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Neuroscience

Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Accidente cerebrovascular isquémico es un evento complejo en el que la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro afectada expuesta a privación de glucosa oxígeno (OGD) es difícil de estudiar. Este artículo presenta una metodología para obtener aislados astrocitos y estudiar su reactividad y la proliferación en condiciones OGD.

Abstract

Accidente cerebrovascular isquémico es una lesión compleja del cerebro causada por un trombo o émbolo obstruye el flujo sanguíneo a partes del cerebro. Esto conduce a la privación de oxígeno y glucosa, lo cual provoca falta de energía y la muerte neuronal. Después de un insulto isquémico movimiento, astrocitos se reactiva y proliferan alrededor del sitio de la lesión que desarrolla. Bajo este escenario, es difícil estudiar la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro expuesto a isquemia. Por lo tanto, este artículo presenta una metodología para estudiar la reactividad de astrositos primaria y proliferación bajo un modelo en vitro de un entorno similar a isquemia, llamado privación de glucosa oxígeno (OGD). Los astrocitos fueron aislados de 1-4 días-viejas ratas neonatales y el número de células astrocytic no específica se evaluó mediante marcador selectivo de astrositos proteína ácida fibrilosa Glial (GFAP) y tinción nuclear. El período en el que los astrocitos son sometidos a la condición de la OGD se puede personalizar, así como el porcentaje de oxígeno que están expuestos. Esta flexibilidad permite a los científicos caracterizar la duración de la enfermedad isquémica como en los diferentes grupos de células in vitro. Este artículo aborda los plazos del OGD que inducen proliferación medido por inmunofluorescencia utilizando la proliferación de la célula Nuclear antígeno (PCNA), reactividad astrositos y morfología hipertrófica. Además de la proliferación, astrocitos experimentan la energía y el estrés oxidativo y responden a inclinacion por liberación de factores solubles en el medio celular. Este medio puede ser recogido y utilizado para analizar los efectos de moléculas liberadas por astrocitos en cultivos neuronales primarios sin interacción de célula a célula. En Resumen, este modelo de cultura de célula primaria puede utilizarse eficientemente para entender el papel de los astrocitos aislados tras lesiones.

Introduction

Movimiento se define como «una aguda disfunción neurológica de origen vascular con desarrollo rápido o repentino de los síntomas y signos, correspondiente a la participación de las áreas del cerebro»1,2. Hay dos tipos de ictus: isquémico y hemorrágico. Cuando la disfunción vascular es causada por un aneurisma o un mal funcionamiento arteriovenoso, acompañado de debilitamiento con la posterior ruptura de una arteria, esto se denomina accidente cerebrovascular hemorrágico3 que, en la mayoría de los casos, conduce a la muerte. Cuando un trombo o un émbolo obstruye flujo de la sangre, causando una privación temporal de oxígeno y glucosa a una región del cerebro, se denomina accidente cerebrovascular isquémico4. Si no se alimentan las células alrededor del área afectada o núcleo isquémico conduce a un desequilibrio homeostático y metabólica, disfunción energética, muerte neuronal e inflamación5, que puede provocar una discapacidad permanente para pacientes6.

Accidente cerebrovascular isquémico es una lesión multifactorial que involucra a varios tipos de células que reaccionan y ejercen sus efectos en diferentes puntos temporales. Muchas interacciones crean un ambiente difícil para estudiar el comportamiento de células individuales. Así que, ¿cómo se estudia la contribución de un tipo de célula específica en un entorno tan complejo? Un modelo aceptado en vitro de isquemia consiste en exponer las células a la privación de oxígeno y glucosa (OGD), durante un determinado período, seguido por la restauración de las células a un ambiente normoxic. Este sistema simula un movimiento isquémico seguido de reperfusión arterial. En este método, las células o los tejidos se exponen a un medio libre de glucosa en medio purgado de oxígeno, usando una cámara hipóxica especializada. El tiempo de incubación de la inclinacion puede variar desde unos pocos minutos hasta 24 horas, dependiendo de la hipótesis que quiere probarse. Estudios han demostrado que dependiendo de los tiempos de la OGD y ambiente normoxic, fenotipos específicos de movimiento (es decir, aguda o subcrónica) puede lograrse. Primarios astrocitos aislados, expuestos a la inclinacion con la posterior restauración a normoxic las condiciones, es un modelo celular muy estudiado para imitar el movimiento in vitro7. Utilizando OGD es posible revelar los mecanismos moleculares independientes de células aisladas en un entorno de movimiento como.

A medida que aumenta nuestro conocimiento de la biología de astrositos, ha comprobado que son cruciales para el mantenimiento de las sinapsis y mantenimiento reparación, desarrollo y Plasticidad neural8. En condiciones normales, astrocitos liberan y responden a citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y gliotransmitters, manteniendo el equilibrio metabólico y la homeostasis dentro de sinapsis5,9. En neuroinflamación aguda, como un accidente cerebrovascular isquémico, estas células pueden convertirse en reactivas muestran una largo plazo sobreexpresión de la proteína ácida fibrilosa Glial (GFAP) y muestran hipertrofia en su morfología5,10, 11 , 12. como se desarrolla el infarto isquémico, la homeostasis proporcionada por astrocitos se convierte afectada, con respecto a la captación de glutamato normal, metabolismo energético, el intercambio de moléculas activas y antioxidante actividad13.

Reactivados los astrocitos proliferan alrededor del tejido de infarto mientras que los leucocitos migran hacia la zona lesionados14. Proliferación astrocytic puede medirse mediante marcadores como el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), Ki67 y bromodeoxiuridina (BrdU)15. Esta respuesta proliferativa se genera de una manera dependiente del tiempo y ayuda a formar la cicatriz glial, una matriz de astrocitos reactivos irreversiblemente a lo largo de la parenquimia del sitio dañado después de una lesión9. Una de las funciones iniciales de esta cicatriz es limitar la extravasación de células inmunitarias en esta área. Sin embargo, estudios han demostrado que la cicatriz se convierte en un impedimento físico para axones a extenderse, como se liberan moléculas de inhibir el crecimiento axonal y crear una barrera física impidiendo que axones que se extiende alrededor de la zona lesionada16. Sin embargo, existe evidencia científica que muestra que después de una lesión de la médula espinal, prevenir totalmente la formación glial de la cicatriz puede afectar la regeneración de axones17. Por lo tanto, debe considerarse el contexto en el que se mide la respuesta astrocytic específica, en el marco de la lesión estudiada.

La metodología presentada se puede aplicar para estudiar la función individualizada de astrocitos después de privación de oxígeno la glucosa y puede ser modificada según las preguntas que el investigador quiere contestar. Por ejemplo, además de los cambios morfológicos y los marcadores expresados en diferentes momentos de la OGD, los sobrenadantes de astrocitos expuestos a inclinacion pueden ser más analizados para identificar factores solubles liberados por estas células, o utilizado como un medio acondicionado para evaluar su efecto en otras células cerebrales. Este enfoque permite estudios de reactividad de astrositos que podrían llevar al esclarecimiento de los factores que regulan y modulan su respuesta en un escenario de accidente cerebrovascular isquémico.

Protocol

postnatales ratas (Sprague Dawley) 1-4 días viejos se utilizan para aislar las cortezas. El método de eutanasia es decapitación, aprobado por las directrices NIH.

1. preparación de instrumentos y materiales para la cirugía

  1. esterilizar instrumentos en autoclave (temperatura: 121 º c, presión: 15 psi, tiempo: 30 minutos) con una caja de acero o un instante sellado bolsa de esterilización. Ver en Tabla de materiales materiales.

2. Completar preparación DMEM

  1. en un vaso de precipitados de un litro que contiene 700 mL de agua esterilizada, añadir Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medio polvo a temperatura ambiente.
  2. Agregar bicarbonato de sodio 3,7 g/L, mientras que la solución se agita con un agitador magnético.
  3. Ajustar el pH a 7.4 con agua esterilizada llevar el volumen hasta 1 L, luego filtra. Fines de cultura, completar el volumen deseado de los medios con 10% FBS y 1% de penicilina/estreptomicina y caliente a 37 ° c. Ver en Tabla de materiales materiales.
    Nota: El pH se ajustó a 7,4 por insertar el electrodo medidor de pH en los medios de comunicación. Entonces los medios de comunicación deben ser agitación, agregue lentamente 1 NaOH M usando un gotero de.

3. Cultivo primario de astrositos

Nota: después de la siembra, los medios de comunicación de la célula deben cambiarse cada tres días y las células pueden ser cultivadas hasta confluencia (11-13 días). Al tercer día, toque el frasco varias veces para la elevación de células de la microglía y las células progenitoras de oligodendrocyte de la cultura, quitar todos los ' viejo ' medios de comunicación, Lave dos veces con 10 mL de PBS, aspirar el PBS y luego añadir nuevos medios frescos. Ver en Tabla de materiales materiales.

  1. Disección de cerebro de la rata recién nacido
    1. realizar la disección en una campana de cultivo de tejidos. Obtener 1-4 días de edad cachorros de rata recién nacida (2 cerebros de rata se utilizan cada frasco de 75 cm 2).
    2. Preparar tres placas de Petri 60 mm y pipetear 5 mL de DMEM completo en cada uno.
      Nota: Pueden dividirse como sigue: #1 para cada rata del cerebro, #2 para todas las cortezas de los cerebros y #3 para todas las cortezas peladas (sin meninges).
    3. Tome el cachorro y el spray con etanol al 70%. Decapitar a lo y descartar el cuerpo en un contenedor de residuos de riesgo biológico pequeño.
    4. Con las pinzas de disección micro, sostener la cabeza y cortar la piel encima de la cabeza para exponer el cráneo.
    5. Con otro par de tijeras, hacer una " T " incisión a partir de la parte posterior del cráneo hacia la nariz. Utilice un par de pinzas para eliminar suavemente el cráneo.
    6. Quitar el cerebro expuesto con un par de pinzas y poner el cerebro en uno de los platos de petri previamente llenados con medio de.
    7. Utilizar otro conjunto de instrumentos estériles para los pasos siguientes.
    8. Use micro-quirúrgico para colocar suavemente un cerebro sobre la tapa invertida de un plato de petri de 60 mm. Cuando la placa de Petri se coloca en una gasa estéril, es posible ver claramente el cerebro y es más fácil de disecar.
    9. Constante del cerebro con micro-quirúrgico y separa el hemisferio cerebral por burlas suavemente a lo largo de la fisura de la línea media con el filo de las pinzas de disección micro.
    10. Reenvío y cortezas, dejando la materia blanca y transferirlas a una placa de Petri, previamente etiquetado como #2. Repita el procedimiento para todos los cerebros, combinando todas las cortezas disecadas en la caja Petri con la etiqueta #2.
    11. Sacar el hipocampo de debajo de cada corteza y descartar lo
    12. Utilizar las pinzas de disección micro y un petri de 60 mm para pelar suavemente las meninges de los lóbulos corticales individuales y colocarlos en la caja Petri con la etiqueta #3.
  2. Disociación de tejidos: método de homogeneizador mezclador
    1. verter suspensión de tejido/medio (cortezas peladas del cerebro) en la bolsa estéril de la licuadora y añada suficiente medio para llevar el volumen total en la bolsa a 5 mL.
    2. La bolsa se coloca en la licuadora el homogeneizador, dejando aproximadamente 2 cm de la bolsa visible por encima de la puerta cerrada. La disociación de células se realiza durante 2,5 min a velocidad alta.
      Nota: Alternativamente, esto puede hacerse por el cierre de la bolsa y lo golpeando suavemente con un vaso de precipitados en la campana. Asegúrese de que utilizar un paño entre la bolsa y vaso de precipitados para evitar fricción.
    3. Verter la suspensión de células en un tamiz de malla número 60 y luego Vierta el filtrado atraviesa en el tamiz número 100, lo que le permite filtrar por gravedad.
    4. Usando 15 mL tubos de centrífuga la suspensión de células a 200 x g en una centrífuga clínica (preferentemente cubo rotor de columpio) por 5 min
    5. Retirar el sobrenadante en un vaso, luego con una pipeta serológica, vuelva a suspender y disociar el precipitado de células en un máximo de 5 mL de medio.
  3. Conteo celular
    1. con una micropipeta, recoger 100 μl de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadir 100 μl de azul tripán.
    2. Insertar 10 μl de la suspensión recogida en el hemocitómetro y contar todas las celdas que son viables en las cuatro esquinas de la Plaza.
    3. Las fórmulas para el cálculo de la densidad de las células antes de preparar los frascos de
    4. son:
      Equation 1
      Equation 2
    5. Agregar por lo menos 500.000 células por frasco de 25 cm 2. Pipetear 5 mL de DMEM a cada matraz. La mezcla no debe alcanzar el cuello del matraz. Colocarlos en una incubadora de 37 ° C en 5% CO 2, por 3 días y luego los medios de comunicación.
  4. Técnicas de purificación de astrositos: cambiar los medios de comunicación, estrategias mecánicas y químicas
    Nota: la tasa metabólica de los astrocitos es alta comparada con otros tipos de células, por lo tanto, en nutricionalmente privado las condiciones, estas células muestran tasas de supervivencia bajas después de algunos días. A diferencia de los astrocitos, microglia no se ven afectados por la privación nutricional y proliferan en estos entornos 18. Para mantener un número reducido de células de la microglía, los autores cambian los medios de cultivo de células astroglial cada 3 días. Este cambio constante en los medios de comunicación celular también disminuirá la población de microglial que puede crecer sobre la monocapa celular astrocytic en el matraz 19.
    1. Uso un Pasteur pipeta para aspirar los medios de comunicación con las células microgliales no adherente de cada uno de los frascos. Lavar cualquier residuo dejado atrás utilizando PBS estéril filtrada a cada uno de los matraces en forma de gota a gota (5 mL/frasco).
    2. Añadir el DMEM estéril filtrada (con suero bovino fetal y antibiótico) gota a gota a cada frasco (5 mL/frasco). Frote suavemente en movimientos circulares para cubrir toda la superficie.
    3. Células de lugar en la 37 y la#176; Incubadora C en 5% CO 2 para 8-10 días los frascos hasta confluencia (> 95% de cobertura de la placa).
      Nota: Varios protocolos han demostrado que cuando los astrocitos llegar a confluencia, métodos mecánicos, tales como sacudir la cultura desde 2 a 24 h, conduce a la separación de las células que se encuentran en la parte superior estos astrocitos, microglia y principalmente precursor células 19 , 20.
    4. Células no astrocíticos se reduce en cultura por realizar agitación orbital a 180 rpm durante 30 minutos. Después de quitar las células en sobrenadante, medios frescos se pipetea en el matraz (~ 15 mL).
    5. Para eliminar las células progenitoras del oligodendrocyte, aumentar la velocidad de agitación a 200 rpm por 6 h 21 , 22 , 23, aspirar sobrenadante y medios frescos pipeta.
      Nota: Para disminuir la presencia de microglia en las culturas, los dos métodos químicos pueden utilizarse secuencialmente (no simultáneamente) en la metodología de cultivo celular primario: citosina arabinosa (ara-c) y L-leucina metil éster (LME) 24.
    6. Inmediatamente cuando las células alcanzan confluencia (100%), 3-4 días después de la remoción mecánica de la microglia, estas células se pueden tratar con 8 μm de la citosina arabinosa compuesta antimitótica (ara-c) en DMEM durante 5 días (cambio a ara-c fresco en DMEM diariamente).
      Nota: El momento agregar Ara-C es fundamental ya que este compuesto es una droga antimitótica, que reduce el número de células se dividen rápidamente como fibroblastos microglia 19 , 25 26 . En contraste con la microglia, cuando confluente, astrocitos dejan proliferar a través de la inhibición de contacto 27.
    7. 2 días para las células para recuperarse del tratamiento con Ara-C.
    8. Para reducir aún más la contaminación microglial, después de que las células llegan a confluencia, usa 50 mM de metil éster de L-leucina (LME) en DMEM corregido a pH 7.4, durante 1 h a 37 ° c.
      Nota: LME cruza la membrana de las células y organelos, y después de ser hidrolizado, L-leucina producido se acumula en los lisosomas de estas células. La acumulación de este aminoácido conduce a una hinchazón osmótica y rotura de lisosomas 28 , 29. LME es altamente eficaz en la eliminación de microglia, en comparación con otras células 20 , 30.

4. Astrocitos en placas de 6 pocillos de cultivo

  1. capa cubreobjetos con poly-D-lisina
    1. ponga un cubreobjetos en cada plato de petri de 35 mm, luego agregar 100 μl de la solución diluida de Poly-D-lisina a cada cubreobjetos y esperar 1 h.
    2. Quitar el Poly-D-lisina y lavar dos veces con 2 mL de agua estéril.
    3. Quitar el agua y esperar a cubreobjetos secar dentro de la campana. Almacenar el cubreobjetos a-20 ° C hasta por dos semanas.
      Nota: Congelación de la solución diluida de Poly-D-lisina; puede almacenarse hasta por dos semanas.
  2. Tripsinización
    1. con una pipeta Pasteur, aspirar el medio de los frascos. Añadir 5 mL/frasco de PBS estéril filtrada para lavar suavemente las células.
    2. Aspirado apagado el PBS y luego añade 5 mL/frasco de filtrado estéril 0.25% tripsina y 0,5 mM de solución de EDTA. Colocar el matraz en el ° c 37, 5% CO 2 incubadora durante 10 minutos
      Nota: Mientras que las células están incubando, caliente 5 mL/frasco de DMEM completo fresca a 37 ° C.
    3. Después de 10 min de incubación, agite para asegurarse de que todas las celdas se levantan fuera del matraz. Añadir rápidamente 5 mL de DMEM completo caliente en cada matraz, para neutralizar la tripsina.
    4. Pipeta suavemente las células arriba y abajo varias veces para romper cualquier " grupos ". Transferir las células suspendidas de dos matraces a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    5. Centrifugar 5 min a 200 x g para recoger el precipitado de células. Resuspenda el sedimento en 500 μl de medio y proceda a colocar las células en los frascos de.
      Nota: Ejemplos de análisis a realizar con las células: 1) transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), para analizar la expresión génica; 2) Western blot para evaluar la expresión de la proteína; 3) análisis de citometría de flujo cuantificar el número de células progenitoras neurales y proteínas de interés; 4) inmunofluorescencia para analizar la expresión de la proteína y la localización.
  3. Siembra astrocitos
    1. después de tratar los astrocitos primarios con tripsina (véase 4.2), recoger 100 μL de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadir 100 μL de azul de tripán de 0,5%.
    2. Añadir 10 μL de la suspensión recogida en tripán azul para el hemocitómetro y contar todas las celdas que son viables.
    3. Utilizar las fórmulas en el paso 3.3 para calcular la densidad de las células antes de preparar los matraces.
    4. Preparar el pozo varios platos añadiendo uno estéril, poly-D-lisina revestido cubreobjetos a cada pocillo. Pipetear las 50.000 células y llenar el resto del volumen en cada plato varios pocillos con medio fresco (aproximadamente 2 mL).
    5. Coloque las placas de varios pocillos en la incubadora de 37 ° c en 5% CO 2, después 5-7 días, astrocytes pueden crecer y cubrir toda la superficie de los cubreobjetos.

5. Protocolo de OGD para astrocitos primaria

  1. preparación medio OGD
    1. suplemento Dulbecco ' s modificado Eagle ' glucosa libre por medio de s con 3,7 g/L bicarbonato de sodio y 1% penicilina/estreptomicina. Ver en tabla 4 materiales.
    2. Purgar 20 mL del medio libre de glucosa por los burbujeantes con 95% N 2 o 5% de CO 2 por 10 min a un flujo de 15 L/min (indicado con el medidor de flujo) mediante la inserción de una pipeta serológica al sistema de gas en el medio.
      Nota: Después de la purga del medio de oxígeno, ajustar el pH a 7.4 (ver nota en el paso 2.1).
    3. Filtro purgado medio libre de glucosa, mediante un sistema de filtro de tubo de 50 mL.
      Nota: Hacer medio fresco de OGD para cada experimento, burbujeo con 95% N 2 o 5% de CO 2 antes de usar, para que las células se exponen a un medio purgado de oxígeno.
  2. Procedimiento experimental
    1. interior de la campana de cultivo de tejidos, eliminar medios de astrositos de cubreobjetos previamente preparado (consulte el paso 4.3.5) y lavar con PBS celular dos veces para eliminar cualquier glucosa en las células.
    2. Añadir 2 mL de los medios de comunicación OGD a cada bien y colocar los platos y bien dentro de la cámara de hipoxia con sus tapas apagado
    3. Conecte la mezcla de gas a la válvula de entrada y deje abierta la válvula de salida. Limpie la cámara con la mezcla de gas de 95% N 2 / 5% CO 2, a 15 L/min durante 5 minutos
    4. Detener el flujo de gas y cierre la abrazadera de la válvula de salida, primero cierre la abrazadera de la tubería de la válvula de entrada de gas.
      Nota: No Asegúrese de fugas de gas cubriendo el sello de la cámara con agua y jabón. Si el sello está seguro, no deben formar burbujas.
    5. Coloque toda la cámara de la incubadora de cultivo celular a 37 ° C por 1 h o 6 h de OGD.
    6. Después de tiempo de incubación, aspirar los medios OGD y cuidadosamente la pipeta 2 mL de DMEM completo a cada 4,67 cm 2 para el normoxic proceso 24 h.

6. Protocolo para la preparación de la inmunofluorescencia de astrositos primaria

Nota: para evaluar la pureza de astrositos, células cerebrales diferentes tipos tales como neuronas, microglia y oligodendrocitos pueden ser detectados por inmunofluorescencia utilizando diferentes marcadores de la célula. Marcadores de proliferación, PCNA y yoduro de propidio (PI) pueden utilizarse en astrocitos primarios expuestos a OGD seguido normoxic condiciones. Ver en Tabla de materiales materiales.

  1. Preparación de inmunofluorescencia
    Nota: se trata de un protocolo general de la inmunofluorescencia, pequeñas modificaciones pueden realizarse para obtener una señal óptima (por ejemplo, períodos de incubación largos, temperatura de incubación). Cada marcador del cuadro 1 se puede utilizar según el fabricante ' protocolo de s.
    1. Para evaluar la viabilidad de las células, las células pueden ser incubadas durante 5 minutos a 37 ° C con PI (5 μm en DMEM completo) y lavar dos veces con 2 mL de PBS por 5 minutos las células que muestran la coloración de la PI son menos viables.
      Nota: Las células tratadas en el paso 5.2.6 uso.
    2. Para fijar las células después de la tinción de la PI, añadir 2 mL de formalina al 4% por 4,67 cm 2, por 20 min a 4 ° c. Para las muestras etiquetadas con PCNA, la solución preferida de fijación es el metanol por 10 min a 4 ° c.
      PRECAUCIÓN: Formalina y metanol son tóxicos.
      Nota: Compruebe siempre los protocolos del anticuerpo específico de cada empresa.
    3. Lavar las células con 2 mL de PBS durante 5 minutos y repetir este paso 3 veces.
    4. Incubar las células en solución de bloqueo (tensioactivo no iónico 0.5%, 10% FBS en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
    5. Lavar las células con 2 mL de PBS durante 5 minutos, repita el lavado 3 veces.
    6. Incubar a 4 ° C, durante la noche (16 h), con el anticuerpo primario (PCNA, GFAP) en una solución de 1% FBS en PBS.
    7. Quitar la solución de anticuerpo primario, lavan las células con 2 mL de PBS durante 5 minutos y repetir este paso 3 veces.
    8. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con el fluoróforo en una solución de 1% FBS en PBS, durante 1 hora, a temperatura ambiente.
    9. Lavar las células con 2 mL de PBS durante 5 minutos, repetir este paso 3 veces. Añadir 1 μg/mL de DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) durante 5 min teñir los núcleos celulares.
    10. Lavar las células con 2 mL de PBS 5 min, repetir este paso dos veces y mantenga en PBS.
    11. Preparar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio con montaje medio.
  2. Microscopio confocal
    1. después de instalar el microscopio, coloque el lado del cubreobjetos hacia abajo sobre la platina del microscopio.
    2. El software, seleccione un rayo láser a 543nm para anticuerpo conjugado GFAP-Cy3.

7. Análisis de viabilidad de la célula

  1. Trypsinize y cuantificar astrocitos siguiendo los pasos 4.3 y 4.4.
  2. Agregar de 1 x 10 4 células/pozo en placas de 96 pocillos y cultivarlas a confluencia.
  3. Utilizando la metodología del paso 5, exponer placas de 96 pocillos cultivos a cualquiera normoxic OGD de 1 h o 6 h OGD.
  4. Tratamiento después de la OGD, normoxic media se agrega a todas las células durante 24 h y viabilidad se mide mediante el ensayo MTT reactivo (utilizar como fabricante ' indican instrucciones de s).
  5. Desde una solución MTT de 5 mg/mL, añadir 10% del volumen total a cada pozo e incubar durante 3 h a 37 ° c con el reactivo MTT.
  6. Quitar los medios de comunicación y resuspender cristales con 200 μL dimetil sulfóxido. Leer la placa en un espectrofotómetro a 570 nm.
    Nota: Una absorción disminuida en relación con las células del control se correlaciona con menos viabilidad.

Representative Results

Una de las principales preocupaciones de la cultura astrocytic primaria es la presencia de otras células como las neuronas, fibroblastos, oligodendrocitos y microglia. En la figura 1, las células aisladas de cortezas de rata tenían cambios de medios de comunicación cada 3 días y ya sea no tratada o tratada con agregado LME de 1 h. 24 h más tarde, las células immunostained para GFAP y contratinción con DAPI. Las células no tratadas mostraron un promedio de 39% no-GFAP células positivas, mientras que células tratadas con LME 8%. Estos resultados muestran cómo los medios de comunicación y tratamiento de LME cambian las células positivas efectivamente disminuida de GFAP no 4,75 veces, produciendo una cultura enriquecida-astrositos. Para determinar si 1 h o 6 h inclinacion afecta viabilidad de astrositos después de esta metodología, la figura 2 muestra un ensayo MTT de culturas de astrositos, 24 h después de la injuria. No se encontró ninguna diferencia significativa en viabilidad en cualquier condición, demostrando que ambos tiempos pueden utilizarse para estudiar la reactividad de los astrositos. Proliferación celular es uno de los efectos provocados por OGD en astrocitos. Células antígeno nuclear de proliferación (PCNA) en la figura 3 aumentó de 10% en las células normoxic, a 30% después de 1 h OGD, mostrando el esperado en vivo respuesta astrocytic15. Por último, astrocitos expusieron a 6 h de OGD seguido por condiciones de normoxic 24 h. Después de este período de tiempo, se realizó inmunofluorescencia contra GFAP. Las células expuestas al OGD se compararon con astrocitos normoxic condiciones. Astrocitos sin inclinacion muestran la tradicional morfología radiada (Figura 4A), mientras que las células que experimentaron la OGD presentan claramente la hipertrofia característica de astrocitos reactivos (Figura 4B). Esta hipertrofia se puede visualizar en el correspondiente interferencia diferencial (DIC) imagen de astrocitos de rata cortical normoxic y OGD condiciones (figura 5).

Figure 1
Figura 1 . Inmunofluorescencia para validar la pureza de la cultura de astrocitos de rata cortical primario con GFAP y DAPI. (A) el panel de la izquierda representa GFAP positivo (rojo), el panel central muestra núcleos (DAPI, azul), y el panel derecho muestra imágenes combinadas de no tratadas de LME (panel superior) y tratados con LME (panel inferior) células. Flechas blancas muestran positivo de GFAP no tinción de las células. (B) cuantificación de núcleos positivos no GFAP en LME y no LME tratados las células. Se realizó una prueba de t no apareada (p < 0.0001) y las barras de error representan la media con el represente de barras SEM. escala 50 micras y fotos fueron tomadas a 20 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Análisis de viabilidad de astrocitos con exposición de 24 h a la OGD. Los astrocitos fueron cultivados en placas de 96 pocillos y exponen a condiciones OGD normoxic, inclinacion de 1 h o 6 h. Después del tratamiento, las células fueron agregadas a normoxic medios durante 24 h y viabilidad se midió mediante ensayo MTT. Absorbancia a 570 muestra nm la viabilidad celular de las células expuestas al OGD en cultura en comparación con las células en condiciones normoxic. Los datos fueron analizados con ANOVA de una vía (p = 0.9669) y presentado con barras de error que representan la media con SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Proliferación de astrocitos de rata aumenta con la exposición a deprivación de oxígeno y glucosa y pueden detectarse mediante PCNA como un marcador de. (A) el panel de la izquierda representa las células PCNA positivas (verde), el panel central muestra núcleos (DAPI, azul) y el panel derecho muestra imágenes fusionadas de células normoxic (panel superior) y 1 h OGD tratados las células (panel inferior). (B) porcentaje de células positivas de PCNA en normoxic versus OGD tratados las células. Se realizó una prueba de desapareado (p < 0.0001) y las barras de error representan la media con el represente de barras SEM. escala 50 micras y fotos fueron tomadas a 20 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Expresión de la proteína ácida fibrilosa Glial (GFAP) conjugado con Cy3 en cultura de astrositos cortical de rata primaria. Astrocitos (A) en un programa de medio ambiente normoxic la morfología radiada característica. La proteína intermedia del filamento, GFAP, llena los cuerpos celulares y se extiende en los procesos citoplasmáticos delgados. Astrocitos de exposición (B) después de 6 h de OGD adoptaron una morfología hipertrófica. Escalas representan 20 micras y fotos fueron tomadas en 40 aumentos en un microscopio confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Los astrocitos corticales de rata bajo privación normoxic y oxígeno y glucosa. Inmunofluorescencia de astrocitos normoxic condiciones (panel izquierdo superior) o 6 h OGD (panel inferior izquierdo), tinción con un anticuerpo conjugado con Cy3 contra GFAP. La correspondiente interferencia diferencial (DIC) imagen se muestra en el panel derecho. Barra de escala representa 20 micras y fotos fueron tomadas a 20 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Propósito Marcador de anticuerpos Descripción
Astrositos cultura validación Iba-1 Detecta las células microgliales
NeuN Identifican neuronas maduras
Olig1 Detecta oligodendrocitos maduros
Olig2, NG2 Detecta las células de precursor del oligodendrocyte
GalC Identifica oligodendrocitos inmaduros o maduros
Proliferación PCNA Se une la proteína p36, expresada en altos niveles en células proliferantes
Viabilidad celular Yoduro de propidio (PI) Se une al ADN, este marcador indica falta de viabilidad celular
TR > MTT Las medidas de funcionalidad mitocondrial Reactividad GFAP Indicador de la reactividad de los astrositos

Tabla 1. Lista de reactivos utilizados para teñir diferentes tipos de células y procesos celulares

Discussion

Este protocolo describe el aislamiento de los astrocitos de las cortezas de la rata. En este método, es fundamental para disminuir la contaminación con otros tipos celulares como los fibroblastos, microglia y oligodendrocitos. Para reducir el número de microglía, se pueden tomar varias medidas: cambio de medios de comunicación, agitación orbital y tratamientos químicos. Una vez pureza cultura confirmado por inmunofluorescencia utilizando marcadores selectivos de celulares o para los más importantes contaminantes de celular, se pueden realizar experimentos. Por ejemplo, anticuerpos contra la molécula de adaptador de enlace de calcio ionizado 1 (Iba-1) pueden utilizarse para detectar la microglia. Muerte neuronal comienza temprano en la cultura y estas células son eliminadas junto con células de precursor del oligodendrocyte (OPC) después de golpear ligeramente del frasco y cambian los medios de comunicación en día 331. Células precursoras oligodendrocytic pueden identificarse usando los anticuerpos como olig2 o NG2. GalC puede utilizarse para identificar oligodendrocitos inmaduros o maduros, pero en esta etapa de la cultura son poco probable ser encontrado. Alternativamente, las células positivas de GFAP no pueden cuantificarse y contaminantes pueden ser estimados. Esta última metodología no discernir entre las células específicas, pero será un más rápido y más económica metodología para determinar el porcentaje de células no astrocíticos en la cultura.

Una vez que se produce una cultura de astrositos enriquecido, OGD puede realizar experimentos para estudiar la reactividad de los astrositos. Purgar una solución con nitrógeno por burbujeo para sustituir el oxígeno es un protocolo comúnmente utilizado32. En nuestra metodología, se utiliza el método de burbujas para purga de oxígeno con nitrógeno (95% N2, 5% CO2) en el medio libre de glucosa con un caudal de 15 L/min, durante 10 minutos, para un volumen total de 0,025 L. Para confirmar que el oxígeno es purgado, medimos la concentración de oxígeno restante en los medios de comunicación mediante el uso de un medidor de oxígeno para líquidos y aire. La concentración de oxígeno restante en los medios de comunicación después de la purga durante 10 min se redujo de 7,9 mg/L a 0,3 mg/L. Para determinar cuánto tiempo la cámara debe purgarse para substituir el oxígeno, purga con N2 se realizó con nada menos que la sugerencia del fabricante de la cámara (20 L/min, 2-5 min). Después de 5 min de purgar a 15 L/min, la concentración de oxígeno en la cámara fue 0%. Otras metodologías utilizando cámaras similares han purgado en un flujo de 8-20 L/min y a veces de 5-10 min para sustituir el oxígeno del aire con nitrógeno33,34.

Como otros modelos de celulares, la OGD tiene limitaciones y resultados deben ser interpretados con cuidado. La inclinacion puede ser dañina para las neuronas, sin embargo, los astrocitos pueden soportar estas condiciones para hasta 24 h35. Otra limitación es que los astrocitos están aislados en este sistema, falta de señalización de otras células. Una manera de superar esta limitación es utilizar medios condicionados de otras células en las mismas condiciones como isquémica. Como alternativa, citoquinas u otros factores pueden añadirse a los medios de comunicación después de OGD36.

Un método alternativo para el estudio de los efectos de la deficiencia de energía en las células, es añadir ouabain a los medios de comunicación.  Principalmente, este compuesto inhibe la bomba sodio/potasio, que agota la producción intracelular de ATP, similar a los efectos de la OGD37,38. Sin embargo, este método tiene la desventaja que sus mecanismos no se entienden completamente y provoca efectos off-target, que introduce variables que constituyen un escenario realista movimiento isquémico.

En Resumen, el método de la OGD es un sistema de células aisladas que permite probar directamente los efectos de diferentes drogas astrocytic objetivos en vitro que podría contribuir a la neuroprotección. También proporciona una herramienta para estudiar biología básica astrositos. Este modelo puede crear una fuerte base de evidencia para justificar las condiciones experimentales para el desarrollo de fármacos utilizando un modelo en vivo de la carrera.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores queremos agradecer a Paola López Pieraldi la asistencia técnica. A.H.M. es agradecido por las subvenciones 8G12MD007600 y U54-NS083924 que apoyaron esta publicación. Agradecemos a NIH-NIMHD-G12-MD007583 subvención para el apoyo del mecanismo. Dera está agradecido por la beca proporcionada por NIHNIGMS-R25GM110513. Estamos agradecidos por el uso de la zona común de la instrumentación y la ayuda de Dr. Priscila Sanabria para el uso de las instalaciones de la proyección de imagen óptica del programa RCMI por conceder G12MD007583. Además, queremos agradecer a José Padilla por su destacado papel en filmación y edición del protocolo visual.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

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Control de reactividad astrositos y proliferación <em>in Vitro</em> bajo condiciones isquémicas
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Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

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