Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Overvågning Astrocyte reaktivitet og spredning in Vitro iskæmisk-lignende betingelser

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Iskæmisk slagtilfælde er en kompleks event hvor astrocytter til regionen berørte hjerne særlige bidrag udsat for glucose iltmangel (OGD) er vanskelige at undersøge. Denne artikel introducerer en metode til at opnå isolerede astrocytter og studere deres reaktivitet og spredning OGD betingelser.

Abstract

Iskæmisk slagtilfælde er en kompleks hjerneskade forårsaget af en blodprop eller embolus blokerer blodtilførslen til dele af hjernen. Dette fører til fratagelse af ilt og glukose, som forårsager energi fiasko og neuronal død. Efter en iskæmisk slagtilfælde fornærmelse, astrocytter blive reaktive og formere sig omkring skaden site, da det udvikler. Under dette scenario er det svært at studere astrocytter til regionen hjernen udsat for iskæmi særlige bidrag. Derfor, denne artikel introducerer en metode til at studere primære astrocyte reaktivitet og spredning under en in vitro- model af en iskæmi-lignende miljø, kaldet glucose iltmangel (OGD). Astrocytter blev isoleret fra 1-4 dag-gamle neonatal rotter og antallet af ikke-specifik astrocytic celler blev vurderet ved hjælp af astrocyte selektive markør Glial fibrillære sure Protein (GFAP) og nukleare farvning. Perioden hvor underkastes astrocytter OGD betingelse kan tilpasses, samt procentdelen af ilt de udsættes for. Denne fleksibilitet giver forskerne til at karakterisere varigheden af iskæmisk-lignende tilstand i forskellige grupper af celler in vitro. I denne artikel beskrives de tidsrammer af OGD, der inducerer astrocyte reaktivitet, hypertrofisk morfologi og spredning målt ved immunfluorescens ved hjælp af prolifererende celle nukleare Antigen (PCNA). Udover spredning, astrocytter gennemgå energi og oxidativ stress, og reagere på OGD ved at frigive opløselige faktorer i celle medium. Dette medie kan indsamles og bruges til at analysere virkningerne af molekyler udgivet af astrocytter i primære neuronal kulturer uden celle til celle interaktion. I sammendrag, kan denne primære celle kultur model bruges effektivt at forstå rollen af isolerede astrocytter efter skade.

Introduction

Slagtilfælde er defineret som "en akut neurologisk dysfunktion af vaskulær oprindelse med enten pludselig eller hurtig udvikling af symptomer og tegn, svarende til inddragelse af fokale områder i hjernen"1,2. Der er to typer af slagtilfælde: blødende og iskæmisk. Når vaskulær dysfunktion er forårsaget enten af en aneurisme eller en arteriovenøs funktionsfejl, ledsaget af svækkelse med posterior ruptur af en arterie, er dette kaldes blødende stroke3 som i de fleste tilfælde fører til døden. Når en blodprop eller en embolus hindrer blodgennemstrømningen, kaldes forårsager en midlertidig frihedsberøvelse af ilt og glucose til et område af hjernen, det iskæmisk slagtilfælde4. Undladelse af at nære cellerne omkring det berørte område eller iskæmiske kerne fører til En homeostatiske og metabolisk ubalance, energiske dysfunktion, neuronal død og inflammation5, som kan fremkalde et livslang handicap for patienter6.

Iskæmisk slagtilfælde er en multifaktoriel skade, som omfatter flere typer af celler, der reagerer og udøve deres virkninger på forskellige tidspunkter. Mange interaktioner oprette et vanskeligt miljø for at studere funktionsmåden for individuelle celler. Så hvordan vi studere bidrag af en bestemt celletype under sådan et komplekst miljø? En accepteret i vitro model af iskæmi består af udsætter celler til ilt og glucose afsavn (OGD), i en vis periode, efterfulgt af restaureringen af celler til et normoxic miljø. Dette system simulerer en iskæmisk slagtilfælde efterfulgt af blod reperfusion. I denne metode, er celler eller væv udsat for en glucose-gratis medier i et miljø, der er renset for ilt, ved hjælp af en specialiseret hypoksiske kammer. OGD inkubationstiden kan variere fra et par minutter op til 24 timer, afhængigt af den hypotese, at ønsker at blive testet. Undersøgelser har vist, at afhængigt af tider af OGD og normoxic miljø, specifikke fænotyper af slagtilfælde (dvs., akut eller subkronisk) kan opnås. Primære isolerede astrocytter, udsat for OGD med posterior restaurering normoxic betingelser, er velundersøgte cellulære model at efterligne slagtilfælde in vitro-7. Ved hjælp af OGD er muligt at afsløre de uafhængige molekylære mekanismer i isolerede celler under et slagtilfælde-lignende miljø.

