Abstract
En este manuscrito, que primero se describe el protocolo de fabricación de un chip de microfluidos, con puntos de oro y regiones recubiertas de fibronectina en el mismo sustrato de vidrio, que controla con precisión la generación de burbujas en tándem y las células individuales estampadas cerca con ubicaciones y formas bien definidas. a continuación, se demuestra la generación de burbujas en tándem mediante el uso de dos láseres pulsados que ilumina un par de puntos del oro con un tiempo de retardo pocos microsegundos. Visualizamos la interacción de burbuja, la burbuja y la formación de chorro de imágenes de alta velocidad y caracterizar el campo de flujo resultante usando velocimetría de imágenes de partículas (PIV). Por último, se presentan algunas aplicaciones de esta técnica para el análisis de células individuales, incluyendo la formación de poros de la membrana celular con la absorción de macromoléculas, la deformación de la membrana localizada determinado por los desplazamientos de perlas de unión a integrinas unidas, y la respuesta del calcio intracelular a partir de imágenes radiométrica. Nuestros resultados muestran que un flujo de chorro rápido y direccional es proproducida por la interacción de burbujas en tándem, que puede imponer una tensión de corte altamente localizada en la superficie de una célula cultivada en las proximidades. Además, los diferentes efectos biológicos pueden ser inducidos por la alteración de la fuerza de la corriente de inyección ajustando la distancia de separación de la célula a las burbujas en tándem.
Introduction
Hay un creciente reconocimiento de que la heterogeneidad celular, que surge de la expresión de los genes estocástico, proteínas y metabolitos, existe dentro de una población de células grandes y sirve como un principio fundamental en la biología para permitir la adaptación celular y la evolución 1. Por lo tanto, a menudo es imprecisa y poco fiable para utilizar mediciones a granel basados en la población para comprender la función de las células individuales y sus interacciones. El desarrollo de nuevas tecnologías para el análisis de una sola célula, por tanto, de gran interés en la investigación biológica y farmacológica es, y se puede utilizar, por ejemplo, para comprender mejor las vías de señalización y procesos clave en la biología de células madre y terapia del cáncer 2-4. En los últimos años, la aparición de plataformas de microfluidos ha facilitado en gran medida el análisis de una sola célula, en el que el posicionamiento, el tratamiento, y la observación de la respuesta de las células individuales se han realizado con estrategias de análisis novedosos 5.
La cavitación desempeña un papel importante en una amplia gama de aplicaciones biomédicas, incluyendo el tratamiento de cánceres por ultrasonidos de alta intensidad (HIFU) 6 enfocada, la fragmentación no invasiva de cálculos renales por litotricia por onda de choque (SWL) 7, la administración de fármacos o gen por sonoporación 8, y la destrucción informó recientemente de células o tejidos por hidrodinámico 9,10 burbuja de cavitación. A pesar de esto, los procesos dinámicos de la burbuja (s) de cavitación interacciones con los tejidos biológicos y las células no han sido bien comprendidos. Esto es debido a la aleatoriedad en la dinámica de iniciación y burbuja de cavitación producidas por ultrasonido, ondas de choque, y la presión hidráulica local; Además, hay una falta de permitir técnicas para resolver las respuestas inherentemente complejos y rápidos de las células biológicas, especialmente en el nivel de una sola célula.
Debido a estos desafíos, no es sorprendente que muy pocos estudios han de abejasn informó para investigar las interacciones célula-burbuja en condiciones experimentales bien controlados. Por ejemplo, la poración de la membrana de las células individuales atrapado en suspensión 11 y la gran deformación impulsiva de los glóbulos rojos humanos 12 se han demostrado usando las burbujas individuales generados por láser en los canales de microfluidos. Esta última técnica, sin embargo, sólo puede producir muy pequeña deformación en células eucariotas, debido a la presencia del núcleo 13. Por otra parte, es difícil controlar los efectos biológicos aguas abajo en el tratamiento de células en suspensión. En otros estudios, la excitación de ultrasonido de una microburbuja unido a la célula (o agente de contraste de ultrasonidos) para la producción de la poración de la membrana y / o las respuestas de calcio intracelular en las células adherentes individuales ha informado 8. Membrana poración de células adherentes individuales también puede ser producido mediante el uso de burbujas en tándem generados por láser en una capa de líquido delgada solución de azul de tripano absorbente de la luz 14 que contiene, opor una burbuja de gas oscilante generado por pulsos de láser microsegundo de irradiación a través de un sustrato ópticamente absorbente en microcámaras 15. En comparación, el sustrato ópticamente absorción tiene una ventaja sobre la solución de azul de tripano láser de absorción debido a que el último es tóxico para las células. Más importante aún, las burbujas generados por láser son más controlable en términos de tamaño de burbuja y la ubicación de burbujas acústicamente excitados. Sin embargo, en todos estos estudios anteriores, la forma celular, la orientación y las condiciones de adherencia no fueron controlados, lo que puede influir sustancialmente la respuesta de las células y los efectos biológicos producidos por tensiones mecánicas 16.
Para superar estos inconvenientes en los estudios anteriores, se ha desarrollado recientemente un sistema experimental para la generación de la burbuja, el patrón celular, las interacciones de células de la burbuja de la burbuja, y en tiempo real los bioensayos de la respuesta celular en un chip microfluídico construido mediante el uso de una combinación única de Techn microfabricacióniques. Tres características principales que distinguen a nuestro sistema experimental de otros en el campo son: 1) el patrón de puntos de oro de tamaño micrométrico en el sustrato de vidrio para permitir la absorción del láser localizado para generación de burbujas 17; 2) el patrón de islas de tamaño micrométrico de la matriz extracelular (ECM) para la adhesión celular en el mismo sustrato para controlar tanto la localización y la geometría de las células individuales; y 3) la compresión de la dimensión del dominio de interacción por células burbuja burbuja de 3D a un espacio cuasi-2D para facilitar la visualización en el plano de las interacciones de burbuja, la burbuja, chorro de campos de flujo, deformación celular, y los efectos biológicos, todos los capturados en una secuencia de imágenes aerodinámico (Figura 1d).
Figura 1: El chip de microfluidos y esquemas de los diferentes ensayos. a) Un chip de microfluidos ensamblado con canales llenos de tinta azul para la visualización. b) una región en el interior del chip de microfluidos con células estampadas y puntos de oro (la distancia entre los dos puntos de oro en la proximidad es 40 micras). Muchos pares de unidades de trabajo pueden disponerse en un canal. c) Primer plano imagen de una sola unidad de trabajo que consiste en un par de puntos de oro y una célula HeLa adherido a la región de la célula-patrón. d) Representación esquemática de la operación del dispositivo. Una sola célula se adhiere y se extiende en la "H" en forma de isla recubiertos con fibronectina. Un par de burbujas de cavitación (burbujas tándem) con oscilación en oposición de fase se produce mediante la iluminación de rayos láser de impulsos en los puntos de oro (véase la figura 4a), que conduce a la generación de un chorro rápido y localizada en movimiento hacia la célula diana cerca. La célula puede ser deformado, porado para la absorción macromolecular, y / o estimulado con una respuesta de calcio, dependiendo de la distancia de separación (S d) de la célula a la burbuja tándem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Esta plataforma puede ser combinado adicionalmente con ensayos de fluorescencia y perlas funcionalizadas unidas a la superficie celular para los efectos biológicos de cavitación inducida. En particular, esta plataforma se abre el camino para ensayos fiables y cuantificables a nivel de una sola célula. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de inducida por la burbuja tándem deformación de la membrana celular, poración celular y captación intracelular, la viabilidad, apoptosis, y la respuesta del calcio intracelular. En el siguiente protocolo, se describe el proceso de fabricación de chips y el procedimiento para el análisis de los diversos efectos biológicos mencionados anteriormente. Por otra parte, también se describen las operaciones del chip.
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Protocol
1. La microfabricación
NOTA: Todos los procedimientos de microfabricación se llevan a cabo en una sala limpia. Una máscara de cromo está diseñado antes de la microfabricación, véase la Figura 2.
Figura 2: Esquema del diseño de canal en el chip microfluídico y las dimensiones de las unidades de trabajo. a) El diseño de la máscara de los microcanales alineados PDMS (verde) y los patrones en el sustrato de vidrio (azul y rojo). b) Imagen ampliada del diseño de la máscara en una sección representativa de las matrices de la unidad de trabajo. c) Representación esquemática de una unidad de trabajo que muestra un patrón de células (azul) y un par de puntos de oro (rojo). Todas las escalas de longitud se muestran en la parte inferior derecha. Haga clic aquí para ver una larger versión de esta figura.
- Patrones de punto de oro
NOTA: El área de cada punto de oro está diseñado para ser dentro de 25 a 30 micras 2, de modo que es lo suficientemente grande para absorber la energía láser para la generación de la burbuja, pero lo suficientemente pequeño para evitar las células individuales que se adhieren a ella. Un diagrama esquemático para la fabricación de puntos de oro se muestra en la Figura 3a.- Limpieza portaobjetos de vidrio (en una campana química)
- Enjuague el portaobjetos de vidrio con acetona y luego alcohol isopropílico (IPA), y luego secarlo con una corriente de N2.
- Remojar el portaobjetos en solución Piranha (H 2 SO 4 H 2 O 2 = 4: 1) durante 10 minutos.
- Sacar la corredera, enjuagarlo con agua DI, y luego secarlo con una corriente de N2.
- Hornear el portaobjetos de vidrio sobre una placa caliente a 120 ° C durante 10 minutos.
- El tratamiento de la diapositiva en un Asher plasma a 100 W durante 90 s.
- Recubrimiento por centrifugación (campana de spin-coating)
- Encienda una placa caliente y esperar hasta que la temperatura es estable a 95 ° C.
- Siga el procedimiento de revestimiento:
1.000 rpm durante 5 s con a / s rampa de 500 rpm;
entonces 3.000 rpm durante 30 s con una / s rampa de 1.000 rpm. - Fijar el portaobjetos de vidrio limpiado en la recubridora de rotación mediante la aplicación de un vacío.
- Cubrir la superficie de deslizamiento con P-20 y comenzar la receta de recubrimiento.
- Repita el proceso de recubrimiento de resina fotosensible NFR-negativo.
- Hornear el portaobjetos a 95 ° C durante 60 s y esperar a que se enfríe a temperatura ambiente.
- Fotolitografía
- Montar la máscara de cromo en el alineador de máscara y asegurarse de que el modelo lado se encuentra hacia abajo hacia la diapositiva.
- Establecer la receta para la fotolitografía modo de exposición dura con 9 s de la exposición UV y rápidamente alinear el sustrato de vidrio con la máscara.
- Después de llevar a cabo la exposición UV, hornear el portaobjetos a 956; C durante 1 min, y luego dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
- Desarrollo
- Desarrollar el patrón en la diapositiva en la solución de revelado durante 60 s.
- Retire el porta del desarrollador, lavarlo con agua DI, y secarlo con una corriente de N2.
- Compruebe el patrón de la geometría en el microscopio, y medir y registrar el tamaño de la característica.
- Deposición de oro (evaporación por haz de electrones) y de elevación inicial
- Hornear la diapositiva a 120 ° C durante 5 minutos, y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
- Limpiar el portaobjetos con plasma en la máquina de grabado iónico reactivo (RIE) durante 90 s a 500 Torr y 100 W.
- Depósito 5 nm de Ti y 15 nm de Au sobre el portaobjetos utilizando un evaporador de haz de electrones 17.
- Remojar el portaobjetos durante la noche en un vaso de precipitados de vidrio que contiene removedor fotorresistente disolvente para eliminar el reposo de oro en la parte superior de la NFR resistir.
- Recuperar la diapositiva, i rast con acetona seguido por el IPA, y se seca con una corriente de N2.
- Secar el portaobjetos en una placa caliente a 115 ° C antes de limpiarlo en el Asher plasma de oxígeno a 100 W durante 90 s.
- Limpieza portaobjetos de vidrio (en una campana química)
- Molecular conjunto de patrones de despegue (MAPL)
Nota: El área de cada isla recubiertos de fibronectina está configurado para estar dentro de 700 a 900 micras 2 para facilitar la adecuada difusión de células HeLa en una región cuadrada y reducir al mínimo las posibilidades de múltiples células de agregación en la isla. Un diagrama esquemático para la preparación de islas de células de modelado se muestra en la Figura 3b.- Recubrimiento por centrifugación
- Repita el paso 1.1.2, pero el uso de fotoprotector S1813-positiva y una temperatura de 115 ° C.
- fotolitografía alineado
- Montar la máscara de cromo en el alineador de máscara y asegúrese de que el lado con el patrón esté orientada hacia abajo hacia la corredera con elpuntos de oro.
- Establecer la receta para la fotolitografía modo de exposición dura con 9 s de la exposición UV.
- Alinear la máscara de la parte superior con la corredera inferior con marcas de alineación, situadas alrededor del borde de la máscara, como una referencia espacial.
- Compruebe la parte central de la máscara y compruebe que las operaciones de matriz están alineados correctamente.
- Completar la exposición UV sin post-horneado.
- Desarrollo
- Repita el paso 1.1.3, pero con 45 s de desarrollo antes de secar sobre una placa calefactora y preservar en N 2 de almacenamiento.
- Recubrimiento por centrifugación
- Tratamiento químico
- Preparar la solución de pasivación: 0,5 mg / ml PLL-g-PEG en tampón HEPES 10 mM.
- Recuperar la diapositiva a partir de N 2 de almacenamiento y limpiarlo utilizando RIE con el ajuste de parámetros: de 500 Torr presión, potencia 100-W, y 90 s de duración.
- Pipeta una gota de solución de pasivación sobre un pedazo de lámina de parafina. </ Li>
- Emparedado la solución con la película y la corredera, asegurándose de que el lado con el patrón de características se encuentra hacia abajo hacia la película; evitar la formación de burbujas.
- Esperar durante 45 minutos antes de retirar el porta la película.
- Remojar la diapositiva de forma consecutiva en removedor de resina fotosensible, removedor de resina fotosensible y agua DI (1: 1), y agua DI, y agitar en un baño de ultrasonidos durante 90 s para cada remojo.
- Se seca la diapositiva sobre una placa caliente para eliminar la humedad antes de sellarlo en un desecador y su almacenamiento en un refrigerador.
- ensamblaje de chips
- Repita los pasos 1.1.1-1.1.4, pero con fotoprotector SU8-2025-negativo y el ajuste de los parámetros que se refiere el protocolo llamado Microchem 18, para preparar un molde de silicona con una máscara fotográfica.
- Fabricar un microcanal PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x W x H) y una pequeña losa de PDMS (800 micras estructura de ranura-ancho) usando litografía blanda.
- Perforar el microchannel para los puertos de acceso de fluido y limpio con cinta adhesiva y luego con IPA.
- Escudo del área modelada del sustrato de vidrio con la losa de PDMS, y aplicar RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) para eliminar PLL-g-PEG de la zona periférica.
- Se trata el microcanal con una dosis reducida de RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), y luego alinearla al sustrato de vidrio impreso (con la pequeña losa de PDMS eliminado); llevar el microcanal y el sustrato de vidrio impreso en contacto conforme en un estereoscopio.
Figura 3: Diagramas esquemáticos para la microfabricación y el chip de montaje. a) patrón de puntos de oro sobre el sustrato de vidrio. b) Preparación del sustrato de vidrio para el patrón celular a través de MAPL. c) Montaje del canal de microfluidos con la unión de plasma. Ver la Lista de materiales para las definiciones of las abreviaturas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- La unión celular
NOTA: células HeLa se mantuvieron rutinariamente en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico solución / antimitótico en un incubador de cultivo celular. Un diagrama esquemático para la fijación de montaje de chips y la célula se muestra en la figura 3c.- Primer el chip con PBS durante 30 min a 1 l / min, y luego la inyección de solución de fibronectina (50 mg / ml en PBS, 1 l / min) durante 45 min.
- Mientras espera, trypsinize cultivo de células con 0,25% de tripsina-EDTA, lavarlos en medio de cultivo, las células individuales de centrífuga, y reconstituir la suspensión celular en pre-calentado (37 ° C) medio de cultivo a 5x10 6 células / ml.
- Vuelva a colocar la solución de fibronectina con PBS y lavar el chip a 10 l / min durante 5 min.
- Inyectarla suspensión celular preparada en el chip, detener el flujo, la abrazadera de la salida, y mantener el chip en una incubadora de cultivo celular durante 30 min.
- Soltar la salida y lavar el chip con medio de cultivo celular a 10 l / min durante 5 min. Reducir la tasa de flujo de perfusión del medio de cultivo a 0,75 l / min y mantener el cultivo de células durante 2 h en la incubadora.
2. generación de burbujas y la visualización de flujos
NOTA: Un diagrama esquemático de la configuración experimental se muestra en la figura 4a para generación de burbujas tándem y la interacción del flujo resultante con una sola célula crecido cerca en un canal microfluídico.
- Generación de burbujas tándem con dos láseres y de control de temporización
- Coloque el chip de microfluidos en el escenario de un microscopio invertido y alinear los focos de dos pulsos de láser Nd: YAG (λ = 532 nm, duración del pulso de 5 ns) en un par de puntos del oro con dibujos separados by 40 micras.
- Utilizar un generador de retardo digital para activar los dos láseres con un retardo de tiempo alrededor de 2,5 mu s para producir dos burbujas iniciadas en los puntos del oro.
- Ajustar la energía de salida del láser (~ 10 mu J) para producir un diámetro máximo de las burbujas dentro de 50 ± 2 m.
- Sincronizar una cámara de alta velocidad (exposición de 200 ns y 2 millones de fotogramas por segundo (fps)) para los láseres y capturar la dinámica de la expansión de la burbuja, el colapso, la interacción de burbuja, la burbuja, y la formación de chorro.
- La cuantificación de la velocidad del chorro
- Registrar la posición de la punta del chorro (J 1) en el extremo proximal de la primera burbuja (B 1) y el extremo distal de B 1, a partir de la generación de la segunda burbuja (B 2) y terminando con la toma de contacto de J 1 hacia el extremo distal de B 1; ver el esquema de la Figura 5a.
- ajustarse linealmente el curso temporal de la posición de both proximal (punta del chorro) y los extremos distales. Calcular la pendiente de la posición de la punta respecto a la curva de tiempo para el extremo proximal para determinar la velocidad del chorro. La intersección de las dos líneas indica el tiempo chorro de toma de contacto. Más detalles se pueden encontrar en la referencia 19.
- La visualización del campo de flujo de burbuja, inducida tándem
- Preparar 1 m de poliestireno (PS) suspensión de perlas en agua DI (2,6% w / v) e inyectar las perlas en el chip microfluídico.
- Generar burbujas en tándem como se describe en el paso 2.1.1-2.1.3.
- Registrar la dinámica de burbujas tándem utilizando una cámara de vídeo de alta velocidad a una velocidad de encuadre 5 M fps con un tiempo de exposición de 100 ns.
- Sube la secuencia de imágenes adquiridas en un software comercial PIV.
- Divide cada imagen en pequeñas ventanas de interrogación de 16 x 16 pixeles (px) con un solapamiento de 75%.
- Aplicar iteración de pasos múltiples y filtros regionales para reducir los errores en el cálculo campo de velocidades, ysalida de los resultados en un mapa del vector de velocidad.
Figura 4: Esquema del montaje experimental y la grabación de imágenes. a) Montaje experimental para la generación de burbujas tándem. b) la secuencia de tiempo utilizado para diferentes tipos de adquisiciones de imágenes. FL: microscopía de fluorescencia, BF: campo claro, IFT: tiempo entre tramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Una sola célula Análisis y Bioefectos
NOTA: La burbuja tándem se produce junto a las células diana, y los efectos biológicos resultantes son estudiados de manera dependiente de la distancia enfrentamiento. La secuencia de tiempo para diferentes tipos de adquisiciones de imágenes se representa en la Figura 4b.
- Poración de la membrana y la absorción macromolecular
NOTA: La captación de macromoléculas extracelulares en la célula diana se caracteriza por la progresiva difusión de yoduro de membrana impermeable de propidio (PI) a través del sitio de poración en la membrana celular.- Después de la etapa 1.5, sustituir el medio de cultivo regular (es decir, DMEM) con una solución de PI (100 g / ml en DMEM) que se ejecuta a una velocidad de flujo de perfusión de 0,5 l / min durante todo el experimento.
- Programar el software de control de microscopio para seleccionar automáticamente el cubo fluorescente PI en la torreta giratoria y sincronizar la temporización de la cámara CCD con la excitación de fluorescencia PI para capturar imágenes de fluorescencia con un tiempo de exposición de 200 ms.
- Después de los dos focos de láser están alineados con un par de puntos de oro junto a una célula diana, ficha tanto de campo brillante (BF) y las imágenes de fluorescencia (FL) antes del tratamiento burbuja tándem.
- Utilice el software de control microscopio para inmediatamenteiniciar un lapso de tiempo de grabación de imágenes de fluorescencia de la célula diana, poco después de la etapa 2.1 para capturar la historia de la captación de PI.
- la deformación de la membrana
- Preparar 1-micras perlas (1% w / v, activados con carbodiimida soluble en agua) y funcionalizar con péptido-2000 (100 g / ml en PBS).
- Después de la etapa 1.5, se incuban las células unidas con las perlas funcionalizadas a una densidad de 1x10 9 perlas / ml a 37 ° C durante 30 min.
- Repita el paso 2.1 para producir burbujas en tándem junto a la célula diana y registrar la deformación celular con una cámara de ultra alta velocidad funcionando a una velocidad de encuadre de 5 millones fps.
- Identificar una tríada de 3 cuentas que permanecen en el plano de la imagen a lo largo del experimento y compilar sus posiciones como (x 1, y 1) (x 2, y 2), y (x 3, y 3) en el experimento de coordenadas.
- Calcular el área de la tríada antes y afTer el tratamiento de la burbuja tándem utilizando la fórmula:
- Calcular la cepa de interés como:
- Sobre la base de las coordenadas de los tres vértices antes y después del tratamiento de la burbuja en tándem, el cálculo de la tensión y la principal área cepa local siguiendo los protocolos establecidos 20,21.
- La viabilidad y la apoptosis
NOTA: FITC Anexina V etiquetas de células, incluidas las apoptóticos, a través de la externalización de la fosfatidilserina (fluorescencia verde). PI etiquetas de los núcleos de las células necróticas (fluorescencia roja). de imágenes de campo claro se utiliza para documentar la morfología celular y para ayudar en la identificación de la viabilidad celular y la apoptosis.- Registrar la posición de cada célula tratada en el canal de microfluidos (facilitado por las etiquetas de dirección en el canal, véase la Figura 2b
- Se incuban las células tratadas en el medio de cultivo celular durante otras 2 h antes de la perfusión del chip con una solución de FITC Anexina V durante 15 min. Las células positivas muestran una fluorescencia verde.
- Repita el paso 3.3.2 24 h después del tratamiento burbuja tándem para estudiar los efectos biológicos a largo plazo en las células diana.
- respuesta de calcio
- Mezclar 3 l de fura-2 a.m. solución madre (1 mg / ml en DMSO) con 3 l de 10% w / v de Pluronic F-127 en 500 l de medio de suero reducido para preparar la solución de etiquetado final (6 M).
- Después de la etapa 1.5, sustituir el medio de cultivo celular con la solución de etiquetado y se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 40 min (1 l / min velocidad de perfusión).
- Vuelva a llenar el canal con el medio de suero reducido (0,75 l / min velocidad de perfusión) antes de comenzar el experimento celular.
- Iniciar la proyección de imagen radiométrica (longitud de onda: 340/380 nm, la exposición de 50 ms)de la célula diana utilizando el sistema de PTI comercial.
- Después de 10 s de imagen radiométrica de la célula al nivel de reposo, producir burbujas en tándem como en el paso 2.1; primero registro con un tiempo entre tramas (IFT) de 0,1 s para 1 min, a continuación, aumentar la IFT a 1 s para otro min, y un aumento adicional de 5 s después de 2 min.
- Utilice el software PTI para calcular la relación R = F340 / F380 en la región de interés (ROI), que es proporcional a la concentración de calcio intracelular.
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Representative Results
La plataforma de microfluidos se describe en este trabajo se puede utilizar para investigar las interacciones de burbuja, la burbuja y para analizar una variedad de efectos biológicos de cavitación inducida a nivel de una sola célula. A continuación, presentamos varios ejemplos para demostrar una variedad de estudios experimentales y ensayos biológicos que se pueden realizar en nuestro sistema experimental. Primero Ilustraremos las interacciones transitorias de burbujas en tándem con la formación de chorro, la visualización del campo de flujo resultante, y el cálculo de la velocidad de reacción (Figura 5a). Vamos a continuación ejemplos actuales de tándem burbuja inducida por deformación de la membrana celular localizada (Figura 5b), poración membrana identificado con la captación de PI (Figura 5c), y la respuesta de calcio intracelular (Figura 5d). Otros ejemplos, tales como los ensayos de viabilidad celular y la apoptosis, se pueden encontrar en la referencia 22.
Figura 5a muestra un ejemplo de la interacción de burbujas en tándem con la formación de chorro, capturado por imágenes de alta velocidad, y el campo de flujo resultante revelado por PIV. Específicamente, después de su expansión máxima, el colapso de la primera burbuja B 1 (producido a 0 mu s) está distorsionada asimétricamente por la rápida expansión de la segunda burbuja B 2 (producido en 2.5 mu s), lo que lleva a la formación de un "hacia arriba" chorro (J 1) en 3,4 microsegundo y el flujo de inyección posterior, que se muestra en 5,4 mu s. La velocidad de reacción promedio es determinada por la pendiente de una línea ajustada a la posición del extremo proximal (o poste) de B 1 antes de la toma (es decir, el contacto con el extremo distal del B 1) frente al tiempo. La velocidad de reacción media se encuentra para aumentar de 20 a 58 m / s cuando el diámetro máximo de B 2 aumenta de 40 a 60 micras. Con base en los resultados del análisis de PIV, el flujo de chorro direccional alrededor del tandburbuja em es del orden de 10 m / s y está confinado dentro de una anchura del orden de 10 micras. Por tanto, es capaz de producir un esfuerzo de corte impulsivo y localizada y gradiente de tensión en una célula diana crecido cerca.
Otro ejemplo se muestra en la figura 5b ilustra la deformación de la membrana celular inducida por el flujo de chorro direccional y localizada producida por el tándem burbujas a Distancia de separación S d = 40 m. La deformación de la membrana y la recuperación están resaltados por el desplazamiento de un cordón funcionalizado (indicado por la línea de puntos de color amarillo) unida al borde de ataque de la membrana celular. La cepa de área local se puede calcular a partir de las coordenadas de una tríada de los granos adyacentes. Un esquema del cambio de área máxima calculada en diferentes lugares en la superficie celular se muestra en el medio. El borde de ataque se estira principalmente (ver los círculos verdes), mientras que el borde de salida o latlados va- de la célula se comprimen (como se indica por los círculos rojos), indicando heterogeneidad en la deformación de células producida por el flujo de chorro de burbujas tándem inducida. La variación temporal de la cepa área en el borde delantero de células se ilustra a la derecha. Se compone de unas pocas oscilaciones rápidas en el principio, seguido de un tramo grande y sostenida por unos 100 mu s (FWHM) y una recuperación gradual posterior en una escala de tiempo de varios ms.
Además, el gran esfuerzo de deformación área y de la tensión integral de la célula de borde de ataque pueden ser responsables de la formación de poros de la membrana celular observado en pequeña S d, como se muestra en Figura 5c. En pequeño S d (es decir, 10 micras, o en algunos casos, 20 mM) y S intermedio d (es decir, la mayoría de los 20 y 30 micras), se induce una alteración de la membrana localizada, que conduce a una absorción de punta de PI extracelular enel citosol. Si la intensidad de PI dentro de la célula sigue aumentando sin saturación, se produce la necrosis. En comparación, si la intensidad de PI es un orden de magnitud inferior y alcanza una meseta a los 10 s siguientes al tratamiento burbuja tándem, se producirá poración reparable con la supervivencia celular probable, que está respaldada por el cambio mínimo en la morfología celular. En general S d (es decir, 40 micras), la captación de PI insignificante siguiente se encuentra el tratamiento de la burbuja en tándem, lo que indica que no poración o insignificante. La célula puede sobrevivir con el crecimiento y la proliferación de 22 regular. En general, los resultados muestran una clara transición en respuesta de las células de la necrosis, a través de la poración de la membrana reparable, a la no formación de poros en el intervalo de S d ≈ 20-40 micras.
Finalmente, se muestran los resultados de las imágenes radiométrica de la respuesta del calcio intracelular provocada por las burbujas en tándem en las células individuales en diferentes Sd, especialmente en el rango subletal de S d = 30 a 50 micras (Figura 5d). La relación de intensidad es proporcional a la cantidad de calcio intracelular. En pequeño S d (es decir, 30 micras o, en algunos casos, 40 mM), una onda de calcio viaja desde el borde de ataque al borde de salida se observa claramente dentro de unos pocos segundos después del tratamiento de la burbuja tándem. Después de que el calcio intracelular alcanza un pico de concentración, que se descompone lentamente al nivel de reposo en pocos minutos. Por el contrario, en general S d (es decir, una mayoría de 50 micras, o en algunos casos, 40 micras), el aumento del calcio intracelular es mucho más suave, y no claramente onda de calcio viajar visible puede ser identificado. Estas dos respuestas de calcio diferentes también se pueden distinguir de su proporción frente al tiempo intensidad perfiles, con diferencias significativas en la amplitud de pico de la relación de intensidad y el tiempo de subida de reposo nivel de picovalor. En una aún mayor S d (es decir, por encima de 60 micras), se puede observar ninguna respuesta de calcio. El porcentaje de células HeLa que exhiben respuestas de calcio en varios S d se resume en la figura 5d (derecha).
En conjunto, nuestros resultados han demostrado que, mediante la alteración de la fuerza de la corriente de chorro (o el cambio de S d), una variedad de efectos biológicos se pueden producir en células HeLa individuales bajo condiciones de cultivo similares, lo que probablemente se correlaciona con la amplitud y duración de la deformación mecánica impuesta sobre la membrana celular 22.
Figura 5: Resultados de la interacción de burbujas en tándem, la deformación de la membrana celular, formación de poros de la membrana, y ensayos de respuesta de calcio. a) el movimiento del fluido y el chorroinducida por la interacción de burbujas tándem. Izquierda: Los cuadros seleccionados que muestra las interacciones de burbujas en tándem con la formación de chorro y el campo revelado por PIV fluir. Los diámetros máximos de las dos burbujas son alrededor de 50 ± 2 micras. Medio: Representación esquemática de las burbujas de chorro en tándem, que ilustra el eje central, el origen de las coordenadas (o), y extremos proximal y distal (o polos) de la primera burbuja B 1. Derecha: Medido poles (con error = ± 1 m) en el proximal y el extremo distal de B 1. b) la deformación de la membrana de la célula. Izquierda: La línea de puntos amarillo etiqueta el desplazamiento de un cordón PS unido al borde de ataque de la membrana celular, lo que indica la deformación de la membrana local y recuperación. Medio: un esquema que muestra el área del pico cepas en diferentes lugares en la superficie celular que se muestran a la izquierda. Derecha: Los cursos de tiempo de las cepas área en el centro del borde de ataque de la célula. Ε Δ es el BAS cepa área calculadaed en cepas principales y Δ Δ es el área de tensión calculada en base al cambio de geometría tríada. Más detalles sobre el cálculo de la tensión y el área de análisis de errores están documentados en la Referencia 22. poración c) membrana celular. Izquierda: imágenes de campo claro antes y después de las imágenes de fluorescencia tándem de tratamiento de burbujas y de lapso de tiempo de captación de PI (0 y 120 s). Las flechas blancas indican la dirección del flujo de inyección. Medio: el típico cambio de la intensidad media de PI en función del tiempo en el interior de las células. Derecha: Resultados estadísticos del porcentaje de células en proceso de necrosis (rojo), poración reparables (azul), y no poración (verde) a diferentes S d. Número de células tratadas: N = 9, 14, 14, y 8 para S d = 10, 20, 30, y 40, respectivamente. El error estadístico es la respuesta intracelular de calcio ± 1 / √ N. d). Izquierda: secuencias de imágenes radiométricos que muestran las respuestas de calcio intracelulares de célula individuals en S d de 30 micras y 50 micras. Las flechas rojas indican la dirección del chorro. Medio: perfiles típicos de respuesta (curvas de tiempo-relación) a diferentes S d. A la derecha: la probabilidad de una respuesta de calcio en diferentes S d. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| distancia de separación (S d) (m) | número de Reynolds (Re) | un promedio de esfuerzo de cizalla (Pa) en el plano yz |
| 20 | 206.96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378.78 | 657,22 |
| 50 | 163.85 | 323,61 |
| 60 | 105.08 | 42.21 |
Tabla 1: Una lista de los parámetros de flujo para la física de los resultados de PIV. Estimación del número de Reynolds y un promedio de esfuerzo de corte con respecto a diferentes distancias de los separadores (S d). El plano YZ se refiere a la anchura del canal plano x altura. El esfuerzo de corte promediado se estima a partir de una altura de 0-7,7 m desde el fondo del canal debido a que la altura de la celda en el canal es de alrededor de 6-7 micras.
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Discussion
El análisis de una sola célula, en combinación con imágenes de células vivas, ha mejorado en gran medida nuestra comprensión de los procesos dinámicos y con frecuencia variable en las células individuales, tales como la aparición del fenotipo y la respuesta inmune 23. En contraste con el cultivo celular convencional en placas o matraces, los sistemas microfluídicos permiten un control preciso del microambiente, hasta el nivel de una sola célula, en tiempo real. En consecuencia, los avances en la tecnología de microfluidos y las técnicas han mejorado en gran medida el rendimiento y la reproducibilidad del análisis de una sola célula. Mediante la integración de la litografía y la superficie suave del patrón, los sistemas de microfluidos pueden ser diseñadas más para facilitar el análisis en profundidad de la respuesta de una sola célula a un sistema complejo de estímulos espaciotemporalmente variables. Por ejemplo, las señales químicas y mecánicas transitorias o se han entregado con éxito a las células individuales, mientras que sus respuestas biológicas o mecánicas se registran automáticamente y analizado 24. A pesar de esta tendencia general, la aplicación de la microfluídica para analizar los efectos biológicos de cavitación inducida a nivel celular ha sido muy limitada. Lo más notable, sólo se ha aplicado a la poración de la membrana de la burbuja inducida de las células individuales en suspensión atrapadas por micropilares 11. En la mayoría de los estudios sobre células adherentes, el beneficio de controlar la morfología celular para mantener la consistencia en las interacciones célula-burbuja dinámicos no está disponible o descuidado en gran medida.
Hemos desarrollado un sistema de microfluidos para controlar con precisión el inicio, la posterior expansión, y la dinámica de colapso de las burbujas de cavitación; interacciones de burbuja, la burbuja con la formación de chorro; y la forma celular, la orientación, patrón de adhesión, y distancia de separación de las burbujas, lo que permite el flujo de inyección reproducible para ser aplicados a las células individuales en condiciones experimentales bien controlados. Este sistema de microfluidos novela es ideal para llevar a cabo st fundamentaludies en la burbuja (s) de cavitación células beta interacciones que son relevantes para una amplia gama de aplicaciones de ultrasonido terapéutico, como la LOC, HIFU, y sonoporación. Hemos demostrado que nuestro sistema de microfluidos puede utilizarse para investigar diversos efectos biológicos de cavitación inducida, incluyendo la deformación de la membrana celular, formación de poros de la membrana, la viabilidad y la respuesta de calcio, de una manera más controlable y reproducible. En particular, el flujo de chorro direccional producido por las burbujas en tándem nos permite investigar la respuesta propiedad y calcio mecánica en células individuales bajo altas cepa de tasas que no han sido bien caracterizados. El, la tensión mecánica impulsiva localizada producida por un flujo de chorro tales no se puede lograr por métodos convencionales de estiramiento, como la aspiración de micropipeta 25 y el uso de óptica 26 y pinzas magnéticas 27. Bu sola Además, en contraste con estudios anteriores utilizando agentes de contraste de ultrasonido 8,28-30 o inducida por láserbbles 31,32, nuestro sistema de microfluidos ofrece un mejor control de las condiciones de la geometría celular y la adhesión, reduciendo así su efecto sustancial en la respuesta celular y efectos biológicos 16.
Mientras que nuestra técnica es fiable y reproducible, se debe seguir el protocolo con precaución para asegurar que el sistema experimental se reproduce fielmente. La calidad de los patrones de superficie en el microcanal es principalmente responsable de la reproducibilidad de las interacciones de células de la burbuja de la burbuja y la cascada de efectos biológicos aguas abajo. Por ejemplo, para las células HeLa, el área de cada punto de oro debe ser alrededor de 25 a 30 micras 2 para asegurar la generación de la burbuja estable, mientras que la prevención de las células se adhieran. Por otro lado, el área de cada isla recubiertos de fibronectina tiene que ser alrededor de 700 a 900 micras 2 para facilitar la adecuada difusión de una sola célula en un cuadrado, mientras que la reducción de la probabilidad de múltiples células que forman los agregados en la isla. Alineaciónentre los puntos de oro y las islas recubiertas de fibronectina se debe realizar con precisión con la ayuda de la alineador de máscara para mantener el error angular dentro de 1 ° y el error axial dentro de 0,5 micras. Por otra parte, este sistema experimental proporciona versatilidad en el seguimiento de una serie de eventos, con su escala de tiempo varía en varios órdenes de magnitud (por ejemplo, la dinámica de burbujas: mu s, deformación celular: ms, poración de la membrana: s, la apoptosis: h). Por lo tanto, es importante controlar con precisión el momento de la adquisición de imágenes y grabación de cada secuencia por ajuste fino de las señales de activación (controlado por un generador de retardo digital). El cultivo de una sola célula debe estar bien mantiene en el microcanal para minimizar la variación de célula a célula en el fenotipo (en su mayor parte a como morfología). Por lo tanto, se requiere un mínimo de 2 h de incubación de la unión de las células y la difusión en las islas antes de proceder con el tratamiento con células aguas abajo. Se recomienda mantener siempre la velocidad de flujo en el microchannel bajo 3 l / min, de modo que la tensión de corte de flujo producido por el medio de cultivo que circula en la célula está dentro del rango fisiológico.
Una limitación actual de nuestra técnica es que la interacción de burbujas tándem y el flujo de chorro resultante sólo se pueden aplicar a una célula diana una vez, porque los puntos de oro se ablación por la irradiación láser. Este inconveniente limita la capacidad de nuestro sistema experimental para imitar los efectos biológicos producidos por el ultrasonido terapéutico, donde las células son a menudo expuestos a eventos de cavitación. Sin embargo, esta limitación temporal puede ser aliviado mediante la aplicación de otra capa delgada de dióxido de silicio para proteger los puntos de oro de la exposición directa en el líquido 15. En general, nuestro sistema de microfluidos ofrece condiciones experimentales bien controlados para investigar los efectos biológicos producidos a partir de la burbuja (s) de cavitación interacciones de Célula y tiene varias características únicas. En primer lugar, el tamaño y la ubicación de la cavitación de burbujas en nuestro correosistema Xperimental puede controlarse con precisión mediante el ajuste de la energía láser incidente absorbida por los puntos de oro. En segundo lugar, la geometría y la adhesión de las células individuales están estandarizados por el patrón celular para minimizar sus efectos sobre las respuestas de células y los efectos biológicos, que conduce a resultados más reproducibles. En tercer lugar, las unidades de trabajo paralelas en el diseño de chips de microfluidos que sea factible para el estudio de los efectos biológicos aguas abajo, tales como el crecimiento celular, la proliferación, y, potencialmente, la expresión de genes, después de la exposición de cavitación, ya que cada célula puede ser dirigida y supervisado de forma individual. En resumen, nuestro sistema de microfluidos y metodología crean interacciones de burbuja, la burbuja fiables para estudiar los efectos biológicos de las células individuales con una mejor precisión.
Nuestro chip de corriente está diseñado para el análisis de células HeLa individuales. Sin embargo, una modificación de las islas del patrón para otras líneas celulares de mamíferos también son posibles. Varias mejoras se pueden hacer para ampliar más la applications del chip. Por ejemplo, los sustitutos de las moléculas de PLL-g-PEG puedan ser exploradas para impedir que las células migren con dibujos individuales, incluso después de 24 h. Además, los nuevos diseños de chips con válvulas de microfluidos pueden ser exploradas para controlar el microentorno local de los células, de modo que los productos químicos tales como los marcadores de fluorescencia o reactivos tóxicos sólo se pueden aplicar a un lugar específico, sin afectar a las células en otras regiones del chip . Con estas mejoras, el sistema de microfluidos que se presenta aquí puede proporcionar la oportunidad de estudiar los efectos biológicos a largo plazo de las células individuales, tales como el metabolismo, la segregación, la diferenciación y la expresión de genes, después de la exposición cavitación o estímulos mecánicos producidos por un flujo de impulsivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
