Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.

Abstract

Accident vasculaire cérébral ischémique est un complexe crânien provoqué par un thrombus ou embolie entrave à la circulation sanguine vers les parties du cerveau. Cela conduit à la privation d’oxygène et de glucose, ce qui provoque la défaillance de l’énergie et la mort neuronale. Après une insulte d’accident vasculaire cérébral ischémique, astrocytes devient réactifs et prolifèrent autour du site de la lésion qu’il développe. Selon ce scénario, il est difficile d’étudier la contribution spécifique des astrocytes dans la région de cerveau exposé à l’ischémie. Par conséquent, cet article présente une méthodologie pour étudier la réactivité primaire astrocyte et prolifération dans un modèle in vitro d’un environnement de type ischémie, appelé la privation d’oxygène glucose (AMG). Les astrocytes ont été isolés de 1 à 4 jours-vieux rats néonatals et le nombre de cellules astrocytaires non spécifique a été évaluée à l’aide du marqueur sélectif astrocyte gliale fibrillaire acide protéine (GFAP) et la coloration des noyaux. La période dans laquelle astrocytes sont soumis à la condition de l’AMG peut être personnalisée, ainsi que le pourcentage d’oxygène, qu'ils sont exposés. Cette souplesse permet aux scientifiques de caractériser la durée de la condition de type ischémique dans différents groupes de cellules in vitro. Cet article explique les délais d’AMG qui induisent la réactivité de l’astrocyte, morphologie hypertrophique et prolifération telle que mesurée par l’immunofluorescence utilisant prolifèrent Cell Nuclear Antigen (PCNA). En plus de la prolifération, astrocytes subissent l’énergie et du stress oxydatif et de répondent aux autres ministères en libérant des facteurs solubles dans le milieu cellulaire. Ce moyen de communication peut être collecté et utilisée pour analyser les effets des molécules libérées par les astrocytes dans des cultures primaires de neurones sans interaction cellule-cellule. En résumé, ce modèle de culture cellulaire primaire peut être utilisé efficacement pour comprendre le rôle des astrocytes isolés sur blessure.

Introduction

Accident vasculaire cérébral est défini comme « un dysfonctionnement neurologique aiguë d’origine vasculaire avec développement rapid ou soudain des symptômes et des signes, correspondant à la participation des principaux domaines d’action dans le cerveau »1,2. Il existe deux types d’AVC : hémorragique et ischémique. Lorsque la dysfonction vasculaire est causée par un anévrisme ou une défectuosité artério-veineuse, accompagné d’affaiblissement postérieur de rupture d’une artère, il s’agit alors d’accident vasculaire cérébral hémorragique3 qui, dans la plupart des cas, conduit à la mort. Lorsqu’un thrombus ou une embolie fait obstacle à la circulation sanguine, provoquant une privation temporaire d’oxygène et de glucose à une région du cerveau, il est appelé accident vasculaire cérébral ischémique4. Incapacité à nourrir les cellules autour de la zone touchée ou ischémique de base conduit à un déséquilibre métabolique et homéostatique, dysfonction énergique, la mort neuronale et inflammation5, qui peut entraîner une invalidité permanente chez les patients6.

Accident vasculaire cérébral ischémique est une lésion multifactorielle impliquant plusieurs types de cellules qui réagissent et exercent leurs effets à des moments différents. De nombreuses interactions créent un environnement difficile pour étudier le comportement des cellules individuelles. Alors, Comment étudier la contribution d’un type de cellule spécifique dans un environnement aussi complex ? Un modèle accepté in vitro de l’ischémie se compose d’exposition des cellules à la privation d’oxygène et de glucose (AMG), pendant une certaine période, suivie par la restauration des cellules à un environnement normoxiques. Ce système simule un accident ischémique cérébral, suivi d’une reperfusion artérielle. Dans cette méthode, cellules ou tissus sont exposés à un média sans glucose dans un environnement purgé de l’oxygène, en utilisant une chambre hypoxique spécialisée. Le temps d’incubation AMG peut varier de quelques minutes jusqu'à 24 h, selon l’hypothèse qui veut être testé. Des études ont montré que, selon les temps des autres ministères et normoxique environnement, phénotypes spécifiques d’accident vasculaire cérébral (c.-à-d., aiguë ou subchronique) peut être réalisé. Des astrocytes primaires isolées, exposés à d’autres ministères à restauration postérieure à conditions normoxiques, est un modèle cellulaire bien étudié pour imiter course in vitro7. À l’aide d’autres ministères est possible de révéler les mécanismes moléculaires indépendantes des cellules isolées dans un environnement de type accident vasculaire cérébral.

Comme nos connaissances de la biologie de l’astrocyte augmente, il est devenu évident qu’ils sont essentiels pour le maintien des synapses et soutenir la réparation, le développement et la plasticité neurale8. Dans des conditions normales, les astrocytes libèrent et répondent aux cytokines, chimiokines, facteurs de croissance et gliotransmetteurs, garder l’équilibre métabolique et l’homéostasie au sein de synapses5,9. En neuro-inflammation aiguë, comme l’accident vasculaire cérébral ischémique, ces cellules peuvent devenir réactives, montrent une surexpression à long terme de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et montrent une hypertrophie dans leur morphologie5,10, 11 , 12. comme l’infarctus ischémique se développe, l’homéostasie fourni par les astrocytes devient affectée, ce qui concerne l’absorption normale de glutamate, métabolisme énergétique, l’échange des molécules actives et anti-oxydant activité13.

Astrocytes réactivées prolifèrent autour du tissu de l’infarctus, tandis que les leucocytes migrent vers la zone lésés14. Astrocytes prolifération peut être mesurée à l’aide de marqueurs comme antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), Ki67 et bromodéoxyuridine (BrdU)15. Cette réponse proliférative est générée de façon dépendante du temps, et il contribue à former la cicatrice gliale, un tableau des astrocytes irréversiblement réactives le long du parenchyme du site endommagé après une blessure9. Une des fonctions premières de cette cicatrice est de limiter l’extravasation de cellules immunitaires dans cette région. Toutefois, des études ont montré que la cicatrice devienne un obstacle physique d’axones étendre, car ils libèrent des molécules inhibant la croissance axonale et créer une barrière physique qui empêche que les axones s’étendant autour de la zone lésée16. Néanmoins, il existe des preuves scientifiques montrant qu’après une blessure de la moelle épinière, complètement éviter la formation de la cicatrice gliale peut nuire à la régénération des axones17. Ainsi, le contexte dans lequel la réponse astrocytaires spécifique est mesuré, doit être considéré sur le cadre de la lésion étudié.

La méthodologie présentée peut être appliquée à l’étude de la fonction individualisée des astrocytes après la privation d’oxygène glucose et elle peut être modifiée selon les questions que le chercheur veut répondre. Par exemple, outre les changements morphologiques et les marqueurs exprimés à des moments différents ministères, les surnageants d’astrocytes exposés à d’autres ministères peuvent être davantage analysés afin d’identifier des facteurs solubles libérées par ces cellules, ou utilisé comme un milieux conditionnés pour évaluer ses effet dans d’autres cellules du cerveau. Cette approche permet aux études sur la réactivité d’astrocyte qui pourraient mener à l’élucidation des facteurs qui régissent et modulent leur réponse dans un scénario d’accident ischémique cérébral.

Protocol

postnatals rats (rats Sprague Dawley) 1-4 jours vieux sont utilisés pour isoler le cortex. La méthode d’euthanasie est décapitation, tel qu’approuvé par le NIH guidelines.

1. préparation des Instruments et matériaux pour chirurgie

  1. instruments de stériliser à l’autoclave (température : 121 ° c, pression : 15 psi, temps : 30 minutes) à l’aide d’une boîte en acier ou un instant sachet de stérilisation d’étanchéité. Voir des matières Table des matières.

2. Compléter DMEM préparation

  1. dans un bécher d’un litre contenant 700 mL d’eau stérilisés à l’autoclave, ajoutez Dulbecco ' s Modified Eagle ' s en poudre à la température ambiante moyenne.
  2. Ajouter 3,7 g/L de bicarbonate de sodium, tandis que la solution est agitée avec un agitateur magnétique.
  3. , Ajuster le pH à 7.4, avec de l’eau autoclavé porter volume jusqu'à 1 L, puis filtre. À des fins de culture, compléter le volume souhaité de médias avec 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine et chaud à 37 ° c. Voir des matières Table des matières.
    Remarque : Le pH est ajusté à 7,4 via l’insertion de l’électrode pH dans les médias. Les médias doivent être en remuant, ajouter lentement puis de 1 NaOH M, à l’aide d’un compte-gouttes.

3. Culture primaire de Astrocyte

Remarque : après l’ensemencement, milieux cellulaires doivent être changés tous les trois jours et les cellules peuvent être cultivées jusqu'à la confluence (11 à 13 jours). Le troisième jour, touchez plusieurs fois et les cellules microgliales ascenseur et cellules progénitrices oligodendrocytes au large de la culture du ballon, supprimer tous les ' vieux ' médias, laver deux fois avec 10 mL de PBS, aspirer le PBS, puis ajoutez des frais nouveaux médias. Voir des matières Table des matières.

    1. Perform la dissection sous une hotte de culture de tissus de la dissection du cerveau de rat nouveau-né. Obtenir 1-4 jours vieux ratons nouveau-nés (2 cerveaux de rat est utilisés par flacon de 75 cm 2).
    2. Préparer trois boîtes de petri de 60 mm et pipette 5 mL de DMEM complet sur chacun.
      Remarque : Ils peuvent être regroupés comme suit : #1 pour chaque rat brain, #2 pour tous les cortex des cerveaux et #3 pour tous les cortex pelées (sans les méninges).
    3. Saisir le pup et vaporiser avec l’éthanol à 70 %. Elle décapiter et jeter le corps dans un conteneur à déchets biohazard petit.
    4. à l’aide de la pince micro-dissection, maintenez la tête et couper la peau sur le dessus de la tête pour exposer le crâne.
    5. Avec une autre paire de ciseaux, faire un " T " incision commençant par l’arrière du crâne vers le nez. Utilisez une paire de pinces pour retirer doucement le crâne.
    6. Enlever le cerveau exposé avec une paire de pinces et de placer le cerveau dans l’un des plats petri précédemment remplis de milieu.
    7. Utiliser un autre ensemble d’instruments stériles pour les étapes subséquentes.
    8. Permet de placer doucement un cerveau sur le couvercle inversé d’un plat de Pétri de 60 mm micro-dissection forceps. Lorsque la boîte de Pétri est placé sur une gaze stérile, il est possible de visualiser le cerveau clairement et il est plus facile à décortiquer.
    9. Régulière du cerveau avec une pince micro-dissection et séparer l’hémisphère cérébral en les taquinant doucement le long de la fissure médiane avec l’extrémité pointue de la pince micro-dissection.
    10. DEVIER et peler le cortex, laissant derrière lui la substance blanche et les transférer sur un plat de Pétri, déjà étiqueté #2. Répétez l’opération pour tous les cerveaux, combinant tous les cortex disséqué dans la boîte de Pétri étiqueté #2.
    11. Sortez de l’hippocampe de dessous chaque cortex et jeter it.
    12. Utiliser la pince micro-dissection et un petri de 60 mm à éplucher délicatement les méninges des lobes corticales individuels et placez-les dans la boîte de Pétri étiqueté #3.
  1. Dissociation tissulaire : méthode mélangeur homogénéisateur
    1. versez suspension tissu/milieu (pelées cortex du cerveau) dans le sac de mélangeur stérile et ajouter assez moyen pour porter le volume total dans le sac à 5 mL.
    2. Placer le sac dans le mélangeur homogénéisateur, laissant environ 2 cm du sac visible au-dessus de la porte fermée. La dissociation cellulaire se faite pendant 2,5 min à grande vitesse.
      Remarque : Sinon, cela peut être fait en fermant le sac et il battre doucement avec un bécher dans la hotte. Assurez-vous d’utiliser un chiffon entre le sac et le bécher pour éviter tout frottement.
    3. Verser la suspension cellulaire dans un tamis à mailles numéro 60, puis versez le débit filtré à travers sur le tamis du numéro 100, ce qui lui permet de filtrer par gravité.
    4. À l’aide de 15 mL tubes, centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g dans une centrifugeuse clinique (préférence swing seau rotor) pendant 5 min.
    5. Décanter le liquide surnageant dans un bécher, puis à l’aide d’une pipette sérologique, remettre en suspension et dissocier le culot de cellules dans un délai maximum de 5 mL de médias.
  2. Comptage cellules
    1. avec une micropipette, collecter 100 µL de la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 100 µL de bleu trypan.
    2. Insérer 10 µL de la suspension recueillie dans l’hémocytomètre et compter toutes les cellules qui sont viables aux quatre coins de la place.
    3. Les formules de calcul de la densité des cellules avant de préparer les flacons sont :
      Equation 1
      Equation 2
    4. Ajouter au moins 500 000 cellules par flacon de 25 cm 2. Pipetter jusqu'à 5 mL de DMEM dans chaque fiole. Le mélange ne devrait pas atteindre le col du matras. Les placer dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO 2, pendant 3 jours, puis changer les médias.
  3. Techniques de purification astrocyte : médias stratégies de changement, mécaniques et chimiques
    Remarque : le taux métabolique des astrocytes est élevé par rapport aux autres types de cellules, par conséquent, dans sur le plan nutritionnel privés des conditions, ces cellules montrent des taux de survie faibles après quelques jours. Contrairement aux astrocytes, la microglie ne sont pas affectés par la privation nutritionnelle et prolifèrent dans ces environnements 18. Pour conserver un nombre réduit de cellules microgliales, les auteurs ont changent les milieux de culture de cellules astroglials tous les 3 jours. Ce changement constant de milieux cellulaires diminuera également la population microgliales qui peut se développer sur le dessus de la monocouche de cellules astrocytaires dans la fiole 19.
    1. Utiliser un Pasteur pipette pour aspirer les médias avec les cellules microgliales non adhérents de chacune des fioles. Laver tous les débris laissés pour compte à l’aide de PBS stérile filtrée à chacune des fioles de manière goutte à goutte (5 mL/flacon).
    2. Ajouter goutte à goutte le DMEM stérile filtrée (avec sérum bovin foetaux et antibiotiques) dans chaque fiole (fiole de 5 mL). Agiter doucement dans un mouvement circulaire pour couvrir toute la surface.
    3. Cellules de lieu dans un 37 ° ; Incubateur à 5 % de CO 2 pendant 8 à 10 jours jusqu'à ce que les ballons atteignent la confluence (> couverture plaque de 95 %).
      Remarque : Plusieurs protocoles ont montré que quand les astrocytes atteignent confluence, des méthodes mécaniques, tels que les poignées de la culture de 2 à 24 h, entraîne le détachement des cellules qui se trouvent sur le dessus de ces astrocytes, la microglie et des précurseurs de cellules 19 , 20.
    4. Des cellules Non-astrocytaires est réduites dans la culture en procédant à une agitation orbitale à 180 tr/min pendant 30 min. Après avoir enlevé les cellules dans le surnageant, supports neufs sont reversé dans le ballon (environ 15 mL).
    5. Pour éliminer les cellules progénitrices oligodendrocytes, augmenter la vitesse de secousse à 200 tr/min à 6 h 21 , 22 , 23, aspirat surnageant et supports neufs pipet.
      Remarque : Pour diminuer la présence des microglies dans les cultures, deux méthodes chimiques peuvent être utilisés de façon séquentielle (non simultanément) dans la méthode de culture de cellules primaires : Arabinose cytosine (Ara-C) et la L-leucine méthyl ester (LME) 24.
    6. Immédiatement quand les cellules atteignent confluence (100 %), 3-4 jours après l’élimination mécanique des microglies, ces cellules peuvent être traitées avec 8 µM de la cytosine d’Arabinose composée antimitotique (Ara-C) en DMEM pendant 5 jours (changement d’Ara-C frais en DMEM quotidiennement).
      Remarque : Le point de temps à ajouter l’Ara-C est critique puisque ce composé est un médicament antimitotique, ce qui réduit le nombre de cellules se divisant rapidement comme les fibroblastes et les cellules microgliales 19 , 25 26 . Contrairement à la microglie, lorsque confluentes, astrocytes ne prolifèrent par l’intermédiaire de l’inhibition de contact 27.
    7. Prévoir 2 jours pour cellules récupérer de l’Ara-C traitement.
    8. Pour réduire la contamination des microglies, lorsque les cellules atteignent la confluence, utilisez 50 mM de L-leucine méthyl ester (LME) en DMEM corrigé à pH 7,4, pendant 1 h à 37 ° c.
      Remarque : LME traverse la membrane des cellules et organites, et après être hydrolysé, la L-leucine produite s’accumule dans les lysosomes des cellules. L’accumulation de cet acide aminé entraîne un gonflement osmotique et rupture des lysosomes 28 , 29. LME est très efficace pour éliminer les cellules microgliales, par rapport aux autres cellules 20 , 30.

4. Cultiver les Astrocytes en plaques 6 puits

  1. lamelles de revêtement poly-D - lysine
    1. Mettez une lamelle dans chaque plat de Pétri de 35 mm, puis ajouter 100 µL de la solution diluée de Poly-D-Lysine à chaque lamelle et attendre 1 h.
    2. Supprimer la Poly-D-Lysine et laver deux fois avec 2 mL d’eau stérile.
    3. Enlever l’eau et attendre que les lamelles couvre-objet sécher à l’intérieur de la hotte. Stocker les lamelles à-20 ° C pendant deux semaines.
      Remarque : Congeler la solution diluée de Poly-D-Lysine ; Il peut être conservé jusqu'à deux semaines.
  2. Trypsinization
    1. à l’aide d’une pipette Pasteur, aspirer le moyen des fioles. Ajouter 5 mL/flacon de PBS stérile filtrée à rincer doucement les cellules.
    2. Aspirer le PBS au large et ajoute ensuite 5 mL/flacon de stérile filtré 0,25 % trypsine et 0,5 mM solution d’EDTA. Placer le ballon dans les 37 ° c, 5 % CO 2 incubateur pendant 10 min.
      Remarque : Alors que les cellules sont en incubation, chauffer 5 mL/flacon de frais DMEM complet à 37 ° C.
    3. Après 10 min d’incubation, agiter pour s’assurer que toutes les cellules sont a décollé le ballon. Ajouter rapidement les 5 mL de DMEM complet chaud dans chaque fiole, pour neutraliser la trypsine.
    4. Pipetez doucement les cellules monter et descendre plusieurs fois pour briser toute " touffes ". Suspension de cellules de transfert de deux flacons dans un tube à centrifuger conique 15 mL.
    5. Centrifuger pendant 5 min à 200 x g pour recueillir le culot cellulaire. Resuspendre le culot dans 500 µL de milieu et aller de l’avant pour placer les cellules dans les fioles.
      Remarque : Exemples d’analyses à réaliser avec des cellules : 1) Reverse transcription PCR (RT-PCR) pour analyser l’expression des gènes ; 2) Western blot pour évaluer l’expression de la protéine ; 3) analyse en cytométrie en flux afin de quantifier le nombre de cellules progénitrices neurales et des protéines d’intérêt ; 4) immunofluorescence pour analyser l’expression des protéines et la localisation.
  3. Ensemencement des astrocytes
    1. après avoir traité les astrocytes primaires avec la trypsine (voir 4.2), collecter 100 μl de la suspension de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 100 μL de 0,5 % le bleu trypan.
    2. Ajouter 10 μL de la suspension recueillie au trypan blue à l’hémocytomètre et compter toutes les cellules qui sont viables.
    3. Utiliser les formules à l’étape 3.3 pour calculer la densité des cellules avant de préparer les erlenmeyers.
    4. Préparer le puits multiples plats en ajoutant un stérile, poly-D-Lysine enduite lamelle dans chaque puits. Pipetter 50 000 cellules et remplir le reste du volume dans chaque plat multipuit avec un milieu frais (environ 2 mL).
    5. Placer les cupules multiples dans l’incubateur de 37 ° c à 5 % de CO 2 et, après 5-7 jours, les astrocytes peuvent croître et couvrent toute la surface des lamelles.

5. Protocole de ministères pour les Astrocytes primaire

  1. les moyenne préparation AMG
    1. supplément Dulbecco ' s modified Eagle ' glucose de s libres moyen avec 3,7 g/L de bicarbonate de sodium et 1 % pénicilline/streptomycine. Voir documentation au tableau 4.
    2. Purge 20 mL du milieu glucose libre par barbotage avec 95 % N 2 / 5 % de CO 2 pendant 10 min à un débit de 15 L/min (indiqué par le débitmètre) en insérant une pipette sérologique pour l’installation de gaz dans le milieu de.
      Remarque : Après avoir purgé le milieu de l’oxygène, ajuster le pH à 7,4 (voir la note sur le point 2.1).
    3. Filtrer le milieu sans glucose purgé à l’aide d’un système de filtre de tube de 50 mL.
      Remarque : Faire un milieu frais AMG pour chaque expérience, bouillonnant avec 95 % N 2 / 5 % de CO 2 avant d’utiliser, pour faire en sorte que les cellules sont exposées à un environnement purgé de l’oxygène.
  2. Procédure expérimentale
    1. à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire, enlevez astrocyte média préalablement préparée lamelles couvre-objet (reportez-vous à l’étape 4.3.5) et laver avec du PBS cellulaire deux fois pour enlever toute glucose sur les cellules.
    2. Ajouter 2 mL de médias AMG pour chaque bien et placez les cupules multiples à l’intérieur de la chambre d’hypoxie avec leurs couvercles OFF
    3. Connecter le mélange gazeux à la vanne d’entrée et laissez la vanne de sortie ouverte. Rincer la chambre avec le mélange de gaz de 95 % N 2 / 5 % CO 2, à 15 L/min pendant 5 min.
    4. Couper l’arrivée de gaz et d’abord fermer la pince sur la valve de sortie, puis fermer la pince sur le tuyau de vanne gaz entrée.
      Remarque : S’assurer il n’y a aucune fuite de gaz en couvrant le sceau de la chambre à l’eau savonneuse. Si le joint est sécurisé, aucune bulle ne devrait former.
    5. Placer la chambre entière dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C pendant 1 h ou 6 h en ministères.
    6. Après que la période d’incubation est terminée, aspirer les médias AMG et soigneusement pipette 2 mL de DMEM complet à chaque 4,67 cm 2 bien pour le normoxique traiter 24 h.

6. Protocole pour la préparation de Immunofluorescence Astrocyte primaire

Remarque : pour évaluer la pureté de l’astrocyte, cellule cérébrale différents types tels que les neurones, la microglie et des oligodendrocytes peuvent être détectées par immunofluorescence à l’aide de marqueurs de cellules différentes. Marqueurs de prolifération, PCNA et l’iodure de propidium (PI) peuvent être utilisés sur primaires astrocytes exposés aux ministères, suivie des conditions normoxiques. Voir des matières Table des matières.

  1. Préparation de l’immunofluorescence
    Remarque : il s’agit d’un protocole général d’immunofluorescence, des modifications peuvent être effectuées pour obtenir un signal optimal (par exemple, les périodes d’incubation plus longues, température d’incubation). Chaque marqueur de tableau 1 peut être utilisé selon le fabricant ' protocole s.
    1. Pour évaluer la viabilité des cellules, les cellules peuvent être incubées pendant 5 min à 37 ° C avec PI (5 µM de DMEM complet) et laver deux fois avec 2 mL de PBS pour 5 min. des cellules qui montrent une coloration PI sont moins viables.
      Remarque : Utiliser les cellules traitées à l’étape 5.2.6.
    2. Pour fixer les cellules après coloration de PI, ajouter 2 mL de formol de 4 % par cm 4,67 2 Eh bien, pendant 20 min à 4 ° c. Pour les échantillons étiquetés avec PCNA, la solution préférée de fixation est méthanol pendant 10 min à 4 ° c.
      Mise en garde : Formol et le méthanol sont toxiques.
      Remarque : Toujours vérifier les protocoles d’anticorps spécifiques de chaque société.
    3. Laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 minutes et répétez cette opération 3 fois.
    4. Incuber les cellules en bloquant la solution (surfactant non ionique 0,5 %, 10 % FBS dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante avec agitant doucement.
    5. Laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 min, à répéter 3 fois au lavage.
    6. Incuber à 4 ° C, pendant la nuit (16 h), avec l’anticorps primaire (PCNA, GFAP) dans une solution de 1 % FBS dans du PBS.
    7. Supprimer la solution de l’anticorps primaire et répétez cette opération 3 fois laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 min.
    8. Incuber avec l’anticorps secondaire conjugué avec un fluorophore dans une solution de 1 % FBS dans du PBS, pendant 1 h, à température ambiante.
    9. Laver les cellules avec 2 mL de PBS pendant 5 min, répétez cette opération 3 fois. Ajouter 1 µg/mL de DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phénylindole) pendant 5 min colorer les noyaux cellulaires.
    10. Laver les cellules avec 2 mL de PBS 5 min, à répéter cette étape deux fois et à garder dans du PBS.
    11. Préparer les lamelles sur une lame de microscope à l’aide du milieu de montage.
  2. Microscope confocal
    1. après avoir configuré le microscope, placez le côté de la lamelle couvre-objet sur la platine du microscope.
    2. En utilisant le logiciel, sélectionnez un faisceau laser à 543nm pour l’anticorps conjugué GFAP-Cy3.

7. Analyse de viabilité de cellules

  1. Trypsinize et de quantifier les astrocytes en suivant les points 4.3 et 4.4.
  2. Ajouter 1 x 10 4 cellules/puits aux plaques de 96 puits et cultivez-les à confluence.
  3. à l’aide de la méthodologie de l’étape 5, exposer cultivées plaques 96 puits à soit normoxique 1J AMG ou 6 h am.
  4. Traitement après AMG, normoxique médias est ajouté à toutes les cellules pendant 24 h et viabilité est mesurée à l’aide de dosage de réactif MTT (utiliser en tant que fabricant ' s instructions indiquent).
  5. D’une solution MTT 5 mg/mL, ajouter 10 % du volume total dans chaque puits et incuber pendant 3 h à 37 ° c avec le réactif MTT.
  6. Supprimer media et remettre en suspension des cristaux à l’aide de sulfoxyde de diméthyle 200 µL. Lire la plaque dans un spectrophotomètre à 570 nm.
    Remarque : Une absorbance une diminution par rapport aux cellules de contrôle fera la corrélation avec moins viabilité.

Representative Results

Une des principales préoccupations de culture astrocytaires primaire est la présence d’autres cellules comme les neurones, oligodendrocytes, les fibroblastes et des cellules microgliales. Dans la Figure 1, les cellules isolées des cortex de rat avaient milieu change tous les 3 jours et étaient soit non traités ou traités avec ajouté LME pendant 1 h. 24 h plus tard, les cellules ont été immunomarquées pour GFAP et Eosine au DAPI. Cellules non traitées ont montré une moyenne de 39 % non-GFAP cellules positives, alors que les cellules traitées au LME ont montré 8 %. Ces résultats montrent comment les médias et le traitement de la LME changer les cellules positives effectivement une diminution non-GFAP 4,75 fois, produisant une culture enrichie-astrocyte. Pour déterminer si les 1 h ou 6 h am affecte la viabilité astrocyte après cette méthodologie, la Figure 2 illustre un test MTT de cultures astrocyte, 24h après l’insulte. Aucune différence significative concernant la viabilité a été trouvé dans n’importe quelle condition, montrant que les deux fois peut être utilisé pour étudier la réactivité de l’astrocyte. La prolifération cellulaire est l’un des effets déclenchés par d’autres ministères dans les astrocytes. Antigène nucléaire de cellule prolifération (PCNA) à la Figure 3 est passée de 10 % dans les cellules normoxiques, à 30 % après 1 h AMG, montrant les attendus en vivo astrocytaires réponse15. Enfin, les astrocytes ont été exposés à 6 h d’AMG, suivie des conditions normoxiques 24h. Après ce laps de temps, immunofluorescence contre GFAP fut jouée. AMG-exposés de cellules ont été comparés aux astrocytes sous conditions normoxiques. Astrocytes sans autres ministères montrent la morphologie stellaire traditionnelle (Figure 4 a), tandis que les cellules qui ont subi les ministères présentent clairement l’hypertrophie caractéristique des astrocytes réactifs (Figure 4 b). Cette hypertrophie peut être visualisé dans l’image de contraste (DIC) interférence différentielle correspondante des astrocytes corticaux rat selon normoxique AMG (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 . Immunofluorescence pour valider les primaires de rat corticales astrocytes culture pureté avec GFAP et DAPI. (A), le panneau de gauche représente GFAP positif cellules (rouge), le panneau central montre noyaux (DAPI, bleu), et le panneau de droite montre des images fusionnées de LME non traitées (panneau du haut) et imprégnées sur le LME (panneau inférieur). Flèches blanches montrent non GFAP-positive teinté de cellules. (B) Quantification des noyaux positifs non-GFAP dans LME et non-LME traités des cellules. Un t-test non apparié a été effectué (p < 0,0001) et les barres d’erreur représentent la moyenne avec représentent de barres SEM. échelle 50 microns et photos ont été prises à un grossissement de 20 x. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Analyse de la viabilité des astrocytes avec 24 h d’exposition à AMG. Astrocytes ont été cultivés dans des plaques de 96 puits et exposés à des conditions d’AMG soit normoxique, 1J AMG ou 6 h. Après le traitement, les cellules ont été ajoutés aux médias normoxique pendant 24 h et viabilité a été mesurée à l’aide du test MTT. Absorbance à 570 nm montre la viabilité cellulaire d’AMG-exposés des cellules en culture par rapport à des cellules dans des conditions normoxiques. On a analysé les données avec ANOVA à (p = 0.9669) et présentés avec des barres d’erreur qui représentent la moyenne avec SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
La figure 3. La prolifération dans les astrocytes rat augmente lors de l’exposition à la privation d’oxygène et de glucose et peut être détectée à l’aide de PCNA comme marqueur. (A), le panneau de gauche représente les cellules positives PCNA (vert), le panneau central montre des noyaux (DAPI, bleu) et le panneau de droite montre des images fusionnées de cellules normoxiques (panneau du haut) et 1 h AMG traités cellules (panneau inférieur). (B) pour cent des cellules normoxiques par rapport aux autres ministères positives PCNA traités des cellules. Un test non appariés a été réalisé (p < 0,0001) et les barres d’erreur représentent la moyenne avec représentent de barres SEM. échelle 50 microns et photos ont été prises à un grossissement de 20 x. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Expression de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) conjugué avec Cy3 dans culture corticale astrocyte primaires de rat. Astrocytes (A) dans un spectacle d’environnement normoxique la morphologie caractéristique stellaire. La protéine de filament intermédiaire, GFAP, remplit les corps cellulaires et se prolonge dans les processus cytoplasmiques minces. Astrocytes exposition (B) après 6 h d’AMG adopte une morphologie hypertrophique. Écailles représentent 20 microns et photos ont été prises à un grossissement de x 40 dans un microscope confocal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Astrocytes corticaux rat sous normoxique et oxygène-glucose privation. Immunofluorescence des astrocytes dans des conditions normoxiques (panneau gauche supérieur) ou 6 h AMG (panneau inférieur gauche), teinté à l’aide d’un anticorps conjugué Cy3 contre GFAP. L’image de (DIC) de contraste interférentiel différentiel correspondant est affiché sur le panneau de droit. Barre d’échelle représente 20 microns et photos ont été prises à un grossissement de 20 x. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Objectif Anticorps/marqueur Description
Astrocyte Culture Validation IBA-1 Détecte les cellules microgliales
NeuN Identifie les neurones matures
Olig1 Détecte les oligodendrocytes matures
OLIG2, NG2 Détecte les cellules précurseurs des oligodendrocytes
GalC Identifie les oligodendrocytes immatures ou matures
Prolifération ANCP Lie p36 protéine, exprimée en quantité élevée chez les cellules en prolifération
Viabilité cellulaire Iodure de propidium (PI) Se lie à l’ADN, ce marqueur indique manque de viabilité cellulaire
TR > MTT Mitochondries fonctionnalité mesures Réactivité GFAP Indicateur de la réactivité de l’astrocyte

Le tableau 1. Liste des réactifs utilisés pour colorer les divers types de cellules et de processus cellulaires

Discussion

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes des cortex de rat. Dans cette méthode, il est essentiel pour diminuer la contamination avec d’autres types cellulaires comme les microglies, oligodendrocytes et fibroblastes. Pour réduire le nombre de cellules microgliales, plusieurs mesures peuvent être prises : changer les médias, orbitale secouant et traitements chimiques. Une fois que la pureté de la culture est confirmée par immunofluorescence à l’aide de marqueurs cellulaires sélectifs ou pour les principaux contaminants cellulaires, des expériences peuvent être effectuées. Par exemple, anticorps dirigés contre la molécule de calcium ionisé liaison adaptateur 1 (Iba-1) peut être utilisé pour détecter les cellules microgliales. La mort neuronale commence au début de la culture et ces cellules sont éliminées avec cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPCs) après le tapement de fiole et médias changent au jour 3,31. Cellules précurseurs oligodendrocytic peuvent être identifiés à l’aide d’anticorps comme olig2 ou NG2. GalC peut servir à identifier des oligodendrocytes immatures ou matures, mais à ce stade de la culture, ce sont peu susceptibles d’être trouvé. Sinon, les cellules non-GFAP positives peuvent être quantifiés et contaminants peuvent être estimés. Cette dernière méthode ne discerne pas entre les cellules spécifiques, mais sera plus rapide et plus économique méthodologie pour déterminer le pourcentage de cellules non-astrocytaires dans la culture.

Une fois qu’une culture de l’astrocyte enrichi est produite, AMG expériences peuvent être menées pour étudier la réactivité de l’astrocyte. Purge une solution avec de l’azote par le bouillonnant pour remplacer l’oxygène est un protocole couramment utilisés32. Dans notre méthodologie, nous utilisons la méthode de propagation pour purger l’oxygène à l’azote (95 % N2, 5 % de CO2) dans le milieu sans glucose à un débit de 15 L/min, pendant 10 min, pour un volume total de 0,025 L. Pour confirmer que l’oxygène est purgé, nous avons mesuré la concentration d’oxygène restant dans les médias en utilisant un compteur d’oxygène pour les liquides et l’air. La concentration d’oxygène restant dans les médias après avoir purgé pendant 10 min a diminué de 7,9 mg/L à 0,3 mg/L. Pour déterminer combien de temps la chambre doit être purgée pour remplacer l’oxygène, purge avec N2 a été réalisée à l’aide de pas moins de suggestion du fabricant chambre (20 L/min, 2-5 min). Après 5 min de purge à 15 L/min, la concentration d’oxygène restant dans la chambre était de 0 %. Autres méthodes à l’aide de chambres semblables ont purgé d’un débit de 8 à 20 L/min et de temps de 5 à 10 min de substituer l’air oxygène avec azote33,,34.

Comme les autres modèles cellulaires, l’AMF a ses limites et résultats doivent être interprétés avec précaution. Les ministères peuvent être nocifs pour les neurones, cependant, les astrocytes peuvent résister à ces conditions pour jusqu'à 24 h35. Une autre limitation est que les astrocytes sont isolées dans ce système, le manque de signalisation d’autres cellules. Une façon de contourner cette limitation consiste à utiliser des milieux conditionnés d’autres cellules dans les mêmes conditions de type ischémique. Par ailleurs, les cytokines ou autres facteurs peuvent être ajoutés aux médias après AMG36.

Une autre méthode pour étudier les effets de la carence en énergie dans les cellules, est d’ajouter l’ouabaïne aux médias.  Ce composé principalement inhibe la pompe sodium/potassium, ce qui épuise la production intracellulaire de l’ATP, similaire aux effets de l’AMG37,38. Toutefois, cette méthode a l’inconvénient que tous ses mécanismes ne sont pas complètement explicitées et il induit des effets hors cible, qui introduit des variables qui constituent un scénario d’accident vasculaire cérébral ischémique irréaliste.

En résumé, la méthode de l’AMG est un système de cellules isolées qui permet de tester directement les effets des différentes drogues astrocytaires cibles in vitro qui pourrait contribuer davantage à la neuroprotection. Il fournit également un outil pour étudier la biologie de base astrocyte. Ce modèle peut créer une base solide d’éléments de preuve pour justifier les conditions expérimentales pour le développement de médicaments à l’aide d’un modèle in vivo d’accident vasculaire cérébral.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs veulent remercier Paola López Pieraldi pour l’assistance technique. A.H.M. est reconnaissante pour les subventions 8G12MD007600 et U54-NS083924 pris en charge de cette publication. Nous remercions NIH-NIMHD-G12-MD007583 subvention pour la prise en charge de l’installation. D.E.R.A. est reconnaissante de la bourse de recherche fourni par NIHNIGMS-R25GM110513. Nous sommes reconnaissants pour l’utilisation de l’espace commun d’Instrumentation et de l’aide du Dr Priscila Sanabria pour l’utilisation de la facilité d’imagerie optique du programme RCMI par grant G12MD007583. En outre, nous tenons à remercier Jose Padilla pour son rôle remarquable dans le tournage et le montage du protocole visuel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46, (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39, (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46, (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67, (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38, (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7, (5), e37574 (2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11, (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119, (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8, (3), e60282 (2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128, (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. 1347987 (2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62, (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55, (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2, (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532, (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9, (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6, (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120, (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7, (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66, (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254, (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131, (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41, (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48, (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93, (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11, (3), 249-259 (2001).
Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération <em>in Vitro</em> dans des Conditions de type ischémique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter