Summary
Dette manuskriptet beskriver en enkel metode for å måle phagosomal pH-verdi og området samt det cytoplasmatiske pH av humane og muse nøytrofiler ved hjelp av kvotient- målings indikatoren seminaphthorhodafluor (snarf) -1, eller S-1. Dette oppnås ved hjelp av levende celler konfokal fluorescens mikroskopi og bildeanalyse.
Abstract
Nøytrofile er avgjørende for å være vert for medfødt forsvar og dermed utgjøre et viktig medisinsk forskning. Den fagosomet, i det intracellulære rommet hvor den dreping og fordøyelse av omsluttet partikler finner sted, er hoved arena for nøytrofil patogen dreping som krever tett regulering. Phagosomal pH er ett aspekt som er nøye kontrollert, på sin side å regulere antimikrobiell proteaseaktivitet. Mange fluorescerende pH-følsomme fargestoffer har blitt brukt til å visualisere phagosomal miljø. S-1 har flere fordeler i forhold til andre pH-følsomme fargestoffer, inkludert dens doble emisjonsspektra, dens motstand mot foto-bleking, og den høye pKa. Ved hjelp av denne metode, har man vist at de nøytrofile fagosomet er usedvanlig alkalisk i forhold til andre fagocytter. Ved å bruke forskjellige biokjemiske bøyning av fargestoff, kan det fagosomet være avgrenset fra cytoplasma, slik at forandringer i størrelsen og formen på fagosomet kan vurderes. Dette gjør at feller ytterligere overvåkning av ionisk bevegelse.
Introduction
De nøytrofile celler er den mest tallrike medfødte immun celle i kroppen. Dens hovedfunksjon består i patruljer blodet og henger og bearbeider de fremmede partiklene at det kan støte på i en prosess kjent som fagocytose 1, 2. Partiklene blir nedbrutt i et intracellulære rommet kalles fagosomet. Aktiveringen av nøytrofil NADPH oksidase, isoformen NOX2, initierer en kaskade av biokjemiske reaksjoner som kulminerer i død av organismen. NOX2 proteinsubenheter fortsette å danne en elektrontransportkjeden kompleks i phagosomal membran 3. Når den er aktivert, den transporterer elektroner fra NADPH over membranen til molekylært oksygen inne i fagosomet, produserer superoksydanioner og ytterligere reaktive oksygenarter. Dette er kjent som luft sprakk, og det er tenkt å være avgjørende for effektiv mikrobiell drap og fordøyelse 2 4, 5. Denne kanal gjør det mulig for den passive bevegelse av protoner ned deres elektrokjemisk gradient fra cytosol inn i fagosomet. Proton-konsentrasjonen blir reflektert ved hjelp av pH, slik at for et gitt nivå av oksidase aktivitet, kan måling av pH-verdien i den fagosomet gi informasjon om den relative deltakelse av proton og ikke-protoniske baner i charge kompensasjon.
Den human neutrofil fagosomet har en alkalisk pH på omtrent 8,5 i 20-30 minutter etter fagocytose 5. Dette innebærer eksistensen av ytterligere ikke-proton ionekanaler i NOX2-induserte ladning kompensasjon, som fusjon og frigivelse av innholdet av de sure granulene og såle erstatning av HVCN1 vil opprettholde et surt miljø, i motsetning til det som observeres. Bevegelsen av ioner for å kompensere denne negative ladning kan også utøve endringer i fagosomet størrelse via osmose. Disse kan være ioner som er tilstede i den nøytrofile ved høye fysiologiske konsentrasjoner: kalium-ioner har vist seg å bevege seg inn i det fagosomet 6, og klorid ionisk bevegelse er en annen kandidat viktig for nøytrofil-funksjons-7.
Reguleringen av pH-verdien i den fagosomet er avgjørende for antimikrobiell proteaseaktivitet 5. Myeloperoksidase (MPO) ser ut til å ha optimal aktivitet ved pH 6, mens for cathepsin G og elastase, de optimale nivåene er pH 7-9 og pH 8-10, henholdsvis 5. Derfor kan forbigående endring i phagosomal pH gi aktivitets nisjer for ulike enzymer til moroDette skjer. Å forstå hvordan pH er involvert i nøytrofil-mikrobielle dreping kan gi nyttig informasjon for utforming av nye nøytrofil-forsterknings mikrobielle midler.
Den nøytrofil fagosomet et meget reaktivt miljø. Dette gjør det vanskelig å nøyaktig vurdere pH, fordi farvestoffer kan lett oksyderes, noe som fører til tekniske gjenstander. Historisk har fluorescein-isothiocyanat (FITC) vært fargestoffet av valget for å måle intracellulær pH 8, 9. Det finnes imidlertid noen ulemper for dets bruk ved måling av nøytrofile phagosomal pH. Det har en pKa-verdi på 6,4 10, noe som betyr at det kan kun nøyaktig kan brukes til å vurdere pH-verdier 5-7,5 8, som det metter ved pH <8 11. Som det nøytrofile phagosomal pH kan bli mye mer basisk 5, kan FITC ikke fange opp hele omfanget av potensielle pH-endringer. En ytterligere signifiskrånende problem med FITC i sammenheng med nøytrofile er at det er tenkt å bli fotobleket av MPO 12. MPO-inhibitor, natriumazid, kan brukes til å begrense fotobleking 13, men det har vist seg at natriumazid direkte senker phagosomal pH-verdien i en MPO-uavhengig måte, og er derfor uegnet for bruk i slike analyser 5.
Sammenlignet med andre intracellulære fargestoffer, har S-1 en forholdsvis høy pKa-verdi på 7,5 10. I sure betingelser, er molekylet protonert og skaper en emisjon signal mellom 560 og 600 nm når eksitert ved 488 nm eller høyere. Når molekylet deprotoneres i mer alkaliske betingelser, er emisjonsbølgelengden over 600 nm. Et forhold på fluorescensstyrkene ved disse to bølgelengder viser emisjons skift, som er mer pålitelig enn enkelt er fluorescensmålinger, da den ikke påvirkes av fluoroforen konsentrasjon og cellestrukturen. S-1 kan konjugeres til antigent materiale, for eksempel zymosan 14, selv om varme-drepte (HK) Candida albicans er foretrukket, som det større overflateareal gir en mer ensartet fluorescens, lesing.
Vi har også anvendt en modifikasjon av denne fremgangsmåten for å studere tidsmessige forandringer i pH (figur 3) 5. Denne metode for måling av cytosolisk pH kan lett anvendes på andre celletyper, som beskrevet andre steder 15, 16, og celler med mer alkaliske phagosomes 14.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle dyr arbeidet ble utført med lisens og godkjenning av Storbritannia Home Office. Menneskelig deltakelse i denne forskningen ble godkjent av Joint UCL / UCLH komiteer på Ethics of Human Research. Alle deltakerne gitt informert samtykke.
1. Fremstilling av C. albicans
- Dyrk en Candida-plate (se Materials List) på en YPD agar plate i henhold til produsentens anvisninger. Plukk en koloni og legge det til 15 ml YPD-medium. Inkuber det i en risteinkubator ved 30 ° C og 200 opm inntil kjøttkraft er uklar (vanligvis ca. 2 dager, eller til en konsentrasjon på omtrent i løpet av 1 x 10 9 / ml).
- Spinne ned Candida medium og suspendere den i 50 ml fosfat-bufret saltvann (PBS). Sentrifuger ved 3000 x g i 10 min. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Plasser røret inneholdende 50 ml av PBS / Candida medium i et vannbad oppvarmet til 60 ° C slik at hele røret er submerged i 1 time.
- For å bekrefte at den Candida er varmedrept, strek en prøve på et YPD-agar-plate og inkubert over natten ved 30 ° C. Juster den varme-drepte (HK) Candida konsentrasjonen til 5-9 x 10 8 / ml, avhengig av Candida vekst, og lagre den i 1 ml aliquoter i en -20 ° C fryser.
MERK: Alle celletall i denne protokollen ble utført ved hjelp av en automatisert celleteller.
- For å bekrefte at den Candida er varmedrept, strek en prøve på et YPD-agar-plate og inkubert over natten ved 30 ° C. Juster den varme-drepte (HK) Candida konsentrasjonen til 5-9 x 10 8 / ml, avhengig av Candida vekst, og lagre den i 1 ml aliquoter i en -20 ° C fryser.
2. S-1 kobling til varmedrepte (HK) Candida
- Fremstill en aliquot av karboksy-S-1 succinimidylester (50 ug) ved fortynning i 100 ul av høy grad av dimetylsulfoksid (DMSO). Vortex godt å blande.
- Forbered 1 ml av 1 x 10 8 HK Candida i 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,3) i et 15 ml rør.
- Tilsett 100 ul av karboksy-S-1-en dråpe om gangen til HK Candida under blanding på en virvel ved omtrent 2000 rpm (middels til høy hastighet). Pakk aluminiums foil rundt røret og plassere den på en valse ved værelsestemperatur i 1 time.
- Vask HK Candida- S-1 (HKC-S-1) tre ganger ved sentrifugering ved 2250 x g i 10 minutter hver. For de første to vaskinger, resuspender pelleten i 15 ml 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,3). Etter den tredje vasking, resuspender den i 1 ml av balansert saltløsning (BSS) buffer (se tabell 1).
- Overfør HKC-S-1 suspensjons inn i rørene i 100 ul aliquoter og lagres ved -20 ° C.
MERK: Bruk rør med lav overflatebindende materiale, hvis det er mulig, som HKC-S-1 partikler som kan feste seg til veggen av normale sentrifugerør. - Opsonisere HKC-S-1
- For humane neutrofiler, tilsett 100 ul av humant IgG i serum til 100 ul opptint HKC-S-en.
- For mus neutrofiler, tilsett 50 pl av normalt museserum og 50 ul av mus Candida immunserum (generert fra C57B6-mus injisert med HK Candida) 5 til 100 ulav HKC-S-1.
- Bland det på en varme-risteapparat ved 37 ° C og 1100 opm i 60-90 minutter, og deretter på et 4 ° C valse i 2 timer.
- Vask tre ganger i BSS-buffer ved sentrifugering ved 17.200 x g i 1 minutt hver. Resuspender i 100 ul buffer BSS.
3. Isolering av neutrofiler
- For humane perifere blodneutrofiler, ta 15 ml blod ved venepunksjon fra en frisk donor og plassere den i en 20 ml sprøyte inneholdende 90 ul av 1,000 IU / ml heparin-natrium-oppløsning (60 ul av heparin / 10 ml blod).
- Ved hjelp av en pipette, injisere 1,5 ml av 10% dekstran-oppløsningen inn i sprøyten. Snu den forsiktig 3 ganger og la det stå oppreist på benken.
- Vent 30-60 min, til blodet er delt omtrent i to, med en topp buffy coat-laget som er stråfarget og et nedre lag inneholdende erytrocytter.
- Forsiktig ut den øverste laget gjennom en nål eller fjerne den med en pipettespiss. Sett det ina 15 ml tube. Unngå å ta ut det røde laget. Ved hjelp av en 5 ml pipette, tilsett 3-4 ml tettshetsgradient medium (se Materialer liste) til bunnen av røret under buffy coat-laget for å oppnå to distinkte lag. Sentrifuger ved 913 xg i 10 min.
MERK: Hvis ved hjelp av musen neutrofiler (se henvisning 17 for mus nøytrofil isolasjon), bruk av cellesuspensjonen som er blitt spylt fra benmargen i stedet. - Hell av supernatanten, etterlater en rød pellet. Forsiktig vortex å forstyrre pelleten. Legg 7 ml destillert, autoklavert H 2 O til pelleten og inverteres i 20 s for å resuspendere pelleten. Legg 7 ml 2x saltvann og snu et par ganger for å blande, lyse de gjenværende røde blodceller.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Hell av supernatanten og resuspender pelleten i BSS-buffer til omtrent 4 x 10 6 / ml.
MERK: For optimal mikroskopi av cellene, beholde cellesuspensjonen en konsentrasjon mellom 1,5 til 6 x 10 6
4. Fremstilling av lysbilder
- Forhånds behandle en 8-brønn plate mikroskopi (se Materialer List) med 200 ul av poly-L-lysin (0,01% oppløsning) i hver brønn i 40-60 minutter ved romtemperatur.
- Fjern poly-L-lysin (kan brukes på nytt), og vaske brønnene to ganger med 200 ul destillert H2O
- Tilsett 200 ul av cellesuspensjonen fremstilt i trinn 3.6 i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i 30-60 min.
- Fremstill en aliquot av 5- (og-6) -karboksy S-1-acetoksymetyl (S-1-AM) ester (50 ug) ved å tilsette 100 ul av høyverdig DMSO til en tube. Vortex å blande. Når den ikke er i bruk, oppbevares ved -20 ° C.
- I et lite rør, tilsett 1,7 ml av BSS-buffer og 20 ul S-1-AM. Vortex å blande.
- Brønnene vaskes to ganger med 200 ul av BSS-buffer, og deretter erstatte bufferen med den S-1-AM-løsning. Vær nøye med å ikke forstyrre monolayer av celler festet til bunnen av brønnen ved forsiktig pipetteringned veggene i brønnene. Inkuber ved romtemperatur i minst 25 min.
- Brønnene vaskes to ganger med 200 ul buffer BSS. For å teste en inhibitor, utgjør en "konsentrat-blanding" av det passende medikamentet i BSS-buffer. Brønnene vaskes to ganger i inhibitoroppløsningen.
MERK: Kontroller for å bruke den samme mengde av medikamentbærer (f.eks, DMSO eller etanol) i kontrollbrønnen som ble brukt for inhibitoren. Ved å teste effekten av sinkklorid, bruker BSS buffer mangler KH 2PO 4 (HEPES kan bufre løsningen alene), som sink utfelles med fosfat. - Sonicate opsonisert HKC-S-en (avsnitt 6.2) i ca. 3 s ved 5 amplitude um. Tilsett 10 ul til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 15-20 minutter for å tillate fagocytose, noe som gjør cellene klare for å bli avbildet for øyeblikksbilder av fagocytose.
5. konfokalmikroskopi
- Ved hjelp av et konfokalt mikroskop, justere laserbølgelengden slik at thved at cellene er eksitert ved 555 nm og emisjon blir detektert ved hjelp av to kanaler, eller detektorer: 560 til 600 nm og over 600 nm.
MERK: Spesifikke mikroskop parametre vil variere for hver mikroskop og må optimaliseres av forskeren. - Vis cellene ved hjelp av en 63X objektiv med olje. Bruk en flis-scan bilde på kontinuerlig innstillingen til å vise sentrum flis. Ved hjelp av fluorescensintensiteten og forsterkning av detektorkanaler, justere fokus og intensitet av laser og forsterkningen av de to kanaler for å optimalisere bildet.
- Delt bildet med innstillingene for å se begge kanaler; kontrollere at det ikke er noen metning av fluorescensintensitet i cytoplasma eller vakuoler. Metning vises som røde prikker. Reduser laser intensitet slik at det er et minimalt antall røde prikker, men cellene og phagosomes er lyse nok til å se klart.
- Når du er fornøyd, klikk på "Start eksperiment." En 9-flis skannebildet genereres. Lagre bildet som en kompleks fil anbefalt avprogramvaren som inneholder et sammensatt bilde av de to kanaler (ikke JPEG eller TIFF).
6. Kalibrerings Eksperimenter
- Konstruer pH standardkurven med Candida alene.
- Klargjør buffere fra pH 3,0 til 13,0, i henhold til tabell 1.
- Ta en alikvot (100 pl) av HKC-S-en. Spinner den ned i 1 minutt ved 17.200 x g. Resuspender den i 500 ul av den tilordnede buffer.
- Med start fra den laveste pH-området ved å legge til suspensjonen til en forhåndsbehandlet brønn (fra trinn 4,2). Plasser lysbildet på det konfokale mikroskop på en oppvarmet scenen satt til 37 ° C.
- Spill fluorescens hver min i 10 min. Gjenta for hver buffer.
- Saponin standardkurve.
- Isoler 1 x 10 7 humane neutrofiler 5 og resuspender dem i 1 ml av den laveste pH-buffer.
- Følge fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 4 for måling av phagosomal pH i neutrofiler.
- Etter inkubasjon med Candida suspensjonen i 20 minutter, tilsett 0,3% saponin (15 ul av 10% lager til en forhåndsbehandlet brønn (fra trinn 4,2)) til formen, og deretter inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C. Ta et bilde hvert minutt i 10 min. Gjenta for hver buffer.
- Cytosoliske pH standardkurver ved å bruke høye K + / nigericin teknikk 5, 18, 19.
- Utgjør de buffere som er beskrevet i tabell 1, fra pH 4,0 til 13,0.
- Følg trinn 4.1-4.7, slik at bare nøytrofiler i de på forhånd behandlede brønner - hver brønn for å inneholde en annen buffer. Tilsett skyv til 37 ° C oppvarmet trinn og registrere fluorescens hver min i 10 min.
- Merk: Det kan ta en viss tid for cytosolisk pH for å stabilisere med den eksterne oppløsning, men etter dette punkt, blir den S-1-forholdetkonstant. Måling av ekstracellulær HKC-S-1 i hvert forsøk kan tjene som en kontroll for å kontrollere at alle inhibitorene tilsettes ikke kommer i konflikt med den S-1 emitterte fluorescens eller påvirke buffer pH.
7. Bildeanalyse
MERK: Her instruksjoner for bildeanalyse (kvantifisering av fluorescens) ved hjelp av fri programvare ImageJ er gitt. Det anbefales å bruke ImageJ.
- Last ned og installer ImageJ versjon> 1.46r som per utvikleren instruksjoner (https://imagej.nih.gov/ij/). Installer tilleggskode filen vedlagt denne protokoll kalt “Phagosomal måling.”
- Åpne Image J og laste bildefilen valgt for analyse på verktøylinjen. For å kombinere de to kanalene, bruke Image> Farge> Gjør Composite.
- Høyreklikk for å velge en fil der du vil lagre resultater.
- Klikk på linjen verktøyet på verktøylinjen og dobbeltklikk for å øke bredden til & #34; 2 ".
- Tegn en linje langs bredden av en fagosomet, og høyreklikk for å "måle pH". Den gjennomsnittlige intensiteten av de to kanaler er oppnådd, og deres graden beregnes automatisk av kodefil i ImageJ.
- Etter endt målingene, høyreklikk for å velge "lagre filen."
- For å måle fagosomet området ved hjelp av fjerde ikonet langs verktøyet linjen for å trekke fri hånd rundt området. Høyreklikk og velg "måle området."
MERK: Resultatene lagres og en loggfil genereres i den valgte katalogen. Resultatene kan bli behandlet ved hjelp av et regneark, en R, eller en tilsvarende programvare. Forholdet mellom fluorescens-forholdet til pH er cirka sigmoidal, og de forholdsverdier generert av ImageJ analyse kan omdannes til pH ved anvendelse av en generalisert logistisk eller sigmoide-funksjon eller ved lineær eller kubiske spline interpolasjon. - For å måle cytoplasma, tegne en linje på tvers av cytoplasma og høyreklikk for å “måle pH”.
Representative Results
Figur 1 viser et øyeblikksbilde av nøytrofiler fra forskjellige steder for å vise varierende phagosomal miljøer. For å lette kvantitativ analyse, er det viktig å frø brønnene med et egnet antall celler: altfor mange vil føre cellene til lag over hverandre, noe som gjør det vanskelig å se vedlagte phagosomes presist; for noen vil selvsagt gi færre resultater, spesielt ettersom ikke alle nøytrofile vil fagocytoserer. Figur 2 er et bilde som er over-mettet; dette kan vurderes ved å dele bildet mellom de to kanaler (ved hjelp av mikroskop programvare anbefalt i Materials List eller en tilsvarende) - røde prikker viser hvor maksimal fluorescens er blitt påvist. Dette kan motvirkes ved å redusere intensiteten av laseren. Kalibreringskurver ved anvendelse av de forskjellige buffersystemer er vist i figur 3, er tilpasset fra Levine et al. 5 </ Sup>. Feilstolpene viser at det er en viss variasjon i fluorescens mellom avlesninger. Figur 4 gir et eksempel på hvordan data for phagosomal pH og området kunne bli presentert. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for hver enkelt måling som skal fremvises med en over-legging boxplot. Men dataene kan også vises i et histogram stolpediagram.
Figur 1: Passende snapshot bilder av nøytrofiler fra mennesker og mus. Helt til høyre er en kvalitativ visuell nøkkel av den omtrentlige fargen på S-1-farget phagosomes som tilsvarer pH-verdien. Den gule fargen indikerer mer surhet, mens rødt indikerer mer alkalitet. (A) viser Hvcn1 - / - mus-benmarg nøytrofiler 20 min etter fagocytose. De phagosomes vises veldig rød, alkalisk, og hovne. Den røde pilen i høyre del avbilledpunkter til en intracellulær Candida, mens pilen i øvre venstre punktene til et ekstracellulært partikkel. (B) viser villtype-mus benmargs nøytrofiler som har inntatt Candida; de er mye mindre alkalisk enn Hvcn1 - / - celler. (C) viser humane perifere blodneutrofiler ble bestemt på samme punkt etter fagocytose. De vises litt mer basisk enn mus villtype celler, men phagosomes er fortsatt ikke så stor og rød som Hcvn1 - / - celler. (D) viser humane nøytrofile celler som er utsatt for fagocytose Candida i nærvær av 5 uM difenylen jodonium (DPI). Alle phagosomes er meget sur med en pH-verdi på 6 eller mindre; medikamentet inhiberer NADPH oksidase, så det er ingen kompenserende ion bevegelse. Protonene frigjort fra de sure granulene som blandes til den fagosomet bevirke den sure pH 20, og økt rekruttering av den V-ATPase til the phagosomal membran ved behandling med DPI 9. Cytoplasma synes også mer alkalisk sammenlignet med celler fra andre forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Over-metning av Hvcn1 - / - benmarg fra mus neutrofiler. Det er viktig å utelukke fra analyse bilder hvor fluorescens data er overmettet. Som beskrevet i avsnitt 5.3, blir det sammensatte bilde delt i to bilder (øverst til venstre, rød pil) med begge kanaler er presentert individuelt. I denne programvare er rekkevidde indikatoren kontrolleres på (nederst til venstre, rød pil), så vil alle bildepunkter som er overmettet er lyse rødt. Det er overmetning som er tilstede i begge kanaler (1 og 2). En magnification av noen celler og ekstracellulær Candida er vist nederst til høyre, med piler som peker til berørte områder. Å analysere disse punkter ville føre til en falsk ratiometrisk måling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Standardkalibreringskurver for omdannelse av S-1 fluorescens forhold til pH-målinger. Standard-kurver for Candida alene i de ulike buffere (merket som "Tris"), og når cellene permeabilisert med saponin ( "Saponin") er svært like, som viser at S-1 lesing innenfor og utenfor cellen (fagosomet og ekstracellulære medium) er sammenlignbare. Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD. S-1-forhold / pH kurven blir avkortet når den ble testet in cytoplasma ( "cytoplasma"), som bør tas i betraktning ved bildeanalyse. Dette tallet er blitt endret fra Levine et al. 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kvantifisering av phagosomal pH og område. Denne figuren viser et eksempel på datapresentasjon. Kurvene som ble generert ved hjelp av programmerings R. A: viser ratio phagosomal og tilsvarende pH-verdi for A (Hvcn1 - / - mus benmarg neutrofiler), B: villtype-mus-benmarg neutrofiler, C: humane perifere blodneutrofiler, og D: human nøytrofile celler med 5 uM DPI n = 3/300. Individuelle målinger er vist som små firkanter, med en overliggende boxplot med medien og interkvartilt område. En rød søyle representerer gjennomsnittet. Som vist på bildene i fig 1, Hvcn1 - / - celler som har svært alkaliske phagosomes i forhold til villtype mus og humane neutrofiler. De har også et større phagosomal område (figur 4B, n = 3/300). Humane nøytrofile phagosomes er litt mer basisk og større enn villtype mus nøytrofiler, mens humane nøytrofiler inkubert med DPI ha meget sure og små phagosomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Balansert saltløsning (BSS) buffer | |||
| NaCl | 156 mM | ||
| KCl | 3 mM | ||
| MgSO4 | 2 mM | ||
| KH 2PO 4 | 1,25 mM | ||
| CaCl 2 | 2 mM | ||
| glukose | 10 mM | ||
| Hepes | 10 mM | ||
| pH 7,4 med NaOH eller HCl | |||
| YPD buljong | |||
| YPD buljong | 50 g | ||
| Destillert vann | 1 L | ||
| Autoklav ved 121 ° C i 15 min | |||
| For YPD-agar: før autoklavering tilsettes 15 g / l agar | |||
| 10% dekstranoppløsning | |||
| Dekstran klinisk grade | 50 g | ||
| NaCl | <td>4,5 g | ||
| Destillert vann | 500 mL | ||
| Legg til glassflaske og autoklav ved 121 ° C i 15 min | |||
| 2x Saline løsning | |||
| NaCl | 18 g | ||
| Destillert vann | 1 L | ||
| Legg til glassflaske og autoklav ved 121 ° C i 15 min | |||
| 10% saponin lager | |||
| BSS buffer | 50 mL | ||
| saponin | 5 g | ||
| Varme BSS-buffer til 37 ° C, tilsett saponin og bland. | |||
| Tilsett 0,1% natriumazid som konserveringsmiddel, lagre blandingen ved 4 ° C. | </ Tr>|||
| kalibrerings~~POS=TRUNC buffere | |||
| Candida standardkurve | |||
| Først utgjør 0,15 M lager av hver buffer | |||
| Sminke 0,15 M NaCl-løsning | |||
| 15 ml endelig volum: 5 ml 0,15 M av det ønskede bufferløsning + 10 ml 0,15 M NaCl-oppløsning | |||
| pH 3 | 100 mM NaCl | 50 mM glysin | |
| pH 4 | 100 mM NaCl | 50 mM acetat | |
| pH 5 | 100 mM NaCl | 50 mM acetat | |
| pH 6 | 100 mM NaCl | 50 mM acetat | |
| pH 7 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 8 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 9 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 10 | 100 mM NaCl | 50 mM glysin | |
| pH 11 | 100 mM NaCl | 50 mM fosfat | |
| pH 12 | 100 mM NaCl | 50 mM fosfat | |
| pH 13 | 100 mM NaCl | 50 mM fosfat | |
| Cytosoliske standardkurve | |||
| Bruk tidligere gjort 0,15 M lager bufferløsninger | |||
| Sminke 0,15 M KCl løsning | |||
| 15 ml endelig volum: 5 ml 0,15 M av ønsket buffer + 10 ml 0,15 M KCl-oppløsning | |||
| 10 mM stamløsning av nigericin i etanol, tilsett 15 ul til hver sluttvolum løsning | |||
| pH 3 | 100 mM KCl 50 mM glysin | 10 uM nigericin | |
| pH 4 | 100 mM KCl | 50 mM acetat | 10 uM nigericin |
| pH 5 | 100 mM KCl | 50 mM acetat | 10 uM nigericin |
| pH 6 | 100 mM KCl | 50 mM acetat | 10 uM nigericin |
| pH 7 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 8 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 9 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 10 | 100 mM KCl | 50 mM glysin | 10 uM nigericin |
| pH 11 | 100 mM KCl | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin |
| pH 12 100 mM KCl | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin | |
| pH 13 | 100 mM KCl | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin |
| pH alle kalibreringsløsninger med enten HCl eller NaOH | |||
Tabell 1: Sammensetning av buffere. Denne tabellen beskriver de aktuelle sammensetninger av de forskjellige bufferne som ble anvendt i protokollen.
Tilleggskode fil. Denne filen inneholder en rekke makroer skrevet av AP Levine, som er nødvendige for bildeanalyse. Forfatterne vil gjerne prøve å løse spørsmål knyttet til bruk av denne koden. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Når de passende reagenser, mikroskop innstillinger og kalibreringsforsøk er satt opp, er denne fremgangsmåte forholdsvis enkel å utføre. De kritiske trinnene omfatter: merking av Candida med S-1 for å sikre at det ikke er noen overbelastning av fargestoff, kalibrering, og analysere bildet.
S-1 er en reagens som er egnet til mer alkalisk pH-miljø, noe som er spesielt viktig for neutrofiler 21 men begrenser dens bruk i visse celletyper. For mer sure omgivelser, slik som makrofag phagosomes, snarf-4, eller S-4, er mer egnet på grunn av sin lavere pKa 22. Videre, for mer nøyaktige avlesninger cytoplasmiske, er det bedre å bruke S-4, som standard-kurve for S-1 viser at fluorescens-forhold begynne å flate ut under pH 6 (figur 3). Andre fargestoffer, så som 2' , 7'-bis (2-karboksyetyl) -5- (og-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) eller pHrodo Red kan også være mer hensiktsmessig i et fortsext som forventes å være sur. Ennå cytoplasma farging er fortsatt nødvendig for korrekt identifisering av phagosomes som inneholdt Candida.
Et viktig trekk ved en phagosomal pH-indikator er at det ikke er irreversibelt forandret ved den reaktive phagosomal miljø. S-1 synes å være motstandsdyktige mot den nøytrofile miljø. Dette er vist ved Levine et al. 5 (se terende video 4 av referanse 5), som demonstrerer den fagocytose og etterfølgende frigjøring av en S-1-merket Candida partikkel ved en Hvcn1 - / -, nøytrofile celler. Når utsatt for fagocytose, slår partikkel fra gul / oransje til rød (nøytral til alkalisk pH-verdi), men når partikkelen er utgitt av neutrofile, går den tilbake til sin opprinnelige farge.
Det er viktig å nevne noen av de begrensninger knyttet til bruk av S-en. Det faktum at dette fargestoffet har to emisjonsspektra som tillater ratiometrisk measurement er en fordel, men spesialutstyr er nødvendig for å hente bilder; mikroskop brukes for forsøkene må være i stand til å ta opp to bilder samtidig eller med en ubetydelig tidsforsinkelse. Forfatterne antar at forskeren forsøker denne protokollen har erfaring med konfokalmikroskopi, eller har tilgang til en profesjonell. Vi kan ikke liste opp alle de spesifikke mikroskop parametere som de vil variere for hver mikroskop og må optimaliseres av forskeren. Den acetoksymetylester konjugert til S-en som gjør at fargestoffet diffunderer inn i cellecytoplasmaet forringes av ikke-spesifikke esteraser i cellecytoplasmaet for å danne fluorescerende molekyl. Esteraser, for eksempel alkalisk fosfatase, til stede i humant serum og føtalt bovint serum, som brukes til å supplere cellekulturmedier. Følgelig må mediet hvor cellene er lastet med S-1-AM (seksjon 4.5) ikke inneholder serum. Dette kan vise seg utfordrende hvis du bruker celler som krever en mer næringsrik rich medium for å opprettholde dem enn den balanserte saltløsning brukt i denne protokollen. Likeledes kan andre fluorescerende mediumkomponentene, slik som fenol-rødt, interferere med S-1-målinger.
Feilstolpene i figur 3 indikerer at det er en viss variasjon i forholdet målinger ved hver pH. Et passende antall gjentagelser av hvert eksperiment (minst n = 3) og like mange enkeltmålinger i hvert enkelt forsøk for å overvinne den inter vacuolar variasjon. Det er således tilrådelig å måle pH-verdien på minst 100 phagosomes for hver tilstand og så mange phagosomal områder som synes å inneholde bare ett Candida. De phagosomes som skal måles for kvantifisering bør være de som er fullstendig omsluttet en Candida partikkel (dvs. de som er fullstendig omgitt av cytoplasma). For å redusere mot utilsiktede skjevheter i utvelgelsen av celler / phagosomes for kvantifisering, bør alle analyser utføres mensblind til de eksperimentelle betingelser.
Her beskriver vi isolering av nøytrofiler ved dekstransedimentering av helt blod, etterfulgt av sentrifugering av plasmalaget gjennom en tetthetsgradient. Vi bruker denne teknikk som det raskt og effektivt frembringer en ren (> 95%) populasjonen av nøytrofile celler, selv om det finnes andre metoder som er tilgjengelige, slik som fullblod sentrifugering gjennom andre tetthetsgradient formler eller negativ seleksjon av nøytrofiler ved bruk av spesialiserte byggesett med antistoffer eller magnetisk perler. Imidlertid kan sistnevnte være uoverkommelig dyrt for de fleste grupper som isolerer nøytrofile rutinemessig. I tillegg bruker vi den antikoagulerende heparin i blodoppsamlingsrøret, mens andre forskere kan være mer vant til å bruke etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller syrecitrat natrium (ACD). Ettersom det er mange forskjellige metoder å velge mellom, er det opp til personlig preferanse for forskeren.
Dessuten,ved isolering og manipulering av nøytrofiler de må håndteres med en viss forsiktighet for å unngå overdreven aktivering. Forsiktighets trinnene omfatter: bare ved hjelp av plast ware, ingen glass; filter-sterilisere alle buffere for å fjerne eventuelt forurensende endotoksin; når spinn neutrofiler sørge for at sentrifugen er godt balansert for å unngå for høye vibrasjoner; begrense så mye som mulig den tid neutrofiler forbli i en pellet etter sentrifugering; opprettholder ikke nøytrofiler i oppløsning på mer enn 5 x 10 6 / ml; og utføre forsøket så snart som mulig etter isolering.
Denne metoden kan være tilpasset for å måle endringer i pH-verdien og phagosomal område over tid ved anvendelse av et oppvarmet trinn satt til 37 ° C på mikroskopet og ta fotografier en gang hver 30 til 60 s fra den samme posisjon, som beskrevet for kalibreringstrinn. Det kan også teoretisk bli tilpasset for høyere gjennomstrømming eksperimenter, slik som i 96-brønners plater, og for flowcytometri eksperimenter, hvor S-1 boksbli anvendt som en pH-indikator 23. Men i disse innstillingene, er det lagt vekt på individuell celle aktivitet erstattet av en mer global effekt på cellepopulasjonen.
Denne metoden tar sikte på å gi en relativt enkel eksperimentelle oppsettet hvorpå enkeltforskere kan tilpasse til deres område av interesse. Forskere kan ønske å utforske nøytrofil phagosomal pH-verdi og området mens de også å måle bevegelsen av andre ioner, for eksempel, intracellulær kalsiumkonsentrasjon. Det er flere fluoriserende Ca2 + indikatorer er lett tilgjengelige for konfokal mikroskopi, for eksempel Indo-1, som også har to emisjonsspekter ved 400 og 475 nm 24. Disse emisjonsbølgelengder overlapper ikke med S-1 emisjonsspektra, men eksitasjonsbølgelengden er ved ultrafiolett (UV) ende av spekteret, noe som kan være skadelig for cellene, og en UV-laser ikke er vanlig på alle mikroskoper. En omfattende gjennomgang av de ulike indikatorene tilmåle intracellulær kalsium-fluks er dekket av Takahashi et al. 25 og Hillson et al. 26.
Som konklusjon, er det andre metoder er tilgjengelige for å måle phagosomal pH ved anvendelse av forskjellige fluorescerende fargestoffer som Nunes et al. har demonstrert 13, så vel som andre grupper 27, 28. Andre forskere har også benyttet S-1 for å måle cytosolisk pH 29 eller phagosomal pH 14. Imidlertid er denne protokollen unikt i å måle samtidig pH-verdien i både cytosol og fagosomet, som gir mulighet til å observere endringer i phagosomal tverrsnittsareal og for å skille mellom villtype og Hvcn1 - / - mus neutrofiler og humane neutrofiler med og uten arbeider NADPH oksidase.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble velvillig finansiert av Wellcome Trust, bioteknologi og Biological Sciences Research Council, og Irwin Joffe Memorial Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
| YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
| Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
| Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
| SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
| Vivaglobin human IgG 160 mg/mL solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
| Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
| Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
| Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm) | |
| Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
| Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |
References
- Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).
- Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
- Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).
- Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).
- Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).
- Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
- Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
- Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).
- Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).
- Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
- Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).
- Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).
- Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
- Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).
- Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24 (6), 551-556 (1993).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79 (4), (1999).
- Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
- Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).
- Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).
- Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).
