Summary
توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة لقياس درجة الحموضة phagosomal والمنطقة وكذلك درجة الحموضة هيولي العدلات الإنسان والفأر باستخدام مؤشر ratiometric seminaphthorhodafluor (SNARF) -1، أو S-1. ويتحقق ذلك باستخدام خلايا الحية متحد البؤر المجهري مضان وتحليل الصور.
Abstract
العدلات حاسمة لاستضافة الدفاع الفطري، وبالتالي تشكل مجالا مهما من مجالات البحوث الطبية. ويبلوع، حجرة داخل الخلايا حيث قتل وهضم الجزيئات اجتاحت تجري، هي الساحة الرئيسية للالعدلات قتل الممرض الذي يتطلب تنظيم محكم. Phagosomal الرقم الهيدروجيني هو جانب واحد التي يتم التحكم بعناية، بدوره ينظم نشاط الأنزيم البروتيني المضادة للميكروبات. وقد استخدمت العديد من الأصباغ الحساسة درجة الحموضة الفلورسنت لتصور البيئة phagosomal. S-1 لديها العديد من المزايا أكثر من الأصباغ الحساسة درجة الحموضة الأخرى، بما في ذلك أطياف لها مزدوج الانبعاثات، ومقاومته للصور تبيض، وارتفاع الباكاف الحمضية لها. باستخدام هذه الطريقة، لقد أثبتنا أن يبلوع العدلات قلوية غير عادي بالمقارنة مع البالعات الأخرى. باستخدام الإقتران البيوكيميائية مختلفة من الصبغة، ويبلوع يمكن المرسومة من السيتوبلازم ذلك أن التغيرات في حجم وشكل يبلوع يمكن تقييمها. وهذا ما يسمح وأو زيادة رصد حركة الأيونية.
Introduction
والعدلة هي الأكثر وفرة الخلايا المناعية الفطرية في الجسم. تتكون وظيفتها الرئيسية على القيام بدوريات في مجرى الدم وتجتاح وهضم الجزيئات الأجنبية التي قد تواجهها في عملية تعرف باسم البلعمة 1 و 2. وتدهورت الجسيمات في حجرة داخل الخلايا تسمى يبلوع. تفعيل أوكسيديز العدلات NADPH، وNOX2 شكل الإسوي، يبدأ سلسلة من التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تبلغ أوجها في وفاة الممرض. مفارز البروتين NOX2 المضي قدما لتشكيل مجمع سلسلة نقل الإلكترون في الغشاء phagosomal 3. بمجرد تفعيلها، فإنه ينقل الإلكترونات من NADPH عبر الغشاء إلى الأكسجين الجزيئي داخل يبلوع، وتنتج الأنيونات الفائق وأنواع الاكسجين التفاعلية أبعد. وهذا ما يعرف انفجار في الجهاز التنفسي، ويعتقد أن تكون ضرورية لقتل الميكروبات كفاءة والهضم 2 4 و 5. هذه القناة تسمح للحركة سلبية من البروتونات أسفل التدرج الكهروكيميائية بهم من العصارة الخلوية في يبلوع. وينعكس تركيز بروتون من درجة الحموضة، وذلك لمستوى معين من النشاط أوكسيديز، وقياس درجة الحموضة في يبلوع يمكن أن توفر معلومات عن مشاركة النسبية للمسارات PROTONIC وغير PROTONIC في تعويض مقابل.
ويبلوع العدلات البشري لديه درجة الحموضة القلوية ما يقرب من 8.5 لمدة 20-30 دقيقة بعد البلعمة 5. وهذا يعني وجود قنوات غير بروتون أيون إضافية في أكاسيد النيتروجين2 الناجم عن تعويض تهمة، والانصهار، والإفراج عن محتويات الحبيبات الحمضية والتعويض الوحيد عن طريق HVCN1 سوف تحافظ على بيئة حمضية، على النقيض من تلك التي لوحظت. حركة الأيونات لتعويض هذه الشحنة السالبة يمكن أيضا ممارسة التغيرات في حجم يبلوع عبر التناضح. وقد تكون هذه الأيونات الموجودة في العدلات بتركيزات عالية الفسيولوجية: وقد ثبت أيونات البوتاسيوم للانتقال إلى يبلوع 6، والحركة الأيونية كلوريد هو مرشح آخر مهم لوظيفة العدلات 7.
تنظيم درجة الحموضة في يبلوع أمر حيوي لنشاط الأنزيم البروتيني المضادة للميكروبات 5. يبدو الميلوبيروكسيديز (MPO) أن يكون النشاط الأمثل في درجة الحموضة 6، في حين G كاتيبسين والإيلاستاز، والمستويات المثلى هي درجة الحموضة 7-9 ودرجة الحموضة 8-10، على التوالي 5. ولذلك، تغيير عابر في درجة الحموضة phagosomal قد توفر منافذ النشاط للإنزيمات مختلفة لمتعةction. فهم كيف تشارك درجة الحموضة في قتل الجراثيم العدلات قد تقدم معلومات مفيدة لتصميم العوامل الميكروبية رواية-زيادة العدلات.
