Introduction
번역 컨트롤은 특히 세포 스트레스 일의 기간 동안, 유전자 발현의 전사 조절에 동등하게 중요한 단계로 부상하고있다. 번역 제어의 초점은 단백질 합성의 첫 번째 단계는 7 methylguanosine에 진핵 개시 인자 4E (eIF4E에)의 결합을 포함 개시의 속도 제한 단계 (m 7 GTP)의 mRNA 2의 5 '캡에있다 . 의 eIF4E는 eIF4A, RNA 헬리 카제 및 eIF4G, 다른 번역 요인과 40S는 3 리보솜의 채용에 필요한 비계 단백질을 포함 eIF4F라는 이름의 삼량 체 복합체의 일부입니다. 정상적인 생리 조건에서의 mRNA의 대부분은 모자에 의존하는 메커니즘을 통해 번역되어 있지만, 세포 스트레스의 기간에 따라 인간의 mRNA의 약 10 %는 1,4 intiation 모자 독립적 인 번역을 허용 할 수있는 5 '의 UTRs가 포함되어 있습니다. 모자 종속 번역은 역사적으로 동의어있다OU에 eIF4F으로, 그러나, eIF4F의 스트레스 별 변화는 추세 주제 5-8이되었다.
다양한 세포 응력의 eIF4E 활성이 라파 마이신 복합체 1 (mTORC1)의 포유 동물 표적을 통해 억압되도록. 이러한 키나아제의 목표 중 하나의 증가 된 활성을 초래 응력 하에서 손상되고, 제 (4E-BP) 단백질 4E는 바인딩. 비 인산화 4E-BP는의 eIF4E 및 블록 eIF4G 모자 종속 번역 9,10의 억압의 원인과 상호 작용하는 능력을 결합한다. 흥미롭게도, eIF4E2 (또는 4EHP)라는 이름의 eIF4E의 동족체는 아마도 스트레스 중재 억압을 회피 할 수 4E-BP (11)에 대한 훨씬 낮은 친 화성을 가지고있다. 사실, 처음으로 인해 eIF4G (12)과의 상호 작용의 부족에 번역의 리프레 특징, eIF4E2는 저산소 스트레스 6,13- 동안 그들의 3 'UTR에서 RNA 저산소증 응답 요소를 포함 mRNA를 수백의 번역을 시작합니다. 이 활성화 난eIF4G3, RNA는 저산소 eIF4F 복합체, 또는 eIF4F H 6,13-을 구성하는 단백질 모티브 (4) 및 저산소증 유도 인자 (HIF) 2α 바인딩과의 상호 작용을 통해 달성 s의. 정상적인 조건에서 리프레으로 eIF4E2는 GIGYF2 및 ZNF598 (14)와 결합한다. 이 단지는 부분적으로 아가로 오스 연계 m 7 GTP 친 화성 수지를 통해 확인되었다. 이 고전적인 방법 (15)는 번역의 분야에서 표준과 최고의 가장 일반적으로 아래로 끌어 오기에 캡 결합 복합체를 분리하는 기술을 사용하고 체외에서 결합 분석 16-19입니다. 캡 - 의존적 번역 기계가 상호 변경 부 6-8,13와 같이 유연하고 적응력이 대두되고,이 방법은 급속 스트레스 반응에 관여하는 신규 한 캡 - 결합 단백질을 확인하기위한 강력한 도구이다. 여러 진핵 모델 시스템은 스트레스 반응 등을위한 eIF4E2의 동족체를 사용하여 나타나는 또한, eIF4F의 변화는 광범위한 영향을 미칠 수A. 장대 (20)로, S. Pombe 21 D. 22을 melanogaster의, 그리고 C. 23 엘레 간스.
증거 eIF4F 변동 엄격 조건을 강조하지만, 정상적인 생리 24에 관여 한정되지 않을 수 있음을 시사한다. (미소 전극을 통해 측정) (모세관 말단) 또는 조직 내에서 조직으로의 산소 공급은 뇌 25 2-6 %에서 다양 폐 26 3-12 %, 27 장, 4 %에서 3.5-6 %의 간 28 신장 29 7~12% 근육 30 4 %, 골수 31 6~7%. 세포와 미토콘드리아는 1.3 % 산소 32 이하를 포함한다. 이 값은 세포가 일상적으로 배양 주변 공기보다 저산소증에 훨씬 가깝다. 이것은 무엇을하는 것은 이전에 저산소증 특정 세포 과정은 생리 학적 환경에서 관련 될 수있는 것으로 생각하고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, eIF4F 및 eIF4F H "physioxia"(24)에 노출 된 여러 가지 인간의 세포 라인에 독특한 풀 또는의 mRNA의 클래스의 번역 개시에 참여한다. 낮은 산소는 적절한 태아의 개발 (33)를 구동 세포는 일반적으로 높은 확산 속도, 긴 수명, 적은 DNA 손상과 physioxia (34) 덜 일반적인 스트레스 반응이 있습니다. 따라서, eIF4F H 가능성이 생리 학적 조건에서 선택 유전자의 발현에 중요한 요소이다.
여기, 우리는 고정 된 생리 학적 산소 조건에서 또는 조직의 미세 환경의 가능성이보다 잘 나타내는 동적 변동 범위 내에서 배양 세포에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 장점은 세포가 저산소 워크 스테이션 내에 용해된다는 것이다. 이 세포 용해에 저산소 세포 배양에서 전환 다른 프로토콜에서 수행되는 빈도를 명확하지 않다. 세포는 종종 첫 번째 작은 저산소증 인큐베이터에서 제거 할 수산소의 세포 응답 (하나 또는 두 개의 분) 35 빠른 같이 앞 용해,하지만 산소이 노출 생화학 적 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 특정 캡 - 결합 단백질은 제 2베이스와의 상호 작용을 필요로하거나, 따라서 일부 캡 인터랙는 정제 과정에서 누락 될 수 m 7 GTP를 가수 분해 할 수있다. 아가 로스 결합 된 효소 방수 캡 유사체로는이 프로토콜에서 치환 될 수있다. 여기에 설명 된 방법을 통해 활동과 eIF4F H 및 eIF4F의 다른 변형의 구성을 탐색하는 세포 생리 학적 조건 또는 스트레스 반응시 활용 복잡한 유전자 발현 기계에 빛을 흘릴 것입니다.
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Protocol
세포 배양 1. 준비
- 인간 세포의 시판 주식을 구입합니다.
참고 :이 프로토콜은 HCT116의 대장 암 및 기본 인간의 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC)를 사용합니다. - 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 7.5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 / 높은 포도당 매체 HCT116의 문화를 500 ml의 배지를 확인합니다.
- 5 % FBS, 1 % 상피 세포 성장 보충제로 보충 상피 세포 매체와 1 % P / S : 500 ml의 HRPTEC의 문화 매체합니다.
- 140 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 15 mM의 KH 2 PO 4 : 1 배 인산염 완충 식염수 (PBS)의 500 ml의를 준비합니다. 7.4으로 산도를 조정하고 121 ℃에서 40 분간 고압 증기 멸균에 의해 소독.
세포 배양 2. 개시
- 조심스럽게 t을 방해하지 않고 80-90% 합류 요리에서 매체를 대기음그는 세포.
- 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~ 5 ㎖를 부드럽게 코팅 접시의 표면적을 각 플라스크 바위, 조심스럽게 1X PBS를 대기음. 두 번째 1X PBS 세척을 반복합니다.
- (3) 각각의 배양 접시에 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 용액 부드럽게 고르게 코팅 트립신 EDTA로 세포를 록 나누어. 2 ~ 3 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 90 초 동안 4,000 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 분리 된 세포를 전송합니다.
- 완전 DMEM 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 2 cm 당 약 2,500-5,000 세포의 초기 접종 농도를 달성하기 위해 요구되는 개수 비 발열 폴리스티렌 100mm 세포 배양 접시 계산한다.
- 단계 30-45 분 동안 37 ° C의 수조에서 1.2 또는 1.3으로 만든 전 따뜻한 전체 세포 배양 배지.
- 70 % 에탄올로 세포 배지 병 및 바이알의 오염을 제거. 앞으로 모든이 시점에서조작은 무균 적으로 수행해야합니다.
- 분취 단계 2.6에서 언급 파종 밀도에서 냉동 된 세포의 전체 볼륨을 사용하기 위해 필요한만큼 100mm 세포 배양 접시에 완전 DMEM 6 용액.
- 100 밀리미터 문화 요리의 각 단계 2.6에서 계산 된 세포 현탁액의 볼륨을 전송합니다. 균일 판의 표면 위에 세포를 분산 수동 각 플레이트 락.
- 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 시드 100mm 세포 배양 접시를 놓습니다. 세포가 다음 단계 전에 적어도 24 시간을 배양 할 수 있습니다.
3. 계대 배양
- 세포 생장의 비율 (접시의 면적 % 셀)을 결정하기 위해 현미경 각 세포 배양 접시보기. 인큐베이터 및 사전 따뜻한 전체 매체와 1X PBS로 세포를 돌려줍니다. 세포가 80-100% 합류하는 경우 다음 단계로 진행합니다.
- 조심스럽게을 방해하지 않고 보낸 매체를 대기음각각의 배양 접시에 세포.
- 배양 접시 당 1X PBS의 나누어지는 3 ~ 5 ㎖를 부드럽게 코팅 접시의 표면적을 각 플라스크 바위, 조심스럽게 1X PBS를 대기음. 두 번째 1X PBS 세척을 반복합니다.
- 나누어지는 3 각 배양 접시에 0.05 % 트립신 EDTA ml의 부드럽게는 바위 고르게 코트 트립신 EDTA로 세포에. 2 ~ 3 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 이 인큐베이션 동안 분취 많은 배양 접시에 완전 배지 10 ㎖를 2 cm 당 2,500-5,000 세포의 세포 밀도를 얻기 위해 요구된다.
- 세포를 플레이트로부터 분리되면 빠르게 정의 1X 트립신 억제제 3를 가하여 가볍게 트립신 EDTA 전부가 중화되었는지 확인 1 분 동안 요리 소용돌이 친다.
- 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 분리 된 세포를 전송하고 따로 설정합니다. 남아있는 세포를 수집, 같은 15ml의 원심 분리기 튜브에 그것을 전송 접시에 PBS 1X 3 ㎖를 추가합니다.
- 150 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛5 분.
- 뜨는을 대기음 및 전체 매체의 3 ml의 세포 펠렛을 resuspend.
- 혈구 계를 사용하여 세포를 세어 2 cm 당 2,500-5,000 세포의 세포 밀도를 얻을 완전 배지 15ml를 함유 150mm 배양 접시 시드. 각각의 캡 결합 분석을 위해 두 개의 150mm를 사용합니다.
참고 : 액체 매체를 통해 세포에 산소 확산 볼륨 (36)에 따라 달라집니다. 서스펜션 부착 세포 또는 세포가 사용되는지 여부를 실험과 일치하는 미디어의 볼륨을 유지하도록 권장한다. 미디어 확산에 이러한 가변성을 피하기 위해 (토론에서 논의 된 바와 같이 24 시간 동안 워크 스테이션에서 배양) 미리 조절 될 수있다. - 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 시드 배양 접시를 놓습니다. 세포가 다음 단계로 진행하기 전에 적어도 24 시간을 배양 할 수 있습니다.
4. Physioxic 노출
- 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. 포브스t 결과, 세포는 24 시간 노출 70-80 %의 합류, 48 시간 노출 50 ~ 60 %의 합류 및 72 시간 노출에 대한 40~50% 합류를되어 있는지 확인하십시오.
- 원하는 시간 (24, 48, 또는 실험에 따라 72 시간)에 대한 저산소증 워크 스테이션에 세포를 놓습니다.
- 해당 physioxia에 워크 스테이션을 설정합니다.
참고 : 예를 들어, 3 % O 2 설정이 5 % CO 2 및 92 % N이 수반 될 것이다.
참고 : 동적 범위 내에서 산소 변동이 악기로 특정 타임 라인, 프로그램 일정을 통해 원하는 또는 수동으로 원하는 간격으로 산소 설정을 조정하는 경우. - 60 %의 습도를 설정합니다. 워크 스테이션의 분위기는 그럼에도 불구하고 매우 건조하고, 미디어는 눈에 띄게 긴 실험 (> 48 시간) 동안 증발됩니다. (미디어 스테이션 분위기로 평형화되도록) 세포 배양 DIS에 용지를 보충하기 위해 워크 스테이션 내에서 세포 배양 플라스크 내의 미디어 보유 유지HES.
참고 : 용존 산소가 대기 중 산소 36 평형을하도록 (예 : PBS와 트립신 EDTA)를 용해하기 전에 세포와 상호 작용하는 모든 솔루션은 저산소증 워크 스테이션에서 사용하기 전에 24 시간 동안 미리 조절해야합니다. - 용해 될 때까지 워크 스테이션 내에서 세포를 유지합니다.
캡 결합 분석 5. 준비 버퍼
- 1X TBS 버퍼 (TBS)을 준비합니다.
- DH 2 O의 800 ㎖에, 8.76 g의 NaCl 및 6.05 g 트리스베이스를 해산.
- 1 M 염산을 사용하여 7.4의 최종 pH의 용액을 준비한다.
- DH 2 O를 사용하여 1 L로 최종 볼륨을 가져와
- 비 변성 용해 버퍼를 준비한다. 캡 결합 분석의 일을 버퍼에 용해 준비합니다. 빈 아가로 오스 비즈와 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 (7.9 및 7.13 단계) 씻어 추가 용해 버퍼를 확인합니다.
- DH 2 O 7 ㎖에 160 ㎕의 5 M NAC를 추가L, 160 ㎕의 1 M 트리스 -HCl pH 7.4의 40 ㎕의 200 mM의 NaF로부터 40 ㎕를 1 M의 MgCl 2, 40 ㎕의 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트.
- 7 ml의 용액에이게 팔의 40 μl를 추가합니다. 그것은 매우 점성으로이게 팔을 검색 할 수 있도록 피펫의 끝을 잘라.
- 이게 팔이 모두 용해 될 때까지 최대 피펫 아래로, 또는 소용돌이에 의해 7 ml의 솔루션을 섞는다.
- (8) 용액에 용액의 최종 부피를 올리고 얼음에 보관.
- 배 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) -page 샘플 버퍼를 준비합니다.
- 비이커에서 16 ml의 1 M 트리스 - 염산의 pH 6.8, 12.64 ml의 글리세롤, 8 ml의 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 결합합니다.
- SDS 3.2 g 및 브로 모 페놀 블루의 0.16 g을 추가합니다. 분말이 완전히 자기 교반 막대와 혼합하여 용해 할 수 있습니다.
- -20 ° C에서 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장.
6. 세포 용해
- 비 변성 용해 버퍼를 준비하고 얼음에 일의 일을 계속전자의 캡 결합 분석을.
- 30 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 1X PBS 사전 따뜻하고 트립신.
- 각각의 캡 결합 분석을위한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 용해 버퍼의 나누어지는 980 μl를 수행된다.
- 용해 완충액 980 μL에 4- (2- 아미노 에틸) 벤젠 설 포닐 플루오 라이드 하이드로 클로라이드 10 μL 및 100X 프로테아제 저해제 칵테일의 10 μL를 추가한다. 얼음에 보관하십시오.
- 저산소증 워크 스테이션 내에서 폐기물 용기에 각각 150mm 접시에서 미디어를 폐기하십시오.
- 따뜻한 1X PBS의 3-4 ml의 세포를 세척하고 액체를 모두 폐기합니다.
- 각각의 접시에 따뜻한 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 추가하고 2 분 동안 또는 세포가 더 이상 판에 부착 될 때까지 앉아 보자.
- 피펫을 사용하여, 1.5 ml의 microcentrifuge 관 한 판의 세포를 전송합니다. 세포의 각 플레이트는 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송되도록 필요에 따라 반복합니다.
- 90 초 t 6,000 XG에 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기오 세포 펠렛.
- 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 트립신을 대기음. 펠렛은 90 초 동안 6,000 XG에서 다시 원심 분리기 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 방해합니다.
- 부드럽게 단지 펠렛 위의 튜브에 PBS 200 μl를 피펫 팅하여 따뜻한 1X PBS로 세포를 씻으십시오. 다시 원심 분리기 펠렛을 방해합니다.
- 펠렛을 방해하지 않고 PBS를 대기음.
- 1 ml의 피펫으로부터 500 μL가 첫번째 세포 펠렛에 용해 완충 용액을 준비했다. 로 pipetting 아래로 완전히 펠렛을 재현 탁.
- 두 번째 세포 펠렛으로 재현 탁 세포를 결합하고로 pipetting 아래로 두 번째 펠렛을 재현 탁. 모든 펠릿이 결합 된 각각의 샘플에 대한 재현 탁 될 때까지이 과정을 반복합니다.
- 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 용해 버퍼의 나머지 500 μL와 해물을 결합한다.
- 저산소증 워크 스테이션에서 샘플을 제거합니다.
주 : 용해 완충액을 첨가 후,LL 후속 단계는 저산소증 워크 스테이션은 37 ° C로 설정하고, 다음 단계 냉 (4 ℃ 또는 빙상에서) 수행 될 수있는 바와 같이 대기에서 수행되어야한다. - 를 Lyse 1.5-2 시간 동안 39 ° C에서 샘플들을 회전시킴으로써 교반과를 이용하여 세포.
- 세포 파편을 제거하기 위해 4 ° C에서 15 분 동안 12,000 XG에서 분해 된 세포를 원심 분리기.
- 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 해물을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
- 상층 액의 일부 (~ 10 %)가 미래 웨스턴 블롯 분석을 위해 전체 세포 용 해물 입력 제어로서 사용되는 예비.
7. 캡 결합 분석
- 각 샘플에 대해, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브를 블랭크 아가 로스 비드 제어 슬러리의 50 μL와 γ 아미노 - m 7 GTP 아가 C10 결합 비드 슬러리의 50 μl를 옮긴다. 비드 슬러리의 수집을 용이하게하기 위해 피펫의 팁을 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
- 구슬의 B 펠렛Y는 30 초 동안 500 XG에 슬러리를 원심.
- 조심스럽게 상층 액을 제거하고 TBS의 500 μL의 비드를 재현 탁.
- 반복 7.2 및 7.3 단계를 반복합니다. 30 초 동안 500 XG에 구슬을 펠렛과 뜨는을 제거합니다.
- 빈 아가 로스 비드를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 6.19 단계에서 용 해물을 포함하는 상등액을 전송.
주 : 빈 아가 로스 비드 비특이적 비드와 상호 작용 해물로부터 단백질을 제거하기 전 지우기 단계로서 작용한다. - 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 10 분 동안 품어.
- 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 빈 아가 로스 비드 펠렛.
- γ 아미노 - m 7 GTP 아가 C10 결합 된 비드를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 해물을 전송.
- , 용해 완충액 500 μL의 비드를 재현 탁 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 구슬을 펠렛 및 superna을 버리고 빈 아가로 오스 구슬을 씻으십시오중대장. 오 세척 총이 네 번 반복합니다.
- 1X SDS-PAGE 샘플 버퍼에 빈 아가 로스 비드를 재현 탁하고, 95 ℃에서 90 초 동안 비드를 끓인다. 미래의 웨스턴 블롯 분석을 위해 -20 ° C에서 보관 관심의 단백질이 구슬 비 - 특이 적으로 결합 여부를 관찰합니다.
- 캡 - 결합 단백질을 캡처 4 ° C에서 1 시간 동안 교반과 함께 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬과 해물을 품어.
- 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 펠렛. 상층 액을 버린다.
- 단계 7.9을 반복하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬을 씻으십시오.
- 용해 완충액 600 μL의 비드를 재현 탁.
- 최종 농도 1 mM GTP에 추가.
- 4 ℃에서 1 시간 동안 교반과 함께 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 + 1 ㎜ GTP를 품어. 참고 :이를비특이적 m 7 GTP와 상호 작용하는 단백질을 해제한다 (즉,도 비 메틸화 GTP와 상호 작용).
- 30 초 동안 500 XG에 원심 분리하여 γ 아미노 페닐-m 7 GTP 아가로 오스 C10 연결된 구슬 펠렛.
- 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청을 전송 및 4X SDS-PAGE 샘플 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM의 DTT, 2 % SDS, 블루 0.1 % 브로 모 페놀 및 10 % 글리세롤) 200 μL를 추가한다. 미래의 웨스턴 블롯 분석 37 -20 ° C에서 GTP 제어 샘플을 저장합니다. 단계 7.9를 반복하여 구슬을 씻으십시오.
- 90 초 동안 95 ℃에서 1X SDS-PAGE 샘플 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM의 DTT, 2 % SDS, 블루 0.1 % 브로 모 페놀 및 10 % 글리세롤) 및 종기에 비드를 재현 탁. 미래의 웨스턴 블롯 분석 37 -20 ° C에서 m 7 GTP 결합 된 부분을 저장합니다.
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Representative Results
M이 7 GTP 선호도 열에서의 eIF4E 및 eIF4E2의 산소에 반응하여 캡 결합 능력 분석
1 및도 2는 두 사람의 세포주에서 산소 변동에 대한 응답으로 두 가지 주요 캡 - 결합 단백질의 전형적인 m 7 GTP 선호도 정화의 서양 말을 나타냅니다 F의 igure 1과 대장 암의 주요 인간 신장 근위 관 상피 세포 (HRPTEC () 그림 2에서 HCT116). 세포는 액체 매질에 용해 된 산소는 저산소증 스테이션 내의 공기로 평형화했다되도록 24 시간 동안 지시 된 산소 가용성 유지된다. 레인 입력 (IN)이 7 GTP 결합 된 아가 로스 비드 캡 - 결합 단백질을 포착하기 위해 추가되는 m 전에 전체 세포 용 해물의 10 %를 나타낸다. 이 입력은 차선 농축을 측정하기위한 기준으로 사용M 개의 7 GTP 풀다운에서 표적 단백질. GTP 차선이 1 ㎜ GTP와 용출 있던 m 7 GTP 구슬의 용출액이다. 이 단계는 비 메틸화 GTP 인식 단백질의 검출을 허용한다. 캡 - 결합 단백질의 eIF4E 및 eIF4E2 특히 m 7 GTP을 인식하지만, 자신의 동체 (여기에 표시되지 않음) eIF4E3는 비 메틸화 된 GTP 결합한다. 5 'mRNA의 캡 구조체 (m 7 GTP)를 결합하는 eIF4E를하고 eIF4E2의 능력 (총 가용 풀) 입력 차선 내의 세기에 m 7 GTP 열에 대하여 자신의 밴드 강도를 비교하여 측정 할 수있다.
이러한 정량은 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 세 생물학적 복제에 대한 단백질 밴드의 픽셀 강도를 측정함으로써 수행 될 수있다. 결과는 평균의 표준 오차 ± 밀도 단위 (RDU)의 상대 수단으로 표현된다. 원시 값 이전에 정상화실험 및 제어 모두 샘플에서이 짝이 꼬리 학생의 t- 테스트로 비교 하였다. P는 <0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. 대표적인 실험이 두 세포주들이 eIF4E를 사용하고 eIF4E2 산소의 다른 범위를 보여준다. 그림 1은 HRPTEC 만 eIF4E를 강하게 m에 결합하는 것을 보여준다 7 GTP 8 % O 2 (그림 1A)에서, eIF4E를하고 eIF4E2 모두 크게 m 7 GTP ~ 5 %에서 O 2 (그림 1B - C)과 관련된 것으로, 만 eIF4E2이 1 % O 2 (그림 1D)에서 m 7 GTP에 강하게 결합있다. 그림 2에서 HCT116 세포에서 이러한 캡 - 결합 단백질의 산소에 의존 사용법은 다릅니다 만의 eIF4E는 GTP 12 % O 2 (그림 2A)에서 모두 캡 - 결합 단백질이 m (7)에 크게 바인딩 7m에 크게 결합 5-8% O 2 범위에서 GTP(도 2B - C) 및 전용 eIF4E2 3 % O 2 (도 2D)에서 m 7 GTP 크게 결합한다. GTP와 m 7 GTP 컬럼에서 용출의 부재의 eIF4E 및 eIF4E2이 m 7 GTP에 고유 및 비 메틸화 된 GTP를 인식하지 않는 것을 알 수있다. 막대 그래프는 ImageJ에를 사용하여 세 가지 생물학적 복제의 정량을 나타냅니다. 우리의 결과는 두 가지 캡 - 결합 단백질의 eIF4E와 eIF4E2은 산소 - 의존성 방식으로 mRNA의 m 7 GTP 캡 구조에 결합하는 능력에 차이가 있음을 보여준다.
이 두 단백질의 mRNA의 고유 한 클래스의 번역을 시작한다는 이전의 문헌을 바탕으로, 캡 결합 활성이 변화는 산소 가용성의 변화에 적응하기 위해 생성 된 다른 프로테옴 될 수 있습니다. 이 기술은 5 'mRNA의 캡과 상호 작용하는 신규 한 번역 개시 인자를 특성화하는데 사용될 수있다(또는 캡 - 결합 단백질)와 같은 m 7 GTP의 용출액의 질량 분석 분석과 같은 타겟 웨스턴 블롯 방법 또는 광범위한 접근 방식을 통해.
그림 1 : eIF4E를하고 eIF4E2 활동 ~ 5 %의 O 2에서 HRPTEC에 physioxia 동안 중첩된다. GTP 비드 인간 신장 근위 관 상피 세포에서 m 7을 사용하여 캡처 분석법 (HRPTEC) 해물 (A) 8 %, (B) 5 %, (C) 3 % (D) 24 시간 동안 1 % O 2에 노출시켰다. GTP, GTP의 세척 m 7 GTP에 대한 특이성을 측정하는 단계; m 7 GTP, GTP 세척 후 m 7 GTP 구슬에 바인딩 단백질. 대표적인 웨스턴 블롯 RD (도시되어 적어도 3 개의 독립적 인 실험 데이터 ImageJ에 의해 정량화하고 상대 밀도 단위로 표현 하였다전체 세포 용 해물을 10 %의 입력 (IN)에 U) 상대. * P <0.05 (짝이 꼬리 학생의 t- 테스트)는 IN에 캡 결합 된 분획 (m 7 GTP)에서의 eIF4E 또는 eIF4E2의 농축을 비교하여 큰 변화가 고려되었다. 데이터는 세 개의 독립적 인 실험의 평균 표준 오차 (SEM) 평균 ±. 이 연구는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. Timpano, S. 및 Uniacke은 생리 학적 산소에서 배양 J. 인간의 세포는 번역 별개의 mRNA를 모집하는 두 개의 캡 - 결합 단백질을 사용한다. 2016; 291 (20) : 10772-82 24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2의 eIF4E 및 eIF4E2 활동은 5-8에서 HCT116에서 physioxia 동안 중복%의 O 2. GTP 비드 (A) 12 %, (B) 8 %, (C) 5 % (D) 24 시간 동안 3 % O 2에 노출 HCT116 인간 결장 암종 해물에서 m 7을 사용하여 캡처 분석법. GTP, GTP의 세척 m 7 GTP에 대한 특이성을 측정하는 단계; m 7 GTP, GTP 세척 후 m 7 GTP 구슬에 바인딩 단백질. 대표적인 웨스턴 블랏을 나타낸다 적어도 3 개의 독립적 인 실험 데이터 ImageJ에 의해 정량화하고 전체 세포 용 해물을 10 %의 입력 (IN)에 대하여 밀도 유닛 (RDU) 기준으로 표현 하였다. * P <0.05 (짝이 꼬리 학생의 t- 테스트)는 IN에 캡 결합 된 분획 (m 7 GTP)에서의 eIF4E 또는 eIF4E2의 농축을 비교하여 큰 변화가 고려되었다. 데이터는 세 개의 독립적 인 실험의 평균 표준 오차 (SEM) 평균 ±. 이 연구는 원래 생물 화학 저널에 발표되었다. TIMP항문, S. 및 Uniacke은 생리 학적 산소에서 배양 J. 인간의 세포는 번역 별개의 mRNA를 모집하는 두 개의 캡 - 결합 단백질을 사용한다. 2016; 291 (20) : 10772-82 24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포 캡 결합 단백질의 분석은 신규 산소 조절 번역 개시 인자의 확인을 허용 할 수있다. mRNA의 캡 또는 다른 관련 단백질의 5 '캡 이러한 요소의 선호도가 7 m 그들의 관계의 강도에 의해 측정 될 수 아가 로스 비드 GTP 결합. 이 기술의 한 가지주의는 단백질 분해 이후의 캡 결합 전위를 측정하지만,이 단백질 - 단백질 상호 작용과 번역 후 변형 (PTMS)을 유지하는 비 - 변성 조건 하에서 수행된다는 것이다. 여러 단백질 - 단백질 상호 작용는 5 '캡에 eIF4E를 가족의 결합을 중재. 4E-BP는 결합 및 eIF4G과의 상호 작용을 차단하고 38 복잡한 사전 개시 43S의 채용을 방지하여의 eIF4E을 억압. 의 eIF4E / 4E-BP 단지는 성적 증명서에서 모든 개시를 차단, 5 'mRNA의 캡에 결합 남아 있고, 수m 7 GTP 친 화성 컬럼에서의 eIF4E 억제 마커로 사용 될 수있다. 반대로, m 7 GTP 컬럼에 eIF4G와의 eIF4E의 상호 작용은 활성 번역 개시에 대한 지표가 될 수 있습니다. PTMS 번역 개시 인자의 활성을 조절하는 다른 방법이다. 5 'mRNA의 39 캡 예를 들어, MNK1 의하여의 eIF4E의 인산화는 친 화성을 증가시킬 수있다. 인터페론 자극 된 유전자 15 (ISG15)에 의해 코딩되는 단백질 수정은 병원체 감염 (40)를 통해 인터페론 유도에 대한 응답으로 eIF4E2의 캡 결합 활성을 증가시키는 PTM이다. ISG15 유전자는이 시스템이 낮은 산소에 eIF4E2을 조절할 수 있음을 시사의 프로모터에 저산소증 반응 요소가 포함되어 있습니다. 아주 조금 PTMS은 생리 학적으로 관련 산소 조건에서 캡 - 결합 단백질의 활성을 변경할 수 있습니다 방법에 대한 알려져있다. 질량 분광법 분석에이어서이 기술 번째 신규 산소 조절 및 생리 학적 관련성을 밝힐 수 PTMS에서 번역 개시 인자의 활성을 매개한다.
M이 7 GTP 캡 아날로그로 캡처하는 다른 방법은 eIF4E를하거나 eIF4G와 같은 공지의 캡 - 결합 단백질을 면역 침전과 연관된 단백질을 식별하기 위해 질량 분석을 수행하는 것이다. 이 전략의 한계는 캡 - 결합 단백질은 종종 스트레스 (41) 과립 내에이나 모자 독립적 인 번역 1,4의 다른 세포 역할을합니다. 따라서, m 7 GTP 캡 유사체를 이용하면 새로운 캡 관련 단백질을 조사하고 특히, 캡 - 결합 단백질을 분리하는 가장 좋은, 가장 신뢰할 수있는 방법이다. M이 7 GTP 캡 아날로그 사용의 제한 사항에는 폐품도 만 m 7 GTP mRNA의 모자와 상호 작용하지 효소 DCPS을 decapping하지만 일부 캡 - 결합 단백질 (42)를 결합하기위한 제 2베이스를 필요로한다는 것이다. 또한, 예 Dcp1 / Dcp2 착체 일반 decapping 효소, 히드 수m 7 GTP를 olyze 효과적으로 수지 용량을 줄일 수 있습니다. 따라서 일부 캡 - 결합 단백질이 분석에서 손실 될 수 있습니다. 이러한주의를 우회, 효소 내성 mRNA의 캡 유사체가 사용될 수있다. 두 개의 비 - 가수 분해성 캡 유사체, 모노 뉴클레오티드의 m 7 GpCH2pp 7 GpCH2ppA 뉴클레오티드의 m은 DCP를, Dcp1, Dcp2 및 43를 포착하는 것으로 나타났다. 이러한 mRNA의 캡 유사체는 상업적으로 사용할 수 없습니다, 화학적으로 드 노보 합성 할 수 있어야합니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 모자 결합 "편승"를 통해 단백질이나 캡 - 결합 단백질과 상호 작용하는 단백질을 캡처 할 것입니다. 모자 종속 번역 개시가 개시의 주요 형태이지만, 모자 독립적 인 메커니즘은 세포 스트레스 1의 조건에서 특히 유행이다. 그러나,이 기술의 상황과 소설 스트레스 유발 요인이 식별 번역 개시 6-8,24 분야의 새로운 동향에 파모자 종속 개시에 rticipate 연구의 유망한 지역이다.
이 프로토콜에서 고려해야 할 또 다른 요소는 미디어의 산소입니다. 액체 배지에서 세포를 배양하는 세포와 대기 사이에 장벽을 제공한다. 액체 매체가 대기 가스 성분 36 평형을 24 시간까지 걸릴 수 있음을 보였다. 따라서 세포는 이전의 용해에 필요한 산소 가용성에서 24 시간 동안 배양해야하며, 짧은 배양이 필요한 경우 용지가 미리 조절 될 수있다. 사전 에어컨 가스 교환을 할 수있는 멸균 배양 플라스크에 최소 24 시간 동안 저산소증 워크 스테이션에서 미디어를 유지하는 것을 포함한다. 저산소증 워크 스테이션 내에서 세포에 도입 된 모든 산소 솔루션은 빠르게 등이 프로토콜에서 검토되고있는 모자 종속 번역 개시 등의 세포 신호 전달 경로를 변경할 수 있습니다. 때문에 세포의 산소 감지 경로의 감도, 윌 어떤 솔루션이러한 PBS와 트립신 EDTA 등의 용해 이전에 세포와 상호 작용은 최소 24 시간 동안 미리 조절해야합니다. 용해 및 사후 용해 세척 버퍼가 감기에 사용되어야하며, 따라서 37 ° C의 저산소증 워크 스테이션에 미리 조절되지 않습니다. 단백질에 약간의 산소에 의존 수정이 활성화 된 후 용해 될 수 있지만, 추위 버퍼는 유물로 이어질 수 효소 활동 및 단백질 - 단백질 또는 단백질 RNA 복합체의 "셔플"을 최소화해야합니다. 엄격 성을 높이기 위해이 프로토콜에 대한 수정은 24 시간 동안 용해 및 사후 용해 세척 버퍼 조건의 사전 다음 사용하기 전에 워크 스테이션에서 얼음을 배양 할 수있다. 이러한 솔루션은 수분 증발에 의한 농축 때문에 미디어 버퍼는 3 일 이상 저산소증 스테이션 유지되어서는 안된다. 장기 연구에 (> 삼일), 시드 세포의 초기 량을 신중하게 고려되어야한다. 세포 분열 및 접시의 표면적이 혼잡 해짐에 따라,이러한 미디어 산성화 등의 응력은 뚜껑 결합 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 실험 마지막 날에, 세포를 80-90 %의 컨 플루 언시를 가져야한다.
셀의 양 비드 세척 사용 용해까지 저산소증 워크 스테이션에서 세포를 유지하고, 비 메틸화 GTP 제어 네이 프로토콜 내에서 중요한 단계가있다. 1) 낮은 산소의 세포를 유지하기 위해 여러 가지 방법이 있습니다. 이들의 대부분은 단지 세포 배양 접시를 수납 할 수있는 작은 챔버를 포함하지만, 임의의 조작 또는 세포 용해 주위 공기 챔버 외부에서 수행되어야한다. 예컨대 저산소증 유도 인자로서 산소 검지 장치의 구성 요소가 활성화되거나 하나 또는 두 개의 35 분 만에 비활성화된다. 전술 한 바와 같이 때문에, 저산소증 워크 스테이션에서 세포를 용해하는 것은 각각의 산소 이용 가능성과 관련된 상기 캡 - 결합 단백질의 활동을 보장하기 위해 중요하다. 셀 2) 개수이 프로토콜 (이 150mm 요리)에서 제안 강한 m에 적합한 지 등의 eIF4E의 가족이나 복잡 eIF4F (eIF4A 및 eIF4G)의 일원으로 7 GTP 인터랙. 더 많은 세포를 적어도 다섯 150mm 요리, 과도 상호 작용 또는 eIF4F을 통해 m 7 GTP mRNA의 모자와 만 연관을 가진 단백질을 검출하는 데 필요한 수 있습니다. 3) 세포 용 해물로 배양 한 후 비드를 세정 엄격한 덜 엄격하게 수행 될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜 용해 완충액은 비드 다섯 번 세척하기 위해 사용되는 엄격한 옵션을 제공한다. 약한 상호 작용하는 단백질이 경우 단백질은 관심있는 캡 결합 번 적은 세척을 수행하고 TBS 버퍼 대신 용해 완충액을 이용할 수있다. 4) 그 비 - 특이 비드와 상호 작용하는 단백질을 제거하는 접합 아가 미리 투명한 파쇄 일부 캡 - 결합 단백질 진정한 mRNA의 캡 구조를 구별 할 수없는 메틸화 GTP (m에 중요하지만7 GTP) 및 비 - 메틸화 GTP. 그러한 단백질은 eIF4E를 eIF4E3 동체 (44)이다. GTP와 구슬을 용출도 관심이 될 수있는 비 메틸화 된 GTP를 인식하는 단백질을 제거합니다. 모두 m 7 GTP를 인식하고 GTP가 아직 단백질의 생물학적 관련성이 완전히 밝혀합니다. 이것은 비 메틸화 GTP에서 m 7 GTP을 인식 수행의 eIF4E 및 eIF4E2 단백질에 대해 (보존 된 캡 결합 도메인을 가진 선의의 캡 결합 단백질) eIF4E3 관련된 몇 가지 출판물에 의해 강조된다.
이 기술은, 제시된 관심 m 7 GTP의 인터랙를 식별하는 타겟 접근 또는 질량 분석법을 통해 m 7 GTP 용출액을 분석하여 다양한 방식으로 수행 될 수있다. 몇 가지 다른 기술은 세포 내 분류, 면역, 공동 면역 침전하는 바와 같이 캡 결합 활성을 분석 physioxic 노출 (프로토콜 4)을 따를 수있다차의 polysome 분석. 번역 컨트롤은 전사와 같은 유전자 발현에 동등한 참여자로 부상하고있다. 이 기술을 활용하여 모자 종속 번역 개시가 낮은 산소에 반응 조절 방법에 밝혀 줄 것이다 캡 결합 복합체의 활성과 구성을 조사합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15 cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 ml Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreitol | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
References
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