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Neuroscience

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

Abstract

허 혈 성 뇌졸중은 혈전 또는 두뇌의 부분에 혈액 흐름을 방해 하는 embolus로 인 한 복잡 한 뇌 손상. 이것은 산소와 포도 당, 에너지 실패 원인과 신경 죽음의 부족. 허 혈 성 뇌졸중 모욕 후 이다 반응 되 고 그것은 개발로 부상 사이트 격 증. 이 시나리오에서는 허 혈에 노출 된 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여를 공부 하기 어렵습니다. 따라서,이 문서의 기본 사이토 반응성 산소 포도 당 부족 (지도부) 라는 허 혈 같은 환경의 체 외에 모델 확산을 공부 하는 방법을 소개 합니다. 이다 1-4 일에서 고립 되었다-오래 된 신생아 쥐와 일반적인 astrocytic 셀 수 사이토 선택 마커 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 및 핵 얼룩을 사용 하 여 평가 했다. 기간 이다 지도부 조건에 복종 된다 수 사용자 지정할 수, 그들은에 노출 되는 산소의 백분율 뿐만 아니라. 이 유연성 과학자를 셀 체 외의 다른 그룹에서 허 혈 성 같은 상태 기간 특성을 수 있습니다. 이 문서에서는 사이토 반응성, hypertrophic 형태학 및 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA)를 사용 하 여 면역 형광 검사로 측정 된 유도 지도부의 시간대를 설명 합니다. 확산, 게다가 이다 에너지와 산화 스트레스를 받게 하 고 응답 지도부 셀 중간에 녹는 요소를 해제 하 여. 이 매체는 수집 고 분자 이다 세포 세포 상호 작용 없이 기본 신경 문화에 의해 발표의 효과 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다. 요약 하자면,이 1 차 셀 문화 모델 부상 시 절연된 이다의 역할을 이해 하 효율적으로 사용할 수 있습니다.

Introduction

선 "는 급성 신경 부전 혈관 근원의 증상 및 징후, 뇌의 초점 분야의 참여 하에 해당의 급격 하거나 급속 한 개발"1,2로 정의 됩니다. 뇌졸중의 두 가지 유형이 있다: 출혈 및 허 혈 성. 혈관 장애는 동맥 류 또는 arteriovenous 오작동, 약화의 동맥, 후부 파열과 동반 하 여 발생 하는 경우이, 죽음에 이르게 하는 대부분의 경우에는 출혈 성 뇌졸중3 이라고 불린다. 혈전 또는 embolus 혈액 흐름을 방해, 산소와 포도 당 두뇌 지역에의 임시 박탈을 일으키는 그것 이라고 뇌경색4합니다. 영향을 받는 지역 또는 항상성 및 대사 불균형, 에너지 장애, 신경 죽음, 및 염증5, 환자6평생 장애를 일으킬 수 있는 허 혈 성 핵심 리드 주위 세포를 키 우다 실패.

허 혈 성 뇌졸중은 반응 하 고 다른 시간 지점에서 그들의 효과 발휘 하는 셀의 여러 종류를 포함 multifactorial 부상이 다. 많은 상호 작용 개별 셀의 동작을 연구 하는 어려운 환경을 만들. 그래서, 우리가 어떻게 이러한 복잡 한 환경에서 특정 세포 유형에의 기여를 연구? 허 혈의 허용 시험관에 모델 이루어져 있다 산소와 포도 당 부족 (지도부), 세포를 노출 특정 기간에 대 한 다음 normoxic 환경에 세포의 복원. 이 시스템은 혈 reperfusion 뒤 허 혈 성 뇌졸중을 시뮬레이션 합니다. 이 방법에서는, 세포 또는 조직 전문된 hypoxic 챔버를 사용 하 여 산소의 제거는 환경에서 포도 당 자유로운 매체에 노출 됩니다. 지도부 부 화 시간 몇 분에서 최대 24 h, 가설을 테스트 하 고 싶어에 따라 달라질 수 있습니다. 연구 하는 지도부의 시대에 따라 그리고 normoxic 환경, 스트로크 (, 급성 또는 아민)의 특정 고기를 얻을 수 있다. 기본 절연된 이다, normoxic 조건에 후부 복원와 지도부에 노출 선 체 외7모방을 잘 공부 셀룰러 모델 이다. 지도부를 사용 하 여 뇌졸중 같은 환경에서 격리 된 셀의 독립적인 분자 메커니즘을 밝힐 수 있다.

사이토 생물학의 우리의 지식을 증가, 그것은 분명 그들은 시 냅 스를 유지 하 고 신경 수리, 개발, 및 소성8유지에 대 한 중요 한 되고있다. 정상적인 조건 하에서 이다 놓고 cytokines, 발산, 성장 인자 및 gliotransmitters, 신진 대사 균형 및 시 냅 스5,9내 항상성 유지에 응답. 허 혈 성 뇌졸중 등 급성 neuroinflammation에이 셀 수 있다 반응 될, 장기 overexpression의 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), 표시 및 그들의 형태학5,10, 에 비 표시 11 , 12. 허 혈 성 경색 개발로, 항상성 이다에 의해 제공 된다 영향을, 일반 조미료 통풍 관, 에너지 대사, 활성 분자, 그리고 항 산화 활동13의 교환에 관한.

다시 활성화 이다 백혈구14lesioned 지역 이동 하는 동안 경색 조직 주위 확산. Astrocytic 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA), Ki67, 등 bromodeoxyuridine (BrdU)15마커를 사용 하 여 측정 될 수 있다. 이 증식 응답 시간-종속 방식으로 생성 되 고 glial 흉터, 부상9후 손상 된 사이트의 실질에 따라 돌이킬 반응성 이다의 배열을 형성 하는 데 도움이. 이 흉터의 초기 기능 중 하나는이 지역에서 면역 세포 넘쳐 흐름을 제한 것입니다. 그러나, 연구 흉터 확장 하, 그들은 릴리스 axonal 성장 억제 분자 고 부상된 지역16주위 확장에서 축 삭을 방지 물리적 장벽을 만드는 축 삭에 대 한 물리적 장애물이 되는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그 척수 상해 후 완전히 glial 흉터 대형을 방지 수 있습니다 손상17축 삭 재생을 보여주는 과학적인 증거가 있다. 따라서, 컨텍스트는 특정 astrocytic 응답 측정, 공부 하는 상해의 프레임 워크에 고려 되어야 한다.

제시 하는 방법론 산소가 포도 당 결핍 후 이다의 개별된 기능 연구에 적용할 수 있습니다 그리고 탐정 대답을 원하는 질문에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어 형태학 상 변화와 다른 지도부 시간에 표현 하는 마커, 게다가 이다 지도부에 노출에서 supernatants 분석 될 수 있다 더 식별 성 요인,이 세포에 의해 발표 또는 바른된 미디어로 평가 하는 데 사용 하는 다른 뇌 세포에 효과입니다. 이 이렇게 규제 하 고 허 혈 성 뇌졸중 시나리오에서 그들의 응답을 조절 하는 요인의 설명으로 이어질 수 있는 사이토 반응성에 대 한 연구를 수 있습니다.

Protocol

1-4 일 산 후 쥐 (Sprague Dawley) 오래 된 외피가 분리 하는 데 사용 됩니다. 안락사는 잘린, NIH 지침에 의해 승인.

1. 악기의 준비와 수술에 대 한 자료

  1. 압력솥에 Sterilize 계기 (온도: 121 ° C, 압력: 15 psi, 시간: 30 분) 강철 상자 또는 살 균 주머니 씰링 인스턴트를 사용 하 여. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.

2. DMEM 준비 완료

  1. 압력가 물 700 mL를 포함 하는 1 리터 비 커에 추가 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 실 온에서 중간 파우더.
  2. 3.7 g/L 나트륨 중 탄산염, 솔루션은 자력으로 자극 하는 동안 추가.
  3. 조정 7.4, 압력가 마로 소독 물에 pH 1 L, 볼륨을가지고 필터링 합니다. 10 %FBS 1% 미디어의 원하는 볼륨 보충 목적을 위해 문화, 페니실린/스, 및 37 ˚C에서 따뜻한. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.
    참고: PH 7.4 미디어 pH 미터 전극 삽입을 통해 조정 했다. 천천히 1 M NaOH를 스 포 이트를 사용 하 여 추가 미디어 감동 해야 합니다,.

3. 기본 사이토 문화

참고: 시드, 후 셀 미디어 3 일 마다 변경 되어야 하 고 셀 confluency (11-13 일)까지 성장 될 수 있다. 제 3의 날에 여러 번 리프트 microglial 세포와 문화에서 oligodendrocyte 조상 세포를 플라스 크를 모두 제거는 ' 오래 된 ' 미디어, PBS의 10 mL를 사용 하 여 두 번 세척, PBS, 발음 다음 신선한 새로운 미디어를 추가. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.

  • 신생아 쥐 두뇌의 해 부
    1. 수행 조직 문화 후드에서 절 개
        . 얻기 1-4 일 (2 쥐 두뇌 75 cm 2 플라스 크 당 사용 하는) 오래 된 신생아 쥐 새끼.
      1. 3 60 mm 페 트리 접시를 준비 하 고 각각에 완전 한 DMEM의 5 mL를 플라스틱.
        참고: 그들은 다음과 같이 분할 될 수 있다: #1 각 쥐 뇌, 두뇌의 모든 외피가 (meninges) 없이 모든 벗 겨 외피가 #3 #2.
      2. 파악 강아지와 70% 에탄올 스프레이. 그것은 목을 벨 하 고 작은 생물 학적 폐기물 컨테이너에 시체를 버리고.
      3. 마이크로 해 부 핀셋을 사용 하 여, 머리를 누른 노출은 두개골 머리 위에 피부를 잘라.
      4. 또 한 쌍의가 위, 게는 " T " 절 개는 코 쪽으로 두개골의 뒤쪽에서 시작. 집게의 쌍을 사용 하 여 부드럽게 제거 두개골.
      5. 핀셋의 쌍으로 노출 된 뇌를 제거 하 고 뇌 이전 매체 가득 배양 접시 중 하나에 놓습니다.
      6. 후속 단계에 대 한 살 균 계기의 다른 세트를 사용 하 여.
      7. 는 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 부드럽게 60 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 거꾸로 한 두뇌를 위. 페 트리 접시는 멸 균 거 즈에 배치 됩니다, 그것은 두뇌를 명확 하 게 볼 수 고 해 부 쉽습니다.
      8. 마이크로 해 부 집게와 뇌를 꾸준히 하 고 분리 되는 대뇌 반구 마이크로 해 부 집게의 날카로운 끝을 가진 중간 균열을 따라 부드럽게 놀리는.
      9. Deflect 백색 질 뒤에 남겨두고 외피가 껍질 하 고 이전 표시 #2 페 트리 접시에 그들을 전송. 모든 두뇌, # 2를 표시 하는 페 트리 접시에 모든 해 부 외피가 결합에 대 한 절차를 반복.
      10. 각 피 질 밑에서 해 마에 밖으로가 고 그것을 삭제
      11. 마이크로 해 부 족집게와 60 mm 페 트리를 사용 하 여 개별 대뇌 피 질의 엽에서 meninges 껍질을 부드럽게 하 고 # 3를 표시 하는 페 트리 접시에 그들을 배치.
    2. 조직 분리: 균질 화기 믹서 메서드
      1. 살 균 믹서 기 가방으로 조직/중간 정지 (뇌의 껍질을 벗 겨 외피가)을 부 어 하 고 가방에 5 mL 전체 볼륨을가지고 충분 한 매체 추가.
      2. 닫힌된 문 위에 보이는 가방 약 2 cm를 떠나 균질 화기 믹서 기에 가방을 놓습니다. 셀 분리 고속에서 2.5 분 동안 이루어집니다.
        참고: 또는,이 가방을 닫고 부드럽게 후드에서 비 커와 요동에 의해 수행할 수 있습니다. 피복 부 대와 비이 커를 사용 하 여 마찰을 피하기 위해 있는지 확인 하십시오.
      3. 번호 60 메쉬 체에 세포 현 탁 액을 부 어 하 고 다음에 번호 100 체, 중력에 의해 필터링을 통해 필터링 된 흐름을 붓는 다.
      4. 사용 하 여 15 mL 튜브, 원심에서 5 분에 대 한 임상 원심 분리기 (선호: 스윙 양동이 터)에 200 x g 세포 현 탁 액
      5. 부는 비 커에 상쾌한 어 그리고 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 다시 일시 중단 최대 미디어의 5 mL에에서 셀의 펠 릿을 해리.
    3. 셀 계산
      1. micropipette와 함께 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 100 µ L를 수집 하 고 trypan 파랑의 100 µ L를 추가.
      2. 는 hemocytometer에 수집 된 서 스 펜 션의 10 µ L 하 고 광장의 네 모퉁이 있는 모든 셀을 카운트.
      3. 셀의 밀도 계산 하는 플라스 크를 준비 하기 전에 공식입니다:
        Equation 1
        Equation 2
      4. 25 c m 2 플라스 크 당 적어도 500000 셀 추가. 각 플라스 크에 DMEM의 5 mL를 플라스틱 혼합물은 플라스 크의 목에 도달 하지 해야 합니다. 3 일 동안, 5% CO 2, 37 ° C 배양 기에 넣어 다음 미디어 변경.
    4. 사이토 정화 기법: 미디어 변경, 기계, 및 화학 전략
      참고: 이다의 신진 대사 속도 다른 세포 유형에 비해 높은에 따라서, 영양 박탈 조건,이 셀이 몇 일 후 낮은 생존 율을 보여. 이다, 달리 microglia 영양 부족에 의해 영향을 받지 않습니다 및 이러한 환경 18에서 증식. Microglial 세포의 감소 된 수를 유지 하려면 저자는 astroglial 세포 배양 3 일 마다 변경 합니다. 셀 미디어에서 지속적인 변화가 또한 플라스 크 19에서 astrocytic 셀 단층 위에 성장할 수 있는 microglial 인구를 줄일 것 이다. 비 점착 microglial 세포는 플라스 크의 각 미디어 발음을
      1. 사용은 파스퇴르 피 펫. 워시 모든 파편 dropwise 방식 (5 mL/플라스 크) 각은 플라스 크를 살 균 필터링 PBS를 사용 하 여 뒤에 왼쪽.
      2. 추가 (항생제와 태아 둔감 한 혈 청)와 살 균 필터링 DMEM dropwise 각 플라스 크 (5 mL/플라스 크). 부드럽게 전체 표면을 커버 하는 원형 운동에 선동.
      3. 는 37 곳 셀 &# 176; 플라스 크 confluency에 도달할 때까지 8-10 일 동안 5% CO 2 C 인큐베이터 (> 95% 플레이트 범위).
        참고: 여러 프로토콜 이다 confluency에 도달, 24 h 2에서 문화를 떨고와 같은 기계적인 방법을 셀이이 이다, 주로 microglia 및 전조 위에 있는 셀의 초연에 이르게 나타났습니다 19 , 20.
      4. 비 astrocytic 세포 문화에 30 분 동안 180 rpm에서 궤도 동요를 수행 하 여 줄일 수 있습니다. 상쾌한에 세포를 제거한 후 신선한 미디어 플라스 크 (~ 15 mL)에 pipetted은.
      5. Oligodendrocyte 조상 세포를 제거 하는 6 h 21 , , 22 23, aspirate 상쾌한을 피펫으로 신선한 미디어 200 rpm을 떨고 속도 증가.
        참고: Microglia 문화에의 존재를 줄이려면 두 가지 화학 방법을 순차적으로 사용할 수 있습니다 (동시에) 1 차 셀 문화 방법론에서: Arabinose 시 토 신 (아 라-C) 및 L-신 메 틸 에스테 르 (LME) 24.
      6. 셀 confluency (100%)를 도달 했을 때, 즉시 microglia의 기계적 제거 후 3-4 일이이 세포로 치료가 될 수는 antimitotic 복합 Arabinose 시 토 신 (아 라-C)의 8 µ M DMEM에 5 일 (신선한 아 라-C DMEM 매일 변경)에 대 한.
        참고: 시간 아 라-c 요점은 중요 한이 화합물 이기 때문에 antimitotic 마약, microglia 19 , 25 및 섬유 아 세포와 같은 급속 하 게 분할 세포의 수를 감소 시키는 26 . Microglia, 달리 confluent, 이다 중지 접촉 저해 27를 통해 확산.
      7. Ara C 치료에서 회복 하기 위해 셀에 대 한 일.
      8. 더 후 셀 도달 confluency, microglial 오염 줄이기 위해
      9. DMEM pH 7.4, 37 ˚C에서 1 h에 고정에서 50mm L 신 메 틸 에스테 르 (LME)의 사용.
        참고: LME 십자가 세포와, 세포의 막 그리고 분해 되 고, 후 생산 L 신이이 세포의 리소좀 축적. 이 아미노산의 축적 한 삼투성 붓기와 리소좀 28 , 29의 파열에 지도 한다. LME microglia, 다른 셀 20 , 30에 비해 제거에 매우 효과적 이다.

    4. 6 잘 플레이트에 이다 육성

    1. 폴 리 D lysine과 코팅 coverslips
      1. 넣어 한 coverslip 각 35 mm 페 트리 접시에, 그때 각 coverslip 희석된 폴 리-D-리 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 대기 1 헤
      2. 폴 리-D-리 신을 제거 하 고 2 살 균 물으로 두 번 세척.
      3. 물을 제거 하 고 coverslips 후드 내부 건조 기다립니다. 2 주 동안-20 ° C에서 coverslips 저장.
        참고: 고정 희석된 폴 리-D-리 솔루션; 그것은 최대 2 주 동안 저장 될 수 있다.
    2. Trypsinization
      1. 는 플라스 크에서 중간 발음 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 부드럽게 셀 린스를 살 균 필터링 PBS의 5 mL/플라스 크 추가.
      2. Aspirate PBS를 끄고 살 균 필터링 0.25 %Trypsin 및 0.5 m EDTA 솔루션의 5 mL/플라스 크를 추가. 37 ˚C, 10 분에 대 한 5% CO 2 배양 기에에서 플라스 크를 배치
        참고: 셀은 잠복기 동안 따뜻한 플라스 크 mL 5/37에서 신선한 완전 한 DMEM의 ° c.
      3. 후 10 분, 외피의 모든 세포는 플라스 크를 낸 되도록 교 반 하십시오. 신속 하 게 무력화는 트립 신 각 플라스 크에 따뜻한 완벽 한 DMEM의 5 mL을 추가.
      4. 부드럽게 위아래로 여러 번 어떤 헤어 셀 플라스틱 " 덩어리 ". 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 두 개의 플라스 크에서 일시 중단 된 셀 전송.
      5. 200 x 5 분 동안 원심 분리기 g 세포 pellet를 수집. 다시 중간의 500 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고는 플라스 크에 세포를 진행.
        참고: 셀으로 만들 수 분석의 예: 1) 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR) 유전자 발현; 분석 하 단백질 표정; 평가 하 2) 서쪽 오 점 3) 흐름 cytometry 분석 계량 신경 조상 세포의 수와 관심;의 단백질을 4) 면역 형광 단백질 식 및 지역화 분석.
    3. 시드 이다
      1. trypsin으로 기본 이다 치료 후 (4.2 참조), microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 100 μ를 수집 하 고 추가 0.5 %trypan 파랑의 100 μ.
      2. Trypan에서 수집 된 서 스 펜 션의 추가 10 μ는 hemocytometer 파랑 및 가능한 모든 셀을 카운트.
      3. 는 플라스 크를 준비 하기 전에 셀의 밀도 계산 하는 공식 단계 3.3에서에서 사용.
      4. 준비 다 잘 요리 한 살 균을 추가 하 여, 폴 리-D-리 신 각 우물에 coverslip 코팅. 플라스틱 50000 셀 하 고 신선한 매체 (약 2 mL)와 각 다 잘 접시에 볼륨의 나머지를 작성.
      5. 멀티 잘 요리 5% CO 2 37 ˚C 인큐베이터에 놓고, 5-7 일 후에 이다 수 성장 하 고는 coverslips의 전체 표면을 커버.

    5. 기본 이다에 대 한 지도부 프로토콜

    1. 지도부 중간 준비
      1. 보충 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 무료 포도 당 3.7 g/L 나트륨 중 탄산염, 그리고 1% 페니실린/스. 표 4에 자료를 참조 하십시오.
      2. 2 95% N / 5%를 버블링 하 여 포도 당 자유로운 매체의 20 mL를 제거 15 L/min (흐름 미터 표시) 매체에 가스 시스템에 혈 청 학적인 피 펫을 삽입 하 여 흐름에 10 분 CO 2.
        참고: 산소의 제거, 후 7.4 (단계 2.1에 참고 참조)에 pH를 조정.
      3. 필터링 50 mL 튜브 필터 시스템을 사용 하 여 제거 된 포도 당 자유로운 매체.
        참고: 버블링 2 95% N / 5%, 모든 실험에 대 한 신선한 지도부 매체 확인 셀 산소의 제거는 환경에 노출 되어 있는지 확인 하려면 사용 하기 전에 CO 2.
    2. 실험 절차
      1. 이전 준비 coverslips (4.3.5 단계로 참조)에서 사이토 미디어 조직 문화 후드 안에 제거 그리고 세포에 있는 포도 당을 제거 하려면 두 번 셀룰러 PBS로 세척.
      2. 는 지도부 미디어의 2 개 mL를 추가 각 잘 하 고 다 잘 요리 그들의 뚜껑에서 hypoxia 챔버 내부 배치
      3. 입구 밸브에 가스 혼합물을 연결 하 고 출구 밸브를 열어 둡니다. 플러시 챔버 가스 혼합 2 95% N / 5% CO 2, 5 분에 대 한 15 L/분
      4. 가스 흐름을 막을 먼저 출구 밸브에 클램프를 닫고 다음 가스 입구 밸브 배관에 클램프를 닫습니다.
        참고: 비눗물으로 챔버의 인감을 취재 하 여 가스 누설입니다 확인 하십시오. 아니 거품 형성 한다 물개 안전 경우.
      5. 37 ° C 1 시간 또는 지도부에 6 h에서 셀 문화 인큐베이터 전체 챔버를 넣습니다.
      6. 보육 시간, 끝난 후 지도부 미디어 발음 및 신중 하 게 각 4.67 cm 2는 normoxic를 위해 잘 완전 한 DMEM의 2 개 mL를 피펫으로 24 h. 처리

    6. 기본 사이토 면역 형광 검사 준비를 위한 프로토콜

    참고: 사이토 순도 평가, 다른 뇌 세포 종류와 같은 신경, microglia, 및 oligodendrocytes에 의해 검출 될 수 있다 다른 사용 하 여 면역 형광 세포 마커. 확산 마커, PCNA, 및 propidium 요오드 화물 (PI) 기본 이다 normoxic 조건 다음 지도부에 노출에 사용할 수 있습니다. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.

    1. 면역 형광 검사 준비
      참고:이 일반적인 면역 형광 검사 프로토콜, 사소한 수정 (예를 들어, 더 이상 부 화 기간, 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행할 수 있습니다 부 화 온도)입니다. 표 1에서 각 마커는 제조업체에 따라 사용할 수 있습니다 ' s 프로토콜.
        세포 생존 능력을 평가 하는
      1. 세포와 37 ° C에서 5 분 동안 incubated 수 파이 (완전 한 DMEM 5 µ M)와 PI 얼룩을 보여 주는 5 분 셀은 보다 적게 가능한 한 2 mL의 PBS로 두번 세척.
        참고: 세포 치료 단계 5.2.6 사용.
      2. PI 염색 후 세포를 해결 하기 위해 4 ˚C에서 20 분, 4.67 c m 2 당 4% 포 르 말린의 2 개 mL를 추가 합니다. PCNA와 함께 표시 하는 샘플에 대 한 기본 고정 솔루션은 메탄올 4 ˚C에서 10 분.
        주의: 포 르 말린과 메탄올은 독성.
        참고: 항상 각 회사에서 특정 항 체 프로토콜을 확인 하십시오.
      3. 5 분에 대 한 PBS의 2 mL로 세포 세척 하 고이 단계를 반복 하 여 3 번.
      4. 솔루션을 차단에 셀을 품 어 (0.5% 비 이온 계면 활성 제, 10% FBS PBS에) 부드러운 진동으로 실 온에서 30 분.
      5. 5 분에 대 한 PBS의 2 mL로 세포 세척, 세척을 3 번 반복.
      6. 1 차적인 항 체 (PCNA, GFAP) 1%의 솔루션에서으로 4 ° C에서 하룻밤 (16h), 품 어 PBS에서 FBS.
      7. 1 차적인 항 체 솔루션을 제거, 5 분, PBS의 2 mL로 세포 세척 하 고 3 번이이 단계를 반복.
      8. 1%의 솔루션에 fluorophore와 활용 된 이차 항 체와 품 PBS, 실 온에서 1 h에서 FBS.
      9. 셀 2 mL PBS의 5 분을 씻어, 3 번이이 단계를 반복 합니다. DAPI의 1 µ g/mL를 추가 (4 ' 6, '-diamidino-2-phenylindole) 얼룩 세포 핵 5 분.
      10. PBS 5 분의 2 mL로 세포 세척,이 단계를 두 번 반복 시키고 PBS에.
      11. 설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips 준비.
    2. Confocal 현미경
      1. 현미경을 설정한 후 위 coverslip 측면 아래로 현미경 단계.
      2. 소프트웨어를 사용 하 여 선택 GFAP Cy3 활용 된 항 체에 대 한 543nm에서 레이저 빔.

    7. 세포 생존 능력 분석 결과

    1. Trypsinize와 다음 단계로 4.3 및 4.4 이다 계량.
    2. 96 잘 접시 1 x 10 4 셀/잘 추가 하 고 confluency에 그들을 성장.
    3. 교양된 96 잘 접시 중 normoxic 1 h 지도부에 노출 5 단계에서 방법론을 사용 하 여, 또는 6 h 지도부.
    4. 지도부 후 치료, normoxic 미디어 24 h에 대 한 모든 셀에 추가 되 고 생존 MTT 시 분석 결과 사용 하 여 측정 된다 (제조자로 사용 ' s 명령을 나타냅니다).
    5. 5 mg/mL MTT 솔루션에서 각 잘을 총 볼륨의 10%를 추가 하 고 MTT 시와 37 ˚C에서 3 h에 품 어.
    6. 는 미디어를 제거 하 고 결정 200 µ L 디 메 틸 sulfoxide를 사용 하 여 resuspend. 570에서 분 광 광도 계에 접시를 읽고 nm.
      참고: 제어 셀을 기준으로 감소 흡 광도 적은 생존 연관 됩니다.
  • Representative Results

    기본 astrocytic 문화의 주요 관심사 중 하나는 뉴런, oligodendrocytes, 섬유 아 세포, microglia 등 다른 세포의 존재 이다. 그림 1에서 쥐 외피가에서 고립 된 셀 미디어 변경 3 일 마다 졌고 중 치료 또는 치료와 함께 추가 LME 1 h. 24 시간 후에, 세포에 GFAP immunostained 되었고 DAPI와 counterstained. LME 치료 셀 8% 보여주었다 동안 치료 셀 긍정적인 세포 GFAP-39% 비의 평균을 보였다. 이러한 결과 LME 치료 및 미디어 변경 어떻게 효과적으로 감소 비 GFAP 긍정적인 세포 4.75 배, 농축 사이토 문화를 생산 하 여 보여 줍니다. 만약 1 시간 또는 6 h 지도부에 영향을 미치는 사이토 생존이이 방법론 후를 확인 하려면 그림 2 사이토 문화, 모욕 후 24 h의 MTT 분석 결과를 보여준다. 생존 능력에 큰 차이 두 번 사용할 수 있는 사이토 반응성 연구를 보여주는 어떤 상태에서 발견 되었다. 세포 증식 이다에서 지도부에 의해 실행 하는 효과 중 하나입니다. 증식 세포 핵 항 원 (PCNA) 그림 3 에서 normoxic 셀에 10%에서 1 h 지도부, 예상 vivo에서 astrocytic 응답15을 보여주는 후 30% 증가. 마지막으로, 이다 24 h normoxic 조건 다음 지도부의 6 h에 노출 되었다. 이 시간 후, GFAP에 대 한 면역 형광 검사 수행 되었다. 지도부에 노출 된 세포 이다 normoxic 조건 하에서 비교 되었다. 지도부 없이 이다 지도부를 받았다 셀 명확 하 게 제시 무효 이다 (그림 4B)의 특성 비 대 동안 전통적인 방사상 형태 (그림 4A)를 표시 합니다. 이 비 대뇌 피 질의 쥐 이다 normoxic와 지도부 조건 (그림 5)에서 해당 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지에 구상 될 수 있다.

    Figure 1
    그림 1 . GFAP와 DAPI 기본 대뇌 피 질의 쥐 이다 문화 순도 확인 하기 위해 면역 형광 검사. (A) 왼쪽된 패널 나타냅니다 GFAP 긍정적인 세포 (적색), 중간 패널 핵 (DAPI, 블루), 고 오른쪽 패널의 LME 치료 비 (위) 및 LME 처리 (낮은) 병합 된 이미지 셀. 흰색 화살표 표시 GFAP 양수가 아닌 셀 스테인드. LME에 비 LME 비 GFAP 긍정적인 핵의 부 량 (B) 세포 치료. 짝이 없는 t-검정을 수행 되었다 (p < 0.0001) 오차 막대는 평균 SEM. 규모 바 대표 50 미크론으로 및 사진 20 x 배율에서 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 2
    그림 2 . 생존 분석 결과의 지도부에 24 시간 노출 이다. 이다 96 잘 접시에 배양 되었고, normoxic, 1 h 지도부, 또는 6 h 지도부 조건에 노출. 치료 후, 셀 24 h에 대 한 normoxic 미디어에 추가 하 고 생존 MTT 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 570 nm 쇼 문화에 비교 될 때 지도부 노출 셀의 세포 생존 능력 normoxic 조건에서 세포에서 흡수도. 데이터 일방통행 ANOVA로 분석 되었다 (p = 0.9669) SEM.와 의미를 나타내는 오차 막대 표시 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 3
    그림 3. 쥐 이다에서 확산 시 산소와 포도 당 부족에 노출 증가 및 PCNA 마커로 사용 하 여 검색할 수 있습니다. (A) 왼쪽된 패널 PCNA 긍정적인 세포 (녹색), 중간 패널 표시 핵 (DAPI, 파랑), 그리고 오른쪽 패널 normoxic 세포 (위 패널)의 병합 된 이미지를 보여줍니다 나타내고 1 h 지도부 치료 세포 (낮은 패널). (B) % 지도부 대 normoxic에서 PCNA 긍정적인 세포의 세포 치료. 짝이 없는-테스트 수행 되었다 (p < 0.0001) 오차 막대는 평균 SEM. 규모 바 대표 50 미크론으로 및 사진 20 x 배율에서 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 4
    그림 4 . 기본 쥐 대뇌 피 질의 사이토 문화에서 Cy3 함께 활용 하는 식의 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP). Normoxic 환경 표시 특성 방사상 형태에서에서 (A) 이다. 중간 필 라 멘 트 단백질, GFAP, 셀 시체를 채우고 고 얇은 세포질 과정에 확장 합니다. (B) 후 6 h 지도부의 노출 이다 hypertrophic 형태를 채택 했다. 비늘 20 미크론 나타내고 confocal 현미경에서 40 x 확대 사진을 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 5
    그림 5 . Normoxic과 산소-포도 당 부족에서 대뇌 피 질의 쥐 이다. 이다 normoxic 조건 (위 왼쪽된 패널) 또는 6 h 지도부 (하단 왼쪽된 패널)의 면역 형광 GFAP에 대하여 Cy3 활용 된 항 체를 사용 하 여 스테인드. 해당 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지는 오른쪽 패널에 표시 됩니다. 눈금 막대 20 미크론 나타내고 그림 20 배 확대 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    목적 항 체/마커 설명
    사이토 문화 유효성 검사 Iba 1 Microglial 세포를 감지
    NeuN 성숙한 뉴런 식별
    Olig1 성숙한 oligodendrocytes를 감지
    Olig2 NG2 Oligodendrocyte 선구자 세포를 감지
    GalC 미 숙 또는 성숙한 oligodendrocytes 식별
    확산 PCNA 바인딩 p36 단백질, 세포 증식의 높은 수준에서 표현
    세포 생존 능력 Propidium 요오드 화물 (PI) DNA에 묶는,이 표식이 나타냅니다 세포 생존 능력의 부족
    tr > MTT 측정 미토 콘 드리 아 기능 반응 GFAP 사이토 반응성의 지시자

    표 1입니다. 세포와 세포질 과정의 다양 한 종류를 얼룩 사용 시 약 목록

    Discussion

    이 프로토콜 이다 쥐 외피가에서 격리를 설명합니다. 이 방법에서는, 그것은 microglia, oligodendrocytes, 섬유 아 세포 등 다른 세포 종류와 오염 감소에 중요 한입니다. Microglia의 수를 줄이기 위해, 몇 가지 단계를 취할 수 있습니다: 미디어, 떨고, 궤도 및 화학 치료를 변경. 가장 눈에 띄는 셀 오염 물질에 대 한 선택적 세포 마커를 사용 하 여 면역 형광 또는 문화 순수성을 확인 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 이온화 칼슘 바인딩 접합 기 분자 1 (Iba-1)에 대 한 항 체 microglia 감지를 사용할 수 있습니다. 신경 죽음 문화에 일찍 시작 하 고이 세포는 플라스 크 도청 후 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 함께 제거 미디어 변경 3 일31. Oligodendrocytic 선구자 세포 olig2 NG2 등 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. GalC 미 숙 또는 성숙한 oligodendrocytes를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만이 문화 단계에서 이들은 찾을 수 것입니다. 또는 비 GFAP 긍정적인 세포를 측정할 수 수 하 고 오염 물질을 예상할 수 있습니다. 이 마지막 방법론 특정 셀 사이의 분별 하지 않습니다 하지만 더 빠르고 더 많은 경제 방법론을 문화에 비 astrocytic 세포의 백분율을 결정 됩니다.

    사이토 농축 문화 생산은 일단 지도부 실험 사이토 반응성 연구를 수행할 수 있습니다. 버블링 산소를 대체 하 여 질소 솔루션 제거는 일반적으로 사용 되는 프로토콜32이다. 우리의 방법론를 사용 하 여 버블링 메서드 0.025 l.의 전체 볼륨에 대 일 분 15 L/min의 유량에서 포도 당 자유로운 매체에 (95% N2, 5% CO2) 질소 가스와 산소를 제거 확인 하 고 산소 제거, 액체 및 공기는 산소 측정기를 사용 하 여 미디어에 남아 있는 산소 농도 측정 했습니다. 10 분 동안 제거 후 미디어에 남아 있는 산소 농도 0.3 m g/l.에 7.9 mg/L에서 감소 산소, N2 와 제거를 대체 하는 챔버 해야 합니다 제거 하는 얼마나 오래 결정 챔버 제조 업체의 제안 (20 L/min, 2-5 분) 보다는 더 적은 사용 하 여 수행 되었다. 15 L/min에서 정화의 5 분 후 챔버에 남아 있는 산소 농도 0%를 했다. 유사한 챔버를 사용 하 여 다른 방법론 8-20 L/min 흐름 속도 및 공기 산소와 질소33,34를 대체할 5-10 분의 시간에서 제거 했습니다.

    다른 휴대 전화 모델과 마찬가지로 지도부는 제한 하 고 결과 신중 하 게 해석 한다. 그러나 지도부는 뉴런에 유해할 수 있다,, 이다 최대 24 h35에 대 한 이러한 조건을 견딜 수 있습니다. 또 다른 한계는 이다 다른 세포에서 신호 부족이 시스템에서 격리 됩니다. 이 제한을 극복 하기 위해 한 가지 방법은 같은 허 혈 성 같은 상태에서 다른 셀에서 조건된 미디어를 사용 하는 것입니다. 또는, cytokines 또는 다른 요인 수에 추가 미디어 지도부36후.

    셀, 에너지 부족의 효과 연구 하는 대체 방법에 ouabain를 추가 하는.  이 화합물은 주로 나트륨/칼륨 펌프, ATP, 지도부37,38의 효과 비슷한의 세포내 생산 감소를 억제. 그러나,이 메서드는 단점은 모든 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다 및 오프 대상 효과 유도 소개 하는 허 혈 성 뇌졸중 비현실적인 시나리오를 구성 하는 변수.

    요약 하자면, 지도부 메서드는 다른 astrocytic 마약 대상에서 생체 외에서 더 neuroprotection에 기여할 수 있는 효과 직접 테스트를 수 있는 격리 된 셀 시스템. 그것은 또한 기본적인 사이토 생물학을 공부 하는 도구를 제공 합니다. 이 모델은 선의 비보에 모델을 사용 하 여 약물의 개발에 대 한 실험 조건을 정당화 하는 증거의 강한 기초를 만들 수 있습니다.

    Disclosures

    저자는 공개 없다.

    Acknowledgments

    저자는 기술 지원에 대 한 파 올라 로페스 Pieraldi를 감사 드립니다. A.H.M.는 보조금 8G12MD007600 및 U54-NS083924이이 간행물을 지원에 대 한 감사. 우리 시설 지원에 대 한 NIH-NIMHD-G12-MD007583 그랜트를 감사합니다. D.E.R.A.는 NIHNIGMS-R25GM110513에서 제공 하는 원정대에 대 한 감사입니다. 우리는 일반적인 계측 영역의 사용에 대 한 감사와 광학 이미징 시설 RCMI 프로그램의 사용에 대 한 박사 Priscila Sanabria의 원조 G12MD007583 부여. 또한, 우리는 그의 뛰어난 역할을 촬영 하 고 편집 하는 시각적 프로토콜에 대 한 호세 빠 디 야 감사 드립니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Instruments for Surgery - Step 1
    Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
    Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
    Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
    Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
    Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
    Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
    Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
    DMEM Preparation - step 2
    Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
    Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
    Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
    Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
    Astrocyte culture - step 3
    Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
    Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
    Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
    Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
    Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
    Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
    Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
    Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
    60mm petri dishes Falcon 351007
    Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
    Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
    Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
    Beaker 400mL Pyrex 1000
    Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
    Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
    Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
    75cm2 sterile flasks Falcon 353136
    Multi-well plate Falcon 353046
    Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
    Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
    Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
    Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
    L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
    Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
    Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
    Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
    Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
    Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
    Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
     OGD Medium Preparation - step 5
    Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
    Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
    Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
    200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
    Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
    Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
    Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
    Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
    Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
    Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
    95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
    primary astrocyte immunofluorescence - step 6
    Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
    Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
    Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
    Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
    Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
    Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
    Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
    Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
    Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
    Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
    Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
    Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
    Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
    4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
    Confocal microscope Olympus

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    사이토 반응성 및 확산에서 <em>체 외에</em> 허 혈 성 같은 조건 모니터링
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    Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

    Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

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