Vores viden om astrocyte biologi stiger, er det blevet tydeligt, at de er afgørende for at opretholde synapser og fastholde neurale reparation, udvikling og plasticitet8. Under normale omstændigheder, astrocytter frigive og reagere på cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer og gliotransmitters, at holde stofskiftebalance og homøostase i synapser5,9. I akutte neuroinflammation, såsom iskæmisk slagtilfælde, kan disse celler blive reaktiv, vise en langsigtet overekspression af Glial fibrillære sure Protein (GFAP), og vise hypertrofi i deres morfologi5,10, 11 , 12. som den iskæmisk infarkt udvikler, homøostase, som astrocytter bliver påvirket, om normale glutamat optagelse, energimetabolisme, udveksling af aktive molekyler, og antioxidant aktivitet13.

Reaktiveret astrocytter formere sig omkring infarkt væv mens leukocytter vandrer mod lesioned område14. Astrocytic spredning kan måles ved hjælp af markører som prolifererende celle nukleare antigen (PCNA), Ki67 og bromodeoxyuridine (BrdU)15. Denne proliferativ svar er genereret i en tidsafhængig måde og det hjælper danner glial arret, en bred vifte af uigenkaldeligt reaktive astrocytter langs parenkym af den skadede lokalitet efter en skade9. En af de oprindelige funktioner i dette ar er at begrænse den immun celle ekstravasation fra dette område. Undersøgelser har dog vist, at arret bliver en fysisk hindring for axoner udvide, som de frigive molekyler hæmme cytoskeletale vækst, og skabe en fysisk barriere, der forhindrer axoner fra strækker sig rundt om det skadede område16. Der er dog videnskabelige beviser for, at efter en rygmarvsskade, helt forhindrer glial ar dannelse kan forringe regenerering af axoner17. Således, den kontekst hvor den specifikke astrocytic reaktion måles, skal tages i betragtning ved rammerne af den skade, der er undersøgt.

Den præsenteres metode kan anvendes til at studere den individualiserede funktion af astrocytter efter glukose iltmangel og det kan ændres afhængigt af de spørgsmål, som efterforsker ønsker at besvare. For eksempel, udover de morfologiske forandringer og markører udtrykt på forskellige OGD tidspunkter, analysere fra astrocytter udsat for OGD kan yderligere analyseres for at identificere opløselige faktorer udgivet af disse celler, eller bruges som konditioneret medie til at vurdere sin effekt i andre hjerneceller. Denne tilgang gør det muligt for undersøgelser på astrocyte reaktivitet, der kan føre til udredning af de faktorer, der styrer og modulere deres svar i en iskæmisk slagtilfælde scenario.

Protocol

postnatal rotter (Sprague Dawley) 1-4 dage gamle bruges til at isolere cortex. Metoden til aktiv dødshjælp er halshugning, som er godkendt af NIH retningslinjer.

1. forberedelse af instrumenter og materialer til kirurgi

  1. Sterilize instrumenter i en autoklave (temperatur: 121 ºC, pres: 15 psi, tid: 30 min) ved hjælp af en stålkasse eller et øjeblik forsegling sterilisation pose. Se materialerne i Table of Materials.

2. Komplet DMEM forberedelse

  1. i en 1 liter bægerglas indeholdende 700 mL autoklaveres vand, tilføje Dulbecco ' s ændret Eagle ' s Medium pulver ved stuetemperatur.
  2. Tilføje 3,7 g/L natriumbikarbonat, mens opløsningen omrøres med en magnetomrører.
  3. Juster pH-værdien til 7.4, med autoklaveres vand bringe volumen op til 1 L, derefter filtreres. Henblik på kultur, supplere den ønskede mængde af medier med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin og varm på 37 ˚C. Se materialerne i Table of Materials.
    Bemærk: PH var justeret til 7.4 via indsætte pH meter elektrode i medierne. Medierne skal omrøring, derefter langsomt tilføje 1 M NaOH ved hjælp af en pipette.

3. Primære Astrocyte kultur

Note: efter såning, celle medier skal ændres hver tre dage og celler kan dyrkes op til confluency (11-13 dage). På den tredje dag, tryk på kolben flere gange til lift microglial celler og oligodendrocyte stamceller fra kulturen, fjerne alle de ' gamle ' medier, vaskes to gange med 10 mL PBS, Aspirér PBS, derefter tilføje friske nye medier. Se materialerne i Table of Materials.

  1. Dissektion af nyfødte rat brain
    1. udføre dissektion i vævskultur hætte. Få 1-4 dage gamle nyfødte rotte unger (2 rat brains bruges pr. 75 cm 2 kolbe).
    2. Forberede tre 60 mm petriskåle og afpipetteres 5 mL af komplet DMEM på hver.
      Bemærk: De kan opdeles som følger: #1 for hver rotte hjerne, #2 for alle cortex af hjerner og #3 for alle de skrællede cortex (uden meninges).
    3. Forstå pup og spray med 70% ethanol. Hug hovedet af den og kassér kroppen i en lille biohazard spildbakken.
    4. Benytter de micro-dissekere pincet, holde hovedet og skære huden på toppen af hovedet til at eksponere kraniet.
    5. Med en anden saks, gøre en " T " snit fra bagsiden af kraniet mod næsen. Bruge et par pincet forsigtigt fjerne kraniet.
    6. Fjern udsatte hjernen med et par pincet og læg hjernen i en af petriskåle tidligere fyldt med medium.
    7. Bruger et andet sæt af sterile instrumenter for de efterfølgende skridt.
    8. Bruge mikro-dissekere pincet til blidt sted en hjerne på en 60 mm petriskål inverteret låget. Når petriskålen placeres på steril gaze, er det muligt at se hjernen klart, og det er nemmere at dissekere.
    9. Steady hjernen med mikro-dissekere pincet og adskille cerebral halvkugle af forsigtigt drilleri langs midterlinjen revne med den skarpe ende af den mikro-dissekere pincet.
    10. Deflect og skræl cortex, efterlod den hvide substans, og overføre dem til en petriskål, tidligere mærket #2. Gentag proceduren for alle de hjerner, kombinere alle de dissekerede cortex i petriskålen mærket #2.
    11. Tag hippocampus fra nedenunder hver cortex og kassere det.
    12. Bruger den mikro-dissekere pincet og en 60 mm petri til forsigtigt skræl meninges fra de enkelte kortikale kamre, og placere dem i petriskålen mærket #3.
  2. Væv dissociation: homogeniseringsapparat blender metode
    1. hældes sterile blender taske væv/medium affjedring (flåede cortex i hjernen) og tilføje nok medium for at bringe den samlede mængde i posen til 5 mL.
    2. Sted taske i homogeniseringsapparat blender, forlader ca 2 cm af posen synlig over den lukkede dør. Celle dissociation er gjort under 2,5 min ved høj hastighed.
      Bemærk: Alternativt kan dette gøres ved at lukke posen og forsigtigt dunkende det med et bæger i hætten. Sørg for at bruge en klud taske og bæger for at undgå gnidninger.
    3. Hældes en nummer 60 mesh si cellesuspension og derefter hælde den filtrerede gennemstrømningen på nummer 100 sigten, gør det muligt at filtrere ved hjælp af tyngdekraften.
    4. Ved hjælp af 15 mL rør, centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i en klinisk centrifuge (helst swing spand rotor) i 5 min.
    5. Hæld supernatanten i et bægerglas, derefter ved hjælp af en serologisk pipette, genopslæmmes og adskille pellet af celler i et maksimum på 5 mL af media.
  3. Celle tælle
    1. med en mikropipette, indsamle 100 µL af cellesuspension i 1,5 mL microcentrifuge rør og tilsæt 100 µL af trypan blå.
    2. Indsætte 10 µL af den indsamlede suspension i hemocytometer og tælle alle de celler, der er bæredygtige i de fire hjørner af pladsen.
    3. Formler til beregning af massefylde af celler før forberede kolberne er:
      Equation 1
      Equation 2
    4. tilføje mindst 500.000 celler pr. 25 cm 2 kolbe. Der afpipetteres op til 5 mL af DMEM i hver kolbe. Blandingen bør ikke nå kolbens hals. Placere dem i et 37 ° C inkubator på 5% CO 2, for 3 dage, derefter ændre medierne.
  4. Astrocyte rensning teknikker: medier ændrer, mekaniske og kemiske strategier
    Note: den metaboliske sats af astrocytter er høj sammenlignet med andre celletyper, derfor i ernæringsmæssigt berøvet betingelser, disse celler viser lav overlevelsesrate efter et par dage. I modsætning til astrocytter, mikroglia påvirkes ikke af ernæringsmæssige afsavn og formere sig i sådanne miljøer 18. For at opretholde en reduceret antallet af microglial celler, ændre forfatterne astroglial celle Kulturmedier hver 3 dage. Denne konstante ændring i celle medier vil også mindske den microglial befolkning, der kan vokse på toppen af astrocytic celle éncellelag i kolben 19.
    1. Brug en Pasteur pipette til Aspirér medier med ikke-tilhænger microglial celler fra hver af kolberne. Vask snavs efterladt ved hjælp af steril-filtreret PBS til hver af kolberne i en dråbevis måde (5 mL/kolbe).
    2. Tilføje den sterile-filtreret DMEM (med antibiotika og føtal bovint serum) dråbevis til hver kolbe (5 mL/kolbe). Gnub blidt i en cirkulær bevægelse til at dække hele overfladen.
    3. Sted celler i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2 til 8-10 dage indtil kolberne nå confluency (> 95% plade dækning).
      Bemærk: Flere protokoller har vist, at når astrocytter nå confluency, mekaniske metoder, som ryster kultur fra 2 til 24 h, fører til udstationering af celler, der ligger på toppen af disse astrocytter, hovedsagelig mikroglia og forløber celler 19 , 20.
    4. Non-astrocytic celler reduceres i kultur ved at udføre, orbital ryster på 180 rpm i 30 min. Efter fjernelse af celler i supernatanten, friske medier er pipetted i kolben (~ 15 mL).
    5. At fjerne stamceller oligodendrocyte øge ryster hastighed til 200 rpm for 6 h 21 , 22 , 23, aspirat supernatanten og afpipetteres friske medier.
      Bemærk: For at mindske tilstedeværelsen af mikroglia i kulturer, to kemiske metoder kan anvendes sekventielt (ikke samtidigt) i den primære celle kultur metode: Arabinose cytosin (Ara-C) og L-leucin methyl ester (LME) 24.
    6. Straks, når celler når confluency (100%), 3-4 dage efter mekanisk fjernelse af mikroglia, disse celler kan behandles med 8 µM af den antimitotic sammensatte Arabinose cytosin (Ara-C) i DMEM i 5 dage (ændring til frisk Ara-C i DMEM dagligt).
      Bemærk: Tidspunkt at tilføje Ara-C er kritisk, da dette stof er en antimitotic medicin, der reducerer antallet af hurtigt dividere celler såsom mikroglia 19 , 25 og fibroblaster 26 . I modsætning til mikroglia, når sammenflydende, astrocytter stoppe prolifererende via kontakt hæmning 27.
    7. Tillade 2 dage for cellerne til at inddrive fra Ara-C behandling.
    8. Til yderligere reduktion af microglial kontaminering, når celler når confluency, bruge 50 mM af L-leucin methylester (LME) i DMEM fast på pH 7,4, i 1 timer ved 37 ˚C.
      Bemærk: LME krydser membranen af celler og organeller, og efter at være hydrolyseret, L-leucin produceret ophobes i lysosomer af disse celler. Ophobning af denne aminosyre fører til en osmotisk hævelse og brud på lysosomer 28 , 29. LME er yderst effektive til at fjerne mikroglia, i forhold til andre celler 20 , 30.

