Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

न्युट्रोफिल फेगोसोम इमेजिंग और कोशिका द्रव्य एक Ratiometric पीएच संकेतक का उपयोग करना

doi: 10.3791/55107 Published: April 5, 2017

Summary

यह पांडुलिपि phagosomal पीएच और क्षेत्र के साथ-साथ ratiometric सूचक seminaphthorhodafluor (snarf) -1, या एस -1 का उपयोग करते हुए मानव और माउस न्यूट्रोफिल की cytoplasmic पीएच मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है। इस लाइव सेल कोंफोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग हासिल की है।

Abstract

न्यूट्रोफिल सहज रक्षा की मेजबानी के लिए महत्वपूर्ण हैं, परिणामस्वरूप, चिकित्सा अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र का गठन। फेगोसोम, intracellular कम्पार्टमेंट जहां हत्या और घिरा हुआ कणों के पाचन जगह ले, न्युट्रोफिल रोगज़नक़ हत्या कि तंग विनियमन की आवश्यकता है के लिए मुख्य क्षेत्र है। Phagosomal पीएच एक पहलू यह है कि ध्यान से नियंत्रित किया जाता है रोगाणुरोधी प्रोटीज गतिविधि को विनियमित करने बारी में, है। कई फ्लोरोसेंट पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों phagosomal पर्यावरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एस -1 अपनी दोहरी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, फोटो विरंजन के लिए अपनी प्रतिरोध, और इसकी उच्च pKa सहित अन्य pH- संवेदनशील रंजक, पर कई फायदे हैं। इस विधि का उपयोग करना, हम दिखा दिया है कि न्युट्रोफिल फेगोसोम अन्य फ़ैगोसाइट की तुलना में असामान्य रूप से क्षारीय है। डाई के विभिन्न जैव रासायनिक conjugations का उपयोग करके, फेगोसोम कोशिका द्रव्य से चित्रित किया जा सकता है ताकि आकार और फेगोसोम के आकार में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है। यह च की अनुमति देता हैया आयनिक आंदोलन की आगे की निगरानी।

Introduction

न्युट्रोफिल शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में सहज प्रतिरक्षा सेल है। इसका मुख्य कार्य खून गश्त और छा और विदेशी कणों कि यह phagocytosis 1, 2 के रूप में जाना प्रक्रिया में सामना कर सकते हैं पचाने के होते हैं। कणों फेगोसोम नामक एक intracellular डिब्बे में अपमानित कर रहे हैं। न्युट्रोफिल एनएडीपीएच ऑक्सीकारक, isoform NOX2, की सक्रियता के जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का एक झरना है कि रोगज़नक़ की मौत में खत्म आरंभ करता है। NOX2 प्रोटीन सबयूनिट्स phagosomal झिल्ली 3 में एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला जटिल बनाने के लिए आगे बढ़ें। एक बार सक्रिय, यह इलेक्ट्रॉनों फेगोसोम अंदर आणविक ऑक्सीजन के लिए झिल्ली भर एनएडीपीएच से transports, सुपरऑक्साइड anions और आगे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का निर्माण किया। यह श्वसन फट रूप में जाना जाता है, और यह कुशल माइक्रोबियल हत्या और पाचन 2 के लिए आवश्यक माना जाता है 4, 5 द्वारा किया जाता है। इस चैनल फेगोसोम में साइटोसोल से उनके विद्युत ढाल नीचे प्रोटॉन की निष्क्रिय आंदोलन के लिए अनुमति देता है। प्रोटॉन एकाग्रता पीएच से परिलक्षित होता है, इसलिए oxidase गतिविधि का एक दिया स्तर के लिए, फेगोसोम में पीएच मापने प्रभारी मुआवजे में protonic और गैर protonic रास्ते में से रिश्तेदार की भागीदारी के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

मानव न्युट्रोफिल फेगोसोम phagocytosis 5 के बाद लगभग 8.5 20-30 मिनट के लिए की एक क्षारीय पीएच है। यह NOX में अतिरिक्त गैर-प्रोटॉन आयन चैनल के अस्तित्व का तात्पर्य2 प्रेरित प्रभारी मुआवजा, संलयन और अम्लीय कणिकाओं और HVCN1 से एकमात्र मुआवजा की सामग्री की रिहाई, एक अम्लीय वातावरण बनाए रखना होगा ने कहा कि के विपरीत है। आयनों के आंदोलन इस नकारात्मक चार्ज भी असमस के माध्यम से फेगोसोम आकार में परिवर्तन लागू हो सकता है क्षतिपूर्ति करने के लिए। उच्च शारीरिक सांद्रता में न्युट्रोफिल में मौजूद इन आयनों हो सकता है: पोटेशियम आयनों फेगोसोम 6 में ले जाने के लिए दिखाया गया है, और क्लोराइड आयनिक आंदोलन एक और उम्मीदवार न्युट्रोफिल समारोह 7 के लिए महत्वपूर्ण है।

फेगोसोम में पीएच के विनियमन रोगाणुरोधी प्रोटीज गतिविधि 5 के लिए महत्वपूर्ण है। Myeloperoxidase (MPO) 6 पीएच पर इष्टतम गतिविधि है, जबकि cathepsin जी और इलास्टेज के लिए, इष्टतम स्तर को पीएच 7-9 और पीएच 8-10 कर रहे हैं, क्रमशः 5 प्रकट होता है। इसलिए, phagosomal पीएच में क्षणिक परिवर्तन मज़ा करने के लिए विभिन्न एंजाइमों के लिए गतिविधि आलों प्रदान कर सकता हैction। समझना कैसे पीएच न्युट्रोफिल माइक्रोबियल हत्या में शामिल है उपन्यास न्युट्रोफिल-बढ़ाने माइक्रोबियल एजेंट के डिजाइन के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

न्युट्रोफिल फेगोसोम एक उच्च प्रतिक्रियाशील माहौल है। यह, यह मुश्किल सही रूप में पीएच आकलन करने के लिए बनाता है क्योंकि रंगों को आसानी से ऑक्सीकरण जा सकता है, तकनीकी कलाकृतियों के लिए अग्रणी। ऐतिहासिक रूप से, fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) पसंद के रंग intracellular पीएच 8, 9 को मापने के लिए किया गया है। हालांकि, वहाँ न्युट्रोफिल phagosomal पीएच को मापने में इसके उपयोग के लिए कुछ नुकसान कर रहे हैं। यह अर्थ है कि यह केवल सही ढंग से, 5 से 7.5 से 8 पीएच स्तर को आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के रूप में यह पीएच <8 से 11 पर संतृप्त, 6.4 10 का एक pKa है। न्युट्रोफिल phagosomal पीएच बहुत अधिक क्षारीय 5 बन सकता है के रूप में, FITC संभावित पीएच परिवर्तन की पूरी रेंज पर कब्जा नहीं कर सकते हैं। एक और महत्वपूर्णन्यूट्रोफिल के संदर्भ में FITC के साथ नहीं कर सकते समस्या यह है कि यह MPO 12 से photobleached माना जाता है। MPO अवरोध करनेवाला, सोडियम azide, 13 photobleaching सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह दिखाया गया है कि सोडियम azide सीधे एक MPO स्वतंत्र ढंग से phagosomal पीएच कम करती है और इस तरह इस तरह के assays 5 में उपयोग के लिए अनुपयुक्त है।

अन्य intracellular रंगों की तुलना में, एस -1 7.5 10 का एक अपेक्षाकृत उच्च pKa है। अम्लीय परिस्थितियों में, अणु protonated है और जब 488 एनएम या इसके बाद के संस्करण पर उत्साहित 560 और 600 एनएम के बीच एक उत्सर्जन संकेत पैदा करता है। जब अणु अधिक क्षारीय परिस्थितियों में deprotonated है, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 600 एनएम खत्म हो गया है। इन दोनों तरंगदैर्य पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक अनुपात, उत्सर्जन पारी है, जो अधिक एकल प्रतिदीप्ति माप से विश्वसनीय है इंगित करता है के रूप में यह फ्लोरोफोरे एकाग्रता और कोशिका की संरचना से अप्रभावित है। एस -1, इस तरह के zymosan 14 के रूप में, प्रतिजनी सामग्री को संयुग्मित किया जा सकता है, हालांकि गर्मी को मार डाला (हांगकांग) कैंडिडा एल्बीकैंस पसंद किया जाता है के रूप में बड़े सतह क्षेत्र अधिक सुसंगत प्रतिदीप्ति पढ़ने देता है।

हम यह भी पीएच में अस्थायी परिवर्तन (चित्रा 3) 5 अध्ययन करने के लिए इस विधि का एक संशोधन का इस्तेमाल किया है। साइटोसोलिक पीएच की माप के लिए इस विधि को आसानी से, के रूप में कहीं अधिक क्षारीय phagosomes 14 के साथ वर्णित 15, 16, और कोशिकाओं अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है।

Protocol

आचार बयान: सभी पशु काम लाइसेंस और यूनाइटेड किंगडम गृह मंत्रालय की मंजूरी के साथ आयोजित किया गया। इस शोध में मानव की भागीदारी मानव अनुसंधान की नैतिकता पर संयुक्त यूसीएल / UCLH समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी प्रतिभागियों को सूचित सहमति प्रदान की है।

1. सी एल्बीकैंस की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक कैंडिडा डिस्क (देखें सामग्री सूची) एक YPD अगर प्लेट पर आगे बढ़ें। एक कॉलोनी उठाओ और YPD शोरबा के 15 एमएल में जोड़ें। 30 डिग्री सेल्सियस और 200 rpm पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में यह सेते हैं जब तक शोरबा बादल छाए रहेंगे (आमतौर पर के बारे में 2 दिन, या मोटे तौर पर 1 / एमएल से अधिक x 10 9 के एक एकाग्रता के लिए) है।
  2. कैंडिडा मध्यम नीचे स्पिन और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 50 एमएल में यह फिर से निलंबित। 10 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र। इस चरण में दो बार दोहराएँ।
  3. पीबीएस / कैंडिडा माध्यम के 50 एमएल युक्त ट्यूब 60 डिग्री सेल्सियस तक preheated एक जल स्नान में रखें ताकि पूरे ट्यूब रों है1 घंटे के लिए ubmerged।
    1. इसकी पुष्टि के लिये कैंडिडा एक YPD अगर प्लेट पर गर्मी को मार डाला, लकीर एक नमूना हैं और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। 5-9 करने के लिए गर्मी को मार डाला (हांगकांग) कैंडिडा एकाग्रता समायोजित x 10 8 / एमएल, कैंडिडा विकास पर निर्भर करता है, और एक -20 में 1 एमएल aliquots में संग्रहीत सी फ्रीजर °।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के सभी सेल की गिनती एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया।

2. एस -1 युग्मन गर्मी मारे गए (हांगकांग) कैंडिडा

  1. उच्च ग्रेड डाइमिथाइल sulfoxide के 100 μL (DMSO) में यह कमजोर द्वारा carboxy-एस -1 succinimidyl एस्टर (50 माइक्रोग्राम) के एक विभाज्य तैयार करें। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
  2. एक 15 एमएल ट्यूब में 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (8.3 पीएच) में 1 x 10 8 एच कैंडिडा के 1 एमएल तैयार करें।
  3. एच कैंडिडा करने के लिए एक समय है, जबकि मोटे तौर पर एक भंवर पर मिश्रण 2,000 आरपीएम (उच्च गति के लिए मध्यम) में एक बूंद के 100 μL 1 carboxy-S-जोड़ें। लपेटें एल्यूमीनियम फोईट्यूब के आसपास एल और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक रोलर पर रखें।
  4. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 2250 XG पर centrifugation द्वारा एच Candida- एस -1 (एच के सी सी-एस-1) तीन बार धोएं। पहले दो धोने के लिए, 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (पीएच 8.3) के 15 एमएल में गोली resuspend। तीसरे धोने के बाद, संतुलित नमक के घोल (बीएसएस) बफर के 1 एमएल में यह फिर से निलंबित (तालिका 1 देखें)।
  5. 100 μL aliquots में नालियों में एच के सी सी-एस -1 निलंबन स्थानांतरण और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
    नोट: कम सतह बाध्यकारी सामग्री, यदि संभव हो, के रूप में के साथ ट्यूब का प्रयोग करें एच के सी सी-एस -1 कणों सामान्य अपकेंद्रित्र ट्यूब की दीवार से चिपक कर सकते हैं।
  6. Opsonize एच के सी सी-एस -1
    1. मानव न्यूट्रोफिल के लिए, thawed के 100 μL एच के सी सी-एस -1 के लिए मानव आईजीजी सीरम के 100 μL जोड़ें।
    2. माउस न्यूट्रोफिल के लिए, सामान्य माउस सीरम के 50 μL जोड़ें और माउस कैंडिडा प्रतिरक्षा सीरम के 50 μL 5 μL 100 (एच कैंडिडा इंजेक्शन C57B6 चूहों से उत्पन्न)के एच के सी सी-एस -1।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी शेकर पर यह मिश्रण और 60-90 मिनट के लिए 1,100 आरपीएम, और उसके बाद 2 घंटे के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रोलर पर।
    4. 1 मिनट प्रत्येक के लिए 17,200 XG पर centrifugation द्वारा बीएसएस बफर में तीन बार धोएं। बीएसएस बफर के 100 μL में Resuspend।

3. न्यूट्रोफिल का अलगाव

  1. मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल के लिए, एक स्वस्थ दाता से venipuncture द्वारा खून की 15 एमएल लेने के लिए और 1,000 आइयू / एमएल हेपरिन सोडियम समाधान (हेपरिन के 60 μL खून की / 10 एमएल) के 90 μL युक्त एक 20 एमएल सिरिंज में रखें।
  2. एक विंदुक टिप का उपयोग करना, सिरिंज में 10% dextran समाधान के 1.5 एमएल इंजेक्षन। यह धीरे उल्टें 3 बार और यह बेंच पर सीधा खड़े छोड़ दें।
  3. 30-60 मिनट रुको, जब तक रक्त एक शीर्ष बफी कोट परत है कि भूसे रंग का है और एक नीचे की परत एरिथ्रोसाइट्स युक्त के साथ आधे में मोटे तौर पर विभाजित है,।
  4. ध्यान से एक सुई के माध्यम से ऊपर परत बाहर धक्का या एक विंदुक टिप के साथ उसे निकाल दें। यह मैं रखोna 15 एमएल ट्यूब। लाल परत बाहर ले करने से बचें। एक 5 एमएल विंदुक का प्रयोग, घनत्व ढाल माध्यम के 3-4 एमएल जोड़ने बफी कोट परत के नीचे ट्यूब दो अलग-अलग परतों प्राप्त करने के लिए की तह तक (सामग्री सूची देखें)। 10 मिनट के लिए 913 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: अगर माउस न्यूट्रोफिल का उपयोग कर (माउस न्युट्रोफिल अलगाव के लिए संदर्भ 17 देखें), कोशिका निलंबन कि अस्थि मज्जा से बजाय प्लावित किया गया है का उपयोग करें।
  5. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो, एक लाल गोली अकेली रह गई। धीरे भंवर गोली परेशान करने के लिए। गोली के लिए आसुत, autoclaved एच 2 ओ के 7 एमएल जोड़ें और 20 s के लिए उलटने गोली resuspend। 2x खारा के 7 एमएल जोड़ें और मिश्रण करने, शेष लाल रक्त कोशिकाओं lysing कई बार उलट।
  6. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और लगभग 4 x 10 6 / एमएल के लिए बीएसएस बफर में गोली resuspend।
    ध्यान दें: कोशिकाओं के इष्टतम माइक्रोस्कोपी के लिए, 1.5-6 x 10 6 के बीच सेल निलंबन एकाग्रता रखने

4. स्लाइड की तैयारी

  1. एक 8 अच्छी तरह से माइक्रोस्कोपी प्लेट पूर्व का इलाज अच्छी तरह से प्रत्येक में पाली एल लाइसिन की 200 μL (0.01% समाधान) के साथ (सामग्री सूची देखें) कमरे के तापमान पर 40-60 मिनट के लिए।
  2. पाली एल लाइसिन निकालें (पुन: उपयोग किया जा सकता है) और आसुत एच 2 ओ के 200 μL के साथ दो बार कुओं धो
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कदम 3.6 में तैयार सेल निलंबन के 200 μL जोड़ें। 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  4. एक ट्यूब के लिए उच्च ग्रेड DMSO के 100 μL जोड़कर 5 (और -6) -carboxy एस -1 acetoxymethyl (एस -1-AM) एस्टर (50 माइक्रोग्राम) के एक विभाज्य तैयार करें। भंवर मिश्रण। जब उपयोग में नहीं, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. एक छोटे से ट्यूब में 1.7 बीएसएस बफर के एमएल जोड़ सकते हैं और एस -1-AM के 20 μL। भंवर मिश्रण।
  6. कुओं बीएसएस बफर के 200 μL के साथ दो बार धोएं, और फिर एस -1-AM समाधान के साथ बफर बदलें। धीरे pipetting द्वारा अच्छी तरह के नीचे से जुड़ी कोशिकाओं के monolayer को परेशान नहीं करने पर ध्यान देंकुओं की दीवारों नीचे। कम से कम 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  7. कुओं बीएसएस बफर के 200 μL के साथ दो बार धोएं। एक अवरोध करनेवाला के परीक्षण के लिए बीएसएस बफर में उचित दवा के एक "मास्टर मिश्रण" बनाते हैं। कुओं अवरोध करनेवाला समाधान में दो बार धोएं।
    ध्यान दें: नियंत्रण में दवा वाहन (जैसे, DMSO या इथेनॉल) की एक ही राशि का उपयोग करने के साथ ही अवरोध करनेवाला के लिए इस्तेमाल किया गया था सुनिश्चित करें। जस्ता क्लोराइड के प्रभाव का परीक्षण करते हैं, तो, बीएसएस बफर कमी के.एच. 2 पीओ 4 का उपयोग करें (HEPES समाधान अकेले बफ़र कर सकते हैं) के रूप में जस्ता फॉस्फेट के साथ precipitates।
  8. 5 आयाम सुक्ष्ममापी लगभग 3 रों के लिए opsonized एच के सी सी-एस-1 (खंड 6.2) Sonicate। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 μL जोड़ें। 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते phagocytosis अनुमति देने के लिए, कोशिकाओं phagocytosis की फोटो के लिए imaged होने के लिए तैयार हो जाता है।

5. Confocal माइक्रोस्कोपी

  1. एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, लेजर तरंग दैर्ध्य इतना वें समायोजितकोशिकाओं पर 555 एनएम पर उत्साहित हैं और उत्सर्जन दो चैनलों, या डिटेक्टरों द्वारा पता लगाया जाता है: 560-600 एनएम और 600 एनएम से अधिक।
    नोट: विशिष्ट माइक्रोस्कोप मापदंडों प्रत्येक खुर्दबीन के लिए अलग और की आवश्यकता होगी शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना है।
  2. तेल के साथ एक 63X लेंस का उपयोग कोशिकाओं को देखें। केंद्र टाइल देखने पर निरंतर सेटिंग पर किसी छवि टाइल-स्कैन का उपयोग करें। , ध्यान और लेजर की तीव्रता और दो चैनलों के लाभ प्रतिदीप्ति तीव्रता और डिटेक्टर चैनलों के लाभ का उपयोग कर समायोजित छवि का अनुकूलन करने के।
  3. दोनों चैनलों को देखने के लिए सेटिंग्स का उपयोग कर छवि को विभाजित; जाँच कोशिका द्रव्य या रिक्तिकाएं में प्रतिदीप्ति तीव्रता का कोई संतृप्ति नहीं है। संतृप्ति लाल डॉट्स के रूप में प्रकट होता है। लेजर तीव्रता को कम इतना है कि लाल बिंदुओं का एक न्यूनतम संख्या में है, लेकिन कोशिकाओं और phagosomes काफी उज्ज्वल स्पष्ट रूप से देखने के लिए कर रहे हैं।
  4. जब संतुष्ट हों, पर क्लिक करें "आरंभ प्रयोग।" एक 9 टाइल स्कैन इमेज उत्पन्न होता है। छवि सहेजें एक जटिल फ़ाइल के रूप में की सिफारिशसॉफ्टवेयर है कि दो चैनलों (jpeg या टिफ नहीं) की एक समग्र छवि में शामिल है।

6. अंशांकन प्रयोगों

  1. अकेले कैंडिडा साथ पीएच मानक वक्र का निर्माण।
    1. प्रति तालिका 1 के रूप में, 13.0 करने के लिए 3.0 पीएच से बफ़र्स तैयार करें।
    2. एच के सी सी-एस -1 से एक विभाज्य (100 μL) ले लो। पर 17,200 एक्स जी 1 मिनट के लिए इसे नीचे स्पिन। सौंपा बफर के 500 μL में यह Resuspend।
    3. सबसे कम पीएच रेंज से शुरू, एक के लिए निलंबन जोड़ने अच्छी तरह से पूर्व इलाज किया (कदम 4.2 से)। कोंफोकल खुर्दबीन पर स्लाइड एक गर्म चरण 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट पर रखें।
    4. 10 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति हर मिनट रिकार्ड। प्रत्येक बफर के लिए दोहराएँ।
  2. सैपोनिन मानक वक्र।
    1. 1 x 10 7 मानव न्यूट्रोफिल 5 अलग और सबसे कम पीएच बफर के 1 एमएल में उन्हें फिर से निलंबित।
    2. विधि पी को मापने के लिए खंड 4 में वर्णित का पालन करेंन्यूट्रोफिल में hagosomal पीएच।
    3. 20 मिनट के लिए कैंडिडा निलंबन के साथ ऊष्मायन के बाद, 0.3% सैपोनिन जोड़ने (10% शेयर के 15 μL एक पूर्व इलाज किया (कदम 4.2 से) अच्छी तरह से) पकवान, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। 10 मिनट के लिए एक छवि हर समय दें। प्रत्येक बफर के लिए दोहराएँ।
  3. साइटोसोलिक पीएच मानक घटता उच्च K + / nigericin तकनीक 5, 18, 19 का उपयोग कर।
    1. बफ़र्स 13.0 करने के लिए, तालिका 1 में वर्णित पीएच 4.0 से बना लो।
    2. चरणों 4.1-4.7 का पालन करें, पूर्व इलाज किया कुओं में केवल न्यूट्रोफिल छोड़ने - प्रत्येक अच्छी तरह से एक अलग बफर को रोकने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस गर्म चरण के लिए स्लाइड जोड़ें और प्रतिदीप्ति 10 मिनट के लिए हर मिनट रिकॉर्ड है।
    3. नोट: यह के लिए साइटोसोलिक पीएच बाहरी समाधान के साथ स्थिर करने के लिए कुछ समय लग सकता है, लेकिन इस बिंदु के बाद, एस -1 अनुपात मूल्य हो जाता हैलगातार। मापने बाह्य एच के सी सी-एस -1 प्रत्येक प्रयोग में एक नियंत्रण की जाँच करने के कि किसी भी अवरोधकों जोड़ा एस -1 उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के साथ हस्तक्षेप या बफर पीएच को प्रभावित नहीं करते के रूप में काम कर सकते हैं।

7. छवि विश्लेषण

नोट: यहाँ, छवि विश्लेषण (प्रतिदीप्ति के quantitation) मुफ्त सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग करने के लिए निर्देश प्रदान की जाती है। ImageJ के उपयोग की सिफारिश की है।

  1. डाउनलोड करें और ImageJ संस्करण स्थापित> डेवलपर के निर्देशों के अनुसार 1.46r (https://imagej.nih.gov/ij/)। इस प्रोटोकॉल कहा जाता है के साथ संलग्न पूरक कोड फ़ाइल स्थापित करें "Phagosomal माप।"
  2. खुली छवि जम्मू और उपकरण पट्टी पर विश्लेषण के लिए चुने गए छवि फ़ाइल लोड। दो चैनलों गठबंधन करने के लिए, का उपयोग करें छवि> रंग> कम्पोजिट करें।
  3. जिसमें परिणाम स्टोर करने के लिए एक फ़ाइल चुनने के राइट क्लिक करें।
  4. उपकरण पट्टी पर लाइन उपकरण पर क्लिक करें और चौड़ाई बढ़ाने के लिए # लिए & डबल क्लिक करें34, 2 "।
  5. एक फेगोसोम की चौड़ाई में एक लाइन खींचें, और "उपाय पीएच" के लिए तो राइट क्लिक करें। दो चैनलों की औसत तीव्रता का अधिग्रहण किया है, और उनके अनुपात ImageJ में कोड फ़ाइल द्वारा स्वचालित रूप से गणना की जाती है।
  6. माप खत्म करने के बाद, चुनने के लिए राइट क्लिक करें "फ़ाइल सहेजें।"
  7. फेगोसोम क्षेत्र मापने के लिए, क्षेत्र के आसपास मुक्त हाथ आकर्षित करने के लिए उपकरण पट्टी के साथ चौथे आइकन का उपयोग करें। चयन करने के लिए राइट-क्लिक करें "उपाय क्षेत्र।"
    नोट: परिणाम सहेजे जाते हैं और एक लॉग फ़ाइल निर्देशिका का चयन किया में उत्पन्न होता है। परिणाम स्प्रेडशीट, अनुसंधान, या एक बराबर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कार्रवाई की जा सकती है। पीएच के प्रतिदीप्ति अनुपात के बीच संबंधों को लगभग sigmoidal है, और ImageJ विश्लेषण द्वारा उत्पन्न अनुपात मूल्यों एक सामान्यीकृत रसद या अवग्रह समारोह या रेखीय या घन पट्टी प्रक्षेप द्वारा का उपयोग कर पीएच में बदला जा सकता।
  8. कोशिका द्रव्य मापने के लिए, कोशिका द्रव्य भर में एक रेखा खींच और करने के लिए "उपाय पीएच राइट क्लिक करें"।

Representative Results

चित्रा 1 बदलती phagosomal वातावरण प्रदर्शित करने के लिए अलग मूल से न्यूट्रोफिल की फोटो प्रस्तुत करता है। मात्रात्मक विश्लेषण आसान बनाने के लिए यह कोशिकाओं की एक उचित संख्या के साथ कुओं बीज के लिए महत्वपूर्ण है: बहुत से, कोशिकाओं एक दूसरे पर परत कारण होगा इसे ठीक ढंग से संलग्न phagosomes देखने पर मुश्किल हो जाता है; बहुत कम होगा, निश्चित रूप से, कम परिणाम प्रदान करते हैं, विशेष रूप से के रूप में नहीं हर न्युट्रोफिल phagocytose होगा। चित्रा 2 एक छवि है कि अधिक संतृप्त है, लाल बिंदु दिखाने जहां अधिकतम प्रतिदीप्ति का पता चला है - यह अपने दो चैनलों के बीच छवि बंटवारे (सामग्री सूची या एक बराबर में सिफारिश की माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर) द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इस लेजर की तीव्रता को कम करके मुकाबला किया जा सकता है। विभिन्न बफर सिस्टम का उपयोग कर अंशांकन घटता लेविन एट अल से अनुकूलित 3 चित्र में दिखाया जाता है। 5 </ Sup>। त्रुटि सलाखों दिखाने रीडिंग के बीच प्रतिदीप्ति में कुछ बदलाव नहीं है। चित्रा 4 कैसे phagosomal पीएच और क्षेत्र के लिए डेटा प्रस्तुत किया जा सकता का एक उदाहरण देता है। यह दृष्टिकोण प्रत्येक व्यक्ति के माप एक से अधिक बिछाने boxplot साथ प्रदर्शित करने के लिए अनुमति देता है। हालांकि, डेटा भी एक हिस्टोग्राम बार चार्ट में प्रदर्शित किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्र 1: मनुष्यों और चूहों से न्यूट्रोफिल का उपयुक्त स्नैपशॉट छवियों। करने के लिए अब तक सही एस -1 से सना हुआ पीएच के लिए इसी phagosomes की अनुमानित रंग का एक गुणात्मक दृश्य की कुंजी है। पीले रंग अधिक अम्लता को इंगित करता है, जबकि लाल अधिक क्षारीयता इंगित करता है। माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल phagocytosis के बाद 20 मिनट - (ए) से पता चलता Hvcn1 - /। phagosomes बहुत, लाल क्षारीय, और सूजन दिखाई देते हैं। के निचले दाएं भाग में लाल तीरएक intracellular कैंडिडा करने के लिए छवि अंक है, जबकि एक बाह्य कण के लिए ऊपरी बाएं अंक में तीर। (बी) wildtype माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल कि कैंडिडा किया जाता है पता चलता है; / - - कोशिकाओं वे Hvcn1 से बहुत कम क्षारीय हैं। (सी) phagocytosis के बाद एक ही बिंदु पर मानव परिधीय रक्त neutrophils को दर्शाता है। वे माउस wildtype कोशिकाओं की तुलना में थोड़ा अधिक क्षारीय दिखाई देते हैं, लेकिन अभी भी phagosomes रूप में बड़ा नहीं और Hcvn1 के रूप में लाल कर रहे हैं - / - कोशिकाओं। (डी) मानव न्यूट्रोफिल कि 5 माइक्रोन diphenylene iodonium (डीपीआई) की उपस्थिति में कैंडिडा phagocytosed है पता चलता है। सभी phagosomes, बहुत अम्लीय हैं 6 या उससे कम की एक पीएच के साथ; दवा एनएडीपीएच ऑक्सीकारक रोकता है, इसलिए वहाँ कोई प्रतिपूरक आयन आंदोलन है। प्रोटॉन अम्लीय कणिकाओं कि फेगोसोम के फ्यूज से रिहा th के लिए अम्लीय pH 20, और वि ATPase के सक्रियण की वृद्धि की भर्ती का कारणडीपीआई 9 के साथ इलाज पर ई phagosomal झिल्ली। कोशिका द्रव्य भी अन्य शर्तों से कोशिकाओं की तुलना में अधिक क्षारीय प्रकट होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: से अधिक संतृप्ति Hvcn1 की - / - माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल। यह विश्लेषण छवियों जिसमें प्रतिदीप्ति डेटा पर संतृप्त कर रहे हैं से बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है। खंड 5.3 में वर्णित है, समग्र छवि दो छवियों (ऊपर छोड़ दिया है, लाल तीर) को व्यक्तिगत रूप से प्रस्तुत दोनों चैनलों के साथ में विभाजित है। इस सॉफ्टवेयर में, सीमा सूचक पर (नीचे छोड़ दिया, लाल तीर) चेक किया जाता है, तो किसी भी पिक्सल जिस पर संतृप्त कर रहे हैं चमकदार लाल कर रहे हैं। वहाँ दोनों चैनल में ओवर-द संतृप्ति वर्तमान (1 और 2) है। एक magnifकुछ कोशिकाओं के ication और बाह्य कैंडिडा तीर प्रभावित क्षेत्रों की ओर इशारा करते के साथ नीचे दाईं ओर स्थित दिखाया गया है,। इन बातों का विश्लेषण एक झूठी ratiometric माप करने के लिए नेतृत्व करेंगे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: पीएच माप के लिए एस -1 प्रतिदीप्ति अनुपात की रूपांतरण के लिए मानक अंशांकन घटता। कैंडिडा के लिए मानक घटता अलग बफ़र्स में अकेले और (के रूप में "Tris" लेबल) जब कोशिकाओं सैपोनिन ( "Saponin") के साथ permeabilized कर रहे हैं बहुत समान हैं, दिखा रहा है कि एस -1 के अंदर और पढ़ने सेल (फेगोसोम और बाह्य बाहर मध्यम) तुलनीय है। त्रुटि सलाखों ± एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। जब मैं परीक्षण किया एस -1 अनुपात / पीएच वक्र छोटा हैn कोशिका द्रव्य ( "कोशिका द्रव्य"), जो छवि विश्लेषण में ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह आंकड़ा लेविन एट अल से संशोधित किया गया है। 5। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: phagosomal पीएच और क्षेत्र की मात्रा। यह आंकड़ा डेटा प्रस्तुति का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है। Phagosomal अनुपात और इसी पीएच एक के लिए दिखाता है (- / - Hvcn1 माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल), बी: रेखांकन का उपयोग कर प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर आर ए उत्पन्न किया गया wildtype माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल, सी: मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल, और डी: मानव 5 माइक्रोन डीपीआई एन = 3/300 साथ न्यूट्रोफिल। अलग-अलग माप एक मेडी साथ boxplot डालने के साथ, छोटे वर्गों के रूप में दिखाया जाता हैएक और अन्तःचतुर्थक श्रेणी। एक लाल पट्टी मतलब प्रतिनिधित्व करता है। जैसा कि चित्र 1 में छवियों में देखा, Hvcn1 - / - कोशिकाओं बहुत क्षारीय phagosomes wildtype माउस और मानव न्यूट्रोफिल की तुलना में है। उन्होंने यह भी एक बड़ा phagosomal क्षेत्र (चित्रा 4 बी, एन = 3/300) है। मानव न्युट्रोफिल phagosomes, थोड़ा अधिक क्षारीय और wildtype माउस न्यूट्रोफिल से बड़े होते हैं, जबकि मानव डीपीआई के साथ इनक्यूबेट न्यूट्रोफिल बहुत अम्लीय और छोटे phagosomes की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<td> </ Tr>
बैलेंस्ड नमक के घोल (बीएसएस) बफर
सोडियम क्लोराइड 156 मिमी
KCl 3 मिमी
MgSO 4 2 मिमी
के.एच. 2 पीओ 4 1.25 मिमी
2 CaCl 2 मिमी
शर्करा 10 मिमी
Hepes 10 मिमी
NaOH या एचसीएल के साथ पीएच 7.4
YPD शोरबा
YPD शोरबा 50 ग्राम
आसुत जल 1 एल
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव
YPD अगर के लिए: पहले वाष्पदावी 15 ग्राम जोड़ने / एल अगर
10% Dextran समाधान
Dextran नैदानिक ​​ग्रेड 50 ग्राम
सोडियम क्लोराइड 4.5 ग्राम
आसुत जल 500 एमएल
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर कांच की बोतल और आटोक्लेव में जोड़े
2x नमकीन घोल
सोडियम क्लोराइड 18 ग्राम
आसुत जल 1 एल
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर कांच की बोतल और आटोक्लेव में जोड़े
10% Saponin शेयर
बीएसएस बफर 50 एमएल
सैपोनिन 5 ग्राम
37 डिग्री सेल्सियस के लिए हीट बीएसएस बफर, सैपोनिन जोड़ें और मिश्रण।
4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षक के रूप में 0.1% सोडियम azide, स्टोर मिश्रण जोड़ें।
अंशांकन बफ़र्स
कैंडिडा मानक वक्र
सबसे पहले प्रत्येक बफर के 0.15 एम स्टॉक श्रृंगार
0.15 एम सोडियम क्लोराइड समाधान बना लो
15 एमएल अंतिम मात्रा: 5 एमएल 0.15 वांछित बफर समाधान के एम + 10 एमएल 0.15 एम सोडियम क्लोराइड समाधान
पीएच 3 100 मिमी NaCl 50 मिमी ग्लाइसिन
पीएच 4 100 मिमी NaCl 50 मिमी एसीटेट
पीएच 5 100 मिमी NaCl 50 मिमी एसीटेट
पीएच 6 100 मिमी NaCl 50 मिमी एसीटेट
पीएच 7 100 मिमी NaCl 50 मिमी Tris
पीएच 8 100 मिमी NaCl 50 मिमी Tris
पीएच 9 100 मिमी NaCl 50 मिमी Tris
पीएच 10 100 मिमी NaCl 50 मिमी ग्लाइसिन
11 पीएच 100 मिमी NaCl 50 मिमी फॉस्फेट
पीएच 12 100 मिमी NaCl 50 मिमी फॉस्फेट
पीएच 13 100 मिमी NaCl 50 मिमी फॉस्फेट
साइटोसोलिक मानक वक्र
पहले से 0.15 एम स्टॉक बफर समाधान का इस्तेमाल किया
0.15 एम KCl समाधान बना लो
15 एमएल अंतिम मात्रा: 5 एमएल 0.15 वांछित बफर + 10 एमएल 0.15 एम KCl समाधान के एम
इथेनॉल में nigericin के 10 मिमी शेयर, प्रत्येक अंतिम मात्रा समाधान करने के लिए 15 μL जोड़ने
पीएच 3 100 मिमी KCl 50 मिमी ग्लाइसिन 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 4 100 मिमी KCl 50 मिमी एसीटेट 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 5 100 मिमी KCl 50 मिमी एसीटेट 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 6 100 मिमी KCl 50 मिमी एसीटेट 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 7 100 मिमी KCl 50 मिमी Tris 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 8 100 मिमी KCl 50 मिमी Tris 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 9 100 मिमी KCl 50 मिमी Tris 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 10 100 मिमी KCl 50 मिमी ग्लाइसिन 10 माइक्रोन nigericin
11 पीएच 100 मिमी KCl 50 मिमी फॉस्फेट 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 12 100 मिमी KCl 50 मिमी फॉस्फेट 10 माइक्रोन nigericin
पीएच 13 100 मिमी KCl 50 मिमी फॉस्फेट 10 माइक्रोन nigericin
पीएच या तो एचसीएल या NaOH के साथ सभी अंशांकन समाधान

तालिका 1: बफ़र्स की संरचना। इस तालिका में प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया विभिन्न बफ़र्स की उचित रचनाओं का वर्णन है।

पूरक कोड फ़ाइल। इस फ़ाइल में मैक्रो, एपी लेविन ने लिखा है, जो छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं के एक नंबर शामिल हैं। लेखकों इस कोड का उपयोग के साथ जुड़े किसी भी प्रश्न का समाधान करने की कोशिश करने में खुशी होगी। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक बार जब उचित अभिकर्मकों, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स, और अंशांकन प्रयोगों स्थापित कर रहे हैं, इस विधि अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए सरल है। महत्वपूर्ण चरणों में शामिल हैं: एस -1 के साथ कैंडिडा लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए डाई का कोई अधिक भार है कि वहाँ, कैलिब्रेट, और छवि का विश्लेषण।

एस -1 एक अभिकर्मक अधिक क्षारीय पीएच वातावरण के लिए अनुकूल है, जो न्यूट्रोफिल 21 के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, लेकिन कुछ प्रकार की कोशिकाओं में इसके उपयोग को सीमित करता है। इस तरह के बृहतभक्षककोशिका phagosomes, Snarf -4, या एस -4 के रूप में अधिक अम्लीय वातावरण, के लिए, इसकी कम pKa 22 की वजह से अधिक उपयुक्त है। इसके अलावा, अधिक सटीक cytoplasmic रीडिंग के लिए, यह बेहतर एस -4 का उपयोग करने, एस -1 के लिए मानक वक्र के रूप में पता चलता है कि प्रतिदीप्ति अनुपात 6 पीएच नीचे पठार करने के लिए शुरू (चित्रा 3) है। अन्य रंजक, जैसे 2 ', 7'-Bis- (2 carboxyethyl) -5 (और -6) -Carboxyfluorescein (BCECF) या pHrodo लाल भी एक शेष भाग में अधिक उपयुक्त हो सकता हैext कि अम्लीय होने की उम्मीद है। फिर भी कोशिका द्रव्य धुंधला अभी भी कैंडिडा युक्त phagosomes की सही पहचान के लिए आवश्यक है।

एक phagosomal पीएच सूचक की एक महत्वपूर्ण विशेषता है कि यह अपरिवर्तनीय प्रतिक्रियाशील phagosomal पर्यावरण से परिवर्तित नहीं होता है। एस -1 न्युट्रोफिल वातावरण के लिए प्रतिरोधी हो रहा है। यह लेविन एट अल द्वारा दिखाया गया है। / - - न्युट्रोफिल 5 जो phagocytosis और एक एस -1 लेबल कैंडिडा कण के बाद रिहाई एक Hvcn1 द्वारा प्रदर्शित (पूरक संदर्भ 5 वीडियो 4 देखें)। जब phagocytosed, कण पीला / नारंगी लाल (क्षारीय पीएच तटस्थ) से बदल जाता है, लेकिन जब कण न्युट्रोफिल द्वारा जारी की है, यह अपने मूल रंग करने के लिए देता है।

यह एस -1 का उपयोग कर के साथ जुड़े सीमाओं में से कुछ का उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है। तथ्य यह है कि यह डाई ratiometric meas की इजाजत दी दो उत्सर्जन स्पेक्ट्रा हैurement एक फायदा है, लेकिन विशेषज्ञ उपकरण चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है; प्रयोगों में प्रयुक्त किये माइक्रोस्कोप दो छवियों एक साथ या एक तुच्छ समय देरी से रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम होना चाहिए। लेखकों को लगता है कि शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल का प्रयास कर कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अनुभव है, या एक प्रशिक्षित पेशेवर की पहुंच है। हम सभी विशिष्ट माइक्रोस्कोप मापदंडों की सूची नहीं कर सकते हैं के रूप में वे एक खुर्दबीन के लिए अलग और शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। acetoxymethyl एस्टर एस -1 के लिए संयुग्मित कि डाई सेल कोशिका द्रव्य में फैलाना करने की अनुमति देता सेल कोशिका द्रव्य में गैर विशिष्ट esterases से अपमानित किया जाता है फ्लोरोसेंट अणु के रूप में। ऐसे alkaline फॉस्फेट के रूप में esterases,, मानव सीरम और भ्रूण गोजातीय सीरम, जो सेल संस्कृति मीडिया के पूरक के लिए उपयोग किया जाता है में मौजूद हैं। तदनुसार, माध्यम है जिसमें कोशिकाओं एस -1-AM (खंड 4.5) के साथ लोड किए गए हैं सीरम नहीं होनी चाहिए। यदि कोशिकाओं है कि एक और अधिक पोषक तत्वों से रिक की आवश्यकता का उपयोग कर इस चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता हैज मध्यम इस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया संतुलित नमक के घोल से उन्हें बनाए रखने के लिए। इसी प्रकार, इस तरह के फिनोल लाल के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट मध्यम घटकों, एस -1 माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।

3 चित्र में त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है प्रत्येक पीएच पर अनुपात माप में कुछ बदलाव नहीं है। प्रत्येक प्रयोग की पुनरावृत्ति की एक उपयुक्त संख्या (कम से कम n = 3) और प्रत्येक एकल प्रयोग में के रूप में कई अलग-अलग माप अंतर-vacuolar भिन्नता को दूर करने के लिए आवश्यक हैं। यह इस प्रकार के रूप में कई phagosomal क्षेत्रों है कि केवल एक कैंडिडा को रोकने के लिए दिखाई प्रत्येक शर्त के लिए कम से कम 100 phagosomes और का पीएच को मापने के लिए सलाह दी जाती है। Phagosomes quantitation उन है कि पूरी तरह से एक कैंडिडा कण (यानी, उन पूरी तरह से कोशिका द्रव्य से घिरा हुआ) घिरा हुआ है किया जाना चाहिए के लिए मापा जाना चाहिए। quantitation के लिए कोशिकाओं / phagosomes के चयन में अनजाने में पूर्वाग्रहों को कम करने के, सभी विश्लेषण करते हुए प्रदर्शन किया जाना चाहिएप्रयोगात्मक शर्तों को अंधा।

यहाँ, हम पूरे रक्त एक घनत्व ढाल के माध्यम से प्लाज्मा परत की centrifugation द्वारा पीछा के dextran अवसादन द्वारा न्यूट्रोफिल के अलगाव का वर्णन। हम इस तकनीक का प्रयोग के रूप में यह जल्दी से और कुशलता न्यूट्रोफिल का एक शुद्ध (> 95%) आबादी का उत्पादन, हालाँकि अन्य घनत्व ढाल सूत्रों या एंटीबॉडी या चुंबकीय के साथ विशेषज्ञ किट का उपयोग कर न्यूट्रोफिल के नकारात्मक चयन के माध्यम से पूरे रक्त centrifugation के रूप में अन्य तरीकों उपलब्ध हैं, मोती। हालांकि, बाद के अधिकांश समूहों जो न्यूट्रोफिल नियमित अलग के लिए महंगे हो सकता है। इसके अलावा, हम रक्त एकत्रित ट्यूब में थक्कारोधी हेपरिन उपयोग करते हैं, जबकि अन्य शोधकर्ताओं ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) या एसिड साइट्रेट सोडियम (एसीडी) का उपयोग करने के लिए और अधिक आदी हो सकता है। वहाँ कई अलग अलग तरीके से चुनने के लिए कर रहे हैं, यह शोधकर्ता की व्यक्तिगत पसंद पर निर्भर है।

इसके अलावा,जब अलग और न्यूट्रोफिल से छेड़छाड़ वे अत्यधिक सक्रियण से बचने के लिए कुछ देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। एहतियाती कदम शामिल हैं: केवल प्लास्टिक बर्तन का उपयोग कर, कोई गिलास; फ़िल्टर कर-नसबंदी सभी बफ़र्स किसी भी contaminating अन्तर्जीवविष दूर करने के लिए; जब कताई न्यूट्रोफिल यकीन अपकेंद्रित्र अच्छी तरह से अत्यधिक कंपन से बचने के लिए संतुलित है बनाते हैं; से कम समय न्यूट्रोफिल centrifugation के बाद एक गोली में रहते हैं जितना की सीमा; अधिक से अधिक 5 x 10 6 / एमएल के समाधान में न्यूट्रोफिल नहीं बनाए रखते हैं; और अलगाव के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रयोग करते हैं।

के रूप में अंशांकन चरणों के लिए वर्णित इस विधि, खुर्दबीन पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म मंच सेट का उपयोग और एक ही स्थिति से एक बार हर 30-60 रों स्नैपशॉट लेने के द्वारा समय के साथ पीएच और phagosomal क्षेत्र में परिवर्तन को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह भी सैद्धांतिक रूप से इस तरह के 96-अच्छी तरह प्लेटों में के रूप में उच्च throughput प्रयोगों, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और प्रयोगों प्रवाह cytometry के लिए है, जहां एस -1 कर सकते हैंएक pH इंडिकेटर 23 के रूप में इस्तेमाल किया जा। हालांकि, इन स्थितियों में, अलग-अलग सेल गतिविधि पर जोर देने के सेल आबादी पर एक अधिक वैश्विक प्रभाव से बदल दिया है।

इस विधि एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक सेटअप जिस पर अलग-अलग शोधकर्ताओं हित के अपने क्षेत्र के अनुरूप करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं प्रदान करना है। शोधकर्ताओं ने जब भी अन्य आयनों के आंदोलन को मापने, उदाहरण के लिए, intracellular कैल्शियम एकाग्रता के लिए न्युट्रोफिल phagosomal पीएच और क्षेत्र का पता लगाने कर सकते हैं। वहाँ कई फ्लोरोसेंट सीए 2 + इस तरह भारत-1 है, जो भी 400 और 475 एनएम 24 पर दोहरी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के रूप में संकेतक कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। ये उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य एस -1 उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ ओवरलैप नहीं है, लेकिन उत्तेजना तरंगदैर्ध्य स्पेक्ट्रम, कोशिकाओं के लिए हानिकारक जा सकती है, जिनमें से पराबैंगनी (यूवी) अंत में है, और एक यूवी लेजर सब सूक्ष्मदर्शी पर आम नहीं है। करने के लिए विभिन्न संकेतकों की एक व्यापक समीक्षामापने के intracellular कैल्शियम प्रवाह ताकाहाशी एट अल द्वारा कवर किया जाता है। 25 और Hillson एट अल। 26।

अंत में, वहाँ अन्य तरीकों Nunes एट अल के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग कर phagosomal पीएच को मापने के लिए उपलब्ध हैं। 13 के साथ-साथ अन्य समूहों 27, 28 का प्रदर्शन किया है। अन्य शोधकर्ताओं ने यह भी एस -1 का इस्तेमाल किया है साइटोसोलिक पीएच 29 या phagosomal पीएच 14 को मापने के लिए। / - - हालांकि, इस प्रोटोकॉल एक साथ दोनों साइटोसोल और फेगोसोम का पीएच, जो phagosomal पार-अनुभागीय क्षेत्र में परिवर्तन का पालन करने के लिए और wildtype और Hvcn1 के बीच अंतर करने का अवसर प्रदान करता मापने में अद्वितीय है माउस न्यूट्रोफिल, और के साथ और एक के बिना मानव न्यूट्रोफिल एनएडीपीएच ऑक्सीकारक काम कर रहे।

Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

इस काम कृपया वेलकम ट्रस्ट, जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद, और इर्विन जोफ़ मेमोरियल फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU Sigma-Aldrich RQC14003-10EA Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth Sigma-Aldrich Y1375 Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 MP Biomedicals 2101514 Use gloves 
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL  Fannin, Wockhardt UK Ltd FP1077 We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging Thermo Scientific/Invitrogen SS22801 Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Thermo Scientific/Invitrogen C1272 Use gloves
Vivaglobin human IgG  160 mg/mL solution CSL Behring received as a gift Various providers exist
Normal mouse serum Abcam ab7486 Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium) Alere Ltd 1114547 Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin Sigma-Aldrich N7143 Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375 Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503  Various providers exist
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333 Various providers exist
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266 Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016 Various providers exist
Glucose Sigma-Aldrich D9434 Various providers exist
Absolute Ethanol  Sigma-Aldrich 2860 Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI) Sigma-Aldrich D2926 Various providers exist
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086 Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine Sigma P4707 Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) Carl Zeiss The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat Thistle Scientific IB-80826 Other appropriate imaging dishes can be substituted
Soniprep 150 MSE Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter BioRad Various providers exist
1.5 mL Protein LoBind Tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6, (5), 515-517 (2016).
  2. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  3. Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657, (1), 1-22 (2004).
  4. Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588, (23), 4659-4665 (2010).
  5. Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10, (4), 0125906 (2015).
  6. Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, (6878), 291-297 (2002).
  7. Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135, (2), 511-522 (1996).
  8. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75, (7), 3327-3331 (1978).
  9. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277, (8), 6059-6066 (2002).
  10. Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  11. Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79, (17), 6775-6782 (2007).
  12. Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259, (8), 4812-4821 (1984).
  13. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
  14. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25, (21), 3330-3341 (2014).
  15. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
  16. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417, (2), 234-239 (1990).
  17. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95, (5), 827-839 (2014).
  18. Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, (42), 18022-18027 (2009).
  19. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18, (11), 2210-2218 (1979).
  20. Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4, (4), (2016).
  21. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290, (5805), 406-409 (1981).
  22. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71, (5), 2501-2510 (2005).
  23. Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12, (2), 127-132 (1991).
  24. Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24, (6), 551-556 (1993).
  25. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79, (4), (1999).
  26. Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
  27. Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77, (3), 243-252 (2010).
  28. Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (47), 6486-6495 (2015).
  29. Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260, (2), (1991).
न्युट्रोफिल फेगोसोम इमेजिंग और कोशिका द्रव्य एक Ratiometric पीएच संकेतक का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).More

Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter