Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

doi: 10.3791/55107 Published: April 5, 2017

Abstract

נויטרופילים הם קריטיים לארח הגנת מולד, וכתוצאה מכך, מהווים תחום חשוב של מחקר רפואי. Phagosome, התא התאי שבו ההרג והעיכול של חלקיקים הציפו להתקיים, הוא הזירה העיקרית הרג הפתוגן נויטרופילים הדורש רגולציה הדוקה. Phagosomal pH הוא היבט אחד כי נשלט בקפידה, בתורו מסדיר פעילות הפרוטאז מיקרוביאלית. רבים ניאון צבעי pH רגיש שימשו כדי להמחיש את הסביבה phagosomal. יש S-1 מספר יתרונות על פני צבעי pH אחרים רגיש, כוללים ספקטרום הפליטה הכפול שלה, עמידותו-הלבנת תמונה, ואת pKa הגבוהה שלה. באמצעות שיטה זו, אנו הוכחנו כי phagosome נויטרופילים הוא אלקליין חריג בהשוואת פגוציטים אחרים. באמצעות הטיות ביוכימיים שונים של הצבע, phagosome ניתן שמסומן מן הציטופלסמה כך ששינויים בגודל ובצורה של phagosome ניתן להעריך. זה מאפשר Fאו ניטור נוסף של תנועה יונית.

Introduction

נויטרופילים הם תא החיסון המולד בשכיחותו בגוף. תפקידה העיקרי שלו מורכב המסיירים הדם ואת ומלטפות, מעכלים את החלקיקים הזרים כי היא עשויה להיתקל בתהליך המכונה phagocytosis 1, 2. החלקיקים מפורקים בתא של תאיים שנקרא phagosome. הפעלת האנזים מונואמין NADPH נויטרופילים, את NOX2 איזופורם, יוזם מפל של תגובות ביוכימיות המסתיימת במותו של הפתוגן. יחידות משנה חלבון NOX2 להמשיך לגבש מורכבת שרשרת העברת אלקטרונים בקרום phagosomal 3. לאחר הפעלה, זה מעביר אלקטרונים מן NADPH דרך הממברנה לחמצן מולקולרי בתוך phagosome, הפקת אניוני דיסמוטאז ומיני חמצן תגובתי נוספת. תופעה זו ידועה בשם פרץ הנשימה, והוא נחשב חיוני הרג חיידקים יעיל בעיכול 2 4 HVCN1, 5. ערוץ זה מאפשר תנועה פסיבית של פרוטונים לאורך שיפוע אלקטרוכימיים שלהם מן cytosol לתוך phagosome. ריכוז Proton משתקף על ידי pH, כך על רמה מסוימת של פעילות אנזים מונואמין, מדידת pH של phagosome יכול לספק מידע על ההשתתפות היחסית של מסלולי protonic ולא protonic כפיצוי תשלום.

Phagosome נויטרופילים האנושי יש pH בסיסי של כ 8.5 עבור 20-30 דקות לאחר phagocytosis 5. זה מרמז על קיומו של תעלות יונים הלא-פרוטונים נוספים NOX2-induced פיצוי תשלום, כמו פיוז'ן ושחרור תכולתו של גרגרי חומצי ופיצוי בלעדי ידי HVCN1 ישמור בסביבת חומצית, בניגוד לזה שנצפה. התנועה של יונים לפצות מטען שלילי זה עשוי גם להפעיל שינויים בגודל phagosome באמצעות אוסמוזה. יונים יכול להיות אלה הנמצאים נויטרופילים בריכוזים פיסיולוגיים גבוהים: יוני אשלגן הוכחו לנוע לתוך phagosome 6, ותנועה יונית כלוריד היא עוד מועמד חשוב נויטרופילים פונקציה 7.

הסדרת pH של phagosome חיונית עבור פעילות הפרוטאז מיקרוביאלית 5. Myeloperoxidase (MPO) נראה שיש פעילות אופטימלית ב- pH 6, בעוד שעבור cathepsin G ו אלסטט, רמות אופטימליות הן pH 7-9 ו pH 8-10, בהתאמה 5. לכן, שינוי חולף ב pH phagosomal עשוי לספק נישות פעילות אנזימים שונים כיףction. הבנה כיצד pH מעורב בהרג חיידקים נויטרופילים עשויה לספק מידע שימושי עבור העיצוב של סוכני מיקרוביאלית רומן משלים-נויטרופילים.

Phagosome נויטרופילים היא סביבה מאוד תגובתי. זה עושה את זה קשה להעריך במדויק pH, בגלל צבע ניתן חמצון בקלות, מה שמוביל חפצים טכניים. מבחינה היסטורית, isothiocyanate והעמסת (FITC) כבר צבע של בחירה למדוד תאיים pH 8, 9. עם זאת, יש כמה חסרונות לשימוש שלה במדידת pH נויטרופילים phagosomal. יש לה pKa של 6.4 10, מה שאומר שזה יכול במדויק רק לשמש כדי להעריך את רמות מה PH 5 עד 7.5 8, כמו מרווה ב- pH <8 11. כמו pH נויטרופילים phagosomal יכול להיות הרבה יותר אלקליין 5, FITC לא יכול ללכוד מגוון רחב של שינויים pH פוטנציאל. Signifi נוספתהבעיה צביעות עם FITC בהקשר של נויטרופילים היא שזה נחשב להיות photobleached ידי MPO 12. מעכב MPO, יזיד הנתרן, יכול לשמש כדי להגביל photobleaching 13, אבל זה הוכח כי יזיד הנתרן ישירות מוריד את רמת חומציות phagosomal באופן MPO עצמאי ולכן היא בלתי הולמת לשימוש מבחנים כגון 5.

לעומת צבעי תאיים אחרים, S-1 יש pKa גבוה יחסית של 7.5 10. בתנאים חומציים, המולקולה היא protonated ומייצרת אות פליטה בין 560 ו 600 ננומטר כאשר נרגש על 488 ננומטר ומעלה. כאשר המולקולה היא deprotonated בלמעלה תנאי בסיסי, גל הפליטה נגמר 600 ננומטר. יחס של עוצמות הקרינה בשני אורכי גל אלה מצביע על שינוי הפליטה, המהווה יותר הוא אמין יותר מאשר מדידות קרינה יחידות, כפי שהוא אינו מושפע על ידי ריכוז fluorophore ואת מבנה תא. S-1 ניתן מצומדות חומר אנטיגני, כגון zymosan 14, אם כי-הרג חום (HK) קנדידה אלביקנס היא מועדף, שכן שטח הפנים הגדול יותר נותן קריאת קרינה עקבית יותר.

השתמשנו גם שינוי של השיטה בחקר שינויים זמניים ב pH (איור 3) 5. שיטה זו למדידת pH cytosolic ניתן ליישם בקלות סוגי תאים אחרים, כמתואר במקום אחר 15, 16, ו תאים עם phagosomes אלקליין יותר 14.

Protocol

בהצהרת אתיקה: כל עבודת החיה נערכת עם הרישיון והאישור של משרד פן בריטניה. השתתפות אדם במחקר זה אושר על ידי ועדת UCL המשותפת / UCLH על האתיקה של מחקר אדם. כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת.

1. הכנת ג אלביקנס

  1. לגדול דיסק קנדידה (ראה רשימת חומרים) על צלחת אגר YPD לפי הוראות היצרן. פיק מושבה ולהוסיף אותו 15 מ"ל של מרק YPD. דגירה זה חממה רועד ב 30 ° C ו 200 סל"ד עד שהמרק הוא מעונן (בדרך כלל על 2 ימים, או לריכוז של בערך מעל 1 x 10 9 / מ"ל).
  2. ספין למטה המדיום קנדידה מחדש להשעות אותו 50 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים.
  3. מניחים את הצינור המכיל 50 מ"ל של מדיום PBS / קנדידה באמבט מים שחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס, כך הצינור כולו הוא יםubmerged עבור 1 h.
    1. כדי לאשר כי קנדידה הם-הרג חום, פס מדגם לצלחת אגר YPD ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. התאם את-הרג חום (HK) ריכוז קנדידה כדי 5-9 x 10 8 / מ"ל, תלוי צמיחה קנדידה, ולאחסן אותו 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C במקפיא.
      הערה: כל ספירת התאים בפרוטוקול זה בוצעה באמצעות דלפק תא אוטומטי.

2. S-1 צימוד חום-הרג (HK) קנדידה

  1. הכן aliquot של carboxy-S-1 אסתר succinimidyl (50 מיקרוגרם) על ידי דילול אותו 100 μL של sulfoxide דימתיל בדרגה גבוהה (DMSO). וורטקס היטב כדי לערבב.
  2. הכן 1 מ"ל של 1 x 10 8 קנדידה HK ב 0.1 M סודיום ביקרבונט (pH 8.3) בצינור 15 מ"ל.
  3. הוספת 100 μL של carboxy-S-1 טיפה אחת בכל פעם, כדי קנדידה HK תוך ערבוב על מערבולת בערך 2000 סל"ד (בינוני עד מהיר). גלישת אלומיניום foil סביב הצינור ולמקם אותו על רולר בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה.
  4. לשטוף שלוש פעמים HK Candida- S-1 (HKC-S-1) על ידי צנטריפוגה ב 2250 XG במשך 10 דקות כל אחד. בשנתי השטיפות הראשונות, להשעות את הגלולה ב 15 מיליליטר של 0.1 M סודיום ביקרבונט (pH 8.3). לאחר לשטוף השלישי, להשעות אותו 1 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ (ראה טבלה 1).
  5. העברת HKC-S-1 ההשעיה לתוך צינורות ב 100 aliquots μL ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    הערה: צינורות משתמשים עם משטח נמוך מחייב חומר, ואם אפשר, כפי HKC-S-1 חלקיקים יכולים להיצמד לקיר של צינורות צנטריפוגה נורמלים.
  6. Opsonize HKC-S-1
    1. עבור נויטרופילים האדם, להוסיף 100 μL של נסיוב אדם IgG ל 100 μL של HKC-S-1 מופשר.
    2. עבור נויטרופילים עכבר, להוסיף 50 μL של סרום עכבר רגיל 50 μL של בסרום חיסוני עכבר קנדידה (המופקים עכברי C57B6 מוזרקים עם קנדידה HK) 5 כדי 100 μLשל HKC-S-1.
    3. מערבבים אותו על-שייקר חום ב 37 ° C ו- 1100 סל"ד במשך 60-90 דקות, ולאחר מכן על רולר C 4 ° עבור 2 h.
    4. שלוש פעמים לשטוף במאגר BSS על ידי צנטריפוגה ב 17,200 XG במשך 1 דקות כל אחד. גלולה ב 100 μL של חיץ BSS.

3. בידוד של נויטרופילים

  1. עבור נויטרופילים בדם ההיקפי האנושי, לקחת 15 מ"ל של דם על ידי venipuncture מתורם בריא ולמקם אותו לתוך מזרק 20 מ"ל המכיל 90 μL של 1000 פתרון נתרן הפרין IU / מ"ל ​​(60 μL של הפרין / 10 מ"ל של דם).
  2. בעזרת קצה פיפטה, להזריק 1.5 מ"ל של פתרון dextran 10% לתוך המזרק. הפוך אותו בעדינות 3 פעמים ולהשאיר אותו עומד זקוף על הספסל.
  3. המתן 30-60 דקות, עד שהדם מתפרקים לשני חצאים, עם שכבת מעיל באפי העליון כי הוא בצבע קש שכבה בתחתית המכיל אריתרוציטים.
  4. לחץ בעדינות את השכבה העליונה באמצעות מחט או להסיר אותו עם קצה פיפטה. שים את זה אניצינור נה 15 מ"ל. להימנע מלקחת את השכבה האדומה. בעזרת פיפטה מ"ל 5, להוסיף 3-4 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות (ראה רשימת חומרים) לחלק התחתון של הצינור מתחת לשכבת מעיל באפי להשיג שתי שכבות נפרדות. צנטריפוגה ב 913 XG במשך 10 דקות.
    הערה: אם נויטרופילים עכבר באמצעות (ראו התייחסות 17 לעכבר נויטרופילים בידוד), להשתמש השעית התא כי כבר סמוקה ממח העצם במקום.
  5. יוצקים את supernatant, ומשאיר מאחור גלולה אדומה. בעדינות מערבולת להפריע גלולה. להוסיף 7 מ"ל של מזוקקים, לעקר H 2 O ל גלולה ו להפוך עבור 20 s כדי להשעות את גלולה. להוסיף 7 מ"ל של סליין 2x ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב, lysing בתאי הדם האדומים שנותרו.
  6. צנטריפוגה XG 300 5 דק '. יוצקים את supernatant מחדש להשעות גלולה במאגר BSS כ 4 x 10 6 / מ"ל.
    הערה: למיקרוסקופיה האופטימלי של התאים, לשמור על ריכוז השעית תא בין 1.5-6 x 10 6

4. הכנת שקופיות

  1. טרום לטפל צלחת מיקרוסקופיה 8 היטב (ראה רשימת חומרים) עם 200 μL של L- ליזין פולי (פתרון 0.01%) בכל טוב עבור 40-60 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הסר את L- ליזין פולי (ניתן לעשות שימוש חוזר) ולשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של H 2 O. מזוקקים
  3. הוספת 200 μL של תאי השעיה מוכנות בשלב 3.6 זה טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
  4. הכן aliquot של 5 (ו-6) acetoxymethyl S-1 -carboxy (S-1-AM) אסתר (50 מיקרוגרם) על ידי הוספת 100 μL של DMSO בדרגה גבוהה כדי צינור אחד. וורטקס לערבב. כאשר אינו בשימוש, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  5. בתוך צינור קטן, להוסיף 1.7 מ"ל של חיץ BSS ו- 20 μL של S-1-AM. וורטקס לערבב.
  6. לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של חיץ BSS, ולאחר מכן להחליף את החיץ עם הפתרון S-1-AM. יש להיזהר שלא להפריע בשכבה של תאים המחוברים לתחתית הבאר ידי בעדינות pipettingלאורך הקירות של הבארות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה 25 לפחות.
  7. לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של חיץ BSS. כדי לבחון מעכב, לפצות על "תערובת מאסטר" של התרופה המתאימה חיץ BSS. לשטוף את הבארות פעמי הפתרון המעכב.
    הערה: הקפד להשתמש באותה כמות של הרכב התרופה (למשל, DMSO או אתנול) בבקרה גם שימש מעכב. אם בוחנים את ההשפעה של כלוריד אבץ, להשתמש במאגר BSS חסר KH 2 PO 4 (את HEPES יכול חיץ הפתרון לבד), כמו אבץ משקעים עם פוספט.
  8. Sonicate HKC-S-1 opsonized (סעיף 6.2) למשך כ 3 שניות על מיקרומטר משרעת 5. להוסיף 10 μL היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות, כדי לאפשר phagocytosis, מה שהופך את התא מוכן להיות צלם עבור תמונות של phagocytosis.

5. מיקרוסקופיה confocal

  1. באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתאים את אורך הגל לייזר כך thעל התאים נרגשים ב 555 ננומטר ואת הפליטה מזוהית על ידי שני ערוצים, או גלאי: 560-600 ננומטר ומעל 600 ננומטר.
    הערה: פרמטרים מיקרוסקופ ספציפיים יהיו שונים עבור כל מיקרוסקופ צריכים להיות מותאמת על ידי החוקר.
  2. הצג את התאים בעזרת עדשה 63X עם שמן. השתמש בתמונת אריח-סריקה על הגדרה רציפה כדי להציג את משבצת המרכז. באמצעות עוצמת הקרינה ורווח של ערוצי גלאי, לשנות את הפוקוס ואת עוצמת הלייזר ואת הרווח של שני הערוצים כדי לייעל את התמונה.
  3. לפצל את התמונה באמצעות הגדרות כדי להציג שני הערוצים; לבדוק שאין רוויה של עוצמת קרינה בציטופלסמה או וקואולות. רוויה מופיעה כנקודות אדומות. להפחית את עוצמת הלייזר כך שיש מספר מינימלי של נקודות אדומות, אבל התאים phagosomes הם חכמים מספיק כדי לראות בבירור.
  4. כשתהיה מרוצה, לחץ על "התחל ניסוי." תמונת סריקה 9 אריח נוצרת. שמור את התמונה כקובץ מורכב המומלץ על ידיהתוכנה המכילה תמונה מורכבת של שני הערוצים (לא JPEG או TIFF).

6. ניסויי כיול

  1. בניית עקומת סטנדרט pH עם קנדידה לבד.
    1. הכן את החוצצים בין pH 3.0 כדי 13.0, לפי טבלה 1.
    2. קח aliquot אחד (100 μL) של HKC-S-1. לסובב אותו על 1 דקות ב g 17,200 x. Resuspend אותו 500 μL של חיץ שהוקצו.
    3. החל מ טווח pH הנמוך ביותר, להוסיף את ההשעיה לאחד טרום יחס טוב (משלב 4.2). מניחים את השקף על מיקרוסקופ confocal על הבמה מחוממת מוגדר 37 ° C.
    4. רשום את הקרינה בכל דקה במשך 10 דקות. חזור עבור כל חיץ.
  2. עקומת סטנדרט Saponin.
    1. לבודד 1 x 10 7 נויטרופילים האנושי 5 resuspend אותם 1 מ"ל של חיץ pH הנמוך ביותר.
    2. בצע את השיטה המתוארת בסעיף 4 למדידת ppH hagosomal ב נויטרופילים.
    3. לאחר הדגרה עם ההשעיה קנדידה עבור 20 דקות, להוסיף 0.3% saponin (15 μL של 10% במלאי לאחד טרום יחס טוב (משלב 4.2)) על הצלחת, ואז דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. קח תמונה כל דקה במשך 10 דקות. חזור עבור כל חיץ.
  3. עקומות סטנדרטיות pH Cytosolic באמצעות הגבוהה K + / nigericin טכניקה 5, 18, 19.
    1. איפור מאגרים שמתואר בטבלה 1, מ pH 4.0 כדי 13.0.
    2. בצע את פעולות 4.1-4.7, עוזב נויטרופילים רק הבארות טרום טיפול - כל טוב להכיל חיץ שונה. מוסיף את השקף אל הבמה המחוממת 37 מעלות צלזיוס ולהקליט את הקרינה בכל דקה במשך 10 דקות.
    3. הערה: זה עלול לקחת קצת זמן עבור ה- pH cytosolic לייצב עם הפתרון החיצוני, אך לאחר נקודה זו, ערך היחס S-1 הופךקָבוּעַ. מדידת HKC-S-1-התאים בכל ניסוי יכולה לשמש כביקורת לבדוק שכל מעכבים הוסיפו לא להפריע הקרינה הנפלטת S-1 או להשפיע על רמת החומציות של עור החיץ.

ניתוח תמונה 7.

הערה: הנה, הוראות לניתוח תמונה (לכמת הקרינה) באמצעות ImageJ התוכנה החופשי מסופקת. שימוש ImageJ מומלץ.

