fosfatidilserina (fluorescência verde). PI rotula os núcleos de células necróticas (fluorescência vermelha). imagiologia campo brilhante é usada para documentar a morfologia das células e para ajudar na identificação da viabilidade celular e a apoptose.- Gravar a posição de cada uma das células tratadas no canal microfluídico (facilitada pelas etiquetas de endereço no canal, ver Figura 2b
- Incubar as células tratadas, em meio de cultura de células durante mais 2 h antes de perfusão do chip com solução de FITC anexina V durante 15 min. As células positivas apresentam uma cor verde.
- Repetir o passo 3.3.2 em 24 h após o tratamento bolha tandem para estudar os efeitos biológicos de longo prazo nas células-alvo.
- resposta de cálcio
- Misturar 3 uL de solução de Fura-2 AM (1 mg / ml em DMSO) com 3 mL de 10% w / v de Pluronic F-127 em 500 uL de meio de soro reduzido para preparar a solução de rotulagem final (6 uM).
- Seguindo o passo 1.5, substituir o meio de cultura de células com a solução de etiquetagem e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 40 min (1 mL / min taxa de perfusão).
- Encha novamente o canal com o meio de soro reduzido (0,75 mL / taxa de perfusão min) antes de iniciar o experimento celular.
- Comece imagem proporcional (comprimento de onda: 340/380 nm, a exposição de 50 ms)da célula alvo, utilizando o sistema de PTI comercial.
- Após 10 s de imagiologia raciométrica da célula ao nível de repouso, produzem bolhas em tandem como no passo 2.1; primeira ficha com um tempo de interframe (IFT) de 0,1 s, durante 1 min, em seguida, aumentar a IFT a 1 s para outra min, e aumentar ainda mais a 5 s após 2 min.
- Usar o software PTI para calcular a relação R = F340 / F380 na região de interesse (ROI), que é proporcional à concentração de cálcio intracelular.
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Representative Results
A plataforma de microfluidos descrito neste trabalho pode ser utilizada para investigar interacções bolha de bolhas e analisar uma variedade de efeitos biológicos induzida por cavitação ao nível de uma única célula. Aqui, nós apresentamos vários exemplos para demonstrar uma variedade de estudos experimentais e bioensaios que podem ser realizados no nosso sistema experimental. Vamos primeiro ilustrar as interações transientes de bolhas em tandem com a formação jato, a visualização do campo de fluxo resultante e o cálculo da velocidade do jato (Figura 5a). Iremos em seguida exemplos presentes em tandem de bolha induzida por deformação localizada da membrana celular (Figura 5b), a formação de poros de membrana identificada com a captação de PI (Figura 5c), e resposta de cálcio intracelular (Figura 5D). Outros exemplos, tais como ensaios de viabilidade celular e a apoptose, podem ser encontrados na referência 22.
A Figura 5a mostra um exemplo do conjunto bolha interacção com a formação de jacto, capturada pela imagem latente de alta velocidade, e o campo de fluxo resultante revelada por PIV. Especificamente, após a sua expansão máxima, o colapso da primeira bolha B 1 (produzidas a 0 mS) é distorcida assimetricamente pela rápida expansão da segunda bolha B 2 (produzido a 2,5 mS), levando à formação de um "para cima" jet (J 1) em 3,4 ms e subsequente fluxo de jacto, mostrado em 5,4 mS. A velocidade média do jacto é determinada pela inclinação de uma linha ajustada para a posição da extremidade proximal (ou pólo) de B 1 antes de aterragem (isto é, o contacto com a extremidade distal de um B) em função do tempo. A velocidade média de jacto encontra-se a aumentar a partir de 20 a 58 m / s quando o diâmetro máximo de 2 B aumenta de 40 a 60 uM. Com base nos resultados da análise de PIV, o fluxo de jacto direccional em torno do tandin bolha é da ordem de 10 m / s e está confinada dentro de uma largura da ordem de 10 um. É, assim, capaz de produzir uma tensão de cisalhamento e impulsiva localizada e gradiente de pressão em uma célula alvo cultivadas nas proximidades.
Outro exemplo apresentado na Figura 5b ilustra a deformação da membrana celular induzida pelo fluxo de jacto direccional e localizadas produzido pelo conjunto bolhas de impasse distância d S = 40 uM. A deformação e recuperação da membrana são realçadas pelo deslocamento de um grânulo funcionalizado (indicado pela linha a tracejado amarelo) ligado ao bordo de ataque da membrana celular. A estirpe de área local pode ser calculado a partir das coordenadas de uma tríade de pérolas adjacentes. Um esquema da variação de área máxima calculada em diferentes locais na superfície da célula é mostrada no meio. A ponta é esticado principalmente (veja os círculos verdes), enquanto o bordo de fuga ou lateral lados da célula são comprimidas (como indicado pelos círculos vermelhas), indicando a heterogeneidade na deformação celular produzida pelo fluxo de jacto de bolhas induzida em tandem. A variação temporal da estirpe área na vanguarda célula é ilustrado no lado direito. É composta por algumas oscilações rápidas no início, seguindo-se uma grande e sustentada durante cerca de estiramento de 100 uS (FWHM) e uma recuperação gradual subsequente numa escala de tempo de vários MS.
Além disso, a grande área e estirpe estirpe integrante na célula de ponta pode ser responsável pela formação de poros na membrana celular observada pequena S d, como se mostra na Figura 5c. No S pequeno d (isto é, 10 uM, ou, em alguns casos, 20 uM) e o intermediário S-D (ou seja, a maioria dos 20 e 30? M), uma ruptura da membrana localizada é induzida, levando a uma absorção pontual de PI extracelular emo citosol. Se a intensidade do PI dentro da célula continua aumentando sem saturação, necrose ocorre. Em comparação, se a intensidade PI é uma ordem de magnitude mais baixa e atinge um patamar dentro de 10 s após o tratamento bolha em tandem, de formação de poros reparáveis com a sobrevivência da célula, provavelmente, ocorrer, o que é ainda apoiada pela alteração mínima da morfologia celular. Em geral S d (ou seja, 40 mm), a captação PI insignificante é encontrado seguinte conjunto de tratamento bolha, indicando não-poração negligenciável ou. A célula pode sobreviver com crescimento e proliferação 22 regular. No geral, os resultados mostram uma clara transição em resposta celular a partir de necrose, através de formação de poros da membrana reparáveis, a não formação de poros na gama de S d ≈ 20-40 uM.
Finalmente, mostra os resultados de imagiologia raciométrica da resposta de cálcio intracelular induzidos por bolhas em tandem em células individuais em diferentes Sd, especialmente na gama sub-letal de S d = 30-50 pM (Figura 5D). O rácio de intensidade é proporcional à quantidade de cálcio intracelular. No S pequeno d (isto é, 30 uM ou, em alguns casos, 40 um), uma onda de cálcio viajar a partir do bordo de ataque para o bordo de fuga é claramente observado dentro de poucos segundos após o tratamento bolha em tandem. Após o cálcio intracelular atinge um pico de concentração, ele decai lentamente de volta ao nível de repouso dentro de alguns minutos. Em contraste, a grande S d (isto é, a maioria dos 50 um, ou, em alguns casos, 40 um), o aumento de cálcio intracelular é muito mais suave, e não claramente visível viajando onda de cálcio podem ser identificados. Estes dois diferentes respostas de cálcio também pode ser distinguido dos seus perfis de razão de intensidade versus tempo, com diferenças significativas na amplitude de pico da relação da intensidade e o tempo de subida do nível de repouso até ao picovalor. Numa s d ainda maior (isto é, acima de 60 uM), nenhuma resposta de cálcio pode ser observada. A percentagem de células HeLa que exibem respostas de cálcio em vários s d é resumido na Figura 5d (à direita).
Em suma, os nossos resultados demonstraram que, através da alteração da força do fluxo de jacto (ou mudando S d), uma variedade de efeitos biológicos podem ser produzidos em células HeLa individuais sob condições de cultura similares, o que é provavelmente correlacionados com a amplitude e a duração da deformação mecânica aplicada à membrana da célula 22.
Figura 5: Resultados da interacção bolha em tandem, a deformação da membrana celular, a formação de poros da membrana, e os ensaios de resposta de cálcio. a) o movimento de fluidos e o jatoinduzida por interacção bolha em tandem. Esquerda: quadros selecionados mostrando interações bolha conjunto com a formação de jato e campo revelada por PIV fluir. Os diâmetros máximos dos dois bolhas são de cerca de 50 ± 2 uM. Médio: Representação esquemática das bolhas de jacto em tandem, ilustrando o eixo de centro, de origem das coordenadas (o), e extremidades proximal e distal (ou postes) da primeira bolha 1 B. Direita: Medido pole positions (com erro = ± 1 mm) no proximal e extremidade distal do B 1. b) deformação da membrana celular. Esquerda: A linha pontilhada amarelo rotula o deslocamento de um grânulo PS ligado ao bordo de ataque da membrana celular, indicando a deformação da membrana local e recuperação. Meio: um esquema que mostra a área de pico de estirpes em diferentes locais na superfície da célula apresentados à esquerda. Direita: Os cursos de tempo das estirpes no meio da área da aresta principal da célula. Δ ε é o bas estirpe área calculadaed em cepas principais e Δ Δ é a estirpe área calculada com base na alteração da geometria tríade. Mais detalhes sobre o cálculo estirpe área e análise de erros são documentados na Referência 22. poração c) membrana celular. Esquerda: imagens de campo claro antes e depois do tratamento conjunto de bolhas e de lapso de tempo imagens de fluorescência de captação de PI (0 e 120 s). As setas brancas indicam a direcção do fluxo do jacto. Meio: a variação típica de intensidade média versus tempo PI no interior das células. Direita: Os resultados estatísticos da percentagem de células em necrose (vermelho), poração reparáveis (azul), e não-poração (verde) em diferentes S d. Número de células tratadas: N = 9, 14, 14, e 8 para d S = 10, 20, 30, e 40, respectivamente. O erro é de ± 1 estatística / √ N. d) a resposta de cálcio intracelular. Esquerda: sequências de imagens raciométrica que mostram as respostas de cálcio intracelulares de célula individuals a s d de 30 um e 50 um. As setas vermelhas indicam a direção do jato. Médio: perfis de resposta típicos (curvas de tempo de rácio) em diferentes S d. Direita: a probabilidade de uma resposta de cálcio em diferentes S d. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| distância de afastamento (S d) (mm) | número de Reynolds (Re) | média tensão de cisalhamento (Pa) no plano YZ |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105,08 | 42,21 |
Tabela 1: Uma lista de parâmetros para a física de fluxo a partir dos resultados de PIV. Estimado número de Reynolds e média tensão de cisalhamento em relação a diferentes distâncias espaçadores (S d). O plano YZ refere-se à largura do canal plano x altura. A tensão de cisalhamento média é estimado a partir de uma altura de 0-7,7? M a partir do fundo do canal porque a altura da célula no canal é de cerca de 6-7 um.
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Discussion
Análise de uma única célula, em combinação com imagens ao vivo de células, melhorou substancialmente a nossa compreensão dos processos dinâmicos e muitas vezes variáveis em células individuais, como o desenvolvimento fenótipo ea resposta imune 23. Em contraste com a cultura de células em pratos convencional ou frascos, sistemas de microfluidos permita o controle preciso do microambiente, para baixo para o nível de uma única célula, em tempo real. Consequentemente, os avanços na tecnologia de microfluidos e técnicas têm em grande parte melhorou o rendimento e reprodutibilidade da análise de uma única célula. Ao integrar macio litografia e superfície padronização, sistemas microfluídicos pode ainda ser projetado para facilitar a análise em profundidade da resposta de uma única célula para padrões complexos de estímulos espaço-temporalmente variáveis. Por exemplo, sinais mecânicos química transitória ou foram entregues com sucesso para células individuais, enquanto suas respostas biológicas ou mecânicas foram registrados automaticamente e analisadas 24. Apesar desta tendência geral, a aplicação da microfluídica para analisar bioeffects induzida por cavitação no nível celular tem sido muito limitado. Mais notavelmente, que só foi aplicada para a formação de poros de membrana induzida por bolha de células individuais em suspensão presas por micropillars 11. Na maioria dos estudos sobre células aderentes, o benefício de controlar a morfologia das células para manter a consistência nas interações célula-bolha dinâmica não está disponível ou em grande parte negligenciado.
Nós desenvolvemos um sistema microfluídico para controlar com precisão o início, a expansão subsequente e dinâmica colapso das bolhas de cavitação; interações bolha-bolha com formação de jato; e a forma da célula, orientação, padrão de adesão, e distância de afastamento a partir das bolhas, permitindo assim o fluxo de jacto reprodutível para ser aplicado a células individuais em condições experimentais bem controladas. Este novo sistema microfluídico é ideal para a realização de st fundamentaisudies na bolha (s) cavitação -cell interações que são relevantes para uma gama diversificada de aplicações de ultra-som terapêutico, como SWL, HIFU, e sonoporação. Nós demonstramos que o nosso sistema de microfluidos pode ser usado para investigar vários efeitos biológicos induzida por cavitação, incluindo deformação da membrana celular, a formação de poros da membrana, a viabilidade e a resposta de cálcio, de um modo mais controlável e reprodutível. Mais notavelmente, o fluxo de jacto direccional produzido por bolhas em tandem nos permite investigar a propriedade de cálcio e resposta mecânica em células individuais sob alta exigência-taxas que não foram bem caracterizados. A, tensão mecânica impulsiva localizada produzido por um tal fluxo de jacto não pode ser conseguida por métodos convencionais de alongamento, como a aspiração micropipeta 25 e o uso da óptica 26 e uma pinça 27 magnéticos. Além disso, em contraste com os estudos anteriores usando os agentes de contraste de ultra-sons ou laser 8,28-30-bu induzida únicabbles 31,32, o nosso sistema microfluídico oferece melhor controle das condições de geometria e adesão celular, reduzindo assim o seu efeito substancial na resposta celular e bioeffects 16.
