Summary
La levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe es un excelente sistema modelo para estudiar la citocinesis, la etapa final en la división celular. Aquí se describe un método de microscopía para analizar diferentes eventos cytokinetic en células de levadura de fisión en vivo.
Abstract
La citocinesis, el paso final en la división celular es fundamental para mantener la integridad del genoma. citocinesis adecuada es importante para la diferenciación celular y el desarrollo. Citocinesis implica una serie de eventos que están bien coordinados en el tiempo y el espacio. La citocinesis implica la formación de un anillo de actomiosina en el sitio de división, seguido por la constricción de anillo, la formación de la membrana y surco adicional remodelación de la matriz celular. La levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) es un sistema modelo bien estudiado que ha puesto de manifiesto con claridad sustancial los acontecimientos iniciales en la citocinesis. Sin embargo, no entendemos claramente cómo los diferentes eventos cytokinetic son coordinadas espacio-temporalmente. Para determinar esto, hay que analizar los diferentes eventos cytokinetic en grandes detalles en el tiempo y en el espacio. Aquí se describe un método de microscopía para examinar diferentes ev cytokineticentos en células vivas. Con este enfoque es posible medir el tiempo de diferentes eventos cytokinetic y determinar el momento de la contratación de diferentes proteínas durante la citocinesis. Además, se describen protocolos para comparar la localización de proteínas, y la distribución en el sitio de la división celular. Este es un protocolo básico para estudiar la citocinesis en la levadura de fisión y también se puede utilizar para otras levaduras y sistemas de hongos.
Introduction
La citocinesis, el paso final en la división celular, es un proceso complejo esencial para la diferenciación correcta, el desarrollo y la supervivencia de un organismo. Citocinesis involucra múltiples eventos que se organizan para garantizar una correcta separación celular mientras se mantiene la integridad genómica 1. La citocinesis implica eventos en los que un anillo de actomiosina una vez montado sufre constricción, que es concurrente con la expansión de la membrana y surcado, y remodelación de la matriz extracelular celular, finalmente seguido de abscisión de células 1, 2, 3. Organización inadecuada de eventos cytokinetic puede dar lugar a defectos de separación celular y ploidía, y puede causar enfermedades como el cáncer 4, 5, 6, 7, 8. Los principios fundamentales que permiten organización de eventos cytokinetic no se conocen bien, lo que conduce a bloqueos de carreteras en nuestra comprensión de la etiología de estas enfermedades.
La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) es un excelente sistema modelo para estudiar la citocinesis debido a la naturaleza conservada de las proteínas implicadas 1. En la levadura de fisión, después de actomiosina conjunto de anillo, el anillo entra en una fase de maduración / reposo donde no constreñir 9. La maduración termina con el inicio de la constricción de anillo de actomiosina, concurrente con el ceño membrana y la ingresión tabique. Trabajo seminal en los últimos años nos han dado una comprensión bastante buena del conjunto de anillo de actomiosina en la levadura de fisión 1, 9, 10. En algunos eucariotas, incluyendo la levadura de fisión, el ensamblaje de su anillo de actomiosina no es suficiente para surcado membrana. en fisión de levadura, la constricción del anillo por sí sola no proporciona suficiente fuerza para superar la presión de turgencia interna para la formación de surcos 11. Un modelo reciente indica que esta fuerza se evita mediante la ingresión tabique 11. En otro modelo, el papel de la extensión de la membrana de plasma se ha sugerido para contribuir a la formación de surcos 12, 13. Constricción de anillo y surcado de membrana no se producen en la temperatura Bgs1 / CPS1 sensibles cps1-191 mutante, la principal enzima para la formación del tabique primario 14, 15. Las células que carecen Bgs1 muestran tabique primario defectuoso y prolongada constricción de anillo 15, 16. Bgs1 es reclutado para el sitio de la división celular de ingresión tabique durante la maduración después de actomiosina conjunto de anillo 17, 18. SimilarlY, durante cellularization en embriones de Drosophila, la constricción de anillo es bifásica, con una tasa significativamente la constricción inicial lenta 19, se asemeja a la fase de maduración observado en la levadura de fisión. Bifásica constricción anillo puede ralentizar surcado membrana para permitir la suficiente expansión de la membrana 20 y la modificación de la matriz extracelular. Esto sugiere que después de actomiosina conjunto de anillo, se produce la constricción del anillo de manera eficiente sólo cuando la célula ha cumplido con los requisitos para la formación de surcos. No se entiende bien qué condiciones se requieren para la constricción de anillo de actomiosina después del montaje del anillo, ni los eventos moleculares que regulan este proceso. Recientemente hemos demostrado que, tras actomyosin anillo de montaje de la pequeña GTPasa Cdc42 se somete a un patrón de activación único espacio-temporal 21. Este patrón es establecido por el patrón de localización única de los factores de intercambio de nucleótidos de guanidina Cdc42 (GEF) que activan Cdc42. El Gef1 GEF se localiza en el anillo de actomiosina montado y promueve la aparición de constricción de anillo y ingresión septum, mientras que Scd1 localiza en la membrana surcando y promueve la formación de septum normal. Nos encontramos con que el patrón de activación Cdc42 establecido por sus GEFs conducen a la regulación de los eventos cytokinetic distintas.
Para entender el mecanismo molecular de acontecimientos que finalmente conducen a la separación de células siguiente conjunto de anillo de actomiosina, hay que seguir los acontecimientos cytokinetic distintas en tiempo y espacio. En la levadura de fisión, la citocinesis implica primero el conjunto de nodos precursores alrededor del núcleo, lo que eventualmente reclutan la miosina tipo II, la formin Cdc12, y otras proteínas necesarias para el montaje del anillo de actomiosina. En cuando los eventos cytokinetic distintos y proporcionar un marco de referencia, la separación de los marcadores corporales polo del huso (formación de husillo) se considera como tiempo 0 22. El montaje de THanillo de actomiosina e puede ser seguido mediante el seguimiento en el tiempo de la intensidad de una proteína de actomiosina anillo marcado con fluorescencia tal como el II miosina de cadena ligera reguladora tipo RLC1. Aquí se describe un enfoque microscópico para analizar las diferentes etapas de la citocinesis en el tiempo.
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Protocol
1. Preparación de la muestra
- Se cultivan las células de levadura de fisión que expresan el marcador polo del huso cuerpo SAD1-23 y II mCherry miosina de cadena ligera reguladora de tipo RLC1-24 Tomate en medios líquidos YE a 32 ° C durante 8 generaciones.
NOTA: Para los mutantes sensibles a la temperatura, crecer las células a 25 ° C. Se cultivan las células a mediados de la fase de registro a un OD 600 de 0,5 en YE. Para más información sobre las condiciones de crecimiento de la levadura de fisión consulte el manual de laboratorio de la levadura de fisión 25. - Preparad (o mínimos) los medios de comunicación con un 0,6% de agarosa (agarosa medios de comunicación basados muestran fondo fluorescente menos en comparación con el agar). Para los medios de comunicación derretida añadir 1 mM de ácido ascórbico (vitamina C). La vitamina C apaga los radicales libres que se liberan debido al foto-blanqueo, minimizando así fototoxicidad.
- Verter 3 - 4 ml de la vitamina C se fundió con cordones de los medios de comunicación a una placa de cultivo con fondo de cristal. Deje enfriar y solidificar los medios de comunicación.
Nota laespesor del vidrio en la placa de cultivo depende del espesor hoja de la cubierta adecuado para el microscopio. Aquí, el uso cubreobjetos No. 1.5. - elevar suavemente el material solidificado de la placa de cultivo con la ayuda de un escalpelo afilado. Coloque una punta de pipeta entre la losa de medios y la placa de cultivo para evitar que la losa de volver a caer en el plato (Figura 1).
- Tomar 1 ml de células recién crecientes como se describe en el apartado 1.1 anterior. Girar suavemente las células a 300 xg durante 30 s. Descartar el sobrenadante. Resuspender las células en la pequeña cantidad de medios de comunicación residual que permanece en el tubo después de descartar el sobrenadante.
- Carga de 2 - 5 l de cultivo celular resuspendido entre la losa de medios y el fondo de cristal de la placa de cultivo. Las células deben estar en el cristal. La punta de la pipeta se coloca entre los medios y el plato permite una fácil carga del cultivo celular.
- Muy eliminar suavemente la punta de la pipeta y colocar la losa de los medios de comunicación en su posición original en el culture plato. Asegúrese de evitar cualquier burbuja de aire. Si es necesario, presione suavemente las burbujas de aire deslizando la parte posterior de una punta de pipeta en la parte superior de la losa de los medios de comunicación.
- Deje que las células se sientan en la placa de cultivo de 30 min a una hora en la oscuridad a la temperatura a la que se llevará a cabo la microscopía. Esto es importante para evitar cualquier choque debido al cambio en las condiciones de crecimiento para las células.
2. Adquisición de imágenes
- Colocar una gota de aceite en el lado exterior del vidrio en la placa de cultivo. Coloque la placa de cultivo en un microscopio invertido.
- Para minimizar la autofluorescencia de los medios YE utilizar un filtro de GFP con un rango de longitud de onda estrecha (520 - 535 nm).
- Se centran en el plano medio de las células y asegurarse de que están bien espaciados y no demasiado lleno. Asegúrese de iniciar la adquisición de imágenes de las células en la fase adecuada del ciclo celular. Para este experimento, siga las células de los finales de G2.
- Programar el software de adquisición de imágenes to tomar GFP, RFP y DIC imágenes de las células.
- Para este experimento utilizar el tiempo de exposición de 100 ms para DIC y 75 ms de tiempo de exposición para los filtros de GFP y RFP. El tiempo de exposición depende de los ajustes del microscopio, la proteína en estudio y de la duración del experimento. Para los ajustes del microscopio dado, utilizar la potencia del láser 50%.
- Para capturar imágenes en 3 dimensiones, programa de software de adquisición de imágenes para obtener imágenes Z-escala. Use un tamaño de paso de 0,4 micras y una distancia de 3,0 m (media de z total) alrededor del punto de foco central de las células. Esto conduce a la captura de 16 Z-cuadros por punto de tiempo con una distancia total Z de 6 micras.
NOTA: Z-series de adquisición de imágenes permite la captura de los cuerpos polares del huso.
- Tomar imágenes cada 2 min. Cambiar el tiempo de exposición de acuerdo con los requisitos del experimento. El tiempo de exposición también se puede cambiar de acuerdo a la proteína de interés y la intensidad de la señal. Sin embargo, cabe destacar que cortaer intervalos o más tiempo de exposición aumento de foto-toxicidad debido a la decoloración y, por tanto, las células pueden ser seguidos sólo por un corto tiempo.
- Adquirir imágenes hasta que las células separadas físicamente según lo observado por las imágenes DIC, o programar el software para detener la adquisición después de 90 minutos.
Análisis 3. Imagen
- El análisis temporal de los acontecimientos cytokinetic
- Usando el software de adquisición de imágenes hacer proyecciones de los Z-marcos para cada punto del tiempo. Hacer diferentes archivos para cada longitud de onda de imagen adquirida.
- Exportar esta serie de tiempo-punto de proyección como un archivo .tiff.
- Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ. Abra la serie de imágenes para cualquiera de las longitudes de onda.
- Seleccione una celda para ser estudiados. Doble click en la opción de línea de la barra de herramientas. Esto abrirá otra ventana para ajustar el ancho de línea. Ajuste el ancho de línea para corresponder a la anchura de la celda. Para que una célula WT esto es aproximadamente 40 - 50 píxeles. Dibujar una línea a lo largo deleje largo de la célula de interés.
- Haga clic en Análisis> Herramientas> Gestor de retorno de la inversión y haga clic en Agregar. Esto añadirá la línea seleccionada a la ventana de retorno de la inversión para su uso posterior. No cierre esta ventana.
- Haga clic en la imagen de interés y seleccione Editar> Cambios> Enderezar. Esto abrirá otra ventana. Marque "Todo el proceso de pila". Esto enderezará la celda horizontalmente.
- Haga clic en Imagen> Transformar> Rotar 90 grados a la derecha. Esta imagen está ahora enderezó verticalmente.
- Haga clic en la imagen> Pilas> Hacer Montage. Esto abrirá una ventana para asignar el número de filas y columnas para la pila, el factor de escala para el tamaño de la imagen, la primera y la última rebanada (marco) para el montaje y el incremento de marco para el montaje. Compruebe rebanadas de etiqueta y pulsa enter.
- Como se muestra una ventana con un montaje de la célula de interés, abrir la serie de imágenes para la otra longitud de onda.
- Haga clic en el identificador de línea en el gestor de retorno de la inversión. Esto seleccionarála misma célula en el segundo archivo de imagen. Repita los pasos 3.1.6 - 3.1.8. Esto abrirá un montaje de la segunda imagen.
- En la imagen con el marcador cuerpo polo del huso sad1-mCherry, busque inicio de la separación del marcador cuerpo polo del huso y marcar ese punto de tiempo como el tiempo 0.
- Siga la señal RLC1-Tomate en la imagen con el tiempo y buscar la señal que aparece como una línea distinta en comparación con los parches de RLC1-tomate. Este tiempo de punto marca la finalización del montaje de anillo de actomiosina / inicio de la fase de maduración.
- de desplazamiento siguiente a través de la película con el tiempo para determinar cuando el anillo RLC1-tomate comienza a disminuir de tamaño. Esto está marcado como el final de la maduración de fase / inicio de la constricción de anillo.
- Siga la señal RLC1 de tomate con el tiempo a lo largo de constricción hasta que aparece como un punto en el centro del eje de la célula. Esto está marcado como el final de anillo de constricción / final de ingresión septum.
- Tras el montaje de imágenes DIC, determinar el final de célulasseparación. Registre el punto de tiempo cuando la célula se separa físicamente.
- Para la separación del cuerpo polo del huso medir la distancia entre los dos cuerpos polares del huso en el tiempo utilizando la herramienta de línea de ImageJ. Trazar la distancia en el cuerpo polo del huso en el tiempo.
- Registrar los diferentes puntos de tiempo para los diferentes eventos cytokinetic para calcular la duración de cada fase cytokinetic y comparar con la separación del cuerpo polo del huso en el tiempo.
- Análisis espacial de eventos cytokinetic
- Seleccione una celda con un anillo de actomiosina visible. Doble click en la opción de línea de la barra de herramientas de ImageJ. Esto abrirá otra ventana para ajustar el ancho de línea. Ajustar el ancho de la línea para que se corresponda con el espesor del anillo (15 - 20 píxeles). Dibujar una línea a lo largo del anillo con objeto de garantizar la totalidad del espesor del anillo está incluido.
- Haga clic en Análisis> Herramientas> Gestor de retorno de la inversión y haga clic en Agregar. Esto añadirá la línea seleccionada a la ventana de retorno de la inversión para su uso posterior.No cierre esta ventana.
- Haga clic en la imagen de interés y seleccione Editar> Cambios> Enderezar. Esto abrirá otra ventana. Marque "Todo el proceso de pila". Esto enderezará el anillo horizontal.
- Cambiar la intensidad del plano más brillante de la pila Z enderezado (desde 3.1.6) usando Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste> Restablecer.
- Haga clic en la pestaña Stk> Proyecto 3D. Se abrirá un cuadro de diálogo. Cambiar el método de proyección a punto más brillante y la separación de la rebanada de 2 ó 3 píxeles. Por último, el eje de cambio de giro a X o el eje Y (esto cambiará dependiendo del ángulo de visión deseado), haga clic en interpolar y haga clic en Aceptar para generar una proyección en 3D de la imagen. Utilice la barra de desplazamiento debajo de la imagen para girar la imagen.
- Abrir la serie de imágenes de la otra banda de frecuencia con ImageJ.
- Haga clic en el identificador de línea en el gestor de retorno de la inversión. Se seleccionará el mismo anillo en el segundo archivo de imagen. Repita los pasos 4.2.4 y 4.2.5.Esto abrirá un anillo de 3 dimensiones en la imagen con la otra longitud de onda.
- Con los dos anillos de imagen 3D abierto, haga clic en la imagen> Color> Combinar Canales. Esto abrirá una caja. Seleccione cada imagen desde el menú desplegable para el color correspondiente deseada y haga clic en OK. Esto abrirá un material compuesto tanto de las imágenes en diferentes longitudes de onda.
- Comparar la localización de los diferentes marcadores con respecto a la localización en el anillo cytokinetic o membrana ingressing. RLC1-GFP es un marcador para el anillo cytokinetic. Las proteínas co-localizar con RLC1-GFP se localizan en el anillo mientras que las proteínas localizar detrás señal RLC1-GFP localizar a la membrana ingressing.
NOTA: La proteína de interés tiene que ser de un fluoróforo diferente que la del marcador de anillo. - Generar 3 anillos dimensionales durante las diferentes etapas de la citocinesis para comparar la localización espacial de las proteínas a lo largo de la citocinesis.
- Análisis de distri proteínasbución en el anillo cytokinetic
- Para comparar y analizar la distribución de las proteínas a lo largo del anillo de medir el coeficiente de varianza de la distribución de proteínas. Un alto coeficiente de varianza indica la distribución desigual de las proteínas a lo largo del sitio de división y sugiere conjunto de anillo inadecuada, la maduración o la formación de septum, dependiendo de qué fase se forma la imagen o analizada.
- El uso de 3 anillos cytokinetic reconstruida unidimensional (de 3.2.2), dividir la imagen en al menos 4 cuadrantes de tal manera que una cuarta parte del anillo aparece en cada cuadrante. Para ello utilice la herramienta de línea para dibujar líneas perpendiculares en la imagen. Después de cada línea click en la imagen> Superposición> Añadir la selección o el uso atajo Ctrl + B.
- Ir a Análisis> Configurar la medición. Seleccionar el valor de gris medio en el cuadro que se abre. Haga clic en Aceptar.
- El uso de las líneas dibujadas anteriormente como guías dibujar un rectángulo para definir cada cuadrante utilizando la herramienta de rectángulo.
- Para medir la intensidad media de cada cuadrante, haga clicen Análisis> Medida o utilizar el atajo Ctrl + M.
- Registrar el valor de gris medio para los cuatro cuadrantes (MG-MG 1 4).
- Seleccionar un área pequeña en cada cuadrante fuera del anillo como selección de fondo.
- Medir el valor de gris medio de la selección de antecedentes para los cuatro cuadrantes (BG 1 -BG 4).
- li> En la sustracción del fondo para cada uso cuadrante de la siguiente formulación MG 1 -Promedio (BG 1: BG 4) = Intensidad de anillo en cada cuadrante (IRQ). En esta etapa hay 4 valores de IRQ, una para cada cuadrante.
- A continuación calcular el coeficiente de variación para cada anillo utilizando la siguiente formulación Desviación estándar (IRQ 1: IRQ 4) / media (IRQ 1: IRQ 4). Calcular la media Coeficiente de varianza para cada cepa y compara con las otras cepas.
NOTA: Un aumento estadísticamente significativo en coeficiente de variación en una cepa en comparación con los controles INDica desigual distribución de la proteína / entrega a lo largo del sitio de división en esa etapa de la citocinesis.
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Representative Results
Células de levadura de fisión que expresan el marcador anillo, RLC1-GFP (verde, Figura 2) y el husillo marcador de polo órgano SAD1-mCherry (rojo, Figura 2) se obtuvieron imágenes durante la citocinesis. El inicio de marcador cuerpo polo del huso (flecha blanca, las Figuras 2A, B) se considera como el tiempo 0. señal RLC1-GFP aparece en el momento -4 min con referencia al husillo separación cuerpo polo (flecha roja, las Figuras 2A, 2B). Señal RLC1-GFP forma un husillo min después de la separación de cuerpos polares anillo 10 continua (flecha abierta, las Figuras 2A, B) que marca el final del conjunto de anillo de actomiosina. El anillo de actomiosina (RLC1-GFP) comienza a disminuir en anchura 22 min después de la finalización de conjunto de anillo y 32 min después de la separación del husillo cuerpo polo (punta de flecha cerrada, las Figuras 2A, B). constricción de anillo termina 20 minutos después del inicio de la constricción, 42 min desde el inicio de la unidad de anillo y 52 minutos ya que la separación del cuerpo polo del huso (Asteris blancok, las Figuras 2A, B). Por último, la abscisión de células se produce 72 minutos después de la separación del cabezal cuerpo polar (cabeza de flecha roja, las Figuras 2A, B).
La localización del marcador anillo RLC1-Tomate y marcador de membrana tabique Bgs1-GFP se analizaron en el lugar de la división a lo largo de la citocinesis. Reconstrucción en 3D del anillo reveló que actomyosin anillo marcado con RLC1-Tomate acoplado antes de la contratación Bgs1-GFP (Figura 3, 10 min). Durante la fase de maduración del anillo Bgs1-GFP fue reclutado para el sitio de división y se superponía con el anillo de actomiosina como se muestra por RLC1-tomate (Figura 3, 30 min). Esto indica que Bgs1 se localiza en el anillo momento de la contratación. A medida que el anillo se contrae, Bgs1-GFP también se localiza en la membrana ingressing adyacente al anillo de constricción (Figura 3, 40 min). Al final de la constricción, la señal Bgs1-GFP es visible en la membrana Barri ingresseder (Figura 3, 50 min). Finalmente, después de la señal de constricción RLC1-tomate está ausente, mientras que Bgs1-GFP parece localizar a lo largo de la barrera de la membrana con un disco de apariencia como (Figura 3, 60 min). Así, estas observaciones indican que la enzima sintetizadora tabique Bgs1 se localiza en el anillo después del montaje y persiste después de la constricción de anillo en la barrera de la membrana como se ha informado antes del 17.
Se analizó la distribución de las proteínas a lo largo del anillo de actomiosina para determinar la eficiencia de los eventos cytokinetic (Figura 4). La distribución desigual o no homogénea de las proteínas a lo largo del anillo de actomiosina se ha asociado con la señalización alterada y conjunto de anillo cytokinetic ineficiente 26. Aquí mostramos dos anillos 3D reconstruida durante la fase de maduración, que expresan la proteína F-Bar Cdc15-GFP (Figura 4). La imagende la izquierda muestra una distribución uniforme de Cdc15-GFP a lo largo del anillo con un bajo coeficiente de varianza (0.098), mientras que la imagen de la derecha muestra la distribución desigual, con un alto coeficiente de varianza (0,226, Figura 4).
Figura 1: Preparación de Cultura del plato por un generador de imágenes. Esquemática que describe la inoculación de las células en una placa de cultivo con fondo de cristal superpone con la pista de los medios de comunicación. Ver protocolo para detalles (Sección 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 Momento de cytokinetic Eventos en S. pombe. (A) Montaje de una célula que expresa Spindle marcador de polo órgano SAD1-mCherry (panel izquierdo), proteína anillo RLC1-GFP (panel central) y de campo brillante (panel derecho) sometidos a la citocinesis se muestra en intervalos de 2 min. Las flechas blancas marcas en el cuerpo de separación (centrosoma) polo del huso a los 17 min, flecha roja marca el reclutamiento inicial de RLC1-GFP en el sitio de división, abierta marcas de flecha anillo de maduración a 27 min, punta de flecha marca el inicio de la constricción de anillo a los 47 min, entre asteriscos final de la constricción de anillo a los 69 min y punta de flecha roja marca la abscisión celular a los 97 min. (B) Cronología de los eventos cytokinetic con referencia a la mitosis como determinar de una formación corporal polo del huso y la separación. Las celdas eran imágenes a 25 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cell División del sitio durante las diferentes etapas de la citocinesis. reconstrucción 3D de actomyosin anillo Z-pilas durante las diferentes etapas de la citocinesis de la misma célula, conjunto de anillo (10 min después de polo del huso de separación del cuerpo), la maduración del anillo (30 minutos posterior a la separación del husillo polo órgano), constricción de anillo (polo posterior del husillo 40 min la separación del cuerpo), final de la constricción (50 min después de la separación de polos del huso cuerpo), barrera de tabique (60 min después de la separación de polos del huso cuerpo). RLC1-Tomate marca anillo mientras Bgs1-GFP marca la membrana plasmática que envuelve el tabique. Barra de escala = 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distribución de proteínas a lo largo del anillo. Imágenes de 3D reconstruidas actomyosin anillo de tipo salvaje cells que expresan GFP-Cdc15 dividen en cuatro cuadrantes. El coeficiente de varianza de cada anillo se indica. Barra de escala = 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí hemos descrito un protocolo para estudiar eventos cytokinetic en la levadura de fisión de manera temporal. El protocolo descrito aquí proporciona una resolución temporal de diferentes eventos cytokinetic con referencia a la otra; momento de la contratación o la pérdida de proteínas con referencia a la fase cytokinetic; estructura del anillo a lo largo de las diferentes fases de la citocinesis; y la progresión de la citocinesis con referencia a la mitosis. Con este protocolo, es posible definir con precisión la fase cytokinetic que puede ser modificado en diferentes mutantes, proporcionando de este modo una comprensión más detallada de las proteínas implicadas en diferentes fases cytokinetic. Además, la capacidad para distinguir diferentes fases temporalmente cytokinetic permitirá el análisis de los mecanismos moleculares que conducen a la organización de diferentes fases cytokinetic. La resolución temporal de los diferentes eventos cytokinetic también permite el análisis de la estructura de anillo cytokinetic y proteínas de distribucióna través de los diferentes eventos. La localización espacio-temporal de diferentes proteínas se pueden comparar y analizar con este enfoque. Con el uso de fluoróforos adecuados, múltiples proteínas pueden ser estudiadas y comparadas entre sí. Además aquí también hemos descrito cómo se puede analizar la distribución de las proteínas a lo largo del anillo para determinar la organización de proteínas o la entrega en el lugar de la división. Si bien el protocolo descrito aquí se aplica a la citocinesis la levadura de fisión, este enfoque también se puede utilizar para estudiar la citocinesis en otras levaduras y hongos con los cambios apropiados a las condiciones de crecimiento y de formación de imágenes.
Este protocolo consiste en las células vivas de imagen cuando se dividen. Las células imágenes utilizando este protocolo necesitan para crecer en condiciones óptimas para evitar los efectos pleótropos. Se debe tener cuidado de no desplazar las células en el campo de visión, como las células excesivas pueden conducir a la pérdida de nutrientes rápida. Además fluoróforos de imagen en las células conduce a la toxicidad debida a la libreradicales liberados como resultado de la foto-blanqueo. Esto puede ser minimizado con la adición de un compuesto de extinción de radicales libres tal como ácido ascórbico. La adición de ácido ascórbico permite obtener imágenes prolongada de las células bajo el microscopio. Durante la adquisición de imagen, todo el eje Z de la célula necesita ser fotografiado para garantizar la captura de los cuerpos polares del huso. La ausencia de una señal adecuada para los cuerpos polares del huso no permitirá que la resolución temporal adecuada de la citocinesis. En particular, se debe tener cuidado a la imagen con precisión la separación inicial de los marcadores del cuerpo polo del huso ya que este es el tiempo 0. captura adecuada de las células a lo largo del eje Z también es crítica para el buen 3 reconstrucciones tridimensionales de los anillos y septa.
Para la imagen de las secciones transversales de los anillos y los tabiques, el protocolo descrito aquí se pueden modificar con un pozo microfabricado que permite que las células de levadura de fisión en forma de barra para ser lugar verticalmente para formación de imágenes a lo largo del eje largo de la cell como se ha informado aquí 27. Mientras que este protocolo puede capturar de manera muy precisa el reclutamiento de proteínas y la localización en el tiempo en el lugar de la división celular de la resolución espacial de las imágenes es limitada debido a la resolución del microscopio utilizado. Super-resolución de la microscopía puede ayudar a mejorar la resolución espacial, pero puede afectar a la resolución temporal. Los recientes avances en microscopía, como la microscopía de celosía de lámina de luz pueden ayudar a mejorar la resolución espacial sin comprometer la resolución temporal 28. Además de microscopía de luz, la citocinesis en la levadura de fisión también puede ser estudiada en el tiempo utilizando espectroscopia Raman 29, 30.
El uso de este enfoque que hemos informado de que la pequeña GTPasa Cdc42 se somete a un patrón de activación único espacio-temporal durante la citocinesis 21. Este enfoque nos permite estudiar la organización de diferentes eventos cytokinetics con el tiempo y describir los detalles moleculares de estos eventos. Los informes han sugerido que la presencia de un anillo de actomiosina montado por sí sola no es suficiente para surcado membrana eficiente y citocinesis 11, 21, 31. El protocolo descrito aquí puede utilizarse para investigar los eventos moleculares que conducen a la citocinesis adecuada después del montaje del anillo de actomiosina. Además, la integridad del anillo de actomiosina y su efecto en surcos de la membrana y la ingresión septum puede ser examinado. Esto proporcionará una comprensión más profunda de los diferentes eventos moleculares que conducen a la separación juntos con éxito.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
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