  1. הורד והתקן גרסה ImageJ> 1.46r בהתאם להנחיות של היזם (https://imagej.nih.gov/ij/). התקן את קובץ קוד המשלים מצורף עם פרוטוקול זה נקרא "מדידת Phagosomal."
  2. פתח תמונה J ו לטעון את קובץ התמונה שנבחרה לניתוח על הכלים. כדי לשלב את שני הערוצים, להשתמש Image> צבע> הפוך מרוכבים.
  3. לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור קובץ בו כדי לאחסן תוצאות.
  4. לחץ על כלי הקו בסרגל הכלים ולחצו לחיצה כפולה על מנת להגדיל את הרוחב ל & #34; 2 ".
  5. צייר קו לרוחב של phagosome, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על "pH מידה". עוצמת הממוצע של שני ערוצי נרכש, ואת היחס שלהם מחושב באופן אוטומטי על ידי קובץ קוד ImageJ.
  6. לאחר שסיים את המדידות, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור "לשמור את הקובץ."
  7. כדי למדוד את שטח phagosome, השתמש בסמל הרביעי יחד בסרגל הכלים לצייר ביד חופשית מסביב לאזור. לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור "אזור מידה."
    הערה: התוצאות נשמרות בקובץ יומן נוצר בתיקייה הנבחרת. התוצאות עשויות להיות מעובד באמצעות גיליון אלקטרוני, R, או תוכנה מקבילה. הקשר בין יחס קרינת pH הוא כ sigmoidal, ואת ערכי היחס שנוצרו על ידי ניתוח ImageJ ניתן להמיר pH באמצעות פונקצית סיגמואיד כללית או לוגיסטית או על ידי ליניארי או אינטרפולציה שגם מעוקב.
  8. כדי למדוד הציטופלסמה, למתוח קו על פני הציטופלסמה לבין לחץ לחיצה ימנית על "pH מידה".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU Sigma-Aldrich RQC14003-10EA Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth Sigma-Aldrich Y1375 Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 MP Biomedicals 2101514 Use gloves 
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL  Fannin, Wockhardt UK Ltd FP1077 We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging Thermo Scientific/Invitrogen SS22801 Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Thermo Scientific/Invitrogen C1272 Use gloves
Vivaglobin human IgG  160 mg/mL solution CSL Behring received as a gift Various providers exist
Normal mouse serum Abcam ab7486 Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium) Alere Ltd 1114547 Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin Sigma-Aldrich N7143 Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375 Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503  Various providers exist
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333 Various providers exist
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266 Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016 Various providers exist
Glucose Sigma-Aldrich D9434 Various providers exist
Absolute Ethanol  Sigma-Aldrich 2860 Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI) Sigma-Aldrich D2926 Various providers exist
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086 Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine Sigma P4707 Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) Carl Zeiss The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat Thistle Scientific IB-80826 Other appropriate imaging dishes can be substituted
Soniprep 150 MSE Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter BioRad Various providers exist
1.5 mL Protein LoBind Tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6, (5), 515-517 (2016).
  2. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  3. Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657, (1), 1-22 (2004).
  4. Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588, (23), 4659-4665 (2010).
  5. Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10, (4), 0125906 (2015).
  6. Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, (6878), 291-297 (2002).
  7. Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135, (2), 511-522 (1996).
  8. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75, (7), 3327-3331 (1978).
  9. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277, (8), 6059-6066 (2002).
  10. Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  11. Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79, (17), 6775-6782 (2007).
  12. Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259, (8), 4812-4821 (1984).
  13. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
  14. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25, (21), 3330-3341 (2014).
  15. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
  16. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417, (2), 234-239 (1990).
  17. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95, (5), 827-839 (2014).
  18. Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, (42), 18022-18027 (2009).
  19. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18, (11), 2210-2218 (1979).
  20. Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4, (4), (2016).
  21. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290, (5805), 406-409 (1981).
  22. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71, (5), 2501-2510 (2005).
  23. Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12, (2), 127-132 (1991).
  24. Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24, (6), 551-556 (1993).
  25. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79, (4), (1999).
  26. Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
  27. Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77, (3), 243-252 (2010).
  28. Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (47), 6486-6495 (2015).
  29. Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260, (2), (1991).
הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).More

Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter