Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/55112
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Introduction

שליטה Translational מתגלה צעד חשוב לא פחות לרגולציה תעתיק בביטוי הגנים, במיוחד בתקופות של מתח הסלולר 1. מוקד שליטת תרגום הוא צעד שער הגבלת חניכה שבו הצעדים הראשונים של סינתזת חלבון לערב הכריכה של 4E גורם ייזום איקריוטיים (eIF4E) אל 7-methylguanosine (מ 7 GTP) 5 'כובע של mRNAs 2 . eIF4E הוא חלק ממכלול trimeric בשם eIF4F הכולל eIF4A, גידול helicase RNA, eIF4G, חלבון פיגומים הנדרש לגיוס של גורמי תרגום אחרים ואת 40S הריבוזום 3. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, רוב mRNAs המכריע מתורגם באמצעות מנגנון כובע תלוי, אבל תחת תקופות של מתח הסלולר כ 10% של mRNAs האנושי מכילים 5 'UTRs עלולה לאפשר תרגום עצמאי-כובע טכס חניכת 1,4. תרגום שווה תלויה כבר היסטורי נרדףמפוקפק עם eIF4F, לעומת זאת, וריאציות ספציפי לחץ של eIF4F הפכו נושאי טרנדים 5-8.

מדגיש תאיים שונה לגרום לפעילות eIF4E צורך להדחיק באמצעות היעד היונק של rapamycin מורכבי 1 (mTORC1). קינאז זה הופך לקוי תחת לחץ, וכתוצאה מכך את הפעילות המוגברת של אחד היעדים שלה, 4E-חלבון מחייב (4E-BP). ללא פוספורילציה 4E-BP נקשר eIF4E וחוסם את יכולתה לקיים אינטראקציה עם eIF4G גורם לדיכוי של תרגום תלוי כובע 9,10. נקודה מעניינת היא homolog של eIF4E בשם eIF4E2 (או 4EHP) יש זיקה הרבה יותר נמוך עבור 4E-BP 11, אולי שמאפשר לו לחמוק הדחקה בתיווך מתח. ואכן, בתחילה לאפיין מדכא של התרגום בשל היעדר האינטראקציה עם eIF4G 12, eIF4E2 יוזם את התרגום של מאות mRNAs המכילים אלמנטים בתגובה היפוקסיה רנ"א 3 שלהם 'UTR במהלך מתח היפוקסי 6,13. אני הפעלה זושעות מושגת באמצעות אינטראקציות עם eIF4G3, RNA חלבון מחייב מוטיב 4, והגורם היפוקסיה מושרה (HIF) 2α להוות מורכבים eIF4F חוסר חמצן, או eIF4F H 6,13. כתוצאה מדכאת בתנאים רגילים, eIF4E2 נקשר עם GIGYF2 ו ZNF598 14. מתחמים אלה היו, בין שאר, שזוהו באמצעות שרפי זיקת GTP מ 7 Agarose צמודים. השיטה הקלאסית זה 15 הוא תקן בתחום התרגום והוא הטוב ביותר הנפוץ טכניקה לבודד מתחמי מחייב כובע לנתץ ו במבחנה מחייב מבחני 16-19. כמו מכונות תרגום תלוי כובע מתגלה גמישות להתאמה עם חלקים בין-שינוי 6-8,13, שיטה זו היא כלי רב עצמה כדי לזהות חלבוני כובע מחייב רומן במהירות מעורב תגובת הלחץ. יתר על כן, וריאציות eIF4F עשויות להיות השלכות רחבות כמערכות מודל מספר איקריוטיים להופיע להשתמש homolog eIF4E2 לתגובות מתח כזהכמו א thaliana 20, ס Pombe 21, ד melanogaster 22, ו- C. elegans 23.

הראיות עולה כי שינויים eIF4F לא יכול להיות מוגבל למצבי לחץ, אבל להיות מעורבים בפיזיולוגיה נורמלי 24. אספקת חמצן לרקמות (בקצוות נימי) או בתוך רקמות (נמדד באמצעות microelectrodes) נע בין 2-6% במוח 25, 3-12% בתוך הריאות 26, 3.5-6% במעי 27, 4% ב הכבד 28, 7-12% בכליה 29, 4% בשריר 30, ו 6-7% ב מח עצם 31. תאי המיטוכונדריה מכילים פחות מ -1.3% חמצן 32. ערכים אלה הם הרבה יותר קרובים היפוקסיה מאשר באוויר הסביבה שבה תאים בתרבית באופן שגרתי. הדבר מצביע על כך מה בעבר נחשבו כמו תהליכים תאיים ספציפי היפוקסיה עשויים להיות רלוונטיים בסביבה פיזיולוגית. מעניין, eIF4F ו eIF4F H 24. חמצן נמוך גם דוחפת להתפתחות תקינה של העובר 33 ותאי בדרך כלל יש שיעורי התפשטות גבוה, תוחלת החיים ארוכה יותר, פחות נזק בדנ"א ותגובות הלחץ הכללי פחות physioxia 34. לכן, eIF4F H עשויה גורם מפתח בביטוי של גנים בוחרים בתנאים פיסיולוגיים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לתאי תרבות בתנאי חמצן פיסיולוגיים קבועים או במגוון משתנה דינמי כי סביר יותר נציג microenvironments רקמות. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי התאים lysed בתוך תחנת עבודה היפוקסיה. לא לעתים קרובות ברור כיצד מעבר מתרבות תא היפוקסי תמוגה התא מתבצע פרוטוקולים אחרים. תאים הם לעתים קרובות להסיר תחילה מן חממת היפוקסיה קטנה להיותקדמי תמוגה, אבל לחשיפה זו חמצן יכולה להשפיע הביוכימיים כתגובה הסלולר לחמצן היא מהירה (אחד או שתיים דקות) 35. חלבוני כובע מחייב מסוימים דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים hydrolyze GTP מ 7, ולכן חלק interactors הכובע עלול לרדת לטמיון בתהליך הטיהור. Agarose-צמוד אנלוגים כובע עמיד enzymatically ניתן להחליף בפרוטוקול זה. היכרות עם הפעילות ורכב eIF4F H וריאציות אחרות של eIF4F באמצעות השיטה המתוארת כאן שתשפוך אור על מנגנוני ביטוי הגנים המורכבים שתאיים לנצל במהלך מצבים פיסיולוגיים או תגובות דחק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכשירי תרבית תאים

  1. לרכוש מניות זמינות המסחרי של תאים אנושיים.
    הערה: פרוטוקול זה מנצל HCT116 קרצינומה המעי הגס ותאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות אדם מן המעלה הראשונה (HRPTEC).
  2. הפוך 500 מ"ל בינוני לתרבות של HCT116: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) / בינוני גלוקוז גבוהה בתוספת 7.5% עוברית שור סרום (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
  3. הפוך 500 מ"ל בינוני לתרבות של HRPTEC: המדיום הסלולרי אפיתל השלימו עם FBS 5%, 1% תוספת צמיחת תאים אפיתל, ו -1% P / S.
  4. הכן 500 מ"ל של 1x פוספט-בופר (PBS): 140 מ"מ NaCl, KCl 3 מ"מ, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 15 מ"מ KH 2 PO 4. התאם ל- pH 7.4 לעקר ידי מעוקר במשך 40 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.

2. ייזום של culturing תא

  1. בזהירות לשאוב את המדיום מצלחת ומחוברות 80-90% מבלי להפריע tהוא התאים.
  2. Aliquot 3-5 מ"ל של 1x PBS לכל צלחת תרבות, בעדינות רוק בקבוק אחד כדי לצפות את פני השטח של המנה, ובזהירות לשאוב PBS 1x. חזור עבור לשטוף 1x PBS שני.
  3. Aliquot 3 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לתוך כל מנה תרבות בעדינות רוק כדי מעיל באופן שווה את התאים עם טריפסין-EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות.
  4. העברת התאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב 4000 XG במשך 90 שניות.
  5. גלולה תא גלולה ב 1 מ"ל של DMEM מלאה.
  6. ספירת תאים באמצעות haemocytometer. לחשב כמה שאינם pyrogenic ומנות תרבית תאים קלקר 100 מ"מ נדרשים להשיג צפיפות זריעה ראשונית של כ 2,500-5,000 תאים לס"מ 2.
  7. תרבית תאים בינוני מלאה טרום חמה שנעשה צעדי 1.2 או 1.3 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 30-45.
  8. לטהר את הבקבוק הבינוני בקבוקון תא עם 70% אתנול. מכאן ואילך כליש לבצע פעולות בסביבה נקייה מחיידקים.
  9. Aliquot 6 מיליליטר של DMEM המלא לתוך צלחות תרבית תאים רבות 100 מ"מימ נדרשו להשתמש כל הנפח של תאים קפואים בתוך צפיפות הזריעה שצוינה בשלב 2.6.
  10. מעבירים את נפח תא ההשעיה המחושב בשלב 2.6 לכל אחד את הכלים תרבות 100 מ"מ. רוק כל צלחת באופן ידני כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני השטח של הצלחת.
  11. מניחים את צלחת תרבות 100 מ"מ תא זרע בחממה ב 37 ° C באווירה 2 5% CO. אפשר תאים כדי לדגור לפחות 24 שעות לפני הצעדים הבאים.

3. Subculturing

  1. צג כל מנת תרבית תאים תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את אחוז התאים confluency (תאי% מכסים את השטח של המנה). חזור תאי החממה הבינוני מלאים מראש חמים 1x PBS. המשך לשלב הבא אם התאים הם 80-100% ומחוברות.
  2. בזהירות לשאוב את המדיום בילה מבלי להפריעתאים בכל צלחת תרבות.
  3. Aliquot 3-5 מ"ל של 1x PBS לכל צלחת תרבות, בעדינות רוק בקבוק אחד כדי לצפות את פני השטח של המנה, ובזהירות לשאוב PBS 1x. חזור עבור לשטוף 1x PBS שני.
  4. Aliquot 3 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA לתוך כל מנה תרבות בעדינות רוק כדי שווה לצפות את התאים עם טריפסין-EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות.
  5. במהלך הדגירה זה, aliquot 10 מ"ל של מדיום מלאה לתוך הכלים תרבות רבים ככל נדרשים להשיג צפיפות התאים של 2,500-5,000 תאים לס"מ 2.
  6. כאשר התאים יש מנותקים מן הצלחת, להוסיף במהירות 3 מיליליטר של מעכבי טריפסין 1x מוגדרים בעדינות מערבולת את מנת דקות 1 כדי להבטיח שכל של טריפסין-EDTA נוטרל.
  7. העברת התאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל ומניחים בצד. הוסף 3 מ"ל 1x PBS על צלחת לאסוף כל התאים הנותרים, ולהעביר כי אל הצינור צנטריפוגות אותו 15 מ"ל.
  8. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG 150במשך 5 דקות.
  9. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של מדיום מלאה.
  10. ספירת תאים באמצעות haemocytometer וזרעי 150 מ"מ צלחות תרבות המכיל 15 מ"ל של מדיום מלאה להשיג צפיפות התאים של 2,500-5,000 תאים לס"מ 2. השתמש בשני 150 מ"מ עבור כל assay מחייב כובע.
    הערה: דיפוזיה חמצן לתאים דרך תקשורת נוזלית תלויה בנפח 36. מומלץ לשמור על נפח התקשורת העקבית בין ניסויים אם תאים חסידים או תאים בתרחיף משמשים. מדיה ניתן מראש מותנה (וטופחו על ידי תחנת עבודה עבור 24 שעות כפי שפורט דיון) להימנע variabilities אלה דיפוזיה.
  11. מניח את כלי התרבות הזורעת בחממה ב 37 ° C באווירת 2 5% CO. אפשר תאים כדי לדגור לפחות 24 שעות לפני שתמשיך את הצעדים הבאים.

4. חשיפה Physioxic

  1. הצג את התאים תחת המיקרוסקופ. לקבלת BESתוצאות t, להבטיח כי תאים הם ומחובר 70-80% עבור חשיפת 24 שעות, ומחוברות 50-60% עבור חשיפת hr 48, ו ומחוברים 40-50% עבור חשיפת 72 שעות.
  2. מניח את התאים לתוך תחנת עבודה היפוקסיה בפעם הרצויה (24, 48, או 72 שעות בהתאם הניסוי).
  3. הגדר את העבודה על physioxia המתאים.
    הערה: לדוגמה, הגדרה 3% O 2 תלווה 5% CO 2 ו -92% N 2.
    הערה: אם תנודות חמצן בטווח דינאמי הרצוי על מסגרת זמן ספציפית, תוכנית לוח הזמנים לתוך המכשיר או באופן ידני את הגדרות חמצן בתדירות הרצויה.
  4. הגדר את הלחות ל -60%. אווירת העבודה מאוד יבשה בכל זאת, ומדיה תתאדה ניכרת במהלך ניסויים ארוכים (> 48 שעות). לשמור עתודת תקשורת בבקבוק תרבית תאים בתוך תחנת העבודה (כך שהתקשורת היא equilibrated עם אווירת תחנת העבודה) כדי לחדש את התקשורת דיס תרבית תאיםהס.
    הערה: כל פתרון יהיה אינטראקציה עם תאים לפני תמוגה (כגון PBS טריפסין-EDTA) צריך להיות מראש מותנה למשך 24 שעות לפני השימוש בתוך תחנת עבודה היפוקסיה כך החמצן המומס equilibrates עם חמצן אטמוספרי 36.
  5. שמור את התאים בתוך תחנת עבודה עד תמוגה.

5. חוצצים הכנות לקראת Assay Cap-מחייב

  1. כן 1x טריס שנאגר מלוח (TBS).
    1. בשנת 800 מ"ל של DH 2 O, לפזר 8.76 גרם NaCl ו 6.05 גרם טריס הבסיס.
    2. תביאו את פתרון ה- pH הסופי של 7.4 באמצעות 1 M HCl.
    3. תביאו את הנפח הסופי ל 1 L באמצעות DH 2 O.
  2. הכן חיץ תמוגה הלא denaturing. כן תמוגה חיץ היום של assay מחייב הכובע. הפוך חיץ תמוגה נוסף כדי לשטוף את החרוזים הריקים agarose ואת agarose GTP γ-aminophenyl-מ 7 חרוזי C10-צמודים (צעדי 7.9 ו 7.13).
    1. ב 7 מ"ל של DH 2 O, להוסיף 160 μl 5 M NACl, 160 μl 1 M טריס- HCl pH 7.4, 40 μl 200 מ"מ NaF, 40 μl 1 M MgCl 2, ו -40 μl 1 מ"מ נתרן orthovanadate.
    2. הוסף 40 μl של Igepal לפתרון 7 מ"ל. חותכים את קצה פיפטה כדי לסייע לאחזר Igepal כפי שהוא צמיגה מאוד.
    3. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה, או מערבולת, הפתרון 7 מ"ל עד שכל Igepal כבר מומס.
    4. הרם את הנפח הסופי של פתרון 8 מיליליטר ולשמור על קרח.
  3. כן 4x נתרן Dodecyl סולפט (SDS) -PAGE לדוגמא הצפה.
    1. בכוס, לשלב 16 מ"ל 1 M טריס-HCl pH 6.8, 12.64 מ"ל גליצרול, ו -8 מ"ל dithiothreitol (DTT).
    2. להוסיף 3.2 גרם של SDS ו 0.16 גרם של כחול bromophenol. אפשר אבקה לפזר באופן מלא על ידי ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי.
    3. Aliquot לתוך 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

6. תא תמוגה

  1. הכן חיץ תמוגה הלא denaturing ולשמור על הקרח יום הדואר מחייב כובע assay.
  2. טרום חם 1x PBS טריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. Aliquot 980 μl של חיץ תמוגה לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge עבור כל assay מחייב כובע מבוצע.
  4. הוסף 10 μl של 4- (2-aminoethyl) hydrochloride benzenesulfonyl פלואוריד 10 μl של קוקטייל מעכבי פרוטאז 100x אל 980 μl של חיץ תמוגה. שמור על הקרח.
  5. מחק את התקשורת מכל מנה 150 מ"מ מיכל פסולת בתוך תחנת עבודה היפוקסיה.
  6. שוטפים את התאים עם 3-4 מ"ל של PBS 1x חם וזורקים את כל הנוזל.
  7. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA חם על כל מנה ולתת לשבת במשך 2 דקות או עד תאים לא הם דבקו יותר לצלחת.
  8. בעזרת פיפטה, העברת תאים של צלחת אחת לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. חזור על פי הצורך, כך כל צלחת של תאים מועבר צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge נפרד.
  9. צנטריפוגה 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ב 6000 XG במשך 90 שניות to גלולת התאים.
  10. לשאוב טריפסין בעזרת פיפטה מבלי להפריע גלולה. אם הגלולה מופרת, מחדש צנטריפוגות צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ב -6,000 XG במשך 90 שניות.
  11. שוטפים את התאים עם PBS 1x חם על ידי pipetting בעדינות 200 μl של PBS לתוך הצינור בדיוק מעל גלולה. Re-צנטריפוגה אם הגלולה מופרת.
  12. לשאוב PBS מבלי להפריע גלולה.
  13. פיפטה 500 μl מן 1 מ"ל מוכן פתרון חיץ תמוגה על גלולה הסלולרית הראשונה. Resuspend גלולה לחלוטין על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  14. מערבבים את התאים resuspended עם גלולה התא השני ו resuspend גלולה השני על ידי pipetting למעלה ולמטה. חזור על תהליך זה עד שכל הכדורים שולבו ו resuspended עבור כל דגימה.
  15. מערבבים את lysate עם למאגר תמוגה 500 μl של שנותרו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  16. הסר דגימות מתחנת העבודה היפוקסיה.
    הערה: לאחר הוספת חיץ תמוגה,השלבים הבאים ll הם להתבצע באוויר הסביבה כמו תחנת עבודת היפוקסיה מוגדרת 37 מעלות צלזיוס, השלבים הבאים הם כדי להתבצע קר (4 מעלות צלזיוס או על קרח).
  17. Lyse את התאים באמצעות תסיסה עדינה על ידי החלפה של דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5-2 שעות.
  18. צנטריפוגה התאים lysed ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת הסלולר.
  19. מעבירים את lysate אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש וזורקים את הכדור.
  20. שמורת חלק (5-10%) של supernatant לשמש כביקורת קלט כל תא lysate לניתוח כתם המערבי בעתיד.

Assay 7. מחייב יתר

  1. עבור כל דגימה, להעביר 50 μl של slurry מלא חרוז ריק agarose ו -50 μl של agarose GTP γ-aminophenyl-מ 7 slurry החרוז C10 הצמוד להפריד 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. השתמש במספריים כדי להסיר את קצה פיפטה כדי להקל על אוסף של slurry חרוז.
  2. גלולה ב החרוזיםy centrifuging את התערובת הדלילה XG ב 500 במשך 30 שניות.
  3. הסר את supernatant בזהירות resuspend את החרוזים 500 μl של TBS.
  4. חזור על שלבים 7.2 ו -7.3. גלולת חרוזי XG ב 500 במשך 30 שניות ולהסיר supernatant.
  5. מעבירים את supernatant המכיל את lysate משלב 6.19 אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את החרוזים agarose ריק.
    הערה: חרוזי agarose הריקים לפעול כצעד טרום סליקה להסיר חלבונים מן lysate כי אינטראקציה הלא במיוחד עם החרוז.
  6. דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C עם תסיסה עדינה.
  7. גלולת חרוזי agarose הריק על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות.
  8. מעבירים את lysate אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את החרוזים γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10.
  9. שטפו את החרוזים agarose ריק על ידי resuspending את החרוזים 500 μl של חיץ תמוגה, pelleting את החרוזים על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות, ולהשאיר את supernatant. חזרו על התרגיל ארבע פעמים עבור סכום כולל של חמישה שוטף.
  10. Resuspend החרוזים agarose ריק במאגר מדגם 1x SDS-PAGE, ומרתיחים חרוזים עבור 90 שניות על 95 מעלות צלזיוס. חנות ב -20 ° C לניתוח כתם מערבי בעתיד לראות האם החלבון של עניין נקשר הלא במיוחד כדי החרוז.
  11. דגירה lysate עם חרוזים צמודי C10 agarose GTP γ-aminophenyl-מ 7 עם תסיסה עדינה במשך שעה 1 ב 4 ° C כדי ללכוד חלבונים קושרי כובע.
  12. גלולת חרוזי γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות. בטל supernatant.
  13. שטפו את החרוזים γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 ידי חזרה צעד 7.9.
  14. Resuspend את החרוזים 600 μl של חיץ תמוגה.
  15. להוסיף GTP לריכוז סופי של 1 מ"מ.
  16. דגירה חרוזים γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 + 1 מ"מ GTP עם תסיסה עדינה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. הערה: זהיהיה לנתק חלבונים אינטראקציה הלא במיוחד עם GTP מ 7 (כלומר, גם אינטראקציה עם GTP הלא מפוגל).
  17. גלולת חרוזי γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות.
  18. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדשה ולהוסיף 200 μl של חיץ מדגם 4x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 מ"מ DTT, 2% SDS, 0.1% bromophenol כחול, ו -10% גליצרול). חנות מדגם שליטת GTP ב -20 ° C לניתוח כתם מערבי בעתיד 37. שטפו את החרוזים על ידי חזרה על שלב 7.9.
  19. Resuspend החרוזים במאגר מדגם 1x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 מ"מ DTT, 2% SDS, 0.1% bromophenol כחול, גליצרול 10%), ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. אחסן את מ 7 חלק GTP הנכנס ב -20 ° C לניתוח כתם המערבי בעתיד 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח יכולת Cap-מחייב תגובה חמצן של eIF4E ו eIF4E2 בבית מ 7 טור GTP זיקה

איורים 1 ו -2 מייצגים כתמים המערבי של טיהור זיקה מ 7 GTP טיפוסי של שני חלבונים כובע מחייב מרכזי בתגובה לתנודות חמצן בשני שורות תאים אנושיים: תאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות אדם מן המעלה הראשונה (HRPTEC) ב קרצינומה F igure 1 ו הגס ( HCT116) באיור 2. תאים הם שמרו על זמינות חמצן המצוינת למשך 24 שעות על מנת להבטיח כי החמצן המומס בתקשורת נוזל equilibrated עם האוויר בתוך תחנת העבודה היפוקסיה. השביל קלט (IN) מייצג 10% של lysate התא כולו לפני מ 7 GTP צמודי חרוזים agarose מתווספים ללכוד חלבונים קושרי כובע. שביל קלט זו משמש כבסיס למדידת העשרהשל חלבון היעד הנפתח GTP מ 7. השביל GTP הוא eluate מן החרוזים מ 7 GTP שהיו elute עם 1 מ"מ GTP. שלב זה מאפשר זיהוי של חלבונים כי גם להכיר GTP הלא מפוגל. החלבונים קושרי כובע eIF4E ו eIF4E2 להכיר מ 7 GTP במיוחד, אבל homolog שלהם eIF4E3 (לא מוצג כאן) גם נקשר GTP הלא מפוגל. היכולת של eIF4E ו eIF4E2 לחייב את מבנה כובע 5 'mRNA (GTP מ 7) ניתן למדוד על ידי השוואת עוצמת הלהקות שלהם ביחס טור GTP מ 7 לעוצמת בנתיב הקלט (ברכה זמינה כלל).

כימות זה יכול להתבצע על ידי מדידת עוצמת פיקסל של להקות החלבון במשך שלוש ביולוגי משכפל עם תוכנת ניתוח תמונה כגון ImageJ. תוצאות באות לידי ביטוי כאמצעי יחסי של יחידות צפיפות (RDU) ± שגיאת התקן של הממוצע. ערכים גלם לפני נורמליזציהמשני דגימות ניסוי ובקרה הושוו על ידי מבחן t דו-זנבי המזווג. P <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. ניסוי נציג זה מראה כי יש שתי שורות תאי טווחים שונים של חמצן לשימוש eIF4E ו eIF4E2 שלהם. איור 1 מראה כי ב HRPTEC רק eIF4E נקשר חזק מ 7 GTP ב -8% O 2 (איור 1 א), כי הן eIF4E ו eIF4E2 קשורים משמעותית עם GTP מ 7 מ 3-5% O 2 (איור 1 ב - C), ושרק eIF4E2 נקשר מאוד GTP מ 7 ב 1% O 2 (איור 1D). באיור 2, בתאי HCT116, השימוש תלוי החמצן של חלבוני כובע מחייב אלה שונה: רק eIF4E נקשר באופן משמעותי מ 7 GTP ב 12% O 2 (איור 2 א), שני חלבוני קושרי הכובע להיקשר באופן משמעותי מ 7 GTP בטווח 5-8% O 2(איור 2 ב - C), ורק eIF4E2 נקשר באופן משמעותי GTP מ 7 ב 3% O 2 (איור 2 ד). עדר elution מעמודת GTP מ 7 עם GTP מראה כי eIF4E ו eIF4E2 הוא ספציפיים GTP מ 7 ואינו מכירי GTP הלא מפוגלת. הגרפים, מייצגים כימות של שלושה משכפל ביולוגי באמצעות ImageJ. תוצאות המחקר מראות כי שני חלבוני כובע מחייב גדולים, eIF4E ו eIF4E2, נבדלים ביכולת שלהן כדי לאגד את מבנה כובע mRNA מ 7 GTP בצורת חמצן תלוי.

בהתבסס על הספרות קודמת כי שני חלבונים אלה ליזום את התרגום של כיתות ייחודיות של mRNAs המפנה בפעילות מחייב כובע יכול לגרום proteomes השונה שנוצר להסתגל לשינויים זמינים חמצן. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לאפיין גורמי ייזום תרגום רומן כי אינטראקציה עם 5 הכובע mRNA '(או עם חלבונים קושרי כובע) באמצעות גישה כתם המערבי ממוקד או בגישה רחבה כגון ניתוח ספקטרומטריית מסה של eluate GTP מ 7.

איור 1
איור 1: eIF4E ו eIF4E2 פעילויות חופפות במהלך physioxia ב HRPTEC 3-5% O 2. מבחנים צלמו מ 7 GTP חרוז בתא אפיתל צינורי הפרוקסימלי אדם כליות (HRPTEC) lysates חשוף (א) 8%, (ב) 5%, (ג) 3% או (ד) 1% O 2 במשך 24 שעות. GTP, לשטוף GTP למדוד וספציפיות מ 7 GTP; מ 7 GTP, חלבונים מאוגדים חרוזים מ 7 GTP לאחר לשטוף GTP. כתמים מערביים נציג מוצגים ונתונים מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים כומתו על ידי ImageJ והביעו כיחידות צפיפות יחסיות (RDU) ביחס 10% קלט (IN) של lysate התא כולו. * P <0.05 (מזווג שני זנב מבחן t) נחשב שינוי משמעותי כאשר משווים את העשרת eIF4E או eIF4E2 בשבריר הנכנס כובע (GTP מ 7) עם הצבא ההודי הלאומי. נתונים, ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) של שלושה ניסויים בלתי תלויים. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. Timpano, ס ו Uniacke, תאים אנושיים J. מתורבת תחת חמצן פיזיולוגיים לנצל שני חלבונים קושרי כובע לגייס mRNAs ברורים לתרגום. 2016; 291 (20): 10,772-82 24. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
EIF4E איור 2. ופעילויות eIF4E2 חפיפה במהלך physioxia ב HCT116 מן 5-8% O 2. מבחני צלמו מ 7 GTP החרוזים lysates קרצינומה המעי הגס האנושי HCT116 חשופים (א) 12%, (ב) 8%, (ג) 5% או (ד) 3% O 2 במשך 24 שעות. GTP, לשטוף GTP למדוד וספציפיות מ 7 GTP; מ 7 GTP, חלבונים מאוגדים חרוזים מ 7 GTP לאחר לשטוף GTP. כתמים מערביים נציג מוצגים ונתונים מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים כומתו על ידי ImageJ והביעו כיחידות צפיפות יחסיות (RDU) ביחס 10 קלטי% (IN) של lysate תא כולו. * P <0.05 (מזווג שני זנב מבחן t) נחשב שינוי משמעותי כאשר משווים את העשרת eIF4E או eIF4E2 בשבריר הנכנס כובע (GTP מ 7) עם הצבא ההודי הלאומי. נתונים, ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) של שלושה ניסויים בלתי תלויים. מחקר זה פורסם במקור בכתב העת Journal of Biological Chemistry. TIMPano, ס ו Uniacke, תאים אנושיים J. מתורבת תחת חמצן פיזיולוגיים לנצל שני חלבונים קושרי כובע לגייס mRNAs ברורים לתרגום. 2016; 291 (20): 10,772-82 24. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הניתוח של חלבוני קושרי כובע בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיסיולוגיים יכול לאפשר זיהוי של גורמי ייזום תרגום רומן מוסדר חמצן. הזיקה של הגורמים הללו עבור המכסה '5 של mRNA או חלבונים הקשורים כובע אחרים ניתן למדוד את עוצמת הקשר שלהם אל מ 7 GTP צמודים חרוזי Agarose. אזהרה אחת של טכניקה זו היא כי הוא מודד את הפוטנציאל מחייב כובע של חלבונים-ימסו פוסט, אבל זה מבוצע בתנאים שאינם denaturing המקיימים אינטראקציות חלבון-חלבון ופוסט translational שינויים (PTMs). אינטראקציות חלבון-חלבון כמה לתווך את הכריכה של המשפחה eIF4E את הכובע '5. 4E-BP נקשר ומדכא eIF4E ידי חסימת האינטראקציה שלה עם eIF4G ומניעת גיוס של 43s מראש חניכה 38 מורכבים. מתחם eIF4E / 4E-BP נשאר קשור 5 כובע mRNA ', שמנע מראש כל חניכה מן התעתיק שעליו, והוא יכוללשמש כסמן עיכוב eIF4E בעמודות זיקה GTP מ 7. לעומת זאת, האינטראקציה של eIF4E עם eIF4G על עמודות מ 7 GTP יכול לשמש כסמן ייזום התרגום פעיל. PTMs הוא עוד שיטה להסדיר את הפעילות של גורמי ייזום תרגום. לדוגמה, זירחון של eIF4E ידי Mnk1 יכול להגדיל וזיקתה עבור mRNA '5 מכסה 39. תכונת השינוי של החלבון המקודד על ידי 15 אינטרפרון מאולצת ג'ין (ISG15) הוא PTM המגביר את פעילותם מחייב כובע של eIF4E2 בתגובה אינדוקציה אינטרפרון באמצעות זיהום הפתוגן 40. גן ISG15 מכיל מרכיב תגובה היפוקסיה ב האמרגן שלה טוען כי מערכת זו יכולה לווסת eIF4E2 חמצן נמוך. מעט מאוד ידוע על איך PTMs רשאית לשנות את הפעילות של חלבונים קושרי כובע במהלך תנאי חמצן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. טכניקה זו ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף מוסדר חמצן הרומן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית PTMs הב לתווך הפעילות של גורמי ייזום תרגום.

שיטה חלופית כדי לכיד עם אנלוגי כובע מ 7 GTP תהיה immunoprecipitate חלבון ידוע מחייב כובע כגון eIF4E או eIF4G ולבצע ספקטרומטריית מסה לזהות חלבונים קשורים. הגבלה של אסטרטגיה זו היא כי חלבוני קושרי כובע לעתים קרובות יש תפקידים הסלולר חלופיים כגון בתוך לחץ גרגירי 41 או בתרגום כובע-עצמאי 1,4. לכן, ניצול מ 7 אנלוגים GTP כובע היא הטובה ביותר, השיטה האמינה ביותר לבודד חלבוני קושרי כובע, במיוחד כאשר חוקרים חלבוני כובע הקשורים רומן. הגבלה של ניצול אנלוגי כובע GTP מ 7 היא שחלק חלבונים קושרי כובע כמו נבלות decapping אנזים DcpS לא רק אינטראקציה עם כובע mRNA מ 7 GTP, אלא גם לחייב את הבסיס השני לכריכה 42. יתר על כן, אנזימים decapping בכלל, כגון מורכבות Dcp1 / Dcp2, יכול hydrolyze GTP מ 7 וביעילות להפחית קיבולת שרף. לכן, כמה חלבונים קושרי כובע עלולים ללכת לאיבוד בניתוח זה. כדי לעקוף אזהרות אלה, תחליפי כובע mRNA עמידים enzymatically יכולים להיות מנוצלים. שני אנלוגים כובע הלא hydrolyzable, mononucleotide מ 7 GpCH2pp או dinucleotide מ 7 GpCH2ppA הוכחו ללכוד DcpS, Dcp1, ו Dcp2 43. אנלוגים כובע mRNA אלה אינם זמינים מסחריים, אבל חייבים להיות מסונתזים כימיים דה נובו. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא שרק כובע מחייב חלבונים או חלבונים אינטראקציה עם חלבונים קושרי כובע באמצעות "piggybacking" יהיה בשבי. בעוד ייזום תרגום תלוי כובע הוא הסוג העיקרי של ייזום, מנגנונים שאינו קשור כובע הם נפוצים במיוחד במהלך תנאי לחץ תא 1. עם זאת, בהקשר של טכניקה זו המגמות המסתמנות בתחום ייזום התרגום 6-8,24, בזיהוי גורמי מתח המושרה רומן participate בייזום כובע תלוי הוא אזור מבטיח של מחקר.

גורם נוסף שיש לשקול בפרוטוקול זה הוא חמצן בתקשורת. Culturing תאים במדיום נוזלי מספק מחסום בין התאים והאווירה. הוכח כי תקשורת נוזלית עשויה להימשך עד 24 שעות כדי לאזן עם רכב הגז האטמוספרי 36. לכן, התאים חייבים להיות מתורבת למשך 24 שעות בזמינות החמצן הרצויה לפני התפרקות או בתקשורת ניתן מראש מותנה אם incubations קצר נדרשים. אוויר טרום כרוך בשמירה על תקשורת תחנת העבודה היפוקסיה במשך שעה 24 לפחות בקבוק תרבות סטרילית המאפשרת חילוף גזים. כל פתרון מחומצן הציג את התאים בתוך תחנת עבודת היפוקסיה יכול לשנות מסלולי איתות הסלולר במהירות כגון ייזום התרגום תלוי כובע הנבחנת בפרוטוקול זה. בשל הרגישות של מסלולי חישת חמצן בתאים, כל פתרון שיביאאינטראקציה עם תאים לפני תמוגה כגון PBS טריפסין-EDTA חייב גם להיות מראש הותנתה hr 24 לפחות. מאגרי תמוגה לשטוף שלאחר תמוגה חייבים לשמש קרים ולכן אינם מראש המתלים לביצוע העבודה היפוקסיה 37 מעלות צלזיוס. בעוד כמה שינויים תלויי חמצן לחלבונים יכולים להיות-ימסו פוסט פעיל, המאגרים הקרים נדרשים לצמצם פעילות אנזימטית ו "דשדוש" של קומפלקסי חלבונים-חלבון או חלבון-RNA שעלולה להוביל חפצים. שינוי כדי בפרוטוקול זה כדי להגדיל את ההחמרה עשוי להיות תנאי מוקדם תמוגה מאגרים לשטוף שלאחר תמוגה למשך 24 שעות ולאחר מכן לדגור אותם על קרח בתוך התחנה העבודה לפני השימוש. מדיה מאגרים לא צריכה להיות כל זמן העבודה היפוקסיה במשך יותר משלושה ימים, כי פתרונות אלו יוכלו להתרכז בשל התאדות מים. עבור מחקרים לטווח ארוך (> 3 ימים), הסכום הראשוני של תאי זרע חייב להישקל בזהירות. ככל שהתאים לחלק את שטח הפנים של המנה הופך צפוף,מדגיש אחר כגון החמצת תקשורת עלול להשפיע על פעילותם של חלבוני קושרי כובע. ביום האחרון של הניסוי, התאים צריכים להיות confluency של 80-90%.

ישנם ארבעה שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה: שמירה על תאי תחנת העבודה היפוקסיה עד תמס, כמות תאים המשמשות, שטיפת החרוזים, ואת שליטת GTP הלא מפוגל. 1) ישנן מספר שיטות כדי לשמור על תאי חמצן נמוך. רוב אלה כוללים תאים קטנים שיכול להכיל מנות תרבית תאים בלבד, אבל כל תמוגה מניפולציה או תא חייבת להתבצע מחוץ לתאים באוויר הסביבה. רכיבים של מכונות חישה-חמצן כגון הגורמים מושרה היפוקסיה מופעלים או מומת בתוך דקה או שתיים 35. לכן, כאמור, lysing התאים עבודה היפוקסיה היא קריטית כדי להבטיח את הפעילות של חלבונים קושרי כובע קשורה זמינות החמצן בהתאמה. 2) מספר תאיםהציע בפרוטוקול זה (שתי מנות 150 מ"מ) הוא נאות מ 7 GTP interactors חזק כמו המשפחה או חברי eIF4E של eIF4F המורכב (eIF4A ו eIF4G). עוד תאים, לפחות חמש 150 מ"מ צלחות, עשויות להידרש לזהות חלבונים עם אינטראקציות חולפות או כי רק מקשר עם הכובע מ 7 GTP mRNA באמצעות eIF4F. 3) שטיפת החרוזים לאחר דוגר אותם עם lysate התא יכולה להתבצע באופן מחמיר ופחות מחמיר. הפרוטוקול המובא כאן מציע אפשרות מחמירים שם חיץ תמוגה משמש לשטוף את החרוזים חמש פעמים. אם חלבונים עם אינטראקציות חלשות Cap-חלבונים מחייבים הם בעלי העניין, אפשר לבצע שטיפות פחות ולנצל מלוחים טריס שנאגר במקום חיץ תמוגה. 4) אמנם חשוב טרום לנקות את lysate התא עם agarose unconjugated להסיר חלבונים שאינם במיוחד אינטראקציה עם חרוז, כמה חלבונים קושרי כובע לא יכול להבדיל בין מבנה כובע mRNA נכון, GTP מפוגל (מ 'GTP 7), ו GTP הלא מפוגל. חלבון אחד כזה הוא eIF4E homologue eIF4E3 44. משחרר את החרוזים עם GTP יהיה לסלק את כל חלבון כי גם מכיר GTP הלא מפוגל, אשר יכול להיות עניין. הרלוונטיות הביולוגיות של חלבונים שמזהים הן GTP מ 7 ו GTP טרם הובהרו באופן מלא. זו מודגשת על ידי כמה פרסומים מעורבים eIF4E3 (שהוא חלבון כובע מחייב בתום לב עם תחום כובע מחייב שימור) ביחס החלבונים eIF4E ו eIF4E2, אשר מכירים מ 7 GTP מ GTP הלא מפוגל.

טכניקה זו, כפי שהוצגו, ניתן לבצע כגישה ממוקדת לזהות interactors GTP מ 7 של עניין או כגישה רחבה על ידי ניתוח eluate GTP מ 7 באמצעות ספקטרומטריית מסה. כמה טכניקות אחרות לעקוב אחרי חשיפת physioxic (פרוטוקול 4) לנתח פעילות מחייב כובע כגון חלוקת subcellular, immunofluorescence, שיתוף immunoprecipitation,nd ניתוח polysome. שליטת Translational מתגלה תורם שווה ביטוי גנים כמו שעתוק. שימוש בטכניקה זו כדי לחקור את הפעילות ורכב מתחמי חייב כובע שישפוך אור על אופן שבו ייזום תרגום תלוי כובע מוסדר בתגובת חמצן נמוך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Tags

גנטיקה גיליון 118 תרגום mRNA מ ' חמצן כובע eIF4E eIF4E2 GTP ייזום פיזיולוגיים
ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, … More

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter