Introduction
Translationel kontrol fremstår som en lige så vigtig skridt til transkriptionel regulering i genekspression, især i perioder med cellulært stress 1. En omdrejningspunktet for oversættelse kontrol er det hastighedsbegrænsende trin i indledningen, hvor de første skridt i proteinsyntese involverer binding af den eukaryote indledning faktor 4E (eIF4E) til 7-methylguanosin (m 7 GTP) 5 'cap af mRNA'er 2 . eIF4E er en del af en trimert kompleks opkaldt eIF4F der omfatter eIF4A, en RNA helicase, og eIF4G, et stillads protein kræves for rekruttering af andre oversættelse faktorer og 40S ribosom 3. Under normale fysiologiske betingelser, er det store flertal af mRNA oversættes via en cap-afhængig mekanisme, men under perioder med cellulære stress ca. 10% af de menneskelige mRNA indeholder 5 'UTR'er der kan tillade cap-uafhængig oversættelse intiation 1,4. Cap-afhængige oversættelse har været historisk synonymskellige med eIF4F dog stress-specifikke variationer af eIF4F er blevet et trending emne 5-8.
Forskellige cellulære belastninger forårsager eIF4E aktivitet, der skal undertrykkes via pattedyr mål for rapamycin kompleks en (mTORC1). Denne kinase bliver forringet under stress, hvilket resulterer i forøget aktivitet af et af sine mål, den 4E-bindende protein (4E-BP). Ikke-phosphoryleret 4E-BP binder sig til eIF4E og blokerer dens evne til at interagere med eIF4G forårsager undertrykkelse af cap-afhængige oversættelse 9,10. Interessant, en homolog af eIF4E opkaldt eIF4E2 (eller 4EHP) har en meget lavere affinitet for 4E-BP 11, måske gør det muligt at omgå stress-medieret repression. Faktisk oprindeligt karakteriseret som en repressor af oversættelse på grund af sin mangel på interaktion med eIF4G 12, eIF4E2 indleder oversættelse af hundredvis af mRNA, der indeholder RNA hypoxi respons elementer i deres 3'UTR under hypoxisk stress 6,13. Denne aktivering iS opnåede gennem interaktioner med eIF4G3, RNA-bindende protein-motiv 4, og hypoxi inducerbar faktor (HIF) 2α at udgøre en hypoxisk eIF4F kompleks eller eIF4F H 6,13. Som en repressor under normale forhold, eIF4E2 binder med GIGYF2 og ZNF598 14. Disse komplekser blev delvist identificeret ved agarose-bundne m 7 GTP affinitetsresiner. Denne klassiske metode 15 er standard inden for oversættelse og er de bedste og mest anvendte teknik til at isolere cap-bindende komplekser i pull ned og in vitro bindingsassays 16-19. Da hætten-afhængige oversættelse maskiner er på vej som fleksibel og tilpasningsdygtig med indbyrdes skiftende dele 6-8,13, denne metode er et stærkt værktøj til hurtigt at identificere nye cap-bindende proteiner involveret i stress respons. Endvidere kunne variationer i eIF4F har brede implikationer, da flere eukaryote modelsystemer synes at bruge en eIF4E2 homolog til stressreaktioner sådannesom A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, og C. elegans 23.
Meget tyder på, at variationer i eIF4F ikke kan begrænses til stress betingelser, men være involveret i normal fysiologi 24. Iltforsyning til vævene (ved kapillære ender) eller inden væv (målt via mikroelektroder) varierer fra 2-6% i hjernen 25, 3-12% i lungerne 26, 3,5-6% i tarmen 27, 4% i leveren 28, 7-12% i nyrerne 29, 4% i muskel 30, og 6-7% i knoglemarven 31. Celler og mitokondrier indeholder mindre end 1,3% oxygen 32. Disse værdier er meget tættere på hypoxi end den omgivende luft, hvor celler dyrkes rutinemæssigt. Dette antyder, at hvad der tidligere blev opfattet som hypoxi-specifikke cellulære processer kan være relevant i en fysiologisk indstilling. Interessant eIF4F og eIF4F H 24. Lav ilt driver også korrekt fosterudvikling 33 og celler generelt har højere spredning satser, længere livslængde, mindre DNA skader og færre generelle stressreaktioner i physioxia 34. Derfor eIF4F H sandsynligvis en nøglefaktor i ekspression af udvalgte gener under fysiologiske betingelser.
Her giver vi en protokol til kultur celler i faste fysiologiske iltforhold eller i en dynamisk svingende område, der er sandsynligvis mere repræsentativ for væv mikromiljøer. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at cellerne lyseres i hypoxi arbejdsstation. Det er ikke ofte klart, hvordan overgangen fra hypoksisk cellekultur til cellelyse udføres i andre protokoller. Celler ofte først fjernes fra en lille hypoxi inkubator væreforgrunden lysis, men denne eksponering til oxygen kan påvirke biokemiske veje som det cellulære respons på oxygen er hurtig (en eller to min) 35. Visse cap-bindende proteiner kræver interaktioner med en anden base eller kan hydrolysere m 7 GTP, kan derfor glip af nogle cap interaktionskandidater i rensningsprocessen. Agarose-forbundet til enzymatisk resistente cap-analoger kan erstattes i denne protokol. Udforskning af aktivitet og sammensætningen af eIF4F H og andre variationer af eIF4F gennem den her beskrevne metode vil kaste lys over de indviklede genekspression machineries at celler udnytter under fysiologiske betingelser eller stressreaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse til Cell Culture
- Køb kommercielt tilgængelige lagre af humane celler.
BEMÆRK: Denne protokol udnytter HCT116 kolorektal carcinom og primære humane renale proximale tubulære epitelceller (HRPTEC). - Gør 500 ml medium til dyrkning af HCT116: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) / High glucose medium suppleret med 7,5% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S).
- Gør 500 ml medium til dyrkning af HRPTEC: epitelcelle medium suppleret med 5% FBS, 1% epitelcellevækst supplement, og 1% P / S.
- Forbered 500 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. Indstil pH til 7,4, og der steriliseres ved autoklavering i 40 minutter ved 121 ° C.
2. Indledning af Cell Dyrkning
- aspireres forsigtigt mediet fra en 80-90% sammenflydende skålen uden at forstyrre than celler.
- Alikvote 3-5 ml 1x PBS pr dyrkningsskål, hver kolbe forsigtigt rokke at overtrække overfladearealet af skålen, og omhyggeligt aspirér 1x PBS. Gentag for en anden 1x PBS vask.
- Alikvot 3 ml 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i hver dyrkningsskål og vip forsigtigt til jævnt overtrække cellerne med trypsin-EDTA. Der inkuberes ved 37 ° C i 2-3 min.
- Overfør løsnede celler i et 15 ml centrifugerør og centrifugeres ved 4000 xg i 90 sek.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml komplet DMEM.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Beregn hvor mange ikke-pyrogen og polystyren 100 mm cellekultur retter er forpligtet til at opnå en indledende seeding tæthed på ca. 2,500-5,000 celler pr cm2.
- Pre-varm komplet celledyrkningsmedium fremstillet i trin 1.2 eller 1.3 i et 37 ° C vandbad i 30-45 min.
- Dekontaminér mediet flaske og celle hætteglas med 70% ethanol. Fra dette punkt fremad alleoperationer bør udføres aseptisk.
- Portion 6 ml komplet DMEM i så mange 100 mm cellekultur retter kræves for at bruge hele mængden af frosne celler i seeding tæthed nævnt i trin 2.6.
- Overfør volumenet af cellesuspensionen beregnet i trin 2.6 til hver af de 100 mm dyrkningsskåle. Rock hver plade manuelt at fordele cellerne over overfladen af pladen.
- Placer den podede 100 mm cellekultur skål i inkubatoren ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Tillad celler til at inkuberes mindst 24 timer, før de næste trin.
3. subkultivering
- Vis hver celle dyrkningsskål under et mikroskop for at bestemme procentdelen af cellekonfluens (% celler, der dækker det område af skålen). Retur celler til inkubatoren og præ-varm komplet medium og 1 x PBS. Fortsæt til næste trin, hvis cellerne er 80-100% sammenflydende.
- aspireres forsigtigt det brugte medium uden at forstyrreceller i hver kultur skål.
- Alikvote 3-5 ml 1x PBS pr dyrkningsskål, hver kolbe forsigtigt rokke at overtrække overfladearealet af skålen, og omhyggeligt aspirér 1x PBS. Gentag for en anden 1x PBS vask.
- Alikvot 3 ml 0,05% trypsin-EDTA i hvert dyrkningsskål og vip forsigtigt til jævnt overtrække cellerne med trypsin-EDTA. Der inkuberes ved 37 ° C i 2-3 min.
- Under denne inkubering portion 10 ml komplet medium i så mange dyrkningsskåle skal indhente celledensitet på 2,500-5,000 celler pr cm2.
- Når cellerne har løsrevet fra pladen, hurtigt tilsættes 3 ml 1x defineret trypsininhibitor og forsigtigt hvirvel skålen i 1 min for at sikre, at alle de trypsin-EDTA er blevet neutraliseret.
- Overfør løsnede celler i en steril 15 ml centrifugerør og afsat. Tilsæt 3 ml 1x PBS til fadet for at samle eventuelle resterende celler, og overføre denne til den samme 15 ml centrifugerør.
- Pelletere cellerne ved centrifugering 150 xgi 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml komplet medium.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og frø 150 mm dyrkningsskåle indeholdende 15 ml komplet medium til opnåelse af en celledensitet på 2,500-5,000 celler pr cm2. Brug to 150 mm for hver hætte-bindingsassay.
BEMÆRK: Oxygen diffusion til celler gennem flydende medier afhænger af volumenet 36. Det anbefales at holde mængden af medierne konsistente mellem forsøgene om der anvendes klæbende celler eller celler i suspension. Medier kan præ-condition (inkuberes i arbejdsstationen i 24 timer som omtalt i Discussion) for at undgå disse variabiliteter i diffusion. - Placer podede-dyrkningsskåle i inkubatoren ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. Tillad celler til at inkuberes mindst 24 timer før du går videre til de næste trin.
4. Physioxic Eksponering
- Vis cellerne under mikroskop. For best resultater, at cellerne er 70-80% sammenflydende for en 24 timers udsættelse, 50-60% sammenflydende for en 48 timers udsættelse, og 40-50% sammenflydende for en 72 timers udsættelse.
- Placer cellerne i en hypoxi arbejdsstation for den ønskede (24, 48, eller 72 timer afhængigt af forsøget).
- Indstil arbejdsstation til den relevante physioxia.
BEMÆRK: For eksempel ville en 3% O2 indstilling ledsages af 5% CO2 og 92% N2.
BEMÆRK: Hvis ilt udsving inden for et dynamisk område ønskes over en specifik tidsplan, program tidsplanen i instrumentet eller justere indstillingerne ilt på de ønskede intervaller manuelt. - Indstille fugtigheden til 60%. Arbejdsstationen atmosfæren er meget tør alligevel, og medierne vil mærkbart fordampe under lange eksperimenter (> 48 t). Hold en media reserve i en cellekultur kolbe i arbejdsstationen (så, at medierne er i ligevægt med arbejdsstationen atmosfære) for at genopbygge medierne i cellekultur dishan er.
BEMÆRK: Enhver løsning, der vil interagere med cellerne før lysis (såsom PBS og trypsin-EDTA) skal forkonditioneres i 24 timer før brug i hypoxi arbejdsstation, så den opløste ilt ligevægt med atmosfærens ilt 36. - Holde celler i arbejdsstationen indtil lysis.
5. Forberedelse Buffere til Cap-bindende Assay
- Forbered 1x Tris-bufret saltvand (TBS).
- I 800 ml dH 2 O, opløses 8,76 g NaCl og 6,05 g Tris Base.
- Bring opløsningen til en endelig pH på 7,4 ved anvendelse af 1 M HCI.
- Bring det endelige volumen til 1 liter ved hjælp dH 2 O.
- Forbered ikke-denaturerende lysisbuffer. Forbered lysepuffer dagen af hætten-bindingsassay. Lav ekstra lysis buffer til at vaske de tomme agaroseperler og γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-bundne perler (trin 7.9 og 7.13).
- I 7 ml dH2O, tilsæt 160 ul 5 M Nacl, 160 pi 1 M Tris-HCI pH 7,4, 40 pi 200 mM NaF, 40 pi 1 M MgCl2, og 40 pi 1 mM natriumorthovanadat.
- Tilsæt 40 pi Igepal til 7 ml opløsning. Skær spidsen af pipetten for at hjælpe hente Igepal da det er ekstremt viskos.
- Bland ved pipettering op og ned, eller vortex, 7 ml opløsning, indtil alt Igepal er blevet opløst.
- Hæv endelige volumen af opløsningen til 8 ml og holde på is.
- Forbered 4x natriumdodecylsulfat (SDS) PAGE prøvebuffer.
- I et bægerglas, kombinere 16 ml 1 M Tris-HCI pH 6,8, 12,64 ml glycerol og 8 ml dithiothreitol (DTT).
- Tilføj 3,2 g SDS og 0,16 g bromphenolblåt. Tillad pulver til fuldt ud at opløse ved blanding med en magnetisk omrører.
- Portion i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
6. Cell Lysis
- Forbered ikke-denatureret lysisbuffer og holde på is den dag, the cap-bindingsassay.
- Pre-varm 1x PBS og trypsin i et 37 ° C vandbad i 30 min.
- Alikvote 980 pi lysepuffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør for hver hætte-bindingsassay udføres.
- Tilsæt 10 pi 4- (2-aminoethyl) benzensulfonylfluorid hydrochlorid og 10 pi 100x proteaseinhibitorcocktail til 980 pi lysisbuffer. Hold på is.
- Kassér medier fra hver 150 mm skål i en affaldsbeholder i hypoxi arbejdsstation.
- Vask cellerne med 3-4 ml varmt 1x PBS og kassér al væsken.
- Der tilsættes 1 ml varm 0,05% trypsin-EDTA til hver skål og lad det sidde i 2 min, eller indtil celler er ikke længere klæber til pladen.
- Ved hjælp af en pipette, overføres cellerne i en plade til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag om nødvendigt, således at hver plade af celler overføres til et separat 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifuger 1,5 ml mikrocentrifugerør ved 6.000 xg i 90 sek to pelletere cellerne.
- Aspirer trypsin ved anvendelse af en pipette uden at forstyrre pelleten. Hvis pelleten forstyrres, re-centrifugeres 1,5 ml mikrocentrifugerør ved 6.000 xg i 90 sek.
- Vask cellerne med varm 1x PBS ved forsigtigt at pipettere 200 pi PBS i røret lige over pelleten. Re-centrifuge hvis pelleten forstyrres.
- Aspirer PBS uden at forstyrre pelleten.
- Pipette 500 pi fra 1 ml fremstillet lysepuffer opløsningen på den første cellulære pellet. Pellet resuspenderes fuldstændigt ved pipettering op og ned.
- Kombiner de resuspenderede celler med den anden cellepellet og resuspender anden pellet ved pipettering op og ned. Gentag denne proces, indtil alle pellets er blevet kombineret og resuspenderes for hver prøve.
- Kombiner lysatet med de resterende 500 pi lysepuffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fjern prøverne fra hypoxi arbejdsstation.
BEMÆRK: Efter tilføjelse lysisbuffer, enll efterfølgende trin skal udføres i den omgivende luft som hypoxi arbejdsstation er indstillet til 37 ° C, og de følgende trin skal udføres kold (4 ° C eller på is). - Lyse cellerne under anvendelse forsigtig omrøring ved rotation prøverne ved 4 ° C i 1,5-2 timer.
- Centrifuger lyserede celler ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C til fjernelse cellerester.
- Overfør lysatet til en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør og kassér pelleten.
- Reservere en del (5-10%) af supernatanten, der skal anvendes som et helcellelysat input kontrol for fremtidig western blot-analyse.
7. Cap-bindingsassay
- For hver prøve overføre 50 pi af råemnet agaroseperle kontrol opslæmning og 50 pi af γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-bundet perle opslæmning til at adskille 1,5 ml mikrocentrifugerør. Bruge en saks til at fjerne spidsen af pipetten for at lette indsamlingen af perlen opslæmning.
- Pelletere perler by centrifugering af opslæmningen ved 500 x g i 30 sek.
- Fjern supernatanten omhyggeligt og resuspender perlerne i 500 pi TBS.
- Gentag trin 7.2 og 7.3. Pelletere perlerne ved 500 x g i 30 sek og fjern supernatanten.
- Overfør supernatanten indeholdende lysatet fra trin 6.19 til 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende de tomme agaroseperler.
BEMÆRK: De datoer agaroseperler fungere som en præ-clearing for at fjerne proteiner fra lysatet, at ikke-specifikt interagerer med perlen. - Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C under forsigtig omrøring.
- Pelletere datoer agaroseperler ved centrifugering ved 500 x g i 30 sek.
- Overfør lysatet til 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-bundne kugler.
- Vask de datoer agaroseperler ved at resuspendere perlerne i 500 pi lysepuffer, pelletering af perlerne ved centrifugering ved 500 x g i 30 sek, og kasserer det supernatant. Gentag dette fire gange for i alt fem gange vask.
- Genopslæmme datoer agaroseperler i 1x SDS-PAGE-prøvebuffer, og koges perlerne i 90 sekunder ved 95 ° C. Opbevares ved -20 ° C til fremtidig western blot-analyse for at observere, om proteinet af interesse binder ikke-specifikt til perlen.
- Inkubere lysatet med γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-koblede perler med forsigtig omrøring i 1 time ved 4 ° C for at indfange cap-bindende proteiner.
- Pelletere γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-linked perler ved centrifugering ved 500 x g i 30 sek. Supernatanten kasseres.
- Vask γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-linked perler ved at gentage trin 7.9.
- Resuspendere perlerne i 600 pi lysisbuffer.
- Tilføj GTP til en slutkoncentration på 1 mM.
- Inkubér γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-linked beads + 1 mM GTP med forsigtig omrøring i 1 time ved 4 ° C. Bemærk: Dennevil adskille proteiner, ikke-specifikt interagerer med m 7 GTP (dvs. også interagere med ikke-methyleret GTP).
- Pelletere γ-aminophenyl-m 7 GTP agarose C10-linked perler ved centrifugering ved 500 x g i 30 sek.
- Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes 200 pi 4x SDS-PAGE-prøvebuffer (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromphenolblåt og 10% glycerol). Opbevar GTP kontrolprøven ved -20 ° C til fremtidig western blot-analyse 37. Vask perlerne ved at gentage trin 7.9.
- Resuspendere perlerne i 1x SDS-PAGE-prøvebuffer (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromphenolblåt og 10% glycerol), og kog ved 95 ° C i 90 sek. Opbevar m 7 GTP-bundne fraktion ved -20 ° C til fremtidig western blot-analyse 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse af Cap-bindende evne i Reaktion på Oxygen af eIF4E og eIF4E2 i en m 7 GTP Affinity Column
Figur 1 og 2 repræsenterer western blots af typiske m 7 GTP affinitetsoprensning af to store cap-bindende proteiner som respons på oxygen udsving i to humane cellelinier: primære humane renale proximale tubulære epitelceller (HRPTEC) i F igur 1 og colorectalt carcinom ( HCT116) i figur 2. Celler opretholdes ved den angivne oxygentilgængelighed i 24 timer for at sikre, at det opløste oxygen i de flydende medier har ækvilibreret med luften i hypoxi arbejdsstation. Input bane (IN) udgør 10% af den helcellelysat før m 7 GTP-bundne agaroseperler tilsættes til at indfange cap-bindende proteiner. Denne indgang vognbane bruges som en baseline at måle berigelseaf et målprotein i m 7 GTP pulldown. GTP lane er eluatet fra de M 7 GTP perler, der var eluerer med 1 mM GTP. Dette trin tillader til påvisning af proteiner, som også genkender ikke-methyleret GTP. CAP-bindende proteiner eIF4E og eIF4E2 genkende m 7 GTP specifikt, men deres homolog eIF4E3 (ikke vist her) også binder til ikke-methylerede GTP. Evnen hos eIF4E og eIF4E2 at binde 5'mRNA cap struktur (m 7 GTP) kan måles ved at sammenligne intensiteten af deres bands i m 7 GTP kolonne forhold til intensiteten i input lane (total tilgængelig pulje).
Denne kvantificering kan udføres ved at måle pixel intensitet proteinbåndene tre biologiske gentagelser med et billede analyse software såsom ImageJ. Resultater udtrykkes som relative hjælp af densitetsenheder (RDU) ± standardfejl på middelværdien. Rå værdier før normaliseringfra både eksperimentelle prøver og kontrolprøver blev sammenlignet ved uparret tohalet t-test. P <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dette repræsentative eksperiment viser, at de to cellelinier har forskellige serier af ilt til deres eIF4E og eIF4E2 brug. Figur 1 viser, at kun eIF4E i HRPTEC binder kraftigt til m 7 GTP på 8% O 2 (figur 1A), at både eIF4E og eIF4E2 signifikant er forbundet med m 7 GTP 3-5% O2 (figur 1B - C), og at kun eIF4E2 binder kraftigt til m 7 GTP ved 1% O 2 (figur 1D). I figur 2 i HCT116 celler, ilt-afhængige brugen af disse cap-bindende proteiner er anderledes: Kun eIF4E binder væsentligt til m 7 GTP ved 12% O 2 (figur 2A), begge cap-bindende proteiner binder væsentligt til m 7 GTP i 5-8% O2 interval(Figur 2B - C), og kun eIF4E2 binder væsentligt til m 7 GTP ved 3% O2 (figur 2D). Fraværet af eluering fra m 7 GTP søjle med GTP viser, at eIF4E og eIF4E2 er specifikke for m 7 GTP og ikke genkender ikke-methyleret GTP. De søjlediagrammer repræsenterer kvantificering af tre biologiske gentagelser ved hjælp ImageJ. Vores resultater viser, at to store cap-bindende proteiner, eIF4E og eIF4E2, er forskellige i deres evne til at binde mRNA m 7 GTP cap struktur i en oxygen-afhængig måde.
Baseret på tidligere litteratur, at disse to proteiner indlede oversættelse af unikke klasser af mRNA, kan dette skift i cap-bindende aktivitet resultere i forskellige proteomer genereret at tilpasse sig ændringer i ilt tilgængelighed. Denne teknik kan anvendes til at karakterisere hidtil ukendte translationsinitierings- faktorer, der interagerer med 5'mRNA cap(eller med cap-bindende proteiner) gennem en målrettet western blot tilgang eller en bred tilgang såsom massespektrometri analyse af en m 7 GTP eluatet.
Figur 1: eIF4E og eIF4E2 aktiviteter overlapper under physioxia i HRPTEC 3-5% O 2. Capture assays under anvendelse m 7 GTP perler i human renal proximal tubulær epitelcelle (HRPTEC) lysater udsat for (A) 8%, (B) 5%, (C) 3% eller (D) 1% O2 i 24 timer. GTP, at GTP vask måle specificitet for m 7 GTP; m 7 GTP, proteiner bundet til m 7 GTP perler efter GTP vask. Repræsentative Western blots vises og data fra mindst tre uafhængige forsøg blev kvantificeret ved ImageJ og udtrykt som relative densitet enheder (RDU) i forhold til 10% indgang (IN) af helcellelysat. * P <0,05 (uparret tosidet t-test) blev betragtet som en væsentlig ændring, når man sammenligner berigelsen af eIF4E eller eIF4E2 i cap-bundne fraktion (m 7 GTP) til IN. Data, middel ± standardfejl på middelværdien (SEM) af tre uafhængige forsøg. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. og Uniacke, J. Humane celler dyrket under fysiologiske ilt udnytte to cap proteiner at rekruttere forskellige mRNA til oversættelse. 2016; 291 (20): 10.772-82 24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. eIF4E og eIF4E2 aktiviteter overlapper under physioxia i HCT116 5-8% O2. Capture assays under anvendelse m 7 GTP perler i HCT116 human colorectal carcinoma lysater udsat for (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% eller (D) 3% O2 i 24 timer. GTP, at GTP vask måle specificitet for m 7 GTP; m 7 GTP, proteiner bundet til m 7 GTP perler efter GTP vask. Repræsentative Western blots er vist og data fra mindst tre uafhængige forsøg blev kvantificeret ved ImageJ og udtrykt som relative densitetsenheder (RDU) i forhold til 10% indgang (IN) af helcellelysat. * P <0,05 (uparret tosidet t-test) blev betragtet som en væsentlig ændring, når man sammenligner berigelsen af eIF4E eller eIF4E2 i cap-bundne fraktion (m 7 GTP) til IN. Data, middel ± standardfejl på middelværdien (SEM) af tre uafhængige forsøg. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. og Uniacke, J. Humane celler dyrket under fysiologiske ilt udnytte to cap proteiner at rekruttere forskellige mRNA til oversættelse. 2016; 291 (20): 10.772-82 24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen af cap-bindende proteiner i humane celler eksponeret for fysiologiske iltindhold kan åbne mulighed for identifikation af nye oxygen-regulerede translationsinitierings- faktorer. Affiniteten af disse faktorer for 5'-cap af mRNA eller andre cap-associerede proteiner kan måles ved styrken af deres tilknytning til m 7 GTP-bundet agaroseperler. En advarsel ved denne teknik er, at den måler cap-bindende potentiale af proteiner efter lyse, men den udføres under ikke-denaturerende betingelser, som opretholder protein-protein-interaktioner og posttranslationelle modifikationer (PTMS). Adskillige protein-protein interaktioner medierer bindingen af eIF4E familien til 5'hætten. Den 4E-BP binder og undertrykker eIF4E ved at blokere dens interaktion med eIF4G og forhindre rekruttering af 43S før initiering komplekse 38. Den eIF4E / 4E-BP-komplekset forbliver bundet til 5 'mRNA cap, blokerer enhver indvielse fra afskrift, og kananvendes som en markør for eIF4E inhibering i m 7 GTP affinitetssøjler. Omvendt kan interaktionen af eIF4E med eIF4G på m 7 GTP kolonner være en markør for aktiv translationsinitiering. PTMS er en anden metode til at regulere aktiviteten af translationsinitierings- faktorer. For eksempel kan phosphorylering af eIF4E ved Mnk1 øge sin affinitet for 5 'mRNA cap 39. Proteinet modifikator kodes af Interferon stimuleret Gene 15 (ISG15) er en PTM der øger cap-bindende aktivitet af eIF4E2 som respons på interferon induktion via patogeninfektion 40. Den ISG15 genet indeholder en hypoxi responselement i dets promotor antyder, at dette system kan regulere eIF4E2 i lavt iltindhold. Meget lidt er kendt om, hvordan PTMS kan ændre aktiviteten af cap-bindende proteiner under fysiologisk relevante iltforhold. Denne teknik efterfulgt af massespektrometri analyse kunne afsløre nye ilt-reguleret og fysiologisk relevante PTMS thpå medierer aktiviteten af translationsinitierings- faktorer.
En alternativ metode til at indfange med en m 7 GTP cap-analog ville være at immunpræcipitere en kendt cap-bindende protein, såsom eIF4E eller eIF4G og udfører massespektrometri til at finde associerede proteiner. En begrænsning af denne strategi er, at cap-bindende proteiner ofte har alternative cellulære roller som inden stress granulat 41 eller i cap-uafhængig oversættelse 1,4. Derfor udnytter m 7 GTP cap-analoger er den bedste, mest pålidelige metode til at isolere cap-bindende proteiner, især når de efterforsker nye cap-associerede proteiner. En begrænsning ved anvendelse af en m 7 GTP cap analogen er, at nogle cap-bindende proteiner, såsom fjerneren decapping enzym DCPS ikke kun interagere med m 7 GTP mRNA cap, men også kræve anden base til binding 42. Endvidere decapping enzymer generelt, såsom Dcp1 / Dcp2 komplekset, kan hydrolyze m 7 GTP og effektivt at reducere harpiks kapacitet. Derfor kan nogle cap proteiner tabt i denne analyse. For at omgå disse forbehold, kan enzymatisk resistente mRNA cap analoger udnyttes. To ikke-hydrolyserbare cap analoger, mononukleotid m 7 GpCH2pp eller dinukleotid m 7 GpCH2ppA har vist sig at indfange DCPS, Dcp1, og Dcp2 43. Disse mRNA cap analoger er ikke kommercielt tilgængelige, men skal syntetiseres kemisk de novo. En anden begrænsning af denne protokol er, at kun cap-bindende proteiner eller proteiner interagerer med cap-bindende proteiner via "snylter" vil blive taget til fange. Mens cap-afhængige translationsinitiering er den vigtigste form for indvielse, cap-uafhængige mekanismer er særligt udbredt i betingelserne for cellulært stress 1. Men i forbindelse med denne teknik og nye tendenser inden for translationsinitiering 6-8,24, identificere nye stress-inducerede faktorer at PArticipate i cap-afhængige indvielse er et lovende forskningsområde.
En anden faktor at overveje ved denne protokol er oxygen i medierne. Dyrkning af celler i et flydende medium tilvejebringer en barriere mellem cellerne og atmosfæren. Det er blevet vist, at flydende medier kan tage op til 24 timer at ækvilibrere med atmosfærens gassammensætning 36. Derfor skal celler dyrkes i 24 timer i den ønskede ilt tilgængelighed inden lyse, eller medierne kan forkonditioneres hvis der kræves kortere inkubationer. Forkonditionering involverer opretholdelse mediet i hypoxi arbejdsstation i mindst 24 timer i en steril dyrkningskolbe der tillader gasudveksling. Enhver iltet indført løsningen til cellerne i hypoxi arbejdsstation kunne hurtigt ændre cellulære signalveje såsom hætten-afhængige translationsinitiering, der bliver undersøgt i denne protokol. På grund af følsomheden af de oxygenholdige sensing veje i celler, enhver løsning, der vilinteragerer med celler inden lyse såsom PBS og trypsin-EDTA skal også være konditioneret i mindst 24 timer. Lyse- og efter lyse vaskebuffere skal anvendes kold og derfor ikke forkonditioneres i 37 ° C hypoxi arbejdsstation. Mens nogle oxygen-afhængige ændringer proteiner kunne være aktiv efter lyse, er de kolde buffere kræves for at minimere enzymatiske aktiviteter og "shuffling" af protein-protein- eller protein-RNA-komplekser, der kan føre til artefakter. En ændring i denne protokol for at øge stringens kan være at pre-tilstand lyse- og efter lyse vask buffere i 24 timer og derefter inkuberes dem på is i arbejdsstationen før brug. Medier og buffere bør ikke opbevares i hypoxi arbejdsstation i mere end tre dage, fordi disse løsninger vil koncentrere grund af vand fordampning. Ved længere sigt undersøgelser (> 3 dage), den oprindelige mængde celler seedede skal nøje overvejes. Som cellerne deler og overfladearealet af skålen bliver overfyldt,andre påvirkninger såsom medier forsuring kan påvirke aktiviteten af cap-bindende proteiner. På den sidste dag af forsøget, bør celler har en konfluens på 80-90%.
Der er fire vigtige skridt i denne protokol: opretholdelse cellerne i hypoxi arbejdsstation indtil lyse, mængden af celler, der anvendes, vask af perler, og den ikke-methylerede GTP kontrol. 1) Der er flere metoder til at fastholde cellerne i lav ilt. De fleste af disse omfatter små kamre, der kan holde kun cellekultur retter, men enhver manipulation eller cellelyse skal udføres uden kamrene i luften. Komponenter af den oxygenholdige sensing maskiner såsom hypoxi inducerbare faktorer aktiveres eller inaktiveres i løbet af en eller to minutter 35. Derfor, som tidligere nævnt, lysere cellerne i en hypoxi arbejdsstation er kritisk for at sikre aktiviteten af de cap-bindende proteiner er associeret med den respektive ilt tilgængelighed. 2) Antallet af cellerforeslået i denne protokol (to 150 mm skåle) er tilstrækkelig for en stærk m 7 GTP interaktionskandidater såsom eIF4E familie eller medlemmer af eIF4F komplekset (eIF4A og eIF4G). Flere celler, mindst fem 150 mm skåle, kunne være forpligtet til at detektere proteiner med forbigående interaktioner eller at kun forbinder med m 7 GTP mRNA cap gennem eIF4F. 3) vask af perlerne efter inkubere dem med cellelysatet kan udføres i et stringent og mindre strenge måde. Protokollen præsenteres her giver en stringent mulighed, hvor lysis buffer benyttes til at vaske perlerne fem gange. Hvis proteiner med svagere interaktioner til cap-bindende proteiner er af interesse, kan man udføre mindre vask og udnytte Tris-saltvand i stedet lysisbuffer. 4) Det er vigtigt at pre-rydde cellelysatet med ukonjugeret agarose for at fjerne proteiner, der ikke-specifikt interagerer med vulsten, kan nogle cap-bindende proteiner ikke mellem den sande mRNA cap struktur, methyleret GTP (m7 GTP), og ikke-methyleret GTP. Et sådant protein er eIF4E homologen eIF4E3 44. Eluering perlerne med GTP vil løsne helst protein, der også genkender ikke-methyleret GTP, som kunne være af interesse. Den biologiske relevans af proteiner, som genkender både m 7 GTP og GTP der endnu ikke er fuldt belyst. Dette understreges af de få publikationer involverer eIF4E3 (som er en bona fide cap-bindende protein med en bevaret cap-bindende domæne) i forhold til de eIF4E og eIF4E2 proteiner, som genkender m 7 GTP fra ikke-methylerede GTP.
Denne teknik, som præsenteres, kan udføres som en målrettet tilgang til at identificere m 7 GTP interaktionskandidater af interesse eller som en bred tilgang ved at analysere m 7 GTP eluat via massespektrometri. Flere andre teknikker kan følge physioxic eksponering (protokol 4) at analysere cap-bindende aktivitet såsom subcellulær fraktionering, immunfluorescens, co-immunopræcipitation, ennd polysom analyse. Translationel kontrol fremstår som en lige bidragyder til genekspression som transskription. Ved hjælp af denne teknik til at undersøge aktiviteten og sammensætningen af cap-bindende komplekser vil kaste lys over, hvordan cap-afhængige translationsinitiering reguleres som respons på lavt iltindhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15 cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 ml Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreitol | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
- Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
- Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
- Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
- Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
- Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
- Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
- Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
- Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
- Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
- Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
- Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
- Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
- Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
- Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
- Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
- Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
- Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
- Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
- Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
- Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
- Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
- Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
- Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
- Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
- Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
- Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
- Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
- Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
- Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
- Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
- Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).