4. Dyrke astrocytter i 6-godt plader

  1. belægning coverslips med poly-D-lysin
    1. Læg en coverslip i hver 35 mm petriskål, derefter tilsættes 100 µL af de fortyndede Poly-D-lysin løsning til hver coverslip og vente 1 h.
    2. Fjerne Poly-D-Lysin og vaskes to gange med 2 mL sterilt vand.
    3. Fjerne vand og afvente coverslips at tørre inde i hætten. Gemme coverslips på-20 ° C i op til to uger.
      Bemærk: Fryse den fortyndede Poly-D-lysin løsning; den kan opbevares i op til to uger.
  2. Trypsinization
    1. ved hjælp af Pasteurs pipette, Aspirér medium fra kolberne. Tilføj 5 mL/kolbe af steril-filtreret PBS til forsigtigt skyl cellerne.
    2. Aspirat fra PBS, og derefter tilsættes 5 mL/kolbe steril-filtreret 0,25% Trypsin og 0,5 mM EDTA-oploesning. Kolben anbringes i de 37 ˚C, 5% CO 2 inkubator for 10 min.
      Bemærk: Mens cellerne inkubere, varm 5 mL/kolbe af frisk komplet DMEM på 37 ° C.
    3. Efter 10 min til inkubation agitere for at sikre alle celler er løftet kolben. Hurtigt tilføje 5 mL varm komplet DMEM til hver kolbe, at neutralisere trypsin.
    4. Forsigtigt afpipetteres celler op og ned flere gange for at bryde op nogen " klumper ". Overføre suspenderede celler fra to kolber til en 15 mL konisk centrifugeglas.
    5. Centrifugeres i 5 min. ved 200 x g at indsamle celle pellet. Genopslæmmes pellet i 500 µL af medium og fortsætte med at placere celler i kolberne.
      Bemærk: Eksempler på analyser skal foretages med celler: 1) omvendt transkription polymerase kædereaktion (RT-PCR) at analysere genekspression; 2) vestlige skamplet at evaluere protein udtryk; 3) flow flowcytometri analyse at opgøre antallet af neurale stamceller og proteiner af interesse; 4) immunofluorescens analysere protein udtryk og lokalisering.
  3. Forhåndsudfyldning astrocytter
    1. efter behandling af de primære astrocytter med trypsin (Se 4.2), indsamle 100 μL af cellesuspension i 1,5 mL microcentrifuge rør og tilsæt 100 μL af 0,5% trypan blå.
    2. Tilføje 10 μl af den indsamlede suspension i trypan blå til hemocytometer og tælle alle de celler, der er levedygtige.
    3. Bruger formlerne i trin 3.3 til at beregne massefylden af cellerne før forberede kolberne.
    4. Forbered multi brønden retter ved at tilføje en steril, poly-D-lysin belagt coverslip til hver brønd. Med pipette udtages de 50.000 celler og fyld resten af mængden i hver multi godt parabol med friske medium (ca. 2 mL).
    5. Placer de multi godt retter i 37 ˚C inkubator på 5% CO 2 og efter 5-7 dage, astrocytter kan vokse og dækker hele overfladen af coverslips.

5. OGD protokol for primære astrocytter

  1. OGD medium forberedelse
    1. Supplement Dulbecco ' s ændret Eagle ' s medium-omkostningsfrit glucose med 3,7 g/L natriumbikarbonat, og 1% Penicillin/Streptomycin. Se materialer i tabel 4.
    2. Rense 20 mL af glucose gratis medium af boblende med 95% N 2 / 5% CO 2 til 10 min på en strøm af 15 L/min (angivet med flowmeteret) ved at indsætte en serologisk pipette til gasnettet på mellemlang.
      Bemærk: Efter udrensning medium af ilt, Juster pH-værdi på 7,4 (Se Bemærk på trin 2.1).
    3. Filter fjernet glukose-gratis medium ved hjælp af en 50 mL tube filtersystem.
      Bemærk: Gøre friske OGD medium til hvert eksperiment, boblende med 95% N 2 / 5% CO 2 før du bruger, til at sikre, at cellerne er udsat for et miljø, der er renset for ilt.
  2. Forsøgsmetoden
    1. inde i vævskultur hætten, fjerne astrocyte medier fra tidligere forberedt coverslips (Se trin 4.3.5) og vask med cellulære PBS to gange for at fjerne enhver glucose på cellerne.
    2. Tilsættes 2 mL af OGD medier til hver godt og Anbring de multi godt retter i hypoxi kammer med deres låg ned
    3. Tilsluttes indgangen ventil gasblandingen og forlade exit ventilen åben. Skyl kammer med gasblanding af 95% N 2 / 5% CO 2, på 15 L/min i 5 min.
    4. Stop gasflow, og først lukke klemme på exit ventil, så Luk klemmen på gas indgangen ventil rør.
      Bemærk: Sikre, at der er ingen gas lækage ved at dække seal kammer med sæbevand. Hvis forseglingen er sikker, ingen bobler bør danne.
    5. Sted i hele salen i celle kultur inkubator ved 37 ° C i 1 time eller 6 h i OGD.
    6. Efter at Inkubationstiden er overstået, Aspirér OGD medier og omhyggeligt afpipetteres 2 mL af komplette DMEM til hver 4,67 cm 2 godt for normoxic behandle 24 h.

6. Protokol for primære Astrocyte immunofluorescens forberedelse

Note: for at vurdere astrocyte renhed, forskellige hjerne celle typer såsom neuroner, mikroglia og oligodendrocytes kan påvises ved immunfluorescens ved hjælp af forskellige celle markører. Spredning markører, PCNA og propidium Iodid (PI) kan bruges på primære astrocytter udsat for OGD efterfulgt af normoxic betingelser. Se materialerne i Table of Materials.

  1. Immunofluorescens forberedelse
    Bemærk: dette er en generel immunofluorescens protokol, mindre ændringer kan udføres for at opnå et optimalt signal (fx, længere inkubation perioder, inkubation temperatur). Hver markør fra tabel 1 kan anvendes ifølge producenten ' s protokol.
    1. Til at evaluere cellernes levedygtighed, celler kan blive udruget i 5 minutter ved 37 ° C med PI (5 µM i komplet DMEM) og vaskes to gange med 2 mL PBS for 5 min. celler, der viser PI farvning er mindre rentable.
      Bemærk: Brug cellerne behandles i trin 5.2.6.
    2. At fastsætte celler efter PI farvning, tilsættes 2 mL 4% formalin pr. 4,67 cm 2 godt, i 20 min. på 4 ˚C. For prøver mærket med PCNA, er den foretrukne løsning ved fastsættelse methanol i 10 min på 4 ˚C.
      Forsigtighed: Formalin og methanol er giftigt.
      Bemærk: Altid tjekke specifikt antistof protokoller fra hvert enkelt firma.
    3. Vaske cellerne med 2 mL PBS i 5 min og Gentag dette trin 3 gange.
    4. Ruger celler i blokerende løsning (0,5% nonionisk overfladeaktivt stof, 10% FBS i PBS) i 30 min. ved stuetemperatur med blid ryster.
    5. Cellerne vaskes med 2 mL PBS i 5 min, Gentag vask 3 gange.
    6. Inkuberes ved 4 ° C, natten over (16 h), med primær antistof (PCNA, GFAP) i en opløsning af 1% FBS i PBS.
    7. Fjerne den primære antistof løsning, cellerne vaskes med 2 mL PBS i 5 min., og Gentag dette trin 3 gange.
    8. Incubate med sekundær antistof konjugeret med fluorophore i en opløsning af 1% FBS i PBS, i 1 time ved stuetemperatur.
    9. Cellerne vaskes med 2 mL PBS i 5 min, Gentag dette trin 3 gange. Der tilsættes 1 µg/mL DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) for 5 min at plette cellekerner.
    10. Vaske cellerne med 2 mL PBS 5 min., Gentag dette trin to gange og holde i PBS.
    11. Udarbejde coverslips på et objektglas med montering medium.
  2. Konfokal mikroskop
    1. efter opsætning af mikroskopet, placere coverslip siden ned på stadiet mikroskop.
    2. Ved hjælp af software, vælge en laserstråle på 543nm for GFAP-Cy3 konjugeret antistof.

7. Celle levedygtighed Assay

  1. Trypsinize og kvantificere astrocytter ved at følge trin 4.3 og 4.4.
  2. Tilføje 1 x 10 4 celler/brønd til 96-brønd plader og dyrke dem til confluency.
  3. Bruger metoden fra trin 5, udsætte kulturperler 96-brønd plader til enten normoxic 1 h OGD eller 6 h OGD.
  4. Efter OGD behandling, normoxic media føjes til alle celler i 24 timer og levedygtighed er målt ved hjælp af MTT reagens assay (bruger som producent ' s instruktioner angiver).
  5. Fra en 5 mg/mL MTT løsning, tilføje 10% af den samlede mængde til hver brønd og Inkuber i 3 timer ved 37 ˚C med MTT-reagenset.
  6. Fjerne medier og resuspend krystaller bruger 200 µL dimethylsulfoxid. Læs pladen i et spektrofotometer ved 570 nm.
    Bemærk: En nedsat absorbans i forhold til kontrol celler vil korrelerer med mindre levedygtighed.

Representative Results

En af de største bekymringer af primære astrocytic kultur er tilstedeværelsen af andre celler som neuroner, oligodendrocytes, fibroblaster og mikroglia. I figur 1, isolerede celler fra rotte cortex havde medieændringer hver 3 dag og var enten ubehandlet eller behandlet med tilføjet LME for 1 h. 24 timer senere, celler blev immunostained for GFAP og counterstained med DAPI. Ubehandlede celler viste et gennemsnit på 39% ikke-GFAP positive celler, mens LME-behandlede celler viste 8%. Disse resultater viser, hvordan LME behandling og medier ændre effektivt nedsat GFAP positive celler ved 4,75 fold, producerer en beriget astrocyte kultur. For at bestemme, hvis 1 h eller 6 h OGD påvirker astrocyte levedygtighed efter denne metode, viser figur 2 en MTT analyse af astrocyte kulturer, 24 h efter fornærmelse. Ingen signifikant forskel i levedygtighed blev fundet i enhver tilstand, viser, at begge gange kan bruges til at studere astrocyte reaktivitet. Celledelingen er en af de virkninger, der er udløst af OGD i astrocytter. Prolifererende celle nukleare antigen (PCNA) i figur 3 steg fra 10% i normoxic celler, til 30% efter 1 h OGD, viser den forventede i vivo astrocytic svar15. Endelig, astrocytter blev udsat for 6 h af OGD efterfulgt af 24 h normoxic betingelser. Efter denne periode, blev immunofluorescens mod GFAP udført. OGD-eksponerede celler blev sammenlignet med astrocytter normoxic betingelser. Astrocytter uden OGD Vis den traditionelle Stjernehus morfologi (figur 4A) mens celler, der undergik OGD klart fremlægge de karakteristiske hypertrofi af reaktive astrocytter (figur 4B). Denne hypertrofi kan visualiseres i tilsvarende differential interferens kontrast (DIC) billedet af kortikale rotte astrocytter under normoxic og OGD betingelser (figur 5).

Figure 1
Figur 1 . Immunfluorescens at validere primære kortikale rotte astrocytter kultur renhed med GFAP og DAPI. (A) det venstre panel repræsenterer GFAP positive celler (rød), det midterste panel viser kerner (DAPI, blå), og højre panel viser flettede billeder af ikke-LME-behandlede (øverste panel) og LME-behandlede (nederste panel) celler. Hvide pile viser ikke-GFAP-positive farvede celler. (B) kvantificering af ikke-GFAP positive kerner i LME og ikke-LME behandlede celler. En uparret t-test blev udført (p < 0,0001) og fejllinjer repræsenterer middelværdien med SEM. skala barer repræsenterer 50 mikron og billeder blev taget på 20 x forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Levedygtighed assay af astrocytter med 24 timers eksponering for OGD. Astrocytter var kulturperler i 96-brønd plader og udsat for normoxic, 1 h OGD eller 6 h OGD betingelser. Efter behandling, celler blev føjet til normoxic medier til 24 h og levedygtighed blev målt ved hjælp af MTT assay. Absorbans ved 570 nm viser cellernes levedygtighed af OGD-eksponerede celler i kultur i forhold til cellerne i normoxic betingelser. Data blev analyseret med en-vejs ANOVA (p = 0.9669) og præsenteret med fejllinjer, der repræsenterer gennemsnitlige med SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Spredning i rotte astrocytter øges ved udsættelse for ilt og glucose afsavn og kan påvises ved hjælp af PCNA som markør. (A) panelet til venstre repræsenterer PCNA positive celler (grønne), det midterste panel viser kerner (DAPI, blå), og højre panel viser flettede billeder af normoxic celler (øverste panel) og 1 h OGD behandlede celler (nederste panel). (B) procent af PCNA positive celler i normoxic versus OGD behandlede celler. En matchende test blev udført (p < 0,0001) og fejllinjer repræsenterer middelværdien med SEM. skala barer repræsenterer 50 mikron og billeder blev taget på 20 x forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Udtryk af Glial fibrillære sure Protein (GFAP) konjugeret med Cy3 i primære rotte kortikale astrocyte kultur. (A) astrocytter i et normoxic miljø viser de karakteristiske Stjernehus morfologi. Mellemliggende glødetrådens protein, GFAP, fylder celle organer og strækker sig ind i de tynde cytoplasmatisk processer. (B) efter 6 h af OGD eksponering astrocytter vedtaget en hypertrofisk morfologi. Skalaer repræsenterer 20 mikron og billeder blev taget på 40 x forstørrelse i en Konfokal mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Kortikale rotte astrocytter under normoxic og ilt-glucose afsavn. Immunfluorescens af astrocytter på normoxic betingelser (øverste venstre panel) eller 6 h OGD (nederste venstre panel), farves ved hjælp af en Cy3-konjugeret antistof mod GFAP. Tilsvarende differential interferens kontrast (DIC) billedet er vist på højre panel. Skalalinjen repræsenterer 20 mikron og billeder blev taget på 20 x forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Formål Antistof/mærke Beskrivelse
Astrocyte kultur validering IBA-1 Registrerer microglial celler
NeuN Identificerer modne neuroner
Olig1 Registrerer modne oligodendrocytes
Olig2, NG2 Registrerer oligodendrocyte forløber celler
GalC Identificerer umodne eller modne oligodendrocytes
Spredning PCNA Binder p36 protein, udtrykt på et højt niveau i prolifererende celler
Cellernes levedygtighed Propidium Iodid (PI) Binder sig til DNA, denne markør angiver mangel på cellernes levedygtighed
Kra MTT Foranstaltninger mitokondrie funktionalitet Reaktivitet GFAP Indikator for astrocyte reaktivitet

Tabel 1. Liste over reagenser, der anvendes til at plette forskellige typer af celler og cellulære processer

Discussion

Denne protokol beskriver isolering af astrocytter fra rotte cortex. I denne metode er det afgørende at reducere forurening med andre cellulære typer såsom mikroglia, oligodendrocytes, og fibroblaster. For at reducere antallet af mikroglia, kan der tages flere skridt: ændre media, orbital ryster og kemiske behandlinger. Når kultur renhed er bekræftet ved immunfluorescens benytter selektiv cellulære markører eller for de mest fremtrædende celle forureninger, kan eksperimenter udføres. For eksempel, kan antistof mod ioniseret calcium bindende adapter molekyle 1 (Iba-1) bruges til at registrere mikroglia. Neuronal død starter tidligt i kulturen og disse celler fjernes sammen med oligodendrocyte forløber celler (OPCs) efter kolbe aflytning og medier ændre på dag 331. Oligodendrocytic forløber celler kan identificeres ved hjælp af antistoffer som olig2 eller NG2. GalC kan bruges til at identificere umodne eller modne oligodendrocytes, men kultur nu disse er usandsynligt at finde. Alternativt, ikke-GFAP positive celler kan kvantificeres og forurenende stoffer kan skønnes. Denne sidste metode skelne ikke mellem de specifikke celler, men bliver en hurtigere og mere økonomisk metode til at bestemme procentdelen af ikke-astrocytic cellerne i kulturen.

Når en astrocyte beriget kultur er produceret, kan OGD eksperimenter udført for at studere astrocyte reaktivitet. Udrensning løsning med kvælstof af bobler til at erstatte ilt er et almindeligt anvendte protokol32. I vores metode bruger vi den boblende metode til at rense ilt med nitrogen gas (95% N2, 5% CO2) til glucose-gratis medier med en væskehastighed på 15 L/min, 10 min, for en samlet maengde paa 0,025 L. For at bekræfte, at ilt er udrenset, målte vi koncentrationen af ilt tilbage i medierne ved hjælp af en ilt meter for væske og luft. Koncentrationen af ilt tilbage i medierne efter udrensning for 10 min faldet fra 7,9 mg/L til 0,3 mg/L. For at bestemme, hvor længe salen skal være renset for at erstatte ilt, udrensning med N2 blev udført ved hjælp af ikke mindre end fabrikantens kammer forslag (20 L/min., 2-5 min). Efter 5 min til udluftning på 15 L/min, var koncentrationen af ilt tilbage i kammeret 0%. Andre metoder, ved hjælp af lignende chambers har renset på en 8-20 L/min. strømningshastighed og tider på 5-10 min. til at erstatte luften ilt med kvælstof33,34.

Ligesom andre cellulære modeller, OGD har begrænsninger og resultater bør fortolkes nøje. OGD kan være skadelige for neuroner, men astrocytter kan modstå disse betingelser for op til 24 h35. En anden begrænsning er, at astrocytter er isoleret i dette system, mangler signalering fra andre celler. En måde at overvinde denne begrænsning er at bruge konditioneret medier fra andre celler på samme iskæmisk-lignende betingelser. Alternativt, cytokiner og andre faktorer kan tilføjes til medierne efter OGD36.

En alternativ metode til at studere virkningerne af energi-mangel i cellerne, er at tilføje ouabain til medierne.  Dette stof hæmmer især natrium/kalium-pumpen, som dræner intracellulær produktion af ATP, svarende til virkningerne af OGD37,38. Denne metode har imidlertid den ulempe at alle dens mekanismer ikke er fuldt forstået og det inducerer off target effekter, som introducerer variabler, som udgør en urealistisk iskæmisk slagtilfælde scenario.

Sammenfattende er OGD metode en isoleret celle system, som tillader os at direkte test virkningerne af forskellige astrocytic stof mål i vitro at bidrage yderligere til neuroprotection. Det tilbyder også et værktøj til at studere grundlæggende astrocyte biologi. Denne model kan skabe et stærkt grundlag af beviser til at berettige eksperimentelle betingelser for udviklingen af lægemidler ved hjælp af en i vivo model af slagtilfælde.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Paola López Pieraldi for den tekniske bistand. A.H.M. er glad for grants 8G12MD007600 og U54-NS083924, understøttes denne publikation. Vi takker NIH-NIMHD-G12-MD007583 tilskud til faciliteten støtte. D.E.R.A. er taknemmelig for fellowship leveres af NIHNIGMS-R25GM110513. Vi er taknemmelige for anvendelsen af de fælles arealer, instrumentering og ved hjælp af Dr. Priscila Sanabria for brugen af den optiske Imaging facilitet af programmet RCMI ved at give G12MD007583. Hertil kommer, vil vi gerne takke Jose Padilla for hans enestående rolle i filme og redigere den visuelle protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46, (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39, (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46, (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67, (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38, (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7, (5), e37574 (2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11, (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119, (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8, (3), e60282 (2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128, (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. 1347987 (2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62, (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55, (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2, (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532, (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9, (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6, (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120, (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7, (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66, (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254, (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131, (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41, (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48, (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93, (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11, (3), 249-259 (2001).
Overvågning Astrocyte reaktivitet og spredning <em>in Vitro</em> iskæmisk-lignende betingelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter