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Neuroscience

कोरोनरी की तरह शर्तों के तहत इन विट्रो में Astrocyte जेट और प्रसार की निगरानी

Published: October 21, 2017 doi: 10.3791/55108
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico
* These authors contributed equally

Summary

कोरोनरी स्ट्रोक एक जटिल घटना है जिसमें ऑक्सीजन ग्लूकोज़ अभाव (OGD) के संपर्क में आने वाले प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्र में astrocytes का विशिष्ट योगदान अध्ययन करने के लिए मुश्किल है । यह लेख अलग astrocytes प्राप्त करने के लिए एक पद्धति का परिचय और OGD शर्तों के तहत उनके जेट और प्रसार का अध्ययन ।

Abstract

कोरोनरी स्ट्रोक एक जटिल मस्तिष्क चोट मस्तिष्क के कुछ हिस्सों के लिए एक थक्का या थक्का बाधा रक्त प्रवाह की वजह से है । इससे ऑक्सीजन और ग्लूकोज का अभाव होता है, जो ऊर्जा की विफलता और न्यूरॉन की मौत का कारण बनता है । एक कोरोनरी स्ट्रोक अपमान के बाद, astrocytes प्रतिक्रियाशील हो जाते हैं और चोट साइट के आसपास पैदा के रूप में यह विकसित करता है । इस परिदृश्य के तहत, यह मुश्किल है के लिए astrocytes के विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने के लिए दिमाग के ischemia को उजागर क्षेत्र । इसलिए, इस अनुच्छेद के एक पद्धति का परिचय एक इन विट्रो मॉडल के तहत प्राथमिक astrocyte जेट और प्रसार का अध्ययन करने के लिए पर्यावरण की तरह, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव (OGD) कहा जाता है । Astrocytes 1-4 दिन पुराने नवजात चूहों से अलग थे और गैर विशिष्ट astrocytic कोशिकाओं की संख्या astrocyte चयनात्मक मार्कर Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और परमाणु धुंधला का उपयोग का आकलन किया गया था । अवधि जिसमें astrocytes OGD हालत के अधीन है अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ ऑक्सीजन का प्रतिशत वे करने के लिए उजागर कर रहे हैं । यह लचीलापन वैज्ञानिकों को इन विट्रो मेंकोशिकाओं के विभिन्न समूहों में कोरोनरी की तरह हालत की अवधि को चिह्नित करने की अनुमति देता है । यह आलेख चर्चा करता है कि OGD की समय सीमा astrocyte जेट, hypertrophic आकृति विज्ञान और प्रसार के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मापा Proliferating सेल परमाणु Antigen (PCNA) का उपयोग कर । प्रसार के अलावा, astrocytes ऊर्जा और oxidative तनाव से गुजरना, और कोशिका माध्यम में घुलनशील कारकों को रिहा करके OGD का जवाब । इस माध्यम एकत्र किया जा सकता है और कोशिका के लिए सेल संपर्क के बिना प्राथमिक ंयूरॉंस संस्कृतियों में astrocytes द्वारा जारी अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया । संक्षेप में, इस प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल कुशलता से चोट पर अलग astrocytes की भूमिका को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

स्ट्रोक "संवहनी मूल के एक तीव्र स्नायविक रोग के रूप में या तो अचानक या लक्षण और संकेत के तेजी से विकास के साथ परिभाषित किया गया है, मस्तिष्क में फोकल क्षेत्रों की भागीदारी के लिए इसी"1,2. वहाँ स्ट्रोक के दो प्रकार के होते हैं: रक्तस्रावी और कोरोनरी. जब नाड़ी रोग या तो एक धमनीविस्फार या एक paco खराबी, एक धमनी के पीछे टूटना के साथ कमजोर के साथ के कारण होता है, इस रक्तस्रावी स्ट्रोक3 जो, ज्यादातर मामलों में, मौत की ओर जाता है । जब एक थक्का या एक थक्का पहुंचा रक्त प्रवाह, ऑक्सीजन और एक मस्तिष्क क्षेत्र में ग्लूकोज की एक अस्थाई अभाव के कारण, यह कोरोनरी स्ट्रोक4कहा जाता है । प्रभावित क्षेत्र या कोरोनरी कोर के आसपास कोशिकाओं को पोषण देने में विफलता एक समस्थिति और चयापचय असंतुलन, ऊर्जावान रोग, ंयूरॉन मौत, और सूजन5है, जो रोगियों के लिए एक जीवन भर विकलांगता पैदा कर सकते है की ओर जाता है6।

कोरोनरी स्ट्रोक एक multifactorial चोट कोशिकाओं के कई प्रकार है कि प्रतिक्रिया और अलग समय बिंदुओं पर उनके प्रभाव डालती शामिल है । कई इंटरैक्शन व्यक्तिगत कक्षों के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक कठिन वातावरण बनाते हैं. तो, कैसे हम इस तरह के एक जटिल वातावरण के तहत एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के योगदान का अध्ययन करते हैं? एक स्वीकार किए जाते है इन विट्रो में ischemia के मॉडल के लिए ऑक्सीजन और ग्लूकोज (OGD) अभाव कोशिकाओं को उजागर करने के होते हैं, एक निश्चित अवधि के लिए, एक normoxic वातावरण के लिए कोशिकाओं की बहाली के बाद । इस प्रणाली के रक्त reperfusion द्वारा पीछा एक कोरोनरी स्ट्रोक simulates । इस विधि में, कोशिकाओं या ऊतकों एक ग्लूकोज के लिए एक वातावरण में मुक्त मीडिया को उजागर कर रहे हैं ऑक्सीजन की पर्ज, एक विशेष hypoxic चैंबर का उपयोग. OGD मशीन समय कुछ मिनट से 24 घंटे तक भिंन हो सकते हैं, परिकल्पना है कि परीक्षण किया जाना चाहता है पर निरभर है । अध्ययनों से पता चला है कि OGD और normoxic पर्यावरण के समय के आधार पर, स्ट्रोक के विशिष्ट phenotypes (यानी, तीव्र या जीर्ण) प्राप्त किया जा सकता है । प्राथमिक पृथक astrocytes, normoxic शर्तों को पीछे बहाली के साथ OGD को उजागर, एक अच्छी तरह से अध्ययन किया सेलुलर मॉडल है इन विट्रो7मेंस्ट्रोक की नकल करने के लिए । OGD का प्रयोग एक स्ट्रोक की तरह पर्यावरण के तहत अलग कोशिकाओं के स्वतंत्र आणविक तंत्र प्रकट संभव है ।

astrocyte जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान बढ़ जाती है के रूप में, यह स्पष्ट है कि वे synapses बनाए रखने और तंत्रिका की मरंमत, विकास, और प्लास्टिक8बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । सामांय परिस्थितियों के तहत, astrocytes रिलीज और साइटोकिंस, chemokines, वृद्धि कारकों और gliotransmitters, homeostasis5,9के भीतर चयापचय संतुलन और synapses रखने के लिए जवाब । एक्यूट neuroinflammation में, जैसे कि कोरोनरी स्ट्रोक, इन कोशिकाओं को प्रतिक्रियाशील बन सकता है, Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) की एक लंबी अवधि के व्यक्ती दिखाने के लिए, और उनकी आकृति विज्ञान5,10में अतिवृद्धि दिखाने के लिए, 11 , 12. के रूप में कोरोनरी infarct विकसित करता है, astrocytes द्वारा प्रदान की homeostasis प्रभावित हो जाता है, सामांय ग्लूटामेट अधिक से अधिक, ऊर्जा चयापचय, सक्रिय अणुओं के आदान प्रदान के बारे में, और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि13।

infarct ऊतक के आसपास पुनः सक्रिय astrocytes पैदा जबकि ल्यूकोसाइट्स घावों वाले क्षेत्र की ओर पलायन करते हैं14. Astrocytic जखीरे को proliferating सेल न्यूक्लियर antigen (PCNA), Ki67, और bromodeoxyuridine (BrdU)15जैसे मार्करों का उपयोग करके मापा जा सकता है । इस प्रफलन प्रतिक्रिया एक समय पर निर्भर तरीके से उत्पन्न होता है और यह glial निशान, एक चोट के बाद क्षतिग्रस्त साइट के पैरेन्काइमा के साथ अचल प्रतिक्रियाशील astrocytes की एक सरणी के गठन में मदद करता है9. इस निशान के प्रारंभिक कार्यों में से एक इस क्षेत्र से प्रतिरक्षा कोशिका extravasation सीमा है । हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि निशान axons के लिए एक भौतिक बाधा को बढ़ाने के लिए हो जाता है, के रूप में वे axonal विकास में बाधा अणुओं जारी है, और एक शारीरिक घायल क्षेत्र के आसपास के विस्तार से axons को रोकने बाधा पैदा16। फिर भी, वहां वैज्ञानिक दिखा रहा है कि एक रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद पूरी तरह से रोकने glial निशान गठन axons17के उत्थान ख़राब कर सकते है सबूत है । इस प्रकार, संदर्भ जिसमें विशिष्ट astrocytic प्रतिक्रिया मापा जाता है, पर विचार किया जाना चाहिए चोट के ढांचे का अध्ययन ।

प्रस्तुत पद्धति को astrocytes के व्यक्तिगत समारोह का अध्ययन करने के बाद ऑक्सीजन ग्लूकोज के अभाव में लागू किया जा सकता है और यह सवाल है कि जांचकर्ता जवाब चाहता है के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, रूपात्मक परिवर्तन और मार्करों अलग OGD बार में व्यक्त के अलावा, OGD को उजागर astrocytes से supernatants आगे घुलनशील इन कोशिकाओं द्वारा जारी कारकों की पहचान करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, या एक वातानुकूलित मीडिया के रूप में इस्तेमाल के लिए इसका आकलन अंय मस्तिष्क कोशिकाओं में प्रभाव । इस दृष्टिकोण astrocyte जेट कि कारकों है कि शासन और एक कोरोनरी स्ट्रोक परिदृश्य में उनकी प्रतिक्रिया मिलाना के elucidation के लिए नेतृत्व कर सकता है पर अध्ययन सक्षम बनाता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > प्रसव चूहों (Sprague Dawley) 1-4 दिन पुराने cortices को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है । इच्छामृत्यु की विधि decapitation है, जैसा कि NIH दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित है ।

< p class = "jove_title" > 1. सर्जरी के लिए उपकरणों और सामग्री की तैयारी

  1. एक आटोक्लेव में उपकरण निष्फल (तापमान: १२१ & #186; सी, दबाव: 15 साई, समय: 30 मिनट) एक स्टील बॉक्स या एक पल के लिए बंध्याकरण थैली सील का उपयोग कर । सामग्री की तालिका में सामग्री .
    2. देखें
< p class = "jove_title" > 2. पूर् DMEM वडा

  1. एक एक लीटर चोंच युक्त में ७०० मिलीलीटर autoclaved पानी, जोड़ Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम पाउडर कमरे के तापमान पर.
  2. जोड़ें ३.७ g/L सोडियम बिकारबोनिट, जबकि समाधान एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ उभारा है ।
  3. ७.४ के लिए पीएच समायोजित, autoclaved पानी के साथ 1 एल के लिए मात्रा लाने के लिए, तो फिल्टर । संस्कृति प्रयोजनों के लिए, 10% FBS के साथ मीडिया के वांछित मात्रा पूरक और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, और गर्म पर ३७ & #730; सी. सामग्री की तालिका में सामग्री .
    देखें नोट: पीएच मीडिया में पीएच मीटर इलेक्ट्रोड डालने के माध्यम से ७.४ को समायोजित किया गया था । मीडिया सरगर्मी होना चाहिए, तो धीरे से 1m NaOH एक ड्रॉपर का उपयोग कर जोड़ें ।
< p class = "jove_title" > 3. प्राथमिक Astrocyte कल्चर

< p class = "jove_content" > नोट: सीडिंग के बाद, सेल मीडिया हर तीन दिनों में परिवर्तित किया जाना चाहिए और कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए उगाया जा सकता है (11-13 दिन). तीसरे दिन, कुप्पी का नल कई बार microglial कोशिकाओं को उठाने के लिए और संस्कृति से जनक कोशिकाओं को oligodendrocyte, सभी को दूर & #39; old & #39; मीडिया, पंजाबियों के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर दो बार धोने, महाप्राण, फिर नए सिरे से नया मीडिया जोड़ें । सामग्री के तालिका में सामग्री .

देखें नवजात चूहे की
  1. विच्छेदन ब्रेन
    1. एक ऊतक संस्कृति डाकू में विच्छेदन प्रदर्शन । प्राप्त 1-4 दिन पुराने नवजात चूहे पिल्ले (2 चूहे दिमाग ७५ सेमी 2 कुप्पी) प्रति उपयोग किया जाता है ।
    2. तैयार ३ ६० mm पेट्री व्यंजन और पिपेट 5 मिलीलीटर की पूरी DMEM पर प्रत्येक.
      नोट: वे इस प्रकार विभाजित किया जा सकता है: प्रत्येक चूहे मस्तिष्क के लिए #1, #2 दिमाग के सभी cortices के लिए, और #3 सभी के लिए खुली cortices (बिना मेनिन्जेस) ।
    3. पिल्ला और ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे समझ । यह Decapitate और एक छोटा सा खतरा अपशिष्ट कंटेनर में शरीर को त्यागें ।
    4. सूक्ष्म विदारक चिमटी का उपयोग कर, सिर पकड़ और cranium को बेनकाब करने के लिए सिर के ऊपर त्वचा में कटौती ।
      5. कैंची की एक और जोड़ी के साथ
    5. , बना एक & #34; T & #34; चीरा नाक की ओर खोपड़ी के पीछे से शुरू । संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग धीरे खोपड़ी को दूर करने के लिए ।
    6. चिमटी की एक जोड़ी के साथ उजागर मस्तिष्क को हटाने और पहले माध्यम से भरे पेट्री व्यंजन में से एक में मस्तिष्क जगह है ।
    7. बाद के चरणों के लिए बाँझ उपकरणों का एक और सेट का उपयोग करें.
    8. सूक्ष्म विदारक संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे एक ६० mm पेट्री डिश के उल्टे ढक्कन पर एक मस्तिष्क जगह है । जब पेट्री पकवान बाँझ धुंध पर रखा जाता है, यह स्पष्ट रूप से मस्तिष्क को देखने के लिए संभव है और यह टुकड़े करने के लिए आसान है ।
    9. सूक्ष्म विदारक संदंश के साथ मस्तिष्क स्थिर और धीरे से सूक्ष्म विदारक संदंश के तेज अंत के साथ midline विदर साथ चिढ़ा द्वारा सेरेब्रल गोलार्द्ध को अलग ।
      10. ।
    10. से ध्यान हटाने और cortices छील, सफेद मामले के पीछे जा रहा है, और उंहें एक पेट्री डिश को हस्तांतरण, पहले #2 लेबल । सभी दिमाग के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ, #2 लेबल पेट्री डिश में सभी विदारक cortices के संयोजन.
    11. प्रत्येक प्रांतस्था के नीचे से हिप्पोकैंपस ले और इसे त्यागें ।
    12. सूक्ष्म विदारक चिमटी और एक & #160 का उपयोग करें; ६० mm पेट्री धीरे से मेनिन्जेस को छील कर अलग cortical पालियों में डाल दें, और उन्हें #3 पेट्री लेबल वाली डिश में रखें ।
  2. ऊतक पृथक्करण: homogenizer ब्लेंडर विधि
    1. ऊतक/मध्यम निलंबन (मस्तिष्क के छिले cortices) बाँझ ब्लेंडर बैग में और बैग में कुल मात्रा को लाने के लिए पर्याप्त माध्यम जोड़ने के लिए 5 मिलीलीटर.
    2. homogenizer ब्लेंडर में बैग जगह बंद दरवाजे के ऊपर दिखाई बैग के लगभग 2 सेमी जा । सेल पृथक्करण उच्च गति पर २.५ मिनट के दौरान किया जाता है ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, इस बैग को बंद करने और धीरे यह हुड में एक चोंच के साथ तेज़ द्वारा किया जा सकता है । घर्षण से बचने के लिए बैग और यूरिन के बीच में एक कपड़े का इस्तेमाल ज़रूर करें ।
    3. एक संख्या में सेल निलंबन डालो ६० & #160; जाल छलनी और फिर संख्या १०० छलनी पर के माध्यम से फ़िल्टर प्रवाह डालना, यह गुरुत्वाकर्षण द्वारा फिल्टर करने के लिए अनुमति देता है ।
    4. 15 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग कर, 5 min.
      5. के लिए एक नैदानिक केंद्रापसारक (अधिमानतः स्विंग बाल्टी रोटर) में २०० एक्स जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक
    5. एक चोंच में supernatant बंद डालो, तो एक सीरम पिपेट का उपयोग कर, फिर से निलंबित और अलग कोशिकाओं की गोली मीडिया के 5 मिलीलीटर की एक अधिकतम में ।
  3. सेल काउंटिंग
    1. एक micropipette के साथ, कलेक्ट १०० & #181; एक १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब में सेल सस्पेंशन के एल और जोड़ १०० & #181; l of trypan blue.
    2. Insert 10 & #181; hemocytometer में एकत्र निलंबन के एल और सभी कोशिकाओं है कि वर्ग के चार कोनों में व्यवहार्य है गिनती ।
    3. की कुप्पी तैयार करने से पहले कोशिकाओं के घनत्व की गणना के लिए सूत्र हैं:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55108/55108eq1.jpg"/>
      < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55108/55108eq2.jpg"/>
    4. प्रति 25 सेमी 2 कुप्पी में कम से ५००,००० कक्षों को जोड़ें । प्रत्येक कुप्पी में DMEM के 5 मिलीलीटर तक पिपेट । इस मिश्रण को कुप्पी की गर्दन तक नहीं पहुंचना चाहिए । उन्हें एक ३७ & #176 में रखें; सी मशीन 5% कं 2, 3 दिनों के लिए, फिर मीडिया बदल जाते हैं ।
  4. Astrocyte शुद्धि तकनीक: मीडिया परिवर्तन, यांत्रिक, और रासायनिक रणनीतियों
    नोट: की चयापचय दर अन्य कोशिका प्रकार की तुलना में उच्च है, इसलिए, पोषण में वंचित शर्तों, इन कोशिकाओं को कम जीवित रहने की दर कुछ दिनों के बाद दिखाते हैं । astrocytes के विपरीत, microglia पोषण अभाव से प्रभावित नहीं होते हैं और ऐसे वातावरण में पैदा < सुप क्लास = "xref" > 18 . microglial कोशिकाओं की एक कम संख्या बनाए रखने के लिए, लेखकों astroglial सेल संस्कृति मीडिया हर 3 दिन बदल जाते हैं । सेल मीडिया में इस लगातार बदलाव से microglial जनसंख्या में भी कमी आएगी जो कुप्पी < सुप वर्ग में astrocytic सेल monolayer के शीर्ष पर बढ़ सकती है = "xref" > 19 ।
    1. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग मीडिया को महाप्राण अनुयाई कोशिकाओं के साथ गैर-microglial की हर कुप्पी से करते हैं । एक dropwise तरीके (5 मिलीलीटर/
      2. में कुप्पी के प्रत्येक को बाँझ-फ़िल्टर किए गए पंजाबियों का उपयोग कर पीछे छोड़ दिया किसी भी मलबे को धो लें ।
    2. (एंटीबायोटिक और भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ) बाँझ-फ़िल्टर्ड DMEM जोड़ें dropwise प्रत्येक कुप्पी (5 मिलीलीटर/ धीरे एक परिपत्र गति में आंदोलन के लिए पूरी सतह को कवर ।
      3. एक ३७ & में
    3. जगह कक्ष#176; सी मशीन पर 5% कं 2 के लिए 8-10 दिनों तक कुप्पी तक पहुंच (& #62; ९५% प्लेट कवरेज) ।
      नोट: कई प्रोटोकॉल से पता चला है कि जब astrocytes तक पहुंचने, इस तरह के 2 से 24 ज संस्कृति मिलाते के रूप में यांत्रिक तरीके, कोशिकाओं की टुकड़ी की ओर जाता है कि इन astrocytes के शीर्ष पर झूठ, मुख्य रूप से microglia और अग्रदूत कोशिकाओं < सुप वर्ग = "xref" > 19 , < सुप class = "xref" > 20 .
    4. गैर astrocytic कोशिकाओं संस्कृति में 30 मिनट के लिए १८० rpm पर मिलाते हुए कक्षीय प्रदर्शन से कम कर रहे हैं । supernatant में कोशिकाओं को हटाने के बाद, ताजा मीडिया कुप्पी (~ 15 मिलीलीटर) में pipetted है ।
    5. oligodendrocyte जनक कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, २०० rpm को मिलाने की गति को बढाना 6 ज < सुप वर्ग = "xref" > २१ , < सुप क्लास = "xref" > २२ , < सुप क्लास = "xref" > २३ , महाप्राण supernatant, आणि प्लास्टिक फ्रेश मीडिया.
      नोट: संस्कृतियों में microglia की उपस्थिति कम करने के लिए, दो रासायनिक तरीकों क्रमिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता (नहीं एक साथ) प्राथमिक कोशिका संस्कृति पद्धति में: Arabinose cytosine (आरा-सी) और एल-leucine मिथाइल एस्टर (LME) < सुप वर्ग = "xref" > 24 .
    6. तुरंत जब कोशिकाओं को प्रभावित पहुंच (१००%), microglia के मैकेनिकल हटाने के 3-4 दिन बाद इन कोशिकाओं का इलाज 8 & #181 के साथ किया जा सकता है; antimitotic यौगिक Arabinose cytosine (आरा-सी) के एम DMEM में 5 दिनों के लिए (परिवर्तन के लिए ताजा आरा-सी में DMEM दैनिक).
      नोट: इस परिसर एक antimitotic दवा है के बाद से आरा-सी जोड़ने के लिए समय बिंदु महत्वपूर्ण है, जो तेजी से विभाजित कोशिकाओं की संख्या को कम करता है जैसे microglia < सुप class = "xref" > 19 , < सुप class = "xref" > 25 और fibroblasts < सुप class = "xref" > 26 . microglia के विपरीत, जब धाराप्रवाह, astrocytes रोक proliferating के माध्यम से संपर्क निषेध < सुप वर्ग = "xref" > २७ .
    7. की अनुमति दें 2 दिनों के लिए सेल से पुनर्प्राप्त करने के लिए आरा-C उपचार.
    8. आगे microglial संदूषण को कम करने के लिए, कोशिकाओं के प्रवाह तक पहुंचने के बाद, ५० मिमी का उपयोग करें L-leucine मिथाइल एस्टर (LME) DMEM में पीएच ७.४ पर तय, 1 ज के लिए ३७ & #730; C.
      नोट: LME कोशिकाओं और organelles की झिल्ली को काटता है, और hydrolyzed होने के बाद, एल-leucine का उत्पादन इन कोशिकाओं के lysosomes में जमा हो जाता है । इस एमिनो एसिड का संचय एक परासरणी सूजन और lysosomes का टूटना करने के लिए सुराग < सुप वर्ग = "xref" > 28 , < सुप क्लास = "xref" > 29 . LME microglia को नष्ट करने में अत्यधिक प्रभावी है, अन्य कोशिकाओं की तुलना में < सुप class = "xref" > 20 , < सुप class = "xref" > 30 .
< p class = "jove_title" > 4. 6-वेल प्लेट्स में Astrocytes की खेती करने वाले

  1. कोटिंग coverslips with पाली-D-lysine
    1. प्रत्येक ३५ मिमी coverslip पकवान में एक पेट्री डाल, फिर जोड़ १०० & #181; के पतला पाली-डी-lysine समाधान के लिए प्रत्येक coverslip और प्रतीक्षा 1 h.
    2. को पॉली-डी-Lysine निकालें और 2 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ दो बार धोएं ।
    3. पानी निकालें और डाकू के अंदर शुष्क करने के लिए coverslips के लिए रुको । coverslips को-20 & #176; C को दो सप् ताह तक स् टोर करें ।
      नोट: पतला पाली-डी-Lysine समाधान फ्रीज; इसे दो हफ्तों तक स्टोर किया जा सकता है ।
  2. Trypsinization
    1. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, महाप्राण की कुप्पी से मध्यम । कोशिकाओं को धीरे से कुल्ला करने के लिए बाँझ-फ़िल्टर किए गए पंजाबियों के 5 मिलीलीटर/
    2. महाप्राण बंद पंजाबियों, और फिर जोड़ें 5 मिलीलीटर बाँझ की कुप्पी-फ़िल्टर ०.२५% Trypsin और ०.५ mM EDTA समाधान । ३७ में कुप्पी की जगह & #730; ग, 5% कं 2 मशीन के लिए 10 min.
      नोट: जबकि कोशिकाओं की मशीन है, गर्म 5 मिलीलीटर/३७ पर ताजा पूरा DMEM की कुप्पी & #176; ग.
    3. मशीन के 10 मिनट के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन सभी कोशिकाओं बंद कुप्पी उठा रहे हैं । जल्दी से एक कुप्पी करने के लिए गर्म पूरा DMEM के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, trypsin बेअसर करने के लिए ।
    4. धीरे से कोशिकाओं को पिपेट ऊपर और नीचे कई बार तोड़ने के लिए किसी भी & #34; झुरमुट & #34;. एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए दो कुप्पी से निलंबित कोशिकाओं स्थानांतरण.
    5. २०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक को सेल गोली इकट्ठा । पुनः निलंबित ५०० में गोली & #181; माध्यम के एल और कुप्पी में कोशिकाओं जगह के लिए आगे बढ़ना ।
      नोट: कोशिकाओं के साथ किया जा करने के लिए विश्लेषण के उदाहरण: 1) जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए उल्टा प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर); 2) पश्चिमी दाग प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए; 3) प्रवाह cytometry विश्लेषण तंत्रिका जनक कोशिकाओं और ब्याज की प्रोटीन की संख्या को बढ़ाता है; 4) इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए.
  3. सीडिंग astrocytes
    1. astrocytes के साथ प्राथमिक trypsin का इलाज करने के बाद ( ४.२ को देखें), एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सेल सस्पेंशन का १०० & #956; l और add १०० & #956; l का ०.५% trypan नीला.
    2. Add 10 & #956; trypan ब्लू में एकत्र निलंबन hemocytometer के लिए और सभी कोशिकाओं है कि व्यवहार्य है गिनती के एल ।
    3. कदम ३.३ में सूत्र की कुप्पी तैयार करने से पहले कोशिकाओं के घनत्व की गणना करने के लिए उपयोग करें ।
    4. एक बाँझ, पाली-डी-Lysine लेपित coverslip एक अच्छी तरह से जोड़कर बहु-अच्छी तरह से व्यंजन तैयार करते हैं । ५०,००० कोशिकाओं को पिपेट और प्रत्येक मल्टी-वेल डिश में बाकी मात्रा को ताजे मीडियम (लगभग 2 एमएल) के साथ भरें ।
    5. में बहु-अच्छी व्यंजन जगह ३७ & #730; सी मशीनी पर 5% कं 2 और, 5-7 दिनों के बाद, astrocytes बढ़ सकता है और coverslips की पूरी सतह को कवर कर सकते हैं ।
< p class = "jove_title" > 5. प्राथमिक Astrocytes के लिए OGD प्रोटोकॉल

  1. OGD मध्यम तयारी
    1. Supplement Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; s मध्यम मुक्त ग्लूकोज ३.७ g/L सोडियम बिकारबोनिट के साथ, और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin. तालिका में सामग्री देखें 4 .
    2. ९५% N 2 /5% कं के साथ bubbling द्वारा ग्लूकोज मुक्त माध्यम के 20 मिलीलीटर शुद्ध 15 एल के एक प्रवाह में 10 मिनट के लिए 2 /मिनट (प्रवाह मीटर के साथ संकेत) माध्यम में गैस प्रणाली के लिए एक सीरम पिपेट डालने के द्वारा ।
      नोट: ऑक्सीजन के माध्यम मिटाने के बाद, ७.४ पर पीएच समायोजित (चरण २.१ पर ध्यान दें करने के लिए देखें).
    3. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब फिल्टर प्रणाली का उपयोग कर पर्ज ग्लूकोज मुक्त माध्यम फिल्टर.
      नोट: हर प्रयोग के लिए ताजा OGD माध्यम बनाओ, ९५% N 2 के साथ bubbling/5% सह 2 का उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं ऑक्सीजन की पर्ज एक वातावरण को उजागर कर रहे हैं ।
  2. प्रयोगात्मक प्रक्रिया
    1. ऊतक संस्कृति हूड के अंदर, पहले से तैयार astrocyte से coverslips मीडिया को हटाने (कदम 4.3.5 को देखें) और सेलुलर पंजाबियों के साथ दो बार धोने के लिए कोशिकाओं पर किसी भी ग्लूकोज को हटा दें ।
    2. OGD मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें एक अच्छी तरह से करने के लिए और उनके ढक्कन के साथ हाइपोक्सिया चैंबर के अंदर बहु अच्छी तरह से बर्तन जगह है ।
    3. प्रवेश वाल्व को गैस मिश्रण कनेक्ट और बाहर निकलें वाल्व खुला छोड़ दें । ९५% N 2 /5% कं 2 के गैस मिश्रण के साथ चैंबर फ्लश 5 मिनट के लिए 15 L/
    4. गैस के प्रवाह को रोकने के लिए, और पहले बाहर निकलें वाल्व पर दबाना बंद करो, तो गैस प्रवेश वाल्व टयूबिंग पर दबाना बंद करो ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि साबुन के पानी से चैंबर की सील को कवर कर गैस रिसाव न हो । सील सुरक्षित है, तो कोई बुलबुले के रूप में होना चाहिए.
    5. ३७ में सेल संस्कृति मशीन में पूरे चैंबर जगह & #176; ग के लिए 1 ज या OGD.
      6. में 6 एच
    6. के बाद मशीन समय खत्म हो गया है, महाप्राण OGD मीडिया और ध्यान से प्लास्टिक 2 मिलीलीटर की पूरी DMEM करने के लिए प्रत्येक ४.६७ & #160; सेमी 2 के लिए normoxic प्रक्रिया 24 ज.
< p class = "jove_title" > 6. प्रोटोकाल के लिए प्राथमिक Astrocyte इम्यूनोफ्लोरेसेंस तयारी

< p class = "jove_content" > नोट: शुद्धता का आकलन करने के लिए, विभिन्न मस्तिष्क कोशिका प्रकार जैसे न्यूरॉन्स, Astrocyte, और microglia द्वारा पता लगाया जा सकता इम्यूनोफ्लोरेसेंस अलग सेल मार्कर का उपयोग कर । प्रसार मार्करों, PCNA, और propidium आयोडाइड (PI) प्राथमिक astrocytes OGD शर्तों के बाद normoxic करने के लिए उजागर पर इस्तेमाल किया जा सकता है । सामग्री के तालिका में सामग्री .

देखें
  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस वडा
    नोट: यह एक सामांय इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल है, मामूली संशोधनों के लिए एक इष्टतम संकेत प्राप्त किया जा सकता है ( जैसे , अब गर्मी की अवधि, गर्मी तापमान) । तालिका 1 से प्रत्येक मार्कर का उपयोग निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल के अनुसार किया जा सकता है.
    1. कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए ३७ & #176; सी में PI (5 & #181; एम के साथ पूरा DMEM में) और 5 मिनट के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने के लिए किया जा सकता है ।
      नोट: चरण 5.2.6 में उपचारित कक्षों का उपयोग करें.
    2. धुंधला होने के बाद कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, जोड़ें 2 मिलीलीटर की 4% formalin प्रति ४.६७ & #160; cm 2 खैर, 20 मिनट के लिए 4 & #730; C. PCNA के साथ लेबल किए गए नमूनों के लिए, पसंदीदा फिक्सिंग समाधान पर 10 मिनट के लिए मेथनॉल है 4 & #730; C.
      सावधानी: Formalin और मेथनॉल विषैले होते हैं ।
      नोट: हमेशा प्रत्येक कंपनी से विशिष्ट एंटीबॉडी प्रोटोकॉल की जांच करें ।
    3. 5 मिनट के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धोने कोशिकाओं और इस चरण को दोहराने 3 बार ।
    4. समाधान अवरुद्ध में गर्मी कोशिकाओं (०.५% गैर ईओण surfactant, पंजाब में 10% FBS) कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
    5. 5 मिनट के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो, 3 बार धो दोहराएं ।
    6. में 4 & #176; सी, रातोंरात (16 एच), पंजाब में 1% FBS के समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी (PCNA, GFAP) के साथ ।
    7. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें, 5 मिनट के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, और इस चरण को दोहराने 3 बार ।
    8. के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ एक fluorophore के समाधान में 1% FBS, 1 ज के लिए, कमरे के तापमान पर ।
    9. 5 मिनट के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो, इस चरण को दोहराने 3 बार । Add 1 & #181; g/मब ऑफ DAPI (4 & #39;, 6 & #39;-diamidino-2-phenylindole) के लिए 5 मिनट के लिए दाग सेल नाभिक.
    10. 5 मिनट की 2 मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं, इस कदम को दो बार दोहराएं और पंजाबियों में रहते हैं ।
    11. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक खुर्दबीन स्लाइड पर coverslips तैयार करते हैं.
  2. के फोकल माइक्रोस्कोप
    1. माइक्रोस्कोप की स्थापना करने के बाद coverslip की ओर नीचे की तरफ रखें ।
    2. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, GFAP के लिए 543nm पर एक लेज़र बीम का चयन करें-Cy3 संयुग्मित एंटीबॉडी.
< p class = "jove_title" > 7. सेल व्यवहार्यता परख

  1. Trypsinize और यों astrocytes चरणों का पालन करके ४.३ और ४.४.
  2. Add 1x10 4 cells/९६-अच्छी तरह से प्लेटें और उन्हें प्रभावित करने के लिए विकसित.
  3. चरण 5 से कार्यप्रणाली का उपयोग कर, का पर्दाफाश ९६-well प्लेट्स या तो normoxic 1 ज OGD या 6 ज OGD.
  4. OGD उपचार के बाद, normoxic मीडिया के लिए सभी कोशिकाओं में जोड़ा जाता है 24 एच और व्यवहार्यता MTT एजेंट परख का उपयोग कर मापा जाता है (निर्माता के रूप में उपयोग & #39; एस निर्देश संकेत).
  5. से एक 5 मिलीग्राम/एमएल MTT समाधान, एक अच्छी तरह से कुल मात्रा का 10% जोड़ें और ३७ & #730 पर 3 ज के लिए मशीन, MTT रिएजेंट के साथ सी ।
  6. निकालें मीडिया और क्रिस्टल reसस्पेंड का उपयोग २०० & #181; L dimethyl sulfoxide. एक spectrophotometer में ५७० एनएम में थाली पढ़ें ।
    नोट: नियंत्रण कोशिकाओं के सापेक्ष एक घटी हुई अवशोषक कम व्यवहार्यता के साथ सहसंबंधी होगा ।

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Representative Results

प्राथमिक astrocytic संस्कृति की मुख्य चिंताओं में से एक अन्य कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स, oligodendrocytes, fibroblasts, और microglia की उपस्थिति है । चित्रा 1में, चूहे cortices से पृथक कोशिकाओं मीडिया परिवर्तन हर 3 दिन था और या तो इलाज या 1 घंटे के लिए जोड़ा LME के साथ इलाज किया गया ज .24 h बाद में, कोशिकाओं GFAP के लिए immunostained थे और counterstained के साथ DAPI । अनुपचारित कोशिकाओं को ३९% गैर GFAP सकारात्मक कोशिकाओं के एक औसत दिखाया, जबकि LME-इलाज कोशिकाओं 8% दिखाया । इन परिणामों को दिखाने कैसे LME उपचार और मीडिया परिवर्तन प्रभावी ढंग से गैर GFAP सकारात्मक कोशिकाओं ४.७५ गुना से कम, एक समृद्ध-astrocyte संस्कृति का उत्पादन । यदि 1 ज या 6 एच OGD इस पद्धति के बाद astrocyte व्यवहार्यता को प्रभावित करता है निर्धारित करने के लिए, चित्रा 2 astrocyte संस्कृतियों, अपमान के बाद 24 ज की एक MTT परख से पता चलता है । व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर किसी भी हालत में पाया गया था, दिखा रहा है कि दोनों बार astrocyte जेट अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कोशिका प्रसार astrocytes में OGD द्वारा ट्रिगर प्रभावों में से एक है । Proliferating सेल न्यूक्लियर प्रतिजन (PCNA) में चित्रा 3 normoxic कोशिकाओं में 10% से वृद्धि हुई, 1 ज OGD के बाद 30% करने के लिए, vivo astrocytic प्रतिक्रिया15 में उंमीद दिखा । अंत में, astrocytes 24 एच normoxic शर्तों के द्वारा पीछा OGD के 6 ज के संपर्क में थे । समय की इस अवधि के बाद, GFAP के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन किया गया । OGD-उजागर कोशिकाओं normoxic शर्तों के तहत astrocytes की तुलना में थे । Astrocytes बिना OGD पारंपरिक stellate आकृति विज्ञान (चित्र 4a) शो जबकि कोशिकाओं है कि OGD स्पष्ट रूप से प्रतिक्रियाशील अतिवृद्धि की विशेषता Astrocytes (चित्रा 4B) मौजूद थे । इस अतिवृद्धि इसी अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (cortical चूहा astrocytes की छवि) normoxic और OGD शर्तों (चित्रा 5) के तहत में visualized किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 . GFAP और DAPI के साथ प्राथमिक cortical मूषक astrocytes संस्कृति पवित्रता को मान्य करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस. (A) बाएं पैनल का प्रतिनिधित्व करता है GFAP सकारात्मक कोशिकाओं (लाल), मध्य पैनल से पता चलता है नाभिक (DAPI, नीला), और सही पैनल के विलय छवियों को दिखाता है गैर LME-इलाज (ऊपरी पैनल) और LME-इलाज (कम पैनल) कोशिकाओं । सफ़ेद तीर गैर-GFAP-धनात्मक सना हुआ कक्ष दिखाते हैं । (B) LME और गैर-LME उपचार कक्षों में गैर-GFAP धनात्मक नाभिक का ठहराव । एक ख़राब टी-टेस्ट किया गया (p & #60; ०.०००१) और त्रुटि पट्टियां SEM के साथ माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार्स ५० माइक्रोन और चित्रों का प्रतिनिधित्व 20x आवर्धन पर लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . OGD के लिए 24 एच जोखिम के साथ astrocytes की व्यवहार्यता परख । Astrocytes ९६ में संस्कृति थे अच्छी तरह से प्लेटें और या तो normoxic, 1 ज OGD, या 6 एच OGD शर्तों से अवगत कराया । उपचार के बाद, कोशिकाओं normoxic मीडिया के लिए 24 एच और व्यवहार्यता MTT परख का उपयोग कर मापा गया था के लिए जोड़ा गया । ५७० एनएम पर अवशोषक संस्कृति में OGD उजागर कोशिकाओं की कोशिका व्यवहार्यता से पता चलता है जब normoxic स्थितियों में कोशिकाओं की तुलना में । डेटा एक तरह से ANOVA के साथ विश्लेषण किया गया था (पी = 0.9669) और त्रुटि सलाखों के साथ प्रस्तुत किया है कि SEM के साथ मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3। ऑक्सीजन और ग्लूकोज वंचित करने के लिए जोखिम पर चूहा astrocytes में प्रसार और एक मार्कर के रूप में PCNA का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । (क) बाएं पैनल का प्रतिनिधित्व करता है PCNA सकारात्मक कोशिकाओं (हरा), मध्य पैनल से पता चलता है नाभिक (DAPI, नीला), और सही पैनल normoxic कोशिकाओं (ऊपरी पैनल) और 1 एच OGD इलाज कोशिकाओं (निचले पैनल) की छवियों का विलय से पता चलता है । (B) normoxic में PCNA धनात्मक कक्षों का प्रतिशत OGD उपचारित कक्ष । एक ख़राब-परीक्षण किया गया (p & #60; ०.०००१) और त्रुटि पट्टियां SEM के साथ माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार्स ५० माइक्रोन और चित्रों का प्रतिनिधित्व 20x आवर्धन पर लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . Glial Fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) की अभिव्यक्ति प्राथमिक चूहे Cy3 cortical संस्कृति में astrocyte के साथ संयुग्मित. (क) एक normoxic वातावरण में Astrocytes विशेषता stellate आकृति विज्ञान दिखाएँ. मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन, GFAP, कोशिका निकायों भरता है और पतली cytoplasmic प्रक्रियाओं में फैली हुई है । (ख) OGD एक्सपोजर astrocytes के 6 ज के बाद एक hypertrophic आकृति विज्ञान अपनाया । तराजू 20 माइक्रोन और चित्रों का प्रतिनिधित्व एक फोकल माइक्रोस्कोप में 40x आवर्धन पर ले जाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . normoxic और ऑक्सीजन-ग्लूकोज के अभाव में Cortical चूहा astrocytes । normoxic शर्तों के तहत astrocytes का इम्यूनोफ्लोरेसेंस (ऊपरी बायां फलक) या 6 h OGD (निचला बायां फलक), सना एक Cy3-संयुग्मित एंटीबॉडी के खिलाफ GFAP का उपयोग कर रहा है । इसी अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) छवि सही पैनल पर दिखाया गया है । स्केल बार 20 माइक्रोन और चित्रों का प्रतिनिधित्व करता है 20x आवर्धन पर ले जाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

उद्देश्य एंटीबॉडी मार्कर/ विवरण
Astrocyte कल्चर मान् यता आईबीए-1 microglial कक्षों का पता लगाता है
NeuN की पहचान करता है परिपक्व ंयूरॉंस
Olig1 का पता लगाता है परिपक्व oligodendrocytes
Olig2, NG2 oligodendrocyte के प्रणेता कोशिकाओं का पता लगाता है
GalC पहचानता है अपरिपक्व या परिपक्व oligodendrocytes
प्रसार PCNA बाँधता है p36 प्रोटीन, proliferating कोशिकाओं में उच्च स्तर पर व्यक्त
सेल व्यवहार्यता Propidium आयोडाइड (PI) डीएनए को बांधता है, यह मार्कर कोशिका व्यवहार्यता की कमी को इंगित करता है
tr > mtt उपाय mitochondrial कार्यक्षमता जेट GFAP astrocyte रिजेट का संकेतक

तालिका 1. कोशिकाओं और सेलुलर प्रक्रियाओं के विभिन्न प्रकार के दाग के लिए इस्तेमाल किया एजेंट की सूची

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Discussion

यह प्रोटोकॉल चूहे cortices से astrocytes के अलगाव का वर्णन करता है । इस विधि में, यह microglia, oligodendrocytes, और fibroblasts जैसे अंय सेलुलर प्रकार के साथ संदूषण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । microglia की संख्या को कम करने के लिए, कई कदम उठाए जा सकते हैं: मीडिया, परिक्रमा मिलाते हुए, और रासायनिक उपचार बदल रहा है । एक बार संस्कृति पवित्रता चयनात्मक सेलुलर मार्कर का उपयोग कर या सबसे प्रमुख सेल संदूषणों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा की पुष्टि की है, प्रयोगों प्रदर्शन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी के खिलाफ के लिए प्रेरित कैल्शियम बाध्यकारी एडेप्टर अणु 1 (आईबीए-1) microglia का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । न्यूरॉन की मृत्यु जल्दी संस्कृति में शुरू होता है और इन कोशिकाओं को 331दिन में कुप्पी दोहन और मीडिया परिवर्तन के बाद oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं (OPCs) के साथ एक साथ समाप्त कर रहे हैं । Oligodendrocytic के प्रणेता कोशिकाओं को olig2 या NG2 जैसे एंटीबॉडी का इस्तेमाल करके पहचाना जा सकता है. GalC अपरिपक्व या परिपक्व oligodendrocytes की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस संस्कृति के स्तर पर इन पाया जा करने की संभावना नहीं है । वैकल्पिक रूप से, गैर GFAP सकारात्मक कोशिकाओं को मात्रा जा सकता है और दूषित पदार्थों का अनुमान लगाया जा सकता है । यह अंतिम पद्धति विशिष्ट कोशिकाओं के बीच विचार नहीं करती, बल्कि संस्कृति में गैर-astrocytic कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए एक तेज और अधिक आर्थिक पद्धति होगी.

एक बार एक astrocyte समृद्ध संस्कृति का उत्पादन किया है, OGD प्रयोगों astrocyte जेट अध्ययन करने के लिए आयोजित कर सकते हैं । ऑक्सीजन विकल्प bubbling द्वारा नाइट्रोजन के साथ एक समाधान मिटाना एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल३२है । हमारी पद्धति में, हम bubbling विधि का उपयोग करने के लिए नाइट्रोजन गैस (९५% एन2, 5% CO2) के साथ ऑक्सीजन शुद्ध 15 एल के एक प्रवाह की दर से मुक्त मीडिया में, 10 मिनट के लिए, की कुल मात्रा के लिए ०.०२५ l पुष्टि करने के लिए कि ऑक्सीजन पर्ज है, हम ऑक्सीजन तरल पदार्थ और हवा के लिए एक ऑक्सीजन मीटर का उपयोग करके मीडिया में शेष एकाग्रता मापा । ऑक्सीजन एकाग्रता 10 मिनट के लिए मिटाने के बाद मीडिया में शेष ७.९ मिलीग्राम/l से ०.३ मिलीग्राम/ निर्धारित करने के लिए कितनी देर चैंबर ऑक्सीजन की जगह मिटा दिया जाना चाहिए, N2 के साथ मिटाना नहीं चैंबर निर्माता के सुझाव से कम का उपयोग किया गया था (20 एल/ 15 एल/मिनट में मिटाने के 5 मिनट के बाद, ऑक्सीजन एकाग्रता चैंबर में शेष 0% था । अंय समान कक्षों का उपयोग करने के तरीके एक 8-20 L/ंयूनतम प्रवाह दर पर मिटा दिया है, और 5-10 मिनट के समय के लिए नाइट्रोजन के साथ एयर ऑक्सीजन विकल्प३३,३४।

अंय सेलुलर मॉडल की तरह, OGD सीमाएं है और परिणाम ध्यान से व्याख्या की जानी चाहिए । OGD न्यूरॉन्स के लिए हानिकारक हो सकता है, तथापि, astrocytes अप करने के लिए इन शर्तों का सामना कर सकते हैं 24 h३५. एक और सीमा है कि astrocytes इस प्रणाली में अलग कर रहे हैं, अंय कोशिकाओं से संकेतन कमी है । एक तरह से इस सीमा पर काबू पाने के लिए एक ही कोरोनरी जैसी स्थितियों के तहत अंय कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग है । वैकल्पिक रूप से, साइटोकिंस या अंय कारकों को OGD३६के बाद मीडिया में जोड़ा जा सकता है ।

कोशिकाओं में ऊर्जा की कमी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति है, मीडिया के लिए ouabain जोड़ने के लिए है ।  यह यौगिक मुख्य रूप से सोडियम/पोटेशियम पंप को रोकता है, जो एटीपी के intracellular उत्पादन को चूस रहा है, OGD३७,३८के प्रभाव के समान है । हालांकि, इस विधि नुकसान है कि अपने सभी तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे है और यह बंद लाती है-लक्ष्य प्रभाव है, जो चर परिचय जो एक अवास्तविक कोरोनरी स्ट्रोक परिदृश्य का गठन ।

संक्षेप में, OGD विधि एक अलग सेल प्रणाली है जो हमें सीधे अलग astrocytic दवा लक्ष्यों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है इन विट्रो कि आगे neuroprotection में योगदान कर सकता है । यह भी एक उपकरण के लिए बुनियादी astrocyte जीवविज्ञान अध्ययन प्रदान करता है । यह मॉडल स्ट्रोक के vivo में मॉडल का उपयोग कर दवाओं के विकास के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का औचित्य साबित करने के लिए सबूत का एक मजबूत आधार बना सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक तकनीकी सहायता के लिए Paola López Pieraldi का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । A.H.M. इस प्रकाशन का समर्थन करने वाले पलाश 8G12MD007600 और U54-NS083924 के लिए आभारी है । सुविधा सहायता के लिए हम NIH-NIMHD-G12-MD007583 अनुदान का धन्यवाद करते हैं । D.E.R.A. NIHNIGMS-R25GM110513 द्वारा प्रदान की फैलोशिप के लिए आभारी है । हम आम कर्मशाला क्षेत्र के उपयोग और RCMI कार्यक्रम की ऑप्टिकल इमेजिंग सुविधा के उपयोग के लिए अनुदान G12MD007583 द्वारा डॉ Priscila Sanabria की सहायता के लिए आभारी हैं. इसके अलावा, हम फिल्म और संपादन दृश्य प्रोटोकॉल में उनकी उत्कृष्ट भूमिका के लिए जोस ेके शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२८ ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव (OGD) astrocytes GFAP कोरोनरी स्ट्रोक इन विट्रो मॉडल चूहा PCNA
कोरोनरी की तरह शर्तों के तहत <em>इन विट्रो में</em> Astrocyte जेट और प्रसार की निगरानी
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Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

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