Summary
Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.
Abstract
Nötrofiller doğuştan savunma barındırmak için çok önemlidir ve dolayısıyla tıbbi araştırma önemli bir alan oluşturmaktadır. fagosom, sardı parçacıkların öldürülmesi ve sindirim meydana hücre içi bölme, sıkı bir şekilde düzenlenmesini gerektirir nötrofil patojen öldürme için önemli alandır. Phagosomal pH dikkatli bir şekilde, antimikrobiyal bir proteaz aktivitesinin düzenlenmesinde da kontrol edilir bir yönüdür. Birçok flüoresan pH'a duyarlı boyalar phagosomal ortamı görselleştirmek için kullanılmıştır. S-1, çift emisyon spektrumları, foto-ağartma karşı direnç, ve yüksek pKa'sı dahil olmak üzere diğer pH'a duyarlı boyalar, üzerinde birçok avantajı vardır. Bu yöntemi kullanarak, nötrofil fagosom diğer fagositler göre alışılmışın dışında alkali olduğunu göstermiştir. fagozomun boyutu ve şeklindeki değişiklikler, tespit edilebilir, böylece boyanın farklı biyokimyasal çekimleri kullanarak, fagosom sitoplazmadan tarif edilebilir. Bu f veririyonik hareketi ya da daha fazla izlenmesi.
Introduction
nötrofil Vücutta en bol bulunan doğuştan gelen immün hücredir. Temel işlevi kan dolaşımına devriye ve içine çeken ve fagositoz 1, 2 olarak bilinen bir süreç karşılaşabilecekleri yabancı madde sindirim oluşur. parçacıklar fagosom adı verilen bir hücre içi bölüm degradasyona uğrar. nötrofil NADPH oksidaz, izoform NoX2, aktivasyonu patojenin ölümü ile sonuçlanacak biyokimyasal reaksiyonların kaskadını başlatır. NoX2 protein alt-birimleri phagosomal membran 3 bir elektron taşıma zinciri kompleksi oluşturmak üzere devam eder. Bir kez süperoksit anyon ve diğer reaktif oksijen türleri üreten fagozomun içinde moleküler oksijene membran boyunca NADPH'den elektrota nakleder, aktive edildi. Bu solunum patlaması olarak bilinir ve verimli mikrobiyal öldürme ve sindirim 2 için gerekli olduğu düşünülmektedir 4, 5 ile gerçekleştirilir olduğu tespit edilmiştir. Bu kanal fagozomun sitosolda kendi elektro-kimyasal gradyana aşağı proton pasif hareket edebilmesini sağlar. Proton konsantrasyonunun pH tarafından yansıtılan, yani, oksidaz aktivitesinin, belirli bir seviyesi için, fagozomun pH derecesi ölçülerek şarj telafi protonik olmayan protonik yollarının nispi katılımı hakkında bilgi sağlayabilir.
İnsan nötrofil fagosom fagositozu 5 sonra yaklaşık 8.5 20-30 dakika süreyle bir alkalin pH'a sahiptir. Bu NOX ek olmayan proton iyon kanallarının varlığını imagözlenen aksine, asidik bir ortam sağlamak olur füzyon ve HVCN1 ile asidik granüller ve taban tazminat içeriklerini serbest bırakacak şekilde, yük dengeleme 2 ile indüklenen. iyon hareketi de ozmoz ile fagosom boyutunda değişiklik gösterebilirler, bu negatif bir yükü dengelemek için. Yüksek fizyolojik konsantrasyonlarda nötrofil mevcut Bu maddeler iyonları potasyum iyonları fagozomun 6 taşınmak gösterilmiştir ve klorür iyon hareketi nötrofil fonksiyonu 7 için önemli başka bir adaydır.
Fagozomun pH düzenlenmesi antimikrobiyal proteaz aktivitesi 5 için hayati önem taşımaktadır. Miyeloperoksidaz (MPO), katepsin G ve elastas için, optimal seviyeler 5, sırasıyla, pH 7-9 ve pH 8-10 iken, pH 6'da en iyi aktiviteye sahip gibi görünmektedir. Bu nedenle, phagosomal pH geçici değişim eğlence farklı enzimler için etkinlik niş sağlayabilirction. pH, nötrofil mikrobiyal öldürmede rol ne anlama yeni nötrofil artırmada mikrobik maddelerin tasarımı için yararlı bilgiler sağlayabilir.
nötrofil fagosom oldukça reaktif bir ortamdır. boyalar kolayca okside edilebilir, çünkü bu teknik yapay yol açan, tam olarak pH değerlendirmek zor hale getirir. Tarihsel olarak, flöresin izotiyosiyanat (FITC), hücre içi pH 8, 9 ölçmek için tercih edilen bir boya olmuştur. Bununla birlikte, nötrofil phagosomal pH ölçümü olarak kullanımı için bazı dezavantajları da vardır. O, pH <8 11, doyurur olarak sadece doğru, 5 ila 7,5 ila 8 pH seviyelerini değerlendirmek için de kullanılabilir, yani 6.4 10 bir pKa değerine sahiptir. Nötrofil phagosomal pH daha bazik 5 olmak üzere, FITC potansiyel pH değişiklikleri dizi yakalayamaz. Bir başka özellikleri önemlinötrofillerin bağlamında FITC ile can sorun MPO 12 tarafından photobleached düşünülmektedir olmasıdır. MPO inhibitörü, sodyum azid, 13 ışıkla ağartma sınırlamak için kullanılabilir, fakat sodyum azid ile doğrudan bir MPO bağımsız bir şekilde phagosomal pH'ı düşürür ve bu tür deneylerde 5 kullanılmak için bu şekilde uygunsuz olduğu gösterilmiştir.
Diğer hücre içi boyalar ile karşılaştırıldığında, S-1 7.5 10, nispeten yüksek bir pKa değerine sahiptir. asidik koşullarda, molekül protonlanır ve 488 nm veya daha uyarıldığı zaman 560 ve 600 nm arasında bir emisyon sinyali üretir. molekül daha alkalin koşullarında deprotone edildiğinde, emisyon dalga boyu 600 nm üzerindedir. Bu fluorofor konsantrasyonu ve hücre yapısı etkilenmez, bu iki dalga boyunda floresan yoğunlukları bir oran, daha fazla tek fluoresans ölçümleri daha güvenilir olduğu emisyon kayması gösterir. Isı-ölümlü (HK), Candida albicans, tercih edilmesine rağmen, daha büyük bir yüzey alanı daha tutarlı bir floresans okuma verir S-1, örneğin zimosan 14 olarak, bir antijene konjuge edilebilir.
Ayrıca (Şekil 3) 5 pH geçici değişiklikler incelemek için bu metodun bir modifikasyonu kullandık. Daha alkali fagozomların 14 başka bir yerde 15, 16, ve hücreleri için anlatılan şekilde sitosolik pH ölçümü için bu yöntem kolayca diğer hücre tipleri de uygulanabilir.
Protocol
Etik deyimi: Tüm hayvan çalışmaları lisansı ve İngiltere Home Office onayı ile yürütülmüştür. Bu araştırmada İnsan katılımı İnsan Araştırmaları Etik Ortak UCL / UCLH Komiteleri tarafından onaylandı. Tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay vermiştir.
C. albicans hazırlanması 1.
- Üreticinin talimatlarına göre YPD bir agar plakası üzerinde bir Candida diski (Malzeme Listesi bakınız) büyütün. Bir koloni seçin ve YPD çorbasının, 15 mL ekleyin. Suyu bulutlu (genellikle yaklaşık 2 gün veya yaklaşık / ml 9 1 x 10 üzerinde bir konsantrasyona) kadar 30 ° C ve 200 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe inkübe.
- Candida orta Spin ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 50 ml içinde tekrar süspansiyon. 10 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleyin. İki kez bu adımı yineleyin.
- Tüm boru s kadar 60 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosu içinde, PBS / Candida 50 ml ortamı içeren tüp yerleştirin1 saat boyunca ubmerged.
- Candida YPD bir agar plakası üzerine ısı ile öldürülmüş, çizgi bir örneğidir ve 30 ° C'de bir gece inkübe doğrulamak için. 5-9 ısı ile öldürülmüş (HK), Candida konsantrasyonu ayarlama 8 x 10 / ml Candida büyümeye bağlı olarak, ve ° C dondurucu içinde -20 1 ml alikotlar içinde muhafaza edin.
NOT: Bu protokol tüm hücre sayımları otomatik bir hücre sayacı kullanılarak yapılmıştır.
- Candida YPD bir agar plakası üzerine ısı ile öldürülmüş, çizgi bir örneğidir ve 30 ° C'de bir gece inkübe doğrulamak için. 5-9 ısı ile öldürülmüş (HK), Candida konsantrasyonu ayarlama 8 x 10 / ml Candida büyümeye bağlı olarak, ve ° C dondurucu içinde -20 1 ml alikotlar içinde muhafaza edin.
2. S-1 Kavrama (HK) Candida öldürülmüş ısıtmak için
- Yüksek dereceli dimetil sülfoksit, 100 uL (DMSO) içinde seyreltilmesi ile karboksi-S-1 süksinimidil ester (50 ug) bir kısım hazırlayın. Girdap iyice karıştırmak için.
- 15 ml bir tüp içinde 0.1 M sodyum bikarbonat (pH 8.3) içinde 1 x 10 8 HK Candida 1 mL hazırlayın.
- 100 uL karboksi-S-1, kabaca bir girdap 2.000 rpm (yüksek hıza ortamı) karıştırma sırasında HK Candida her seferinde bir damla ekleyin. alüminyum foi sarınboru etrafında L ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında bir silindir üzerine yerleştirin.
- Her biri 10 dakika için 2250 x g'de santrifüjleme ile HK Candida- S-1 (HkC-S-1) ile üç kez yıkanır. İlk iki yıkama için, 0.1 M sodyum bikarbonat (pH 8.3), 15 mL pelletini. Üçüncü yıkamadan sonra, dengeli tuz solüsyonu (BSS) tampon maddenin 1 mL'si içinde tekrar süspansiyon (Tablo 1 e bakınız).
- 100 uL'lik bölümler halinde tüplere HkC-S-1 süspansiyon aktarın ve -20 ° C'de saklayın.
Not: mümkünse düşük yüzey olarak, bağlayıcı malzeme ile kullanımı borular HkC-S-1 parçacıklar normal santrifüj tüpleri duvarına yapışabilir. - Opsonize HkC-S-1
- İnsan nötrofil için, eritilmiş 100 uL HkC-S-1 insan IgG serum 100 uL ilave edin.
- Fare nötrofiller, normal fare serumu 50 uL ekleyin ve fare Candida Bağışıklık serumunun 50 uL 5 uL 100 (HK Candida enjekte C57B6 farelerde üretilen)arasında HkC-S-1.
- 37 ° C'de bir ısı çalkalayıcı üzerinde karıştırın ve 60-90 dakika süre ile 1100 rpm ve daha sonra 2 saat için 4 ° C silindir üzerine.
- 1 dakika her biri için 17.200 x g'de santrifüjleme ile, BSS tamponu içinde üç kez yıkanır. BSS tamponu 100 uL içinde süspanse edin.
Nötrofiller 3. izolasyonu
- insan periferal kan nötrofillerinin için, sağlıklı bir donörün damardan delme ile kan 15 mL almak ve 1000 lU / ml heparin sodyum çözeltisi (heparin 60 uL kan / 10 mL) 90 uL ihtiva eden bir 20 ml şırınga içine yerleştirin.
- Bir pipet kullanarak, şırınga içine% 10 dekstran çözeltisinin 1.5 mL enjekte edilir. yavaşça 3 kez ters çevirin ve bankta dik duran bırakın.
- Kan saman renkli ve eritrositleri içeren bir alt tabaka olan bir üst ince beyaz tabaka tabaka ile, devre kabaca bölünmüş kadar, 30-60 dakika bekleyin.
- Dikkatli bir şekilde bir iğne içinden üst tabaka üzerinden itmek veya bir pipet ucu ile çıkarın. i koyna 15 ml tüp. Kırmızı tabakasının çıkartılması kaçının. 5 mL'lik bir pipet kullanılarak, yoğunluk gradyanlı ortamının 3-4 ml eklemek iki farklı tabaka elde etmek üzere ince beyaz tabaka olarak tüpün dibine (Malzeme listesi). 10 dakika boyunca 913 x g'de santrifüjleyin.
Not: kullanılarak fare nötrofiller (fare nötrofil izolasyonu için 17 referans bakın), bunun yerine kemik iliğinden yıkandığından hücre süspansiyonu kullanmaktadır. - kırmızı pelet geride bırakarak Süpernatantı dökün. Yavaşça girdap pelet rahatsız. Taneciğe damıtılmış otoklava H2O 7 mL ekleyin ve pelet tekrar süspansiyon 20 s için ters çevirin. 2x tuzlu 7 ml ekleyin ve kalan kırmızı kan hücrelerini parçalayan, karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve yaklaşık 4 x 10 6 / mL BSS tampon içinde tekrar süspansiyon pelet.
, Hücrelerin optimum mikroskopi için 1,5-6 x 10 6 arasındaki hücre süspansiyonu konsantrasyonunu tutmak: NOT
Slaytlar 4. hazırlanması
- 8 oyuklu mikroskopi plaka ön tedavi, oda sıcaklığında 40-60 dakika süre ile her bir poli-L-lizin, 200 uL (0.01% çözelti) ile (Malzeme listesi).
- Poli-L-lisin çıkarın (tekrar edilebilir) ve damıtılmış H2O 200 uL kuyular iki kere yıkayın
- her bir adım 3.6 de hazırlanan hücre süspansiyonu 200 uL ekleyin. 30-60 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Bir tüpe yüksek dereceli DMSO, 100 uL ilave edilerek 5- (ve 6-) -karboksi S-1 asetoksimetil (S-1-am) ester (50 mg) bir kısım hazırlayın. Girdap karıştırmak için. Kullanılmadığı zaman, -20 ° C'de saklayın.
- küçük bir tüp içinde, 1.7 ml BSS tampon eklemek ve S-1-AM, 20 uL. Girdap karıştırmak için.
- BSS tamponu 200 uL kuyular iki kere yıkayın, sonra S-1-AM çözeltisi ile tampon değiştirin. hafifçe pipetleme kuyunun dibine tutturulmuş hücrelerin tek tabaka rahatsız özenKuyular duvarları aşağı. en az 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- BSS tamponu 200 uL kuyular iki kere yıkayın. bir inhibitör test etmek için, BSS bir tamponda uygun bir ilaç "ana karışımı" oluşturur. inhibitör çözeltisi içinde kuyular iki kere yıkayın.
NOT: kontrol, ilaç taşıyıcı (örneğin, DMSO ya da etanol), aynı miktarda kullanımı ayrıca inhibitör için kullanılmıştır emin olun. Çinko klorür etkisini test ise çinko fosfat ile çökelirken, (HEPES, tek başına tampon vazifesi görür) PO4 KH 2 eksik BSS tampon kullanın. - 5 amplitüd um yaklaşık 3 s opsonize HkC-S-1 (bölüm 6.2) sonikasyon. Her kuyuya 10 mcL ekleyin. fagositoz anlık görüntüler için görüntülenmek üzere hücreler hazır hale fagositoz izin vermek için 15-20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe plakası.
5. Konfokal mikroskopi
- konfokal mikroskop kullanılarak, çok th lazer dalga boyu ayarlamahücre 555 nm'de uyarılmış ve emisyon iki kanal veya detektörler tarafından tespit edilir: 560-600 nm ve 600 nm üzerinde.
NOT: Belirli mikroskop parametreleri, her mikroskop için farklıdır ve gerekecektir araştırmacı tarafından optimize edilecek. - yağ ile 63X objektif kullanarak hücrelerin görüntüle. merkez karo görmek için sürekli ayarında bir kiremit-tarama resmi kullanın. , Odaklama ve lazerin yoğunluğu ve iki kanal kazancı floresans yoğunluğu ve detektör kanallarının kazanç Ayarlama ile görüntü optimize etmek.
- iki kanalı görüntülemek için ayarları kullanarak görüntüyü Böl; sitoplazma veya vaküol flüoresan yoğunluğunun doyum olup olmadığını kontrol edin. Doygunluk kırmızı noktalar olarak görünür. Orada kırmızı noktalar minimum sayıdır, ama hücreler ve fagozomların açıkça görülebilecek kadar parlak olacak şekilde lazer yoğunluğunu azaltın.
- Memnun kaldığınızda, tıklayın "Deneme başlatın." Bir 9-kiremit tarama görüntü oluşturulur. Karmaşık bir dosya tarafından tavsiye edilen şekilde görüntü kaydetmeİki kanal (JPEG veya tiff olmayan) bir bileşik görüntüsünü içeren bir yazılım.
6. Kalibrasyon Deneyler
- Tek başına Candida ile pH standart eğri oluşturmak.
- Tablo 1 'deki gibi, 13,0, pH 3,0 ila tampon hazırlayın.
- HkC-S-1, bir kısım (100 uL) al. 17,200 x g, 1 dakika için Spin. atanan tampon 500 uL içinde süspanse edin.
- düşük bir pH aralığında başlayarak, bir ila süspansiyonu ekleyin (aşama 4,2) da ön-işlemden geçirildi. 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtılmış sahnede konfokal mikroskop slayt yerleştirin.
- 10 dakika floresan her dakika kaydedin. Her bir tampon için tekrarlayın.
- Saponin standart eğrisi.
- 1 x 10 7 insan nötrofilleri 5 izole etmek ve düşük pH tamponu, 1 mL bunları tekrar süspansiyon.
- p ölçmek için bölüm 4'te tarif edilen yöntem takipnötrofillerde hagosomal pH değerine sahiptir.
- 20 dakika boyunca, Candida süspansiyonu ile inkübe edildikten sonra,% 0.3 saponin eklemek (% 10 stokunun 15 uL bir ön-muamele () aşama 4,2 çukur) çanak ve daha sonra 37 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. 10 dakika Görüntüyü her dakikanızı ayırın. Her bir tampon için tekrarlayın.
- Tekniği 5, 18, 19 + / nigericin Yüksek K kullanılarak Sitosolik pH standart eğriler.
- 13,0 pH 4,0, Tablo 1 'de tarif edilen tamponlar hazırlayın.
- Önceden işlenmiş oyuklarda sadece nötrofiller bırakarak adımları 4,1-4,7 takip - her bir farklı bir tampon yer. 37 ° C'ye kadar ısıtıldı aşamaya slayt ekleyin ve floresan 10 dakika boyunca her dakika kaydedin.
- sitosolik pH dış çözelti ile stabilize etmek için belli bir zaman alabilir, ancak bu noktadan sonra, S-1 oran değeri olur: Notsabiti. her deneyde hücre dışı HkC-S-1 Ölçüm eklenen herhangi bir inhibitörleri S-1 yayılan floresan müdahale veya tampon pH değerini etkilemez kontrol etmek için bir kontrol olarak hizmet edebilir.
7. Görüntü Analizi
NOT: Burada, görüntü analizi (floresan kantitasyonu) özgür yazılım ImageJ kullanılarak ilişkin talimatlar verilir. ImageJ kullanılması tavsiye edilir.
- Indirin ve geliştirici talimatlara göre 1.46r> ImageJ sürümünü yüklemek (https://imagej.nih.gov/ij/). denilen bu protokol ile ekli ek kod dosyasını yükleme “Phagosomal ölçümü.”
- Resmi Aç J araç çubuğu üzerine analiz için seçilen görüntü dosyası yüklemek ve. iki kanalı birleştirmek için Resim> Renk> Kompozit yap kullanın.
- Sonuçları saklamak için bir dosya seçmek için sağ tıklayın.
- araç çubuğundaki çizgi aracını tıklayın ve # için & genişliğini arttırmak için çift tıklayın34; 2 ".
- Bir fagozomun genişliği boyunca bir çizgi çizin ve ardından "tedbir pH" sağ tıklayın. iki kanal ortalama yoğunluğu elde edilir ve bunların oranları ImageJ kod dosyası tarafından otomatik olarak hesaplanır.
- ölçümleri bitirdikten sonra, seçme sağ tıklayıp "dosyayı kaydedin."
- fagosom alanını ölçmek için, alanı çevresinde serbest elden çizmek için bir araç çubuğu boyunca dördüncü simgesini kullanın. seçmek için sağ tıklayın "ölçü alanı."
NOT: Sonuçlar kaydedilir ve bir günlük dosyası seçilen dizinde oluşturulur. Sonuçlar E-tabloyu, R ya da eşdeğer bir yazılımı kullanarak işlenebilir. pH floresan oranı arasındaki ilişki yaklaşık olarak sigmoidal ve ImageJ analiz tarafından oluşturulan oran değerleri genel bir lojistik veya sigmoid fonksiyonu ya da doğrusal ya da kübik eğri interpolasyonla kullanılarak pH dönüştürülebilir. - sitoplazma boyunca bir çizgi çizin, sitoplazmaya ölçmek için ve “önlem pH sağ tıklayın”.
Representative Results
Şekil 1, değişen phagosomal ortamları göstermek için, farklı kökenlerden gelen nötrofillerin anlık sunulur. nicel analizini kolaylaştırmak için, hücrelerin uygun bir sayısı ile kuyu tohum önemlidir: çok doğru bir kapalı fagozomların görüntülemek için güçleştirir hücrelerin birbirleri üzerine tabaka neden olur; Çok az irade, elbette, her nötrofil fagosite olmayacak özellikle de, daha az sonuç sağlar. Şekil 2, aşırı doymuş bir görüntü olduğu; Maksimum floresan tespit edildiğini nerede kırmızı noktalar göstermek - bu iki kanal arasında görüntü bölme (Malzeme Listesinde veya eşdeğeri tavsiye mikroskop yazılımı kullanılarak) tarafından değerlendirilebilir. Bu lazerin yoğunluğunun azaltılması ile karşılaştırılabilir. Çeşitli tampon sistemleri kullanılarak kalibrasyon eğrileri Levine ve arkadaşları uyarlanmıştır, Şekil 3'te gösterilmektedir. 5. </ Sup>. Hata çubukları okumaları arasındaki floresans bazı değişiklikler olduğunu göstermektedir. Şekil 4, phagosomal pH ve alanı ile ilgili veri sunulabilir bir örnek verir. Bu yaklaşım, her bir ölçüm aşırı döşeme Boxplot ile görüntülenmesine olanak sağlar. Bununla birlikte, veriler aynı zamanda bir histogram çubuk grafik olarak görüntülenebilir.
Şekil 1: insan ve farelerden alınan nötrofillerin Uygun anlık görüntüler. sağında için pH değerine karşılık gelen S-1-lekeli fagozomların yaklaşık renk ve görülebilir bir kalitatif bir anahtardır. kırmızı daha alkalikliğini gösterir iken sarı renkli, daha asiditeyi gösterir. / -, - (A) Hvcn1 gösteren fare kemik iliği nötrofiller fagositoz 20 dakika sonra. fagozomların çok kırmızı alkalin ve şişmiş görünür. sağ alt kısmında kırmızı okbir hücre içi Candida görüntü noktaları, bir hücre dışı parçacığa sol üst noktalarında ok ise. (B) Candida yutan yabani tip fare kemik iliği nötrofilleri göstermektedir; - / - hücrelerinin de Hvcn1 çok daha az alkalin. (C), fagositoz sonra aynı noktada insan periferal kan nötrofilleri gösterir. Bunlar fare yabanıl tipteki hücrelerden göre biraz daha alkali görünür, ancak fagozomların hala Hcvn1 kadar büyük ve kırmızı değildir - / - hücrelerinde. (D) 5 uM difenilen iyodonyum (DPI) varlığında, Candida fagosite insan nötrofilleri gösterir. Tüm fagozomların 6 ya da daha az bir pH'a sahip olan, çok asidik olan; İlaç, NADPH oksidaz inhibe yüzden telafi edici iyon hareketi vardır. Fagozomun için sigorta asidik granüllerden serbest proton inci V-ATPaz asidik pH 20 ve daha fazla toplanmasına nedenDPI 9 ile işlenmesi üzerine, e phagosomal membran. Sitoplazma diğer koşullardan hücreleri ile karşılaştırıldığında daha fazla alkalin görüntülenir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Aşırı doyma Hvcn1 arasında - / - fare kemik iliği nötrofil. Floresans veri aşırı doymuş olan analiz görüntülerden hariç tutmak için önemlidir. Bölüm 5.3'de açıklandığı gibi, kompozit görüntü bireysel olarak sunulan her iki kanallı iki resim (sol üst, kırmızı ok) ayrılır. Bu yazılım, aralık göstergesi (alt kırmızı sol ok) ile kontrol edilir, daha sonra aşırı doymuş olan herhangi bir piksel, parlak kırmızı. aşırı doygunluk her iki kanalda da mevcut (1 ve 2) bulunmaktadır. bir magnifBazı hücrelerin ication ve hücre dışı Candida oklar etkilenen bölgelere bakacak şekilde, sağ alt kısmında gösterilir. bu noktaları analiz sahte oranlı metrik ölçüme yol açacak. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: pH ölçümleri S-1 floresan oranları dönüştürülmesi için standart kalibrasyon eğrileri. Hücreler saponin ( "Saponin") ile geçirgen hale olduğunda ve ( "Tris" olarak adlandırılan), tek başına farklı tamponlar Candida için standart eğriler, S-1 hücre (fagozomun ve hücre dışı iç ve dış okuma gösteren, çok benzerdir ortamı) ile karşılaştırılabilir. hata çubukları ± SD ortalamasını temsil etmektedir. i test edildiği zaman, S-1 oranı / pH eğrisi kısalırn, görüntü analizi de dikkate alınmalıdır sitoplazma ( "Sitoplazma"). Bu şekil, Levine ve arkadaşları modifiye edilmiştir. 5. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: phagosomal pH ve alanın miktarının belirlenmesi. Bu şekil, veri sunumunun bir örneğini sunmaktadır. Phagosomal oranı ve mukabil pH A ile gösterilmektedir (- / - Hvcn1 fare kemik iliği nötrofiller), A: B: grafikleri programlama yazılımı R.A kullanılarak oluşturulmuştur vahşi tipli fare kemik iliği nötrofiller, C: insan periferal kan nötrofilleri, ve D: insan 5 uM, n = DPI 3/300 ile nötrofiller. Bireysel ölçümler bir medi ile boxplot kaplayan ile, küçük kareler olarak gösterilmektedirBir ve çeyrek değerler aralığı. Kırmızı çubuk ortalamayı temsil eder. Şekil 1 'de resimlerde görüldüğü gibi, Hvcn1 - / - hücreleri, vahşi tipli fare ve insan nötrofil ile karşılaştırıldığında çok alkali fagozomların sahiptir. Ayrıca daha büyük bir phagosomal alanı (Şekil 4B, n = 3/300) sahiptir. DPI ile inkübe insan nötrofil çok asitli ve küçük fagozomların varken İnsan nötrofil fagozomların, vahşi tipli fare nötrofiller biraz daha fazla alkali ve daha büyüktür. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Dengelenmiş tuz solüsyonu (BSS) tamponu | |||
| NaCl | 156 mM | ||
| KCl | 3 mM | ||
| MgSO 4 | 2 mM | ||
| KH2 PO4 | 1.25 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| glikoz | 10 mM | ||
| Hepes | 10 mM | ||
| NaOH veya HCI ile pH 7.4 | |||
| YPD suyu | |||
| YPD suyu | 50 gram | ||
| Arıtılmış su | 1 L'lik | ||
| 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav | |||
| YPD agar için: otoklavlama 15 g eklemeden önce / L ağar | |||
| % 10 dekstran çözeltisi | |||
| Dekstran klinik dereceli | 50 gram | ||
| NaCl | <td>4.5 gr | ||
| Arıtılmış su | 500 mL | ||
| 15 dakika boyunca 121 ° C'de bir cam şişe ve otoklav ekle | |||
| 2x Tuzlu Çözelti | |||
| NaCl | 18 g | ||
| Arıtılmış su | 1 L'lik | ||
| 15 dakika boyunca 121 ° C'de bir cam şişe ve otoklav ekle | |||
| % 10 Saponin stok | |||
| BSS tamponu | 50 ml | ||
| Saponin | 5 g | ||
| 37 ° C'ye kadar ısı BSS tamponu, saponin ilave edilir ve karıştırılır. | |||
| 4 ° C 'de koruyucu olarak% 0.1 sodyum azid, depo karışımı ekleyin. | </ Tr>|||
| Kalibrasyon tamponlar | |||
| Candida standart eğri | |||
| Öncelikle her tamponun 0.15 M stok makyaj | |||
| 0.15 M NaCl solüsyonu Makyaj | |||
| 15 mL nihai hacim: 5 ml + 10 ml 0.15 M NaCI çözeltisi, istenen tampon çözeltisi, 0.15 M | |||
| pH değeri 3 | 100 mM NaCI | 50 mM glisin | |
| pH değeri 4 | 100 mM NaCI | 50 mM asetat | |
| pH değeri 5 | 100 mM NaCI | 50 mM asetat | |
| pH 6 | 100 mM NaCI | 50 mM asetat | |
| pH değeri 7 | 100 mM NaCI | 50 mM Tris | |
| pH 8 | 100 mM NaCI | 50 mM Tris | |
| pH 9 | 100 mM NaCI | 50 mM Tris | |
| pH değeri 10 | 100 mM NaCI | 50 mM glisin | |
| pH değeri 11 | 100 mM NaCI | 50 mM fosfat | |
| pH değeri 12 | 100 mM NaCI | 50 mM fosfat | |
| pH değeri 13 | 100 mM NaCI | 50 mM fosfat | |
| Sitosolik standart eğri | |||
| Daha önce 0.15 M stok tampon çözümler kullanın | |||
| 0.15 M KCl çözeltisi Makyaj | |||
| 15 mL nihai hacim: 5 ml istenen tamponu, 10 mL, 0.15 M KCI çözeltisi 0.15M | |||
| Etanol nigerisin 10 mM stok, her bir nihai hacim çözeltiye 15 uL ilave | |||
| pH değeri 3 | 100 mM KCI 50 mM glisin | 10 uM nigericin | |
| pH değeri 4 | 100 mM KCI | 50 mM asetat | 10 uM nigericin |
| pH değeri 5 | 100 mM KCI | 50 mM asetat | 10 uM nigericin |
| pH 6 | 100 mM KCI | 50 mM asetat | 10 uM nigericin |
| pH değeri 7 | 100 mM KCI | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 8 | 100 mM KCI | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 9 | 100 mM KCI | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH değeri 10 | 100 mM KCI | 50 mM glisin | 10 uM nigericin |
| pH değeri 11 | 100 mM KCI | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin |
| pH değeri 12 100 mM KCI | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin | |
| pH değeri 13 | 100 mM KCI | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin |
| HCI veya NaOH ile pH tüm kalibrasyon çözeltileri | |||
Tablo 1: tamponların bileşim. Bu tablo, protokolünde kullanılan farklı tamponlar uygun bileşimleri tarif etmektedir.
Ek kod dosyası. Bu dosya görüntü analizi için gerekli olan AP Levine tarafından yazılan makrolar, bir dizi içerir. Yazarlar, bu kodu kullanarak ilişkili herhangi sorguları adrese denemek için mutlu olurdu. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Discussion
Uygun reaktifler, mikroskop ayarları ve kalibrasyon deneyleri ayarlandıktan sonra, bu yöntem gerçekleştirmek için oldukça basittir. Kritik adımlar şunlardır: S-1 Candida etiketleme kalibre ve görüntü analiz, boyanın herhangi bir aşırı yükleme olduğundan emin olmak için.
S-1, nötrofilin 21 için özellikle önemlidir, fakat belirli hücre tipleri kullanılmasını kısıtlar daha alkalik pH ortamlarında uygun bir reaktif,. Makrofaj fagozomların, SNARF-4, ya da S-4 daha fazla asidik ortamlarda, için, çünkü bunun düşük pKa değeri 22 daha uygundur. Ayrıca, daha doğru bir sitoplazmik okumaları için, floresans oranları pH 6'nın altında platoya (Şekil 3) başlaması gösteren S-1 için bir standart eğri olarak, S-4 kullanımı daha iyidir. Diğer boyalar, örneğin, 2' , 7'-bis- (2-karboksietil) -5- (ve-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) ya da pHrodo Kırmızı da cont daha uygun olabilirasidik olması beklenen dahili. Yine sitoplazma boyama hala Candida içeren fagozomların doğru tanımlanması için gereklidir.
Bir phagosomal pH göstergesi önemli bir özelliği geri dönüşü olmayan reaktif phagosomal ortamı tarafından değişmez olmasıdır. S-1 nötrofil ortamda dayanıklı olduğu görülmektedir. Bu Levine ve diğerleri tarafından gösterilmiştir. - / - nötrofil 5, bir Hvcn1 fagositozunu ve bir S-1-işaretli Candida parçacık daha sonra tahliye edilmesini göstermektedir (referans 5 Ek video 4). fagosite zaman, partikül (alkali pH nötr) kırmızı, sarı / turuncu döner, fakat partikül nötrofil tarafından serbest bırakılır, bunun orijinal rengine geri döner.
S-1 kullanımıyla ilgili sınırlamalar bazı bahsetmek önemlidir. Bu boya rasyometrik ÖLÇÜMÜ sağlayan iki emisyon spektrumunu sahip olmasıkullanan akan bir avantajdır, ancak uzman ekipman görüntüleri elde etmek için gerekli olan; Deneylerde kullanılan mikroskop iki resim aynı anda ya da önemsiz bir zaman gecikmesiyle kayıt gerekir. Yazarlar, bu protokol çalışırken araştırmacı konfokal mikroskopi kullanılarak tecrübeye sahip ya da eğitimli profesyonel erişimi olduğunu varsayalım. onlar her mikroskop için farklıdır ve araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekecektir gibi tüm spesifik mikroskop parametreleri listeler olamaz. boya hücre sitoplazmasına yayılmasını sağlayan S-1 konjüge asetoksimetil ester, flüoresan molekül oluşturmak üzere hücre sitoplazmasında spesifik olmayan esterazlarla parçalanır. Alkali fosfataz gibi esterazlar, hücre kültürü ortamı olarak desteklenmesi için kullanılır insan serumu ve fetal sığır serumu içinde mevcut bulunmaktadır. Bu duruma göre, hücreler, G-1-AM (bakınız bölüm 4.5) ile yüklü olan orta serum içermemelidir. Daha besin Ric gerektiren hücreleri kullanılarak, bu da zor olabilirh ortamı bu protokol boyunca kullanılan dengelenmiş tuz çözeltisi daha onları sürdürmek için. Benzer bir şekilde, örneğin fenol kırmızı gibi diğer floresan ortam bileşenleri, S-1 ölçümlerine müdahale edebilir.
Şekil 3 'de hata çubukları, her pH değerinde oranı ölçümleri bazı değişiklikler olduğunu göstermektedir. Her bir deney tekrarları bir uygun sayıda (en az n = 3) ve her biri tek bir deneyde çok sayıda bireysel ölçüm arası koful varyasyonunu yenmek için ihtiyaç vardır. En az 100 her bir durum için fagozomların ve sadece bir Candida içeren görünen kadar phagosomal alanlarında pH ölçümü böylece tavsiye edilir. Fagozomların tamamen (yani, bu tamamen sitoplazma ile çevrili) bir Candida parçacık sardı sahip olanlar olmalıdır miktar tayini için ölçülecek. kantitatif için hücreler / fagozomların seçiminde kasıtsız önyargılara karşı azaltmak için, tüm analizler sırasında yapılmalıdırdeneysel koşullara kör.
Burada, bir yoğunluk gradyanı yoluyla plazma tabakanın ardından santrifüj tam kan dekstran sedimantasyonu ile nötrofillerin izolasyonunu tarif eder. hızlı ve verimli bir şekilde nötrofil saf (>% 95) populasyonunu gibi diğer yoğunluk gradyan formüller ya da antikor ya da manyetik ile uzman kitleri kullanılarak nötrofiller negatif seçim yoluyla tam kan merkezkaç olarak kullanılabilen diğer yöntemler vardır, ancak biz, bu tekniği kullanmak boncuklar. Ancak, ikinci rutin nötrofiller izole çoğu grup için pahalı olabilir. Diğer araştırmacılar, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ya da asit sitrat, sodyum (ACD) ile daha alışkın oysa Ayrıca, kan toplama tüpü içinde pıhtılaşma önleyici heparin kullanılır. Seçim için pek çok farklı yöntem vardır gibi, araştırmacının kişisel tercihinize kalmış.
Ayrıca,nötrofilleri izole edilmesi ve manipüle zaman aşırı aktivasyonu engellemek için bir dikkatle ele alınmalıdır. Önlem adımlar şunları içerir: tek bir plastik ürünleri kullanılarak, bir cam; filtre-sterilize kontamine endotoksin ayırma tüm tamponları; ne zaman iplik nötrofiller santrifüj aşırı titreşimi önlemek dengeli olduğundan emin olun; Zaman nötrofil santrifüj işleminden sonra topak kalır mümkün olduğu kadar azaltmak; Birden fazla, 5 x 10 6 / mL çözelti nötrofilleri muhafaza etmez; ve tecrit sonra mümkün olan en kısa sürede denemeyi gerçekleştirmek.
Kalibrasyon adımları için tarif edildiği gibi bu yöntem, mikroskop, 37 ° C'ye kadar ısıtılmış bir sahne seti kullanılarak ve aynı pozisyonda bir kez, her 30-60 s anlık alınarak zamanla pH'ı ve phagosomal alanı değişiklikleri ölçmek için adapte edilebilir. Aynı zamanda, teorik olarak, 96 gözlü plakalar içinde daha yüksek verimli deneyler için uyarlanabilir ve Akış sistometri deneyleri için, burada S-1 canpH indikatörü 23 olarak kullanılabilir. Ancak bu ortamlarda, bireysel hücre aktivitesi üzerine vurgu hücre popülasyonu üzerinde daha global bir etkisi ile değiştirilir.
Bu yöntem, bireysel araştırmacılar kendi ilgi alanı uyacak şekilde adapte edebileceğiniz bunun üzerine nispeten basit bir deney düzeneği sağlamayı amaçlamaktadır. Araştırmacılar, aynı zamanda, örneğin, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu için, diğer iyonlar hareketinin ölçülmesine iken nötrofil phagosomal pH ve keşfetmek isteyebilir. Örneğin Indo-1, aynı zamanda, 400 ve 475 nm 24 ° C'da iki emisyon spektrumunu olduğu gibi konfokal mikroskopi için hazır çok sayıda floresan Ca2 + göstergeler vardır. Bu emisyon dalga boylarında, S-1 emisyon spektrumu ile üst üste, ama eksitasyon dalga boyu hücrelere zarar olabilir spektrumu, bir ultraviyole (UV) ucunda, bir UV lazer tüm mikroskoplar olağan değildir. Farklı göstergelerin kapsamlı bir incelemesiölçmek hücre içi kalsiyum akısı Takahashi ve arkadaşları tarafından kaplanır. 25 ve Hillson ve diğ. 26.
Sonuç olarak, Nunes ve diğerleri gibi farklı floresan boyalar kullanarak phagosomal pH ölçmek için uygun başka yöntemler de vardır. 13 gibi diğer gruplar 27, 28 gösterilmiştir. Diğer araştırmacılar da sitosolik pH 29 veya phagosomal pH 14 ölçmek için S-1 kullanılmıştır. - / - Bununla birlikte, bu protokol, aynı zamanda phagosomal kesit alanı değişiklikleri gözlemlemek ve vahşi tipte ve Hvcn1 ayırt fırsat sağlar sitozol ve fagozomun hem de pH, ölçme benzersizdir fare nötrofiller ile ve olmadan insan nötrofil NADPH oksidaz çalışma.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma nazik Wellcome Trust, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi ve Irwin Joffe Memorial Kardeşliği tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
| YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
| Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
| Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
| SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
| Vivaglobin human IgG 160 mg/mL solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
| Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
| Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
| Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm) | |
| Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
| Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |
References
- Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).
- Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
- Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).
- Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).
- Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).
- Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
- Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
- Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).
- Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).
- Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
- Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).
- Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).
- Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
- Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).
- Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24 (6), 551-556 (1993).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79 (4), (1999).
- Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
- Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).
- Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).
- Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).