ويبلوع العدلة هي بيئة شديدة التفاعل. وهذا يجعل من الصعب إجراء تقييم دقيق درجة الحموضة، لأن الأصباغ قد تتأكسد بسهولة، مما يؤدي إلى التحف الفنية. تاريخيا، كان ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) صبغة الاختيار لقياس درجة الحموضة داخل الخلايا 8 و 9. ومع ذلك، هناك بعض العيوب لاستخدامه في قياس العدلات phagosomal درجة الحموضة. أنه يحتوي على الباكاف الحمضية 6.4 10، وهذا يعني أنه لا يمكن إلا أن بدقة استخدامها لتقييم مستويات الحموضة 5-7،5 8، كما التشبع في درجة الحموضة <8 11. وبما أن درجة الحموضة العدلات phagosomal يمكن أن تصبح أكثر بكثير قلوية 5، FITC لا يمكن التقاط مجموعة كاملة من التغييرات الرقم الهيدروجيني المحتملة. A signifi المزيدمشكلة غير قادر مع FITC في سياق العدلات هي أن يعتقد أن photobleached من MPO 12. المانع MPO، أزيد الصوديوم، ويمكن استخدامها للحد من photobleaching من 13، ولكن ثبت أن أزيد الصوديوم يقلل بشكل مباشر على درجة الحموضة phagosomal بطريقة MPO مستقلة وبالتالي فهو غير مناسب للاستخدام في مثل هذه المقايسات 5.
مقارنة الأصباغ الخلايا الأخرى، S-1 لديه الباكاف الحمضية عالية نسبيا من 7،5 10. في الظروف الحمضية، هو جزيء البروتونية وتنتج إشارة الانبعاثات بين 560 و 600 نانومتر عندما متحمس في 488 نانومتر أو أعلى. عند deprotonated جزيء في ظروف أكثر قلوية، والطول الموجي انبعاث أكثر من 600 نانومتر. وهناك نسبة من شدة مضان في هذه الموجات اثنين يشير إلى تحول الانبعاثات، والتي هي أكثر موثوق من القياسات مضان واحدة، كما أنه لا يتأثر تركيز fluorophore وبنية الخلية. S-1 يمكن مترافق إلى مادة مولدة، مثل زيموزان 14، على الرغم من قتلوا الحرارة ويفضل (HK) المبيضات البيض، حيث أن مساحة سطح أكبر يعطي القراءة مضان أكثر اتساقا.
وقد استخدمنا أيضا تعديل هذا الأسلوب لدراسة التغيرات الزمنية في الرقم الهيدروجيني (الشكل 3) 5. هذه الطريقة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي يمكن تطبيقها بسهولة إلى أنواع أخرى من الخلايا، كما هو موضح في أماكن أخرى 15 و 16، والخلايا مع المزيد من جسم بلعمي القلوية 14.
Protocol
بيان الأخلاق: أجريت جميع الأعمال الحيوان والترخيص والموافقة من وزارة الداخلية المملكة المتحدة. وقد وافق مشاركة الإنسان في هذا البحث من قبل لجان / UCLH UCL المشتركة لأخلاقيات البحوث الإنسان. قدم كل المشاركين الموافقة المسبقة.
1. إعداد C. المبيضة البيضاء
- تنمو قرص المبيضات (انظر قائمة المواد) على لوحة YPD أجار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. اختيار مستعمرة وإضافته إلى 15 مل من YPD مرق. احتضان في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى المرق هو غائم (عادة حوالي 2 أيام، أو إلى تركيز ما يقرب من أكثر من 1 × 10 9 / مل).
- تدور باستمرار المتوسط المبيضات و resuspend في 50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- وضع أنبوب يحتوي على 50 مل من PBS / المبيضات المتوسطة في حمام مائي مسخن الى 60 درجة مئوية بحيث أنبوب كله الصورةubmerged لمدة 1 ساعة.
- للتأكد من أن المبيضات هي قتلوا حرارة، خط عينة على طبق من ذهب YPD أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. ضبط تركيز (HK) المبيضات قتلوا الحرارة إلى 5-9 × 10 8 / مل، اعتمادا على نمو المبيضات، وتخزينها في 1 مليلتر مأخوذة في الثلاجة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: تم تنفيذ جميع التهم خلية في هذا البروتوكول باستخدام عداد الخلية الآلي.
- للتأكد من أن المبيضات هي قتلوا حرارة، خط عينة على طبق من ذهب YPD أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. ضبط تركيز (HK) المبيضات قتلوا الحرارة إلى 5-9 × 10 8 / مل، اعتمادا على نمو المبيضات، وتخزينها في 1 مليلتر مأخوذة في الثلاجة -20 درجة مئوية.
2. S-1 اقتران للحرارة، قتل (HK) المبيضات
- إعداد قسامة من كربوكسي-S-1 succinimidyl استر (50 ميكروغرام) من خلال تمييع في 100 ميليلتر من الدرجة العالية ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). دوامة جيدا لخلط.
- إعداد 1 مل من 1 × 10 8 HK المبيضات في 0.1 M بيكربونات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.3) في أنبوب 15 مل.
- إضافة 100 ميكرولتر من كربوكسي-S-1 قطرة واحدة في وقت لالمبيضات HK حين خلط في دوامة بنحو 2000 دورة في الدقيقة (متوسطة إلى عالية السرعة). التفاف حرية المعلومات الألومنيومل حول الأنبوب وضعه على الأسطوانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- غسل HK Candida- S-1 (HKC-S-1) ثلاث مرات من قبل الطرد المركزي في 2250 x ج لمدة 10 دقيقة لكل منهما. ليغسل الأولين، إعادة تعليق بيليه في 15 مل من 0.1 M بيكربونات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.3). بعد غسل الثالث، إعادة تعليق في 1 مل من العازلة متوازن محلول الملح (BSS) (انظر الجدول 1).
- نقل HKC-S-1 تعليق في أنابيب في 100 مكل وتخزينها في -20 ° C.
ملاحظة: استخدام الأنابيب مع سطح منخفض مادة ملزمة، إن أمكن، كما HKC-S-1 الجسيمات يمكن أن تلتصق على الجدار من أنابيب الطرد المركزي العادية. - يستطهي HKC-S-1
- لالعدلات الإنسان، إضافة 100 ميكرولتر من المصل مفتش الإنسان في 100 ميكرولتر من إذابة HKC-S-1.
- لالعدلات الماوس، إضافة 50 ميكرولتر من مصل الفأر العادي و 50 ميكرولتر من الماوس المبيضات المصل المناعي (ولدت من الفئران C57B6 حقن HK المبيضات) 5-100 ميكرولترمن HKC-S-1.
- مزجها على نار-شاكر عند 37 درجة مئوية و 1،100 دورة في الدقيقة ل60-90 دقيقة، ثم على 4 ° C بكرة لمدة 2 ساعة.
- يغسل ثلاث مرات في المخزن BSS بواسطة الطرد المركزي في 17200 x ج لمدة 1 دقيقة لكل منهما. resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة BSS.
3. عزل العدلات
- لالعدلات الدموية المحيطية الإنسان، واتخاذ 15 مل من الدم عن طريق بزل الوريد من متبرع سليم ووضعه في حقنة 20 مل تحتوي على 90 ميكرولتر من 1000 وحدة دولية / مل من محلول الهيبارين الصوديوم (60 ميكرولتر من الهيبارين / 10 مل من الدم).
- باستخدام طرف ماصة، حقن 1.5 مل من محلول ديكستران 10٪ في حقنة. عكس ذلك بلطف 3 مرات وتركه واقفا منتصبا على مقاعد البدلاء.
- انتظر 30-60 دقيقة، حتى يتم تقسيم الدم إلى النصف تقريبا، مع الطبقة العليا معطف بافي الذي هو بلون القش والطبقة السفلية تحتوي على كريات الدم الحمراء.
- دفع بعناية الطبقة العليا من خلال إبرة أو إزالته مع طرف ماصة. وضعها طغ 15 مل أنبوب. تجنب أخذ طبقة حمراء. باستخدام 5 مل ماصة، إضافة 3-4 مل من كثافة متوسطة الانحدار (انظر قائمة المواد) إلى أسفل الأنبوب تحت طبقة معطف الشهباء للحصول على طبقتين متميزتين. أجهزة الطرد المركزي في 913 x ج لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم الماوس العدلات (أنظر المرجع 17 لعزل الماوس العدلات)، استخدم تعليق الخلية التي تم مسح من نخاع العظام بدلا من ذلك. - تخلصي من طاف، تاركا وراءه بيليه الأحمر. بلطف دوامة تعكير صفو بيليه. إضافة 7 مل من المقطر، H 2 O تعقيمها لبيليه وعكس ل20 ثانية لإعادة تعليق بيليه. إضافة 7 مل من المياه المالحة 2X وعكس عدة مرات لخلط، الناشر خلايا الدم الحمراء المتبقية.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تخلصي من طاف وإعادة تعليق بيليه في المخزن BSS إلى ما يقرب من 4 × 10 6 / مل.
ملاحظة: للحصول على المجهر الأمثل للخلايا، والحفاظ على تركيز تعليق خلية بين 1.5-6 × 10 6
4. إعداد الشرائح
- قبل علاج لوحة المجهري 8 جيدا (انظر قائمة المواد) مع 200 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (0.01٪ محلول) في كل بئر ل40-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة بولي-L-ليسين (يمكن إعادة استخدامها) ويغسل الآبار مرتين مع 200 ميكرولتر من H 2 O. المقطر
- إضافة 200 ميكرولتر من تعليق خلية أعدت في الخطوة 3.6 إلى كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
- إعداد قسامة من 5- (و6) -carboxy S-1 acetoxymethyl (S-1-AM) استر (50 ميكروغرام) وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من DMSO عالية الجودة إلى أنبوب واحد. دوامة لخلط. عندما لا تكون قيد الاستعمال، مخزن في -20 ° C.
- في أنبوب صغير، إضافة 1.7 مل من العازلة BSS و 20 ميكرولتر من S-1-AM. دوامة لخلط.
- يغسل الآبار مرتين مع 200 ميكرولتر من العازلة BSS، ثم قم باستبدال المخزن المؤقت مع الحل S-1-AM. الحرص على عدم تعكير صفو أحادي الطبقة من الخلايا تعلق على الجزء السفلي من البئر بواسطة pipetting بلطفأسفل جدران الآبار. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة على الأقل.
- يغسل الآبار مرتين مع 200 ميكرولتر من العازلة BSS. لاختبار المانع، تشكل "مزيج الرئيسي" للدواء المناسب في المخزن BSS. يغسل الآبار مرتين في حل المانع.
ملاحظة: تأكد من استخدام نفس الكمية من المخدرات المركبة (على سبيل المثال، DMSO أو الإيثانول) في السيطرة كذلك كانت تستخدم لالمانع. إذا اختبار تأثير كلوريد الزنك، استخدم عازلة BSS تفتقر KH 2 PO 4 (وHEPES ويمكن أن تخفف الحل وحده)، ويترسب الزنك مع الفوسفات. - يصوتن opsonized HKC-S-1 (القسم 6.2) لحوالي 3 ثوان في 5 السعة ميكرون. إضافة 10 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة للسماح البلعمة، مما يجعل الخلايا جاهزة للتصوير لقطات من البلعمة.
5. متحد البؤر المجهري
- باستخدام المجهر متحد البؤر، وضبط الطول الموجي لليزر حتى عشرفي الخلايا هي متحمس في 555 نانومتر، ويتم الكشف عن الانبعاثات من قبل اثنين من القنوات، أو كشف عن: 560-600 نانومتر، وأكثر من 600 نانومتر.
ملاحظة: سوف المعلمات المجهر محددة تختلف عن كل المجهر ويحتاج إلى أن يكون الأمثل من قبل الباحث. - عرض الخلايا باستخدام عدسة 63X مع النفط. استخدام صورة البلاط مسح على إعداد المستمر لعرض البلاط المركز. باستخدام كثافة مضان وزيادة قنوات كاشف، وضبط التركيز وشدة الليزر وكسب القناتين لتحسين الصورة.
- تقسيم الصورة باستخدام إعدادات لعرض كل القنوات. تأكد من عدم وجود تشبع كثافة مضان في السيتوبلازم أو فجوات. يبدو تشبع كنقاط حمراء. تقليل كثافة الليزر حتى لا يكون هناك أقل عدد ممكن من النقاط الحمراء، ولكن الخلايا وجسم بلعمي مشرقة بما فيه الكفاية لرؤية واضحة.
- عندما نشعر بالارتياح، انقر على "بدء التجربة." يتم إنشاء 9 البلاط صورة المسح الضوئي. حفظ الصورة كملف المعقد الذي أوصى بهالبرنامج الذي يحتوي على صورة مركبة للقناتين (وليس الحياة السياسية في فرنسا أو TIFF).
6. التجارب المعايرة
- بناء منحنى درجة الحموضة القياسية مع المبيضات وحدها.
- إعداد المخازن المؤقتة من درجة الحموضة 3،0 حتي 13،0، كما في الجدول 1.
- اتخاذ قسامة واحد (100 ميكرولتر) من HKC-S-1. تدور عليه لمدة 1 دقيقة في 17200 ز س. إعادة تعليق في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعين.
- بدءا من أدنى نطاق درجة الحموضة، إضافة تعليق إلى واحدة ما قبل المعالجة جيدا (من الخطوة 4.2). وضع الشريحة على المجهر متحد البؤر في مرحلة ساخنة المقرر ان 37 ° C.
- تسجيل مضان كل دقيقة لمدة 10 دقيقة. كرر لكل العازلة.
- سابونين منحنى القياسية.
- عزل 1 × 10 7 العدلات الإنسان 5 و resuspend لهم في 1 مل من المخزن المؤقت أدنى درجة الحموضة.
- اتبع الطريقة الموضحة في قسم 4 لقياس عدرجة الحموضة hagosomal في العدلات.
- بعد مرور فترة الحضانة مع تعليق المبيضات لمدة 20 دقيقة، إضافة 0.3٪ سابونين (15 ميكرولتر من الأسهم 10٪ إلى بئر واحدة (من الخطوة 4.2) معاملة ما قبل) إلى الطبق، ثم احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. التقاط صورة كل دقيقة لمدة 10 دقيقة. كرر لكل العازلة.
- عصاري خلوي منحنيات درجة الحموضة القياسية باستخدام K عالية + / تقنية 5، 18، 19 nigericin.
- تشكل مخازن موضح في الجدول رقم 1، من الرقم الهيدروجيني 4،0 حتي 13،0.
- اتبع الخطوات 4،1-4،7، وترك العدلات الوحيدة في الآبار التي تمت معالجتها مسبقا - كل بئر لاحتواء منطقة عازلة مختلفة. إضافة الشريحة إلى المرحلة 37 ° C ساخنة وتسجيل مضان كل دقيقة لمدة 10 دقيقة.
- ملاحظة: قد يستغرق بعض الوقت لدرجة الحموضة عصاري خلوي لتحقيق الاستقرار مع الحل الخارجي، ولكن بعد هذه النقطة، تصبح قيمة النسبة S-1ثابت. يمكن قياس خارج الخلية HKC-S-1 في كل تجربة بمثابة مراقبة للتأكد من أن أي مثبطات أضاف لا تتداخل مع S-1 مضان المنبعثة أو تؤثر درجة الحموضة في المخزن المؤقت.
تحليل 7. صورة
ملاحظة: هنا، وتقدم إرشادات لتحليل الصور (الكميات من مضان) باستخدام يماغيج البرمجيات الحرة. يوصى باستخدام يماغيج.
- تحميل وتثبيت النسخة يماغيج> 1.46r وفقا لتعليمات المطور (https://imagej.nih.gov/ij/). تثبيت ملف التعليمات البرمجية التكميلي المرفق مع هذا البروتوكول تسمى "قياس Phagosomal".
- فتح صورة J وتحميل ملف الصورة الذي تم اختياره لتحليل على شريط الأدوات. الجمع بين القناتين، استخدم صورة> اللون> جعل المركب.
- انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار ملف لتخزين النتائج.
- انقر على أداة الخط على شريط الأدوات ثم انقر نقرا مزدوجا لزيادة العرض إلى & #34؛ 2 ".
- رسم خط عبر عرض ليبلوع، ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق إلى "درجة الحموضة التدبير". يتم الحصول على متوسط شدة القناتين، وتحسب نسبتهم تلقائيا عن طريق ملف التعليمات البرمجية في يماغيج.
- بعد الانتهاء من القياسات، انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار "حفظ الملف".
- لقياس منطقة يبلوع، استخدم الرمز الرابع على طول شريط الأدوات رسم يده خالية من جميع أنحاء المنطقة. انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد "منطقة التدبير."
ملاحظة: يتم حفظ النتائج ويتم إنشاء ملف سجل في الدليل المحدد. ويمكن معالجة النتائج باستخدام جداول البيانات، R، أو برنامج ما يعادلها. العلاقة بين نسبة مضان لدرجة الحموضة السيني تقريبا، وقيم النسبة الناتجة عن تحليل يماغيج يمكن تحويلها إلى الرقم الهيدروجيني باستخدام وظيفة اللوجستية أو السيني معممة أو خطية أو مكعب الاستيفاء سين. - لقياس السيتوبلازم، ورسم خط عبر السيتوبلازم وانقر بالزر الايمن على "مقياس درجة الحموضة".
Representative Results
ويبين الشكل 1 لقطات من العدلات من أصول مختلفة لإثبات متفاوتة بيئات phagosomal. لتخفيف التحليل الكمي، من المهم أن البذور الآبار مع عدد مناسب من الخلايا: كثير جدا سوف يسبب الخلايا إلى طبقة فوق بعضها البعض، مما يجعل من الصعب لعرض جسم بلعمي المغلقة بدقة؛ عدد قليل جدا من الإرادة، وبطبيعة الحال، تقديم نتائج أقل، وخصوصا ليس كل العدلات سوف يبلعم. الرقم 2 هو الصورة التي انتهت المشبعة. هذا يمكن تقييمها من خلال تقسيم الصورة بين قنواتها اثنين (باستخدام برنامج المجهر الموصى بها في قائمة المواد أو ما يعادلها) - تظهر بقع حمراء حيث تم الكشف عن الحد الأقصى مضان. هذا يمكن مواجهته عن طريق الحد من كثافة الليزر. وتظهر منحنيات المعايرة باستخدام الأنظمة الوقائية المختلفة في الشكل (3)، مقتبس من ليفين وآخرون. 5 </ سوب>. وتظهر أشرطة الخطأ أن هناك بعض التباين في مضان بين القراءات. ويعطي الشكل 4 مثال على الكيفية التي يمكن بها تقديم بيانات عن درجة الحموضة phagosomal والمنطقة. هذا النهج يسمح لكل قياس الفردية للظهور مع boxplot زرع أكثر. ومع ذلك، يمكن أيضا أن يتم عرض البيانات في الرسم البياني شريط الرسم البياني.
الشكل 1: مناسبة صور لقطة من العدلات من البشر والفئران. إلى أقصى اليمين هو مفتاح البصري النوعي من اللون التقريبي للجسم بلعمي الملون-S-1 المقابلة لدرجة الحموضة. اللون الأصفر يشير إلى المزيد من الحموضة، بينما يشير اللون الأحمر أكثر قلوية. (A) يظهر Hvcn1 - / - الماوس نخاع العظام العدلات 20 دقيقة بعد البلعمة. في جسم بلعمي تظهر أحمر جدا، القلوية، وتورم. السهم الأحمر في الجزء الأيمن السفلي مننقطة صورة لالمبيضات داخل الخلايا، في حين أن السهم في أعلى نقطة اليسرى إلى الجسيمات خارج الخلية. (B) يظهر العدلات نخاع العظام wildtype الماوس التي تناولها المبيضات. أنها قلوية أقل بكثير من Hvcn1 - / - الخلايا. (C) ويظهر العدلات الدم المحيطي الإنسان في نفس النقطة بعد البلعمة. تظهر أكثر قليلا قلوية من خلايا فأر wildtype، ولكن جسم بلعمي لا تزال ليس كما كبيرة والأحمر كما Hcvn1 - / - الخلايا. (D) يظهر العدلات الإنسان التي المبتلعة المبيضات في وجود 5 ميكرومتر diphenylene iodonium (DPI). كل جسم بلعمي حمضية جدا، مع الرقم الهيدروجيني من 6 أو أقل. يمنع الدواء أوكسيديز NADPH، حتى لا يكون هناك أي تحرك أيون التعويضية. البروتونات التي صدرت من حبيبات الحمضية التي فتيل إلى يبلوع تسبب الحموضة الحمضية 20، وزيادة توظيف V-أتباز إلى thالبريد غشاء phagosomal على العلاج مع DPI 9. يظهر السيتوبلازم أيضا أكثر قلوية مقارنة مع الخلايا من الشروط الأخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإفراط في تشبع Hvcn1 - / - الماوس العدلات نخاع العظام. ومن المهم أن تستبعد من الصور التحليل الذي البيانات مضان قد ولت المشبعة. كما هو موضح في القسم 5.3، يتم تقسيم الصورة المركبة في صورتين (أعلى اليسار، السهم الأحمر) مع كل قنوات عرض كل على حدة. في هذا البرنامج، يتم فحص مؤشر مجموعة على (أسفل اليسار، السهم الأحمر)، ثم أي بكسل التي هي فوق المشبعة هي حمراء زاهية. هناك أكثر من التشبع موجودة في كل القنوات (1 و 2). A magnifيظهر ication بعض الخلايا وخارج الخلية المبيضات في أسفل اليمين، مع أسهم تشير إلى المناطق المتضررة. أن تحليل هذه النقاط يؤدي إلى قياس ratiometric كاذبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنيات المعايرة القياسية لتحويل نسب مضان S-1 لقياسات درجة الحموضة. منحنيات القياسية لالمبيضات وحدها في مخازن مختلفة (وصفت بانها "تريس") وعندما يتم permeabilized الخلايا مع سابونين ( "سابونين") متشابهة جدا، وتبين أن S-1 قراءة داخل وخارج الخلية (يبلوع وخارج الخلية متوسطة) قابلة للمقارنة. تمثل أشرطة الخطأ يعني ± SD. وتقصير S-1 / نسبة منحنى درجة الحموضة عند اختباره طن السيتوبلازم ( "السيتوبلازم")، والتي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار في تحليل الصور. تم تعديل هذا الرقم من ليفين وآخرون. 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكمي لدرجة الحموضة phagosomal والمنطقة. يعرض هذا الرقم مثال على عرض البيانات. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام برنامج البرمجة R. A: يظهر نسبة phagosomal وما يقابلها من درجة الحموضة لA (Hvcn1 - / - الماوس العدلات نخاع العظام)، B: wildtype الماوس العظام العدلات نخاع، C: العدلات الدموية المحيطية الإنسان، وD: الإنسان العدلات مع 5 ميكرومتر DPI ن = 3/300. وتظهر القياسات الفردية ومربعات صغيرة، مع تتراكب boxplot مع ميديوومجموعة الشرائح الربعية. يمثل شريط أحمر المتوسط. كما رأينا في الصور في الشكل 1، Hvcn1 - / - الخلايا لديها جسم بلعمي القلوية جدا بالمقارنة مع الماوس wildtype والعدلات الإنسان. لديهم أيضا منطقة أكبر phagosomal (الشكل 4B، ن = 3/300). جسم بلعمي العدلات الإنسان أكثر قليلا القلوية وأكبر من العدلات wildtype الماوس، في حين العدلات الإنسان حضنت مع DPI لها جسم بلعمي حمضية جدا والصغيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| متوازن محلول الملح (BSS) عازلة | |||
| كلوريد الصوديوم | 156 ملي | ||
| بوكل | 3 ملي | ||
| MgSO 4 | 2 مم | ||
| KH 2 PO 4 | 1.25 ملم | ||
| CaCl 2 | 2 مم | ||
| جلوكوز | 10 ملي | ||
| HEPES | 10 ملي | ||
| ودرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك | |||
| YPD مرق | |||
| YPD مرق | 50 غ | ||
| ماء مقطرة | 1 L | ||
| الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة | |||
| للأجار YPD: قبل التعقيم إضافة 15 غرام / L أجار | |||
| 10٪ محلول ديكستران | |||
| الصف السريرية ديكستران | 50 غ | ||
| كلوريد الصوديوم | <td>4.5 ز | ||
| ماء مقطرة | 500 مل | ||
| إضافة إلى زجاجة والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة | |||
| الحل 2X المالحة | |||
| كلوريد الصوديوم | 18 ز | ||
| ماء مقطرة | 1 L | ||
| إضافة إلى زجاجة والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة | |||
| 10٪ الأسهم سابونين | |||
| عازلة BSS | 50 مل | ||
| سابونين | 5 ز | ||
| عازلة BSS الحرارة إلى 37 درجة مئوية، إضافة سابونين وتخلط. | |||
| إضافة 0.1٪ أزيد الصوديوم كمادة حافظة، وتخزين الخليط في 4 درجات مئوية. | </ tr>|||
| مخازن المعايرة | |||
| المبيضات المنحنى القياسي | |||
| تأكد أولا ارتفع بنسبة 0.15 M الأوراق المالية من كل عازلة | |||
| تشكل 0.15 حل M كلوريد الصوديوم | |||
| 15 مل الحجم النهائي: 5 مل 0.15 M من حل العازلة المطلوب + 10 مل 0.15 M كلوريد الصوديوم الحل | |||
| الرقم الهيدروجيني 3 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي الجلايسين | |
| الرقم الهيدروجيني 4 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي خلات | |
| الرقم الهيدروجيني 5 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي خلات | |
| الرقم الهيدروجيني 6 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي خلات | |
| الرقم الهيدروجيني 7 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي تريس | |
| درجة الحموضة 8 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي تريس | |
| الرقم الهيدروجيني 9 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي تريس | |
| الرقم الهيدروجيني 10 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي الجلايسين | |
| الرقم الهيدروجيني 11 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي الفوسفات | |
| الرقم الهيدروجيني 12 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي الفوسفات | |
| الرقم الهيدروجيني 13 | 100 مم كلوريد الصوديوم | 50 ملي الفوسفات | |
| المنحنى القياسي عصاري خلوي | |||
| استخدم التي سبق 0.15 M المحاليل الأسهم | |||
| تشكل 0.15 حل M بوكل | |||
| 15 مل الحجم النهائي: 5 مل 0.15 M من المطلوب عازلة حل + 10 مل 0.15 M بوكل | |||
| 10 ملي الأسهم من nigericin في الإيثانول، إضافة 15 ميكرولتر من كل حل الحجم النهائي | |||
| الرقم الهيدروجيني 3 | 100 ملي بوكل 50 ملي الجلايسين | 10 ميكرومتر nigericin | |
| الرقم الهيدروجيني 4 | 100 ملي بوكل | 50 ملي خلات | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 5 | 100 ملي بوكل | 50 ملي خلات | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 6 | 100 ملي بوكل | 50 ملي خلات | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 7 | 100 ملي بوكل | 50 ملي تريس | 10 ميكرومتر nigericin |
| درجة الحموضة 8 | 100 ملي بوكل | 50 ملي تريس | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 9 | 100 ملي بوكل | 50 ملي تريس | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 10 | 100 ملي بوكل | 50 ملي الجلايسين | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 11 | 100 ملي بوكل | 50 ملي الفوسفات | 10 ميكرومتر nigericin |
| الرقم الهيدروجيني 12 100 ملي بوكل | 50 ملي الفوسفات | 10 ميكرومتر nigericin | |
| الرقم الهيدروجيني 13 | 100 ملي بوكل | 50 ملي الفوسفات | 10 ميكرومتر nigericin |
| درجة الحموضة جميع الحلول المعايرة مع أي حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم | |||
الجدول 1: تكوين مخازن. يصف هذا الجدول التراكيب المناسبة للمخازن المختلفة المستخدمة في البروتوكول.
ملف التعليمات البرمجية التكميلي. يحتوي هذا الملف على عدد من وحدات الماكرو كتبها أب ليفين، والتي هي ضرورية لتحليل الصور. فإن الكتاب سيكون سعيدا في محاولة للتصدي لأية استفسارات المرتبطة باستخدام هذا الرمز. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
مرة واحدة يتم تعيين الكواشف المناسبة، وإعدادات المجهر، والتجارب المعايرة يصل، وهذا الأسلوب هو بسيط نسبيا لأداء. وتشمل الخطوات الحاسمة: وصفها المبيضات مع S-1 لضمان عدم وجود الحمولة الزائدة للصباغة، ومعايرة، وتحليل الصورة.
S-1 هو كاشف تناسب أكثر البيئات القلوية درجة الحموضة، وهو أمر مهم خاصة بالنسبة للالعدلات 21 ولكن يحد من استخدامها في أنواع الخلايا معينة. لبيئات أكثر حمضية، مثل جسم بلعمي بلعم، SNARF-4، أو S-4، هو أكثر ملاءمة بسبب انخفاض الباكاف الحمضية 22 فيها. وعلاوة على ذلك، للقراءات هيولي أكثر دقة، فإنه من الأفضل استخدام S-4، ومنحنى القياسية لS-1 يدل على أن نسب مضان تبدأ في هضبة أدناه الرقم الهيدروجيني 6 (الشكل 3). الأصباغ الأخرى، مثل 2، 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (و6) -Carboxyfluorescein (BCECF) أو pHrodo الأحمر قد يكون أيضا أكثر ملاءمة في تابعتحويلة أنه من المتوقع أن تكون حمضية. بعد تلطيخ السيتوبلازم لا يزال ضروريا لتحديد الصحيح للجسم بلعمي تحتوي على المبيضات.
سمة هامة من سمات مؤشر phagosomal الرقم الهيدروجيني هو أن لا يتم تبديل لا رجعة فيه من قبل البيئة phagosomal رد الفعل. S-1 ويبدو أن مقاومة للبيئة العدلة. ويتضح ذلك من ليفين وآخرون. 5 (انظر التكميلية فيديو 4 من المرجع 5) التي تدل على البلعمة وإطلاق سراحه من المبيضات الجسيمات المسمى S-1-قبل Hvcn1 - / - العدلة. عندما المبتلعة، يتحول الجسيمات من الأصفر / البرتقالي إلى الأحمر (محايد لدرجة الحموضة القلوية)، ولكن عندما يتم تحرير الجسيمات من قبل العدلات، فإنه يعود إلى لونه الأصلي.
ومن المهم أن نذكر بعض القيود المرتبطة باستخدام S-1. والحقيقة أن هذه الصبغة اثنين من أطياف الانبعاث السماح الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ratiometricurement هي ميزة، ولكن هناك حاجة إلى معدات متخصصة للحصول على الصور. المجهر المستخدمة في التجارب يجب أن تكون قادرة على تسجيل صورتين في وقت واحد أو مع تأخير وقت ضئيل. تفترض الكتاب أن الباحث يحاول هذا البروتوكول لديه خبرة في استخدام متحد البؤر المجهري، أو لديه حق الوصول إلى تدريب المهني. لا يمكننا سرد كافة المعلمات المجهر محددة لأنها سوف تختلف عن كل المجهر وتحتاج إلى تحسين من قبل الباحث. وتتحلل استر acetoxymethyl مترافق إلى S-1 الذي يسمح للصبغة أن ينتشر إلى السيتوبلازم الخلية المونوأمينوأوكسيداز غير محددة في السيتوبلازم الخلية لتشكيل جزيء الفلورسنت. المونوأمينوأوكسيداز، مثل الفوسفاتيز القلوية، موجودة في مصل الدم البشري والجنين المصل البقري، والتي تستخدم لاستكمال وسائل الإعلام ثقافة الخلية. وفقا لذلك، يجب أن لا يحتوي على المديين المتوسط والتي يتم تحميلها الخلايا مع S-1-AM (القسم 4.5) مصل. قد يكون هذا صعبا إذا باستخدام خلايا التي تتطلب أكثر المغذيات ريكح المتوسطة للحفاظ عليها من محلول ملحي متوازن المستخدمة في هذا البروتوكول. وبالمثل، مكونات المتوسطة الفلورسنت أخرى، مثل الفينول الأحمر، قد يتداخل مع S-1 القياسات.
أشرطة الخطأ في الشكل (3) تشير إلى أن هناك بعض التباين في قياسات نسبة في كل درجة الحموضة. وهناك عدد مناسب من يكرر كل تجربة (على الأقل ن = 3) وهناك حاجة إلى العديد من القياسات الفردية في كل تجربة واحدة للتغلب على الاختلاف بين فجوي. بالتالي فمن المستحسن لقياس الرقم الهيدروجيني لا يقل عن 100 جسم بلعمي لكل حالة والعديد من المناطق phagosomal التي يبدو أنها تحتوي على واحد فقط المبيضات. في جسم بلعمي المراد قياسها لتحديد الكميات ينبغي أن تكون تلك التي اجتاحت تماما الجسيمات المبيضات (أي تلك محاطة السيتوبلازم). للتخفيف ضد التحيز غير المقصود في اختيار خلية / جسم بلعمي عن الكميات، يجب أن يتم تنفيذ كل التحليلات في حينأعمى لظروف تجريبية.
هنا، نحن تصف عزل العدلات بالترسيب ديكستران من الدم الكامل تليها الطرد المركزي من طبقة البلازما من خلال التدرج الكثافة. نحن نستخدم هذه التقنية لأنها تنتج بسرعة وكفاءة محض (> 95٪) من سكان العدلات، على الرغم من أن هناك وسائل أخرى متاحة، مثل كله الطرد المركزي الدم من خلال الصيغ التدرج الكثافة أخرى أو اختيار السلبية العدلات باستخدام مجموعات متخصصة مع الأجسام المضادة أو المغناطيسي خرز. ومع ذلك، يمكن هذه الأخيرة تكون باهظة بالنسبة لمعظم الجماعات التي عزل العدلات بشكل روتيني. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم الهيبارين تخثر في أنبوب جمع الدم، في حين أن باحثين آخرين قد تكون أكثر اعتادوا على استخدام ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) أو سترات الصوديوم حمض (ACD). كما أن هناك العديد من الطرق المختلفة للاختيار من بينها، والأمر متروك إلى تفضيل شخصي للباحث.
علاوة على ذلك،عندما عزل ومعالجة العدلات التي ينبغي التعامل معها بشيء من الحرص لتجنب تفعيل المفرط. وتشمل الخطوات الاحترازية: فقط باستخدام الأدوات البلاستيكية، لا الزجاج. تصفية تعقيم جميع المخازن لإزالة أي الذيفان الداخلي تلوث. عندما العدلات الغزل تأكد من أجهزة الطرد المركزي هو متوازن لتجنب الاهتزازات المفرطة. لحد قدر الإمكان تبقى العدلات الوقت في بيليه بعد الطرد المركزي. لا تحتفظ العدلات في حل أكثر من 5 × 10 6 / مل. وتنفيذ التجربة في أقرب وقت ممكن بعد العزلة.
ويمكن تكييف هذه الطريقة لقياس التغيرات في درجة الحموضة وphagosomal المنطقة على مر الزمن باستخدام مجموعة مرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية على المجهر وأخذ لقطات مرة واحدة كل 30-60 الصورة من نفس الموضع، كما هو موضح في الخطوات المعايرة. ويمكن أيضا من الناحية النظرية يمكن تكييفه لتجارب إنتاجية أعلى، كما هو الحال في لوحات 96-جيدا، والتدفق الخلوي التجارب، حيث S-1 علبةأن تستخدم مؤشر الرقم الهيدروجيني 23. ومع ذلك، في هذه الإعدادات، يتم استبدال التركيز على نشاط الخلايا الفردية عن طريق تأثير عالمي أكثر على السكان الخلية.
ويهدف هذا الأسلوب لتوفير الإعداد التجريبية بسيط نسبيا التي تقوم عليها الباحثين الأفراد يمكن أن تتكيف مع تناسب مجالات اهتمامهم. قد ترغب الباحثين لاستكشاف العدلات phagosomal درجة الحموضة ومنطقة بينما قياس أيضا حركة الأيونات الأخرى، على سبيل المثال، وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا. هناك العديد من الفلورسنت كا 2+ المؤشرات متاحة بسهولة للفحص المجهري متحد البؤر، مثل الهند و1، التي لديها أيضا أطياف الانبعاث المزدوج في 400 و 475 نانومتر (24). هذه انبعاث موجات لا تتداخل مع أطياف الانبعاث S-1 ولكن الطول الموجي الإثارة في نهاية الأشعة فوق البنفسجية (UV) من الطيف، والتي يمكن أن تضر الخلايا، وجهاز ليزر الأشعة فوق البنفسجية ليست شائعة في جميع المجاهر. استعراض شامل لمؤشرات مختلفة لوتغطي قياس تدفق الكالسيوم داخل الخلايا بواسطة تاكاهاشي آخرون. 25 وHillson وآخرون. 26.
وفي الختام، هناك طرق أخرى متاحة لقياس درجة الحموضة phagosomal باستخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كما نونيز وآخرون. وقد أظهرت 13 وكذلك مجموعات أخرى 27 و 28. وقد استخدم باحثون آخرون أيضا S-1 لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي 29 أو phagosomal درجة الحموضة 14. ومع ذلك، هذا البروتوكول هي فريدة من نوعها في قياس في وقت واحد ودرجة الحموضة لكل من العصارة الخلوية ويبلوع، والذي يوفر فرصة لمراقبة التغيرات في phagosomal منطقة مستعرضة والتمييز بين wildtype وHvcn1 - / - العدلات الماوس، والعدلات الإنسان مع وبدون العمل NADPH أوكسيديز.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل يرجى يلكوم ترست، والتكنولوجيا الحيوية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية، والنصب التذكاري للزمالة ايروين جوفي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
| YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
| Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
| Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
| SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
| Vivaglobin human IgG 160 mg/mL solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
| Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
| Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
| Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm) | |
| Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
| Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |
References
- Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).
- Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
- Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).
- Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).
- Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).
- Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
- Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
- Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).
- Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).
- Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
- Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).
- Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).
- Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
- Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).
- Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24 (6), 551-556 (1993).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79 (4), (1999).
- Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
- Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).
- Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).
- Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).