Embora a nossa técnica é fiável e reprodutível, deve-se seguir o protocolo cuidadosamente para garantir que o sistema experimental é fielmente reproduzida. A qualidade da superfície padronização no microcanal é principalmente responsável pela reprodutibilidade das interacções de células de espuma de bolha e a cascata de efeitos biológicos a jusante. Por exemplo, para células de HeLa, a área de cada ponto de ouro devem ser cerca de 25-30 uM 2 para assegurar a geração de espuma estável, evitando que as células adiram. Por outro lado, a área de cada uma das ilhas revestidas com fibronectina tem de ser cerca de 700-900 ^ M de 2 a facilitar a adequada difusão de uma única célula em um quadrado, enquanto reduzindo a possibilidade de múltiplas células formadoras de agregados na ilha. Alinhamentoentre os pontos de ouro e as ilhas revestidas com fibronectina deve ser precisamente realizada com o auxílio do alinhador de máscara para manter o erro angular dentro de 1 ° e o erro axial dentro de 0,5 uM. Além disso, este sistema experimental proporciona versatilidade no controlo de uma série de eventos, com a sua escala de tempo variado por ordens de grandeza (por exemplo, a dinâmica de bolha: mS, de deformação de células: MS, a formação de poros de membrana: s, apoptose: h). Portanto, é importante para controlar com precisão o momento da aquisição de imagens e gravação de cada seqüência de ajuste fino dos sinais de disparo (controladas por um gerador de atraso digital). A cultura de uma única célula deve ser bem mantida no microcanal para minimizar a variação de célula-a-célula no fenótipo (principalmente referido como morfologia). Por isso, um mínimo de 2 h de incubação é necessário para a ligação de células e espalhando sobre as ilhas antes de prosseguir com o tratamento com células a jusante. Recomenda-se sempre manter a taxa de fluxo na microchannel sob 3 mL / min, de modo que a tensão de cisalhamento do fluxo produzido pelo meio de cultura circulante sobre a célula está dentro da gama fisiológica.
Uma limitação de corrente de a nossa técnica é que a bolha em tandem interacção e o fluxo de jacto resultante só pode ser aplicado a uma célula alvo, uma vez, porque os pontos de ouro será ablação pela irradiação laser. Este inconveniente limita a capacidade de o nosso sistema experimental para imitar os efeitos biológicos produzidos por ultra-som terapêutico, em que as células são muitas vezes expostos a eventos de cavitação. No entanto, essa limitação temporal pode ser aliviada através da aplicação de uma outra camada fina de dióxido de silício para proteger os pontos de ouro a partir de exposição directa no líquido 15. No geral, o nosso sistema microfluídico oferece condições experimentais bem controlados para investigar os efeitos biológicos produzidos a partir de bolha (s) cavitação interações -cell e tem várias características únicas. Em primeiro lugar, o tamanho e a localização do bolhas de cavitação no nosso eXperimental sistema pode ser controlado com precisão ajustando a energia laser incidente absorvida pelos pontos de ouro. Em segundo lugar, a geometria e a adesão de células individuais são padronizados pela padronização de células para minimizar os seus efeitos em respostas celulares e efeitos biológicos, levando a resultados mais reprodutíveis. Em terceiro lugar, as unidades de trabalho paralelos no design de chip de microfluidos tornar viável para estudar os efeitos biológicos a jusante, tais como o crescimento celular, a proliferação, e, potencialmente, a expressão do gene, após a exposição a cavitação, uma vez que cada célula pode ser monitorizado individualmente e dirigida. Em resumo, o nosso sistema microfluídico e metodologia criar interações bolha-bolha confiáveis para estudar os efeitos biológicos das células individuais com melhor precisão.
A nossa actual chip é concebido para a análise de células HeLa individuais. No entanto, uma modificação das ilhas de padrão para outras linhas de células de mamíferos são também possíveis. Várias melhorias podem ser feitas para ampliar ainda mais a applicatioNS do chip. Por exemplo, substitutos das moléculas de PLL-G-PEG poderia ser explorada para impedir que as células individuais estampados de migrar, mesmo depois de 24 h. Além disso, os novos desenhos chip com válvulas de microfluidos pode ser explorado para controlar o micro-ambiente local, das células, de modo que os produtos químicos, tais como marcadores de fluorescência ou de reagentes tóxicos só vai ser aplicado a um local específico, sem afectar as células em outras regiões do chip . Com estas melhorias, o sistema de microfluidos aqui apresentadas pode proporcionar oportunidades para estudar os efeitos biológicos de longo prazo de células únicas, tais como o metabolismo, a segregação, a diferenciação e a expressão do gene, a seguir à exposição a cavitação ou estímulos mecânicos produzidos por um fluxo impulsivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
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