Introduction
Поступательное управления становится столь же важным шагом в регуляции транскрипции в экспрессии генов, особенно в периоды клеточного стресса 1. Координационный центр контроля перевода находится на лимитирующей стадии инициации , где первые этапы синтеза белка связаны с связывание эукариотических фактор инициации 4Е (eIF4E) к 7-methylguanosine (м 7 GTP) 5 'колпачка мРНК 2 , eIF4E является частью тримера комплекса имени eIF4F , который включает eIF4A, РНК - геликазу и eIF4G, белок строительные леса , необходимого для набора других факторов перевода и 40S рибосомы 3. В нормальных физиологических условиях, подавляющее большинство мРНК транслируются с помощью механизма кэп-зависимой, но в периоды клеточного стресса приблизительно 10% человеческих мРНК содержит 5 'НТО , которые могли бы позволить кэп-независимый перевод инициация 1,4. Cap-зависимый перевод был исторически синонимOUs с eIF4F, однако, стресс-специфические вариации eIF4F стали трендом тема 5-8.
Различные клеточные стрессы вызывают eIF4E активность, чтобы быть подавлено через мишень рапамицина у млекопитающих комплекса 1 (mTORC1). Эта киназа становится нарушение в условиях стресса, что приводит к увеличению активности одной из своих целей, то 4E-связывающий белок (4E-BP). Нефосфорилированный 4E-BP связывается с eIF4E и блокирует его способность взаимодействовать с eIF4G вызывает репрессию кэп-зависимой трансляции 9,10. Интересно отметить , что гомолог eIF4E по имени eIF4E2 (или 4EHP) имеет значительно более низкое сродство к 4E-BP 11, может быть , что позволяет ему уйти от стресса опосредованной репрессии. Действительно, первоначально характеризуется как репрессор перевода из - за отсутствия взаимодействия с eIF4G 12, eIF4E2 инициирует перевод сотен мРНК , которые содержат РНК - элементы ответа гипоксия в их 3 'UTR во время гипоксического стресса 6,13. Эта активация яы достигается за счет взаимодействия с eIF4G3, РНК связывающий белок мотив 4 и индуцируемого гипоксией фактор (HIF) 2Л составлять гипоксической eIF4F комплекс, или eIF4F H 6,13. В качестве репрессора при нормальных условиях, eIF4E2 связывается с GIGYF2 и ZNF598 14. Эти комплексы были, в частности, определены через Агарозном-сцепленных м 7 GTP аффинных смол. Этот классический метод 15 является стандартом в области перевода и является лучшим и наиболее часто используемый метод для выделения кэп-связывающих комплексов в выдвиньте вниз и в пробирке анализы связывания 16-19. По мере того как крышка-зависимого перевода машины появляется как гибкость и адаптируемость с интер изменяющие деталей 6-8,13, этот метод является мощным инструментом для быстрого выявления новых кэп-связывающих белков , участвующих в реакции на стресс. Кроме того, изменения в eIF4F может иметь далеко идущие последствия, как несколько эукариотических систем модели появляются использовать гомолог eIF4E2 для таких стрессовых реакцийкак A. thaliana 20, С. Pombe 21, Д. MELANOGASTER 22, и С. Элеганс 23.
Имеющиеся данные свидетельствуют о том , что изменения в eIF4F не может быть строго ограничена стрессовым условиям, но участвовать в нормальной физиологии 24. Подача кислорода к тканям (на концах капилляра) или в тканях (измеряется с помощью микроэлектродов) колеблется от 2-6% в головном мозге 25, 3-12% в легких 26, 3,5-6% в кишечнике 27, 4% в печень 28, 7-12% в почке 29, 4% в мышцах 30, и 6-7% в костном мозге 31. Клетки и митохондрии содержат менее 1,3% кислорода 32. Эти значения гораздо ближе к гипоксии, чем окружающий воздух, где клетки обычно культивируют. Это говорит о том, что ранее считалось, как гипоксия специфические клеточные процессы, которые могут быть необходимы в физиологической обстановке. Интересно, что eIF4F и eIF4F H 24. Низкий уровень кислорода также приводит правильное развитие плода 33 и клетки обычно имеют более высокий уровень пролиферации, увеличенный срок службы, меньше повреждений ДНК и меньше ответов общего напряжения в physioxia 34. Поэтому eIF4F H, вероятно , является ключевым фактором в экспрессии генов , выбранных в физиологических условиях.
Здесь мы приводим протокол к культуре клеток в основных физиологических условиях кислорода или в динамическом диапазоне колеблющейся, который, вероятно более представительным микросреды ткани. Одно из преимуществ этого способа состоит в том, что клетки лизируют в пределах рабочей станции гипоксией. Не так часто, ясно, как переход от гипоксического культуры клеток к лизису клеток производится в других протоколах. Клетки часто сначала удаляют из небольшого гипоксией инкубаторе бытьпередний лизис, но это воздействие кислорода может влиять на биохимические пути , как клеточная реакция с кислородом происходит быстро (один или два мин) 35. Некоторые кэп-связывающие белки требуют взаимодействия с вторым основанием или может гидролизовать м 7 ГТФ, поэтому некоторые крышки interactors могут быть пропущены в процессе очистки. Агарозном связаны с аналогами ферментативно резистентных Колпачок может быть заменен в данном протоколе. Изучение активности и состава eIF4F H и других вариаций eIF4F с помощью метода , описанного здесь будет пролить свет на запутанные экспрессии генов механизмов , которые клетки используют в процессе физиологических условиях или стрессовых реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка к культуре клеток
- Покупка коммерчески доступные запасы человеческих клеток.
Примечание: Этот протокол использует НСТ116 колоректальной карциномы и первичной почки проксимальных канальцев эпителиальные клетки человека (HRPTEC). - Сделать 500 мл среды для культивирования НСТ116: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) / Высокий средний глюкозы, дополненной 7,5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S).
- Сделать 500 мл среды для культивирования HRPTEC: Эпителиальный среду клеток, дополненной 5% FBS, 1% добавки роста эпителиальных клеток, а 1% P / S.
- Приготовьте 500 мл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS): 140 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 15 мМ KH 2 PO 4. Регулировка рН до 7,4 и стерилизуют в автоклаве в течение 40 мин при температуре 121 ° С.
2. Начало культивирования клеток
- Тщательно аспирата среду от 80-90% сливающийся блюдо с не нарушая тон клетки.
- Аликвотные 3-5 мл 1x PBS на чашку для культивирования, аккуратно раскачивать каждую колбу, чтобы покрыть площадь поверхности тарелки, и тщательно аспирата 1X PBS. Повторите эти действия для второй промывки 1x PBS.
- Алиготе 3 мл 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в каждую чашку для культивирования и осторожно встряхните, чтобы равномерно слой клеток с помощью трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 мин.
- Передача обособленные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 4000 х г в течение 90 сек.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды DMEM.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Подсчитайте , сколько апирогенно и полистирольная 100 мм чашки для культивирования клеток необходимы для достижения начальной плотности посева около 2500-5000 клеток на см 2.
- Предварительно теплая полная среда для культивирования клеток сделаны с шагом 1.2 или 1.3, в водяной бане при 37 ° С в течение 30-45 мин.
- Дезактивацию средней бутылки и флакон клеток с 70% этанола. С этого момента всеоперации должны быть выполнены в асептических условиях.
- Алиготе 6 мл полной DMEM на столько 100 мм чашки для культивирования клеток, необходимых для использования весь объем замороженных клеток в пределах плотности высева упомянутого в пункте 2.6.
- Перенести объем клеточной суспензии, вычисленным на этапе 2.6 к каждому из мм культуральные чашки 100. Rock каждую пластину вручную, чтобы равномерно распределить клетки по поверхности пластины.
- Поместите отобранный 100 мм для культивирования клеток блюдо в инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Разрешить клетки инкубировать по меньшей мере, 24 ч до следующих шагов.
3. пересева
- Просмотреть каждую ячейку культуры блюдо под микроскопом, чтобы определить процент клеток сплошности (% клеток, покрывающих площадь тарелки). Возвращение клеток в инкубатор и предварительно теплой полной среде и 1х PBS. Перейдите к следующему шагу, если клетки 80-100% сплошности.
- Тщательно аспирата затрачиваемое среду не нарушаяклеток в каждой культуре блюдо.
- Аликвотные 3-5 мл 1x PBS на чашку для культивирования, аккуратно раскачивать каждую колбу, чтобы покрыть площадь поверхности тарелки, и тщательно аспирата 1X PBS. Повторите эти действия для второй промывки 1x PBS.
- Алиготе 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в каждую чашку для культивирования и осторожно встряхните, чтобы равномерно слой клеток с помощью трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 2-3 мин.
- Во время этой инкубации аликвоты 10 мл полной среды на столько чашки для культивирования, необходимых для получения плотности клеток 2500-5000 клеток на см 2.
- Когда клетки отделяются от пластины, быстро добавляют 3 мл 1x определенного ингибитора трипсина и осторожно взболтать блюдо в течение 1 мин, чтобы гарантировать, что все трипсин-ЭДТА был нейтрализован.
- Перенесите отдельные клетки в стерильный 15 мл центрифужную пробирку и отложите в сторону. Добавьте 3 мл 1x PBS в блюдо, чтобы собрать оставшиеся клетки, и передать, что к тому же 15 мл центрифужную пробирку.
- Гранул клетки центрифугированием 150 XGв течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл полной среды.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 150 мм культуральные чашки , содержащей 15 мл полной среды , чтобы получить плотность клеток 2500-5000 клеток на см 2. Используйте два 150 мм для каждого колпачка-связывающего анализа.
Примечание: диффузии кислорода к клеткам через жидкие среды зависит от объема 36. Рекомендуется сохранить объем средств массовой информации в соответствии между экспериментами, используются ли прилипшие клетки или клетки в суспензии. Средства массовой информации могут быть предварительно кондиционером (инкубируют в рабочей станции, в течение 24 часов, как было описано в обсуждение), чтобы избежать этих изменчивости в процессе диффузии. - Поместите посуду отобранный-культуры в термостате при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Разрешить клетки инкубировать по меньшей мере, через 24 часа, прежде чем перейти к следующему шагу.
4. Physioxic экспозиции
- Просмотреть клетки под микроскопом. Для BESРезультаты T, убедитесь, что клетки на 70-80% сплошности для воздействия на 24 ч, 50-60% сплошности для воздействия на 48 часов, а затем 40-50% сплошности для облучения в 72 ч.
- Поместите клетки в гипоксией рабочей станции в течение требуемого времени (24, 48, или 72 ч в зависимости от эксперимента).
- Установите рабочую станцию к соответствующему physioxia.
Примечание: Например, установка 3% O 2 будет сопровождаться 5% CO 2 и 92% N 2.
Примечание: Если колебания кислорода в пределах динамического диапазона желательно более конкретные сроки, программирования расписания в прибор или вручную настроить параметры кислорода в нужных интервалах. - Установите влажность до 60%. Атмосфера рабочая станция очень сухая, тем не менее, и средства массовой информации будут заметно испаряются во время длительных экспериментов (> 48 ч). Держите резерв средств массовой информации в клеточной культуре колбу в пределах рабочей станции (так что носитель уравновешивают с атмосферой рабочей станции) для пополнения средств массовой информации в культуре клеток дисГЭК.
Примечание: Любое решение , которое будет взаимодействовать с клетками , предшествующих лизиса (например, PBS и трипсин-ЭДТА) должны быть предварительно кондиционируют в течение 24 часов перед использованием внутри рабочей станции гипоксией таким образом , чтобы содержание растворенного кислорода уравновешивается с атмосферным кислородом 36. - Хранить клетки в пределах рабочей станции до лизиса.
5. Подготовка Буферы для Cap-анализе на связывание
- Приготовьте 1х Трис-солевом буфере (TBS).
- В 800 мл дН 2 O растворяют 8,76 г NaCl и 6,05 г Трис Base.
- Доведите раствор до конечного рН 7,4 с помощью 1 М HCl.
- Принесите конечный объем до 1 л с использованием дН 2 O.
- Готовят без денатурированного буфера для лизиса. Подготовка буфера для лизиса день колпачка-связывающего анализа. Сделайте дополнительный буфер для лизиса мыть пустые шарики агарозы и тому γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сцепленные бусинки (шаги 7.9 и 7.13).
- В 7 мл дН 2 O, добавляют 160 мкл 5 М NACл, 160 мкл 1 М Трис-HCl , рН 7,4, 40 мкл 200 мМ NaF, 40 мкл 1 М MgCl 2, и 40 мкл 1 мМ ортованадата натрия.
- Добавьте 40 мкл Igepal к раствору 7 мл. Обрежьте кончик пипетки, чтобы помочь восстановить Igepal как это чрезвычайно вязкая.
- Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз, или вихрь, раствор 7 мл, пока все Igepal не растворится.
- Повысить конечный объем раствора до 8 мл, и держать на льду.
- Подготовьте 4x додецилсульфат натрия (SDS) -page буфера выборок.
- В химическом стакане, смешайте 16 мл 1 М Трис-HCl, рН 6,8, 12,64 мл глицерина и 8 мл дитиотреитола (DTT).
- Добавить 3,2 г SDS и 0,16 г бромофенолового синего. Разрешить порошок полностью раствориться при перемешивании с помощью магнитной мешалки.
- Алиготе в 1,5 мл микропробирок и хранят при -20 ° С.
6. лизиса клеток
- Подготовить неденатурирующем буфер для лизиса и держать на льду день гое капсюль-анализа связывания.
- Предварительно теплой 1X PBS и трипсина в водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин.
- Алиготе 980 мкл буфера для лизиса в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для каждого колпачка-связывающего анализа выполняются.
- Добавляют 10 мкл 4- (2-аминоэтил) фторид-бензолсульфонил гидрохлорида и 10 мкл 100-кратного ингибиторов протеаз к 980 мкл буфера для лизиса. Держите на льду.
- Выбросить носитель из каждого 150 мм блюдо в мусорный контейнер внутри рабочей станции гипоксией.
- Промывают клетки с 3-4 мл подогретого 1x PBS и выбросить всю жидкость.
- Добавить 1 мл подогретого 0,05% трипсина-EDTA в каждую чашку и оставьте на 2 мин или пока клетки больше не привязаны к пластине.
- С помощью пипетки переносят клетки одной пластины на 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Повторите по мере необходимости так, чтобы каждая пластина клеток переносили в отдельную 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга 1,5 мл микроцентрифужных трубки при 6000 мкг в течение 90 сек тO осадка клеток.
- Аспирируйте трипсина с помощью пипетки, не нарушая гранул. Если осадок нарушен, повторно Центрифуга микроцентрифужных трубки 1,5 мл при 6000 мкг в течение 90 сек.
- Вымойте клетки с теплой 1x PBS, осторожно пипеткой 200 мкл PBS в трубу непосредственно над шариком. Повторно центрифуге, если осадок нарушен.
- Аспирируйте PBS, не нарушая гранул.
- Пипеток 500 мкл из 1 мл буфера для лизиса приготовленный раствор на первой сотовой гранулы. Ресуспендируют осадок полностью пипетированием вверх и вниз.
- Объединяют ресуспендировали клетки со вторым осадку клеток и ресуспендируют вторую таблетку с помощью пипетки вверх и вниз. Повторите этот процесс, пока все гранулы не были объединены и ресуспендировали для каждого образца.
- Смешайте лизата с оставшимися 500 мкл буфера для лизиса в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Удалить образцы с рабочей станции гипоксией.
Примечание: После добавления лизиса буфер,Л.Л. последующие шаги должны быть выполнены в окружающем воздухе в качестве рабочей станции гипоксия установлен на 37 ° С, и следующие шаги должны быть выполнены холодным (4 ° С или на льду). - Лизировать клетки, используя легкое перемешивание путем вращения образцов при 4 ° С в течение 1,5-2 ч.
- Центрифуга лизированных клеток при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
- Передача лизата в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и выбросить осадок.
- Резервируют часть (5-10%) надосадочной жидкости для использования в качестве целого входного контроля клеточного лизата для будущего Вестерн-блот-анализа.
7. Cap-связывающим Анализ
- Для каждого образца, передать 50 мкл заготовки агарозном суспензии управления шарик и 50 мкл γ-аминофенил-м 7 ГТФ агарозы С10-сцепленного шарик суспензии для отделения 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Используйте ножницы, чтобы удалить кончик пипетки для облегчения сбора суспензии шарик.
- Гранул бусы бу центрифугирование суспензии при 500g в течение 30 сек.
- Удалить супернатант и ресуспендируют тщательно бусин в 500 мкл TBS.
- Повторите шаги 7.2 и 7.3. Гранул шарики при 500 мкг в течение 30 сек и удалить супернатант.
- Передача супернатант, содержащий лизата из стадии 6,19 в пробирку микроцентрифужных 1,5 мл раствора, содержащего пустые агарозном бисером.
Примечание: Пустые агарозном шарики действуют в качестве стадии предварительной клирингового для удаления белков из лизата, которые неспецифически взаимодействовать с буртиком. - Инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С при осторожном перемешивании.
- Гранул пустые агарозном бисером центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек.
- Передача лизата в микроцентрифужных пробирку объемом 1,5 мл , содержащей γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусы.
- Промыть пустые агарозном бисером ресуспендирования бисером в 500 мкл буфера для лизиса, гранулирование шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек, и отбрасывая supernaTant. Повторите это четыре раза в общей сложности пять стирок.
- Ресуспендируют пустые агарозном бисером в 1x SDS-PAGE образца буфера, и кипение шариками в течение 90 сек при 95 ° С. Хранить при -20 ° С для последующего Вестерн-блоттинга, чтобы наблюдать, связывается ли представляющий интерес белок, неспецифически к буртика.
- Выдержите лизата с γ-аминофенил-м 7 ГТФ агарозы С10-сцепленных бусинок при осторожном перемешивании в течение 1 часа при 4 ° С для захвата кэп-связывающих белков.
- Гранул γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек. Удалите супернатант.
- Вымойте γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусинки, повторив шаг 7.9.
- Ресуспендируют бисером в 600 мкл буфера для лизиса.
- Добавить ГТФ до конечной концентрации 1 мМ.
- Инкубируйте γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый бусин + 1 мМ GTP при осторожном перемешивании в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Примечание: Этабудет разъединить белки , которые неспецифически взаимодействуют с 7 м GTP (то есть, также взаимодействуют с не денатурированного GTP).
- Гранул γ-аминофенил-м 7 GTP агарозном С10-сшитый шарики центрифугированием при 500 мкг в течение 30 сек.
- Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и добавляют 200 мкл 4-кратным SDS-PAGE образца буфера (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, и 10% глицерина). Хранить контрольный образец ГТФ при -20 ° С для последующего Вестерн - блот - анализа 37. Вымойте бисером, повторив шаг 7.9.
- Ресуспендируют бисером в 1x SDS-PAGE образца буфера (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерина), и кипение при температуре 95 ° С в течение 90 сек. Хранить м 7 ГТФ-связанной фракции при -20 ° С для последующего Вестерн - блот - анализа 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ Cap-связывающая способность в ответ на кислородом eIF4E и eIF4E2 в качестве м 7 GTP сходству столбца
На рисунках 1 и 2 представляют собой вестерн - блоттинга типичных м 7 GTP аффинной очистки двух основных кэп-связывающих белков в ответ на колебания кислорода в двух клеточных линий человека: первичные почечные проксимальных канальцев эпителиальные клетки человека (HRPTEC) в F igure 1 и колоректальной карциномы ( НСТ116) на рисунке 2. Клетки поддерживают при указанном наличие кислорода в течение 24 ч, чтобы гарантировать, что содержание растворенного кислорода в жидкой среде, имеет уравновешенную воздуха внутри рабочей станции гипоксией. Входной полоса (IN) составляет 10% от всего клеточного лизата до 7 м ГТФ-сшитые агарозные гранулы добавляют для захвата кэп-связывающих белков. Этот вход полоса используется в качестве основы для измерения обогащенияцелевого белка в ГТФ пулдауна м 7. ГТФ полоса является Элюат из м 7 ГТФ бусинок , которые были элюат с помощью 1 мМ ГТФ. Этот шаг позволяет для обнаружения белков, которые также распознают не-метилированных ГТФ. Колпачок-связывающие белки eIF4E и eIF4E2 признать м 7 GTP конкретно, но их гомологов eIF4E3 (здесь не показано) также связывается с не-денатурированного ГТФ. Способность eIF4E и eIF4E2 связать 5 'мРНК структуру чашечка (м 7 GTP) может быть измерена путем сравнения интенсивности их полос в м 7 колонки ГТФ по отношению к интенсивности во входной полосе (всего имеется бассейн).
Это количественное определение может быть выполнено путем измерения интенсивности пикселей полос белка для трех биологических повторностях с программным обеспечением для анализа изображений, таких как ImageJ. Результаты выражали в виде относительных единиц средств плотности (РДУ) ± стандартная ошибка среднего значения. Сырые значения до нормализацииот обоих экспериментальных и контрольных образцов сравнивали с помощью Т-тест непарный двух Стьюдента. P <0,05 считалось статистически значимым. Этот представительный эксперимент показывает, что две клеточные линии имеют различные диапазоны кислорода для их eIF4E и eIF4E2 использования. На рисунке 1 показано , что в HRPTEC только eIF4E сильно связывается с м 7 ГТФ на 8% O 2 (рис 1А), что оба eIF4E и eIF4E2 значительно связаны с м 7 ГТФ с 3-5% O 2 (фиг.1В - C), и что только eIF4E2 прочно связывается с м 7 GTP на 1% O 2 (рис 1D). На рисунке 2 в НСТ116 клетках, кислород-зависимого использования этих кэп-связывающих белков отличается: только eIF4E значительно связывается с м 7 ГТФ при 12% O 2 (Фигура 2А), причем оба кэп-связывающие белки значительно связываются с м 7 ГТФ в 5-8% диапазоне O 2(Фигура 2В - С), и только eIF4E2 значительно связывается с м 7 GTP на 3% O 2 (рис 2D). Отсутствие вымывания из ГТФ колонны 7 м с ГТФ показывает , что eIF4E и eIF4E2 являются специфическими для 7 м GTP и не признают , не денатурат ГТФ. Гистограммы представляют количественную оценку трех биологических повторностях с использованием ImageJ. Наши результаты показывают , что два основных кэп-связывающих белков, eIF4E и eIF4E2, различаются по своей способности связывать мРНК м 7 GTP структуру крышки в кислородно-зависимым образом.
Основываясь на предыдущей литературе, что эти два белка инициировать перевод уникальных классов мРНК, этот сдвиг в кепке-связывающей активности может привести к различным протеомов сгенерированных адаптироваться к изменениям в наличии кислорода. Этот метод может быть использован для характеристики новых факторов инициации трансляции, которые взаимодействуют с 'мРНК колпачка 5(или с капитализацией-связывающими белками) через целевой Вестерн - блот подхода или широкого подхода , таких как масс - спектрометрического анализа с 7 м GTP элюата.
Рисунок 1: eIF4E и eIF4E2 деятельности перекрываются во physioxia в HRPTEC от 3-5% O 2. Анализы с использованием Захват м 7 GTP бусин в человеческой почечной проксимальных канальцев эпителиальной клетки (HRPTEC) лизаты воздействию (А) 8%, (б) 5%, (C) 3% или (D) 1% O 2 в течение 24 часов. GTP, ГТФ мытья для измерения специфичность в отношении м 7 ГТФ; м 7 GTP, белки , связанные с м 7 GTP шариков после GTP мытья. Представитель Вестерн-блоты показаны и данные по меньшей мере, в трех независимых экспериментах были количественно ImageJ и выражали в единицах относительной плотности (RDU) по сравнению с 10% вход (IN) цельных клеточных лизатов. * P <0,05 (непарный Стьюдента-тест Стьюдента) считалось существенным изменением при сравнении обогащения eIF4E или eIF4E2 в кепке связанной фракции (м 7 GTP) к IN. Данные, среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) из трех независимых экспериментов. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Timpano, С. и Uniacke клетки человека J. культивированные в физиологическом кислорода используют два кэп-связывающих белков для набора различных мРНК для перевода. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. eIF4E и деятельность eIF4E2 перекрываются во physioxia в НСТ116 от 5-8% O 2. Захват анализа с использованием м 7 GTP бусин в НСТ116 человеческой колоректальной карциномы лизатов , подвергающихся (A) 12%, (Б) 8%, (C) 5% или (D) 3% O 2 в течение 24 часов. GTP, ГТФ мытья для измерения специфичность в отношении м 7 ГТФ; м 7 GTP, белки , связанные с м 7 GTP шариков после GTP мытья. Представитель Вестерн-блоты показаны и данные по меньшей мере, в трех независимых экспериментах были количественно ImageJ и выражается в единицах относительной плотности (РДУ) по сравнению с 10% вход (IN) всей лизата клеток. * P <0,05 (непарный Стьюдента-тест Стьюдента) считалось существенным изменением при сравнении обогащения eIF4E или eIF4E2 в кепке связанной фракции (м 7 GTP) к IN. Данные, среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) из трех независимых экспериментов. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Timpано, С. и Uniacke клетки человека J. культивированные в физиологическом кислорода используют два кэп-связывающих белков для набора различных мРНК для перевода. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ кэп-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых физиологических условиях кислорода может быть предусмотрена возможность идентификации новых кислородных регулируемых факторов инициации трансляции. Сродство этих факторов для колпачка 5 'мРНК или других кэп-ассоциированных белков может быть измерена с помощью силы их ассоциации с м 7 GTP-сшитый агарозном бисером. Одно предостережение этого метода заключается в том, что он измеряет кэп-связывающий потенциал белков после лизиса, но она выполняется под неденатурирующих условиях, которые поддерживают белок-белковых взаимодействий и пост-трансляционные модификации (PTMs). Несколько белок-белковых взаимодействий опосредовать связывание семейства eIF4E с колпачком 5 '. 4E-BP связывает и репрессирует eIF4E, блокируя его взаимодействие с eIF4G и предотвращению вербовки в 43S предварительного инициирования комплексных 38. Комплекс eIF4E / 4E-BP остается связанным с "мРНК колпачка 5, блокируя любое посвящение от этой стенограммы, а можетиспользоваться в качестве маркера для eIF4E торможения в м 7 ГТФ аффинные колонки. С другой стороны , взаимодействие eIF4E с eIF4G на 7 м GTP колонн может быть маркером для активного инициации трансляции. PTMs еще один способ регулировать активность факторов инициации трансляции. Например, фосфорилирование eIF4E путем Mnk1 может увеличить сродство к мРНК 5 'крышки 39. Модификатор белок , кодируемый Интерферон стимулированного гена 15 (ISG15) является ПТМ , что увеличивает кэп-связывающую активность eIF4E2 в ответ на индукции интерферона через 40 возбудителя инфекции. Ген ISG15 содержит элемент ответа гипоксия в его промоутера предполагая, что эта система может регулировать eIF4E2 в низким содержанием кислорода. Очень мало известно о том, как PTMs может изменять активность кэп-связывающих белков во время физиологически соответствующих условий кислорода. Этот метод с последующим масс-спектрометрического анализа может выявить новые кислородные регулируемых и физиологически соответствующие PTMs-йна опосредовать активность факторов инициации трансляции.
Альтернативный метод захвата с 7 м GTP аналога крышки будет иммунопреципитации известную кэп-связывающий белок , такой как eIF4E или eIF4G и выполнить масс - спектрометрии для идентификации белков , связанных с . Ограничение этой стратегии заключается в том, что Сар-связывающие белки часто имеют альтернативные клеточные функции , такие как в пределах напряжений гранул 41 или в кепке независимый перевод 1,4. Поэтому, используя м 7 GTP колпачковые аналогов является лучшим, самым надежным способом изолировать кэп-связывающих белков, особенно при исследовании новых кэп-ассоциированных белков. Ограничение использования в м 7 ГТФ колпачок аналог , что некоторые кэп-связывающие белки , такие как поглотитель decapping фермент ПСД не только взаимодействовать с м 7 ГТФ мРНК колпачка, но и требуют вторую базу для связывания 42. Кроме того, decapping ферменты в целом, такие как комплекс Dcp1 / Dcp2, может гидрolyze м 7 GTP и эффективно уменьшить емкость смолы. Таким образом, некоторые крышки-связывающие белки могут быть потеряны в этом анализе. Для того, чтобы обойти эти подводные камни, аналоги ферментативно устойчивые мРНК крышки могут быть использованы. Два негидролизуемый колпачок аналоги, мононуклеотид м 7 GpCH2pp или динуклеотид м 7 GpCH2ppA было показано , что захват ПСД, Dcp1 и Dcp2 43. Эти аналоги мРНК клапана не доступны коммерчески, но они должны быть химически синтезированы заново. Другим ограничением этого протокола является то, что только капсюль-связывающие белки или белки, взаимодействующие с капитализацией-связывающих белков с помощью "Спекуляция" будут захвачены. В то время как шапка-зависимые инициации трансляции является основной формой инициации, шапка-независимые механизмы особенно распространены во условиях клеточного стресса 1. Тем не менее, в контексте этой техники и новых тенденций в области инициации трансляции 6-8,24, выявление новых факторов стресс-индуцированной , что раrticipate в кэп-зависимой инициации является перспективной областью исследований.
Другой фактор, чтобы рассмотреть в этом протоколе является кислород в средствах массовой информации. Культивированием клеток в жидкой среде, обеспечивает барьер между клетками и атмосферой. Было показано , что жидкие среды может потребоваться до 24 часов для уравновешивания с составом 36 атмосферного газа. Таким образом, клетки должны быть культивированы в течение 24 часов в желаемом наличие кислорода до лизиса, или средства массовой информации могут быть предварительно кондиционером, если требуются более короткие инкубацию. Предварительная подготовка включает в себя поддержание средств массовой информации в рабочей станции гипоксией в течение по крайней мере 24 часов в стерильной колбе для культивирования, который позволяет газообмен. Любое окисленный раствор введен в клетки внутри рабочей станции гипоксия может быстро изменить клеточные пути передачи сигналов, таких как крышка-зависимой инициации трансляции, которая в настоящее время рассматривается в данном протоколе. Из-за чувствительности кислорода зондирования путей в клетках, любое решение, которое будетвзаимодействуют с клетками, предшествующих лизиса, таких как PBS и трипсин-ЭДТА должен также быть предварительно выдержан в течение не менее 24 часов. Лизису и после лизиса мыть буферы должны быть использованы холодный и, следовательно, не были предварительно кондиции в C гипоксией рабочую станцию 37 °. В то время как некоторые кислородные-зависимые модификации белков может быть активным после лизиса, холодные буферы необходимы для минимизации ферментативной активности и "перетасовки" белок-белок или РНК-комплексов, которые могут привести к артефактам. Модификация этого протокола для увеличения жесткости может быть предварительным условием лизису и после лизиса мыть буферов в течение 24 ч, а затем инкубировать их на льду в течение рабочей станции перед использованием. Средства массовой информации и буферы не должны храниться в рабочей станции гипоксией в течение более трех дней, потому что эти решения будут концентрироваться в результате испарения воды. Для более долгосрочных исследований (> 3 дня), начальное количество клеток, посеянных должны быть тщательно продуманы. Как клетки делятся и площадь поверхности тарелки становится тесно,другие стрессы, такие как медиа-подкисления может влиять на активность кэп-связывающих белков. В последний день эксперимента клетки должны иметь слитности 80-90%.
Есть четыре важных шагов в рамках этого протокола: сохранение клеток в гипоксия рабочей станции до лизиса, количество клеток, используемых, мытье шарики, а также не-метилированных управления GTP. 1) Есть несколько методов для поддержания клеток в низким содержанием кислорода. Большинство из них включают в себя небольшие камеры, которые могут содержать только блюда клеточной культуры, но любые манипуляции или лизис клеток должны быть выполнены вне камер в атмосферном воздухе. Компоненты кислородного зондирования машины , такие как индуцируемого гипоксией факторы активируются или инактивируется в течение нескольких одного или двух минут 35. Таким образом, как уже упоминалось ранее, лизиса клеток в гипоксической рабочей станции имеет решающее значение для обеспечения активности капа-связывающих белков, который связан с соответствующей доступности кислорода. 2) Количество ячеекпредложил в этом протоколе (два 150 - мм чашках) достаточна для сильного м 7 GTP interactors такие как семейство eIF4E или членов eIF4F комплекса (eIF4A и eIF4G). Более клетки, по крайней мере , пять 150 мм блюда, может потребоваться для обнаружения белков с переходными взаимодействий или что только ассоциированной с 7 м GTP мРНК колпачком через eIF4F. 3) промывание бусинки после выдержки их в термостате с Клеточный лизат может быть выполнена в строгой и менее строгим образом. Протокол, представленные здесь, предлагает строгий вариант, где лизиса буфер используется для мытья бисером пять раз. Если белки с более слабыми взаимодействиями в довершение-связывающие белки представляют интерес, можно выполнить меньшее количество промывок и используют трис-забуференный солевой раствор вместо буфера для лизиса. 4) В то время как важно предварительно очистить клеточный лизат с неконъюгированная агарозы для удаления белков, которые не специфически взаимодействуют с борта, некоторые крышки-связывающие белки не могут различать между истинной структуры мРНК колпачком, метилированный GTP (м7 GTP), и не метилируется ГТФ. Одним из таких белков является eIF4E гомолог eIF4E3 44. Элюирование шарики с ГТФ вытеснят любой белок, который также признает, не денатурат ГТФ, который мог бы представлять интерес. Биологическая значимость белков , которые распознают как м 7 GTP и GTP до сих пор не выяснена. Это подчеркивается в нескольких публикациях , связанных с eIF4E3 (который является добросовестным капсюль-связывающий белок с законсервированного кэп-связывающий домен) по отношению к eIF4E и eIF4E2 белки, которые делают признают м 7 GTP из не-метилированных ГТФ.
Этот метод, как представлено, может быть выполнена в качестве целевого подхода к выявлению м 7 GTP interactors , представляющие интерес или как широкий подход, анализируя м 7 GTP элюата с помощью масс - спектрометрии. Некоторые другие методы могут следовать physioxic воздействия (протокол 4) для анализа кэп-связывающей активности, такие как внутриклеточного фракционирования, иммунофлюоресценции, совместно иммунопреципитации, вй анализ полисом. Поступательное управления становится равным вклад в экспрессии генов в транскрипции. Используя эту технику, чтобы исследовать активность и состав кэп-связывания комплексов будет пролить свет на инициации трансляции капсюль-зависимой регулируется в ответ на низкий уровень кислорода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15 cm culture dish |
AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
1.5 ml Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
Dithiothreitol | Fisher | BP172-25 | DTT |
Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
- Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
- Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
- Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
- Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
- Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
- Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
- Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
- Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
- Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
- Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
- Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
- Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
- Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
- Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
- Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
- Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
- Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
- Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
- Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
- Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
- Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
- Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
- Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
- Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
- Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
- Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
- Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
- Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
- Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
- Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
- Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).