Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/55112
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Introduction

Translationell kontroll framstår som en lika viktigt steg för transkriptionsreglering i genuttryck, särskilt under perioder av cellulär stress 1. En brännpunkt översättnings kontroll är det hastighetsbegränsande steget om inledande där de första stegen i proteinsyntesen involverar bindning av den eukaryota inledande faktorn 4E (eIF4E) till 7-metylguanosin (m 7 GTP) 5 'cap av mRNA 2 . eIF4E är en del av en trimer komplex som heter eIF4F som innehåller eIF4A, en RNA-helikas och eIF4G, en byggnadsställning protein som erfordras för att rekrytera andra faktorer översättnings och 40S ribosom 3. Under normala fysiologiska betingelser, är den stora majoriteten av mRNA översätts via en cap-beroende mekanism, men under perioder av cellulär stress approximativt 10% av humana mRNA-sekvenser innehåller 5 'UTR som kan ge cap-oberoende translation intiation 1,4. Cap-beroende översättning har historiskt varit synonymdigt med eIF4F dock stressspecifika variationer av eIF4F har blivit en trend ämne 5-8.

Olika cellulära påfrestningar orsakar eIF4E aktivitet undertryckas via mammalian target of rapamycin komplex 1 (mTORC1). Detta kinas blir nedsatt under stress, vilket resulterar i ökad aktivitet av ett av sina mål, det 4E bindande protein (4E-BP). Icke-fosforylerad 4E-BP binder till eIF4E och blockerar dess förmåga att interagera med eIF4G orsakar repression av locket beroende översättning 9,10. Interestingly, en homolog av eIF4E namnges eIF4E2 (eller 4EHP) har en mycket lägre affinitet för 4E-BP 11, kanske gör det möjligt att kringgå stressen-medierad repression. I själva verket, till en början karaktäriseras som en repressor av översättning på grund av sin bristande samverkan med eIF4G 12, eIF4E2 initierar översättning av hundratals mRNA som innehåller RNA hypoxi svarselement i deras 3 'UTR under hypoxisk stressen 6,13. Denna aktivering is som uppnås genom interaktioner med eIF4G3, RNA-bindande proteinmotiv 4, och hypoxi inducerbara faktorn (HIF) 2α för att utgöra en hypoxisk eIF4F komplexa eller eIF4F H 6,13. Som en repressor under normala förhållanden, eIF4E2 binder med GIGYF2 och ZNF598 14. Dessa komplex, delvis identifieras genom agaros-länkade m 7 GTP affinitetshartser. Denna klassiska metoden 15 är standard inom översättning och är den bästa och mest använda tekniken för att isolera cap-bindande komplex i pull down och in vitro bindningsanalyser 16-19. Då locket beroende translation maskiner framstår som flexibel och anpassningsbar med inter förändrande delarna 6-8,13, är denna metod ett kraftfullt verktyg för att snabbt identifiera nya cap-bindande proteiner som är involverade i stressvaret. Vidare variationer i eIF4F kan få stora återverkningar som flera eukaryota modellsystem verkar använda en eIF4E2 homolog för stressreaktioner sådanasom A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, och C. elegans 23.

Uppgifter tyder på att variationer i eIF4F inte kan vara strikt begränsad till betona villkor, men att delta i normal fysiologi 24. Syretillförseln till vävnader (vid kapillära ändar) eller inom vävnader (mätt via mikroelektroder) varierar från 2-6% i hjärnan 25, 3-12% i lungorna 26, 3,5-6% i tarmen 27, 4% i levern 28, 7-12% i njuren 29, 4% i muskel 30, och 6-7% i benmärgen 31. Celler och mitokondrier innehåller mindre än 1,3% syre 32. Dessa värden är mycket närmare hypoxi än den omgivande luften, där cellerna är rutinmässigt. Detta tyder på att det som tidigare betraktades som hypoxi specifika cellulära processer kan vara relevant i en fysiologisk miljö. Intressant nog eIF4F och eIF4F H 24. Låg syrehalt driver också korrekt fosterutveckling 33 och celler har generellt högre spridningshastigheter, längre livslängd, mindre DNA-skador och mindre allmän stressreaktioner i physioxia 34. Därför är eIF4F H sannolikt en viktig faktor i uttrycket av utvalda gener under fysiologiska förhållanden.

Här ger vi ett protokoll för att odla celler i fasta fysiologiska syreförhållanden eller i ett dynamiskt varierande område som är sannolikt mer representativ för vävnadsmikromiljöer. En fördel med denna metod är att cellerna lyseras inuti hypoxi arbetsstation. Det är inte ofta klart hur övergången från hypoxiska cellkultur till cellys utförs i andra protokoll. Celler ofta avlägsnas först från en liten hypoxi inkubator varaförgrunden lys, men denna exponering för syre kan påverka biokemiska vägar som den cellulära responsen för syre är snabb (en eller två min) 35. Vissa cap-bindande proteiner kräva interaktion med en andra bas eller kan hydrolysera m 7 GTP, därför några cap Interactmedlemmar kan missas i reningsprocessen. Agaros-kopplade till enzymatiskt resistenta cap-analoger kan vara substituerad i detta protokoll. Utforska verksamhet och sammansättning eIF4F H och andra varianter av eIF4F genom den metod som beskrivs här kommer att kasta ljus över de intrikata genuttryck maskinerier som celler använder under fysiologiska förhållanden eller stressreaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelser för cellodling

  1. Köp kommersiellt tillgängliga lager av mänskliga celler.
    OBS: Detta protokoll använder HCT116 kolorektalcancer och primära humana njur proximala tubulära epitelceller (HRPTEC).
  2. Gör 500 ml medium för odling av HCT116: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) / hög glukos-medium kompletterat med 7,5% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S).
  3. Gör 500 ml medium för odling av HRPTEC: Epitelial cell-medium kompletterat med 5% FBS, 1% epitelcell tillväxtsupplement, och 1% P / S.
  4. Förbereda 500 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. Justera pH till 7,4 och sterilisera i autoklav under 40 min vid 121 ° C.

2. Inledande av cellodling

  1. Försiktigt aspirera mediet från en 80-90% sammanflytande maträtt utan att störa than celler.
  2. Alikvot 3-5 ml av 1 x PBS per odlingsskål, försiktigt vagga varje kolv för att belägga ytarean av skålen, och försiktigt aspirera 1x PBS. Upprepa för en andra 1x PBS tvätt.
  3. Alikvot 3 ml 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i varje odlingsskål och försiktigt vagga att jämnt belägga cellerna med trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 ° C under 2-3 min.
  4. Överföra de lösgjorda cellerna in i ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 4000 xg under 90 sek.
  5. Resuspendera cellpelleten i 1 ml fullständigt DMEM.
  6. Räkna celler med användning av en hemocytometer. Beräkna hur många icke-pyrogent och polystyren 100 mm cellodlingsskålar krävs för att uppnå en initial sådd densitet av ca 2,500-5,000 celler per cm 2.
  7. Pre-varm komplett cellodlingsmedium som gjorts i steg 1.2 eller 1.3 i en 37 ° C vattenbad under 30-45 min.
  8. Sanera mediet flaskan och cellflaska med 70% etanol. Från denna punkt framåt allaoperationer ska utföras aseptiskt.
  9. Alikvotera 6 ml komplett DMEM i så många 100 mm cellodlingsskålar krävs för att använda hela volymen av frysta celler i såddtäthet som nämns i steg 2,6.
  10. Överföra volymen av cellsuspension som beräknats i steg 2,6 till var och en av de 100 mm odlingsskålar. Rock varje platta manuellt fördela cellerna över plattans yta.
  11. Placera den ympade 100 mm cellodlingsskål i inkubator vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. Låt cellerna att inkubera minst 24 timmar innan nästa steg.

3. subkulturodling

  1. Visa varje cellodlingsskål under ett mikroskop för att bestämma den procentuella andelen av cellsammanflytning (% celler som täcker det område av skålen). Återgå celler till inkubatorn och pre-varm komplett medium och 1x PBS. Gå vidare till nästa steg om cellerna är 80-100% sammanflytande.
  2. Försiktigt aspirera det använda mediet utan att störaceller i varje odlingsskål.
  3. Alikvot 3-5 ml av 1 x PBS per odlingsskål, försiktigt vagga varje kolv för att belägga ytarean av skålen, och försiktigt aspirera 1x PBS. Upprepa för en andra 1x PBS tvätt.
  4. Alikvotera 3 ml 0,05% trypsin-EDTA i varje odlingsskål och försiktigt rock till jämnt belägga cellerna med trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 ° C under 2-3 min.
  5. Under denna inkubation, portion 10 ml komplett medium till så många odlingsskålar krävs för att få celltäthet av 2,500-5,000 celler per cm2.
  6. När cellerna har lossnat från plattan, snabbt lägga 3 ml 1x definierad trypsininhibitor och snurra försiktigt skålen under 1 minut för att säkerställa att alla av trypsin-EDTA har neutraliserats.
  7. Överföra de lösgjorda cellerna i en steril 15 ml centrifugrör och ställ åt sidan. Tillsätt 3 ml 1x PBS till skålen för att samla eventuella kvarvarande celler, och överföra denna till samma 15 ml centrifugrör.
  8. Pellets cellerna genom centrifugering 150 xgunder 5 min.
  9. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 3 ml komplett medium.
  10. Räkna celler med användning av en hemocytometer och utsäde 150 mm odlingsskålar innehållande 15 ml komplett medium för att erhålla en celltäthet av 2,500-5,000 celler per cm 2. Använda två 150 mm för varje lock-bindningsanalysen.
    OBS: syrediffusion till celler genom flytande medier är beroende av volymen 36. Det rekommenderas att hålla volymen av medierna konsekvent mellan experiment om vidhäftande celler eller celler i suspension används. Media kan i förväg konditionerade (odlades i arbetsstationen för 24 timmar som diskuteras i diskussions) för att undvika dessa variabilitet i diffusion.
  11. Placera seeded-odlingsskålar i inkubator vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. Låt cellerna att inkubera minst 24 timmar innan du fortsätter till nästa steg.

4. Physioxic Exponering

  1. Visa cellerna under mikroskop. för best resultat, se till att cellerna är 70-80% sammanflytande för en 24 h exponering, 50-60% sammanflytande för en 48 h exponering, och 40-50% sammanflytande för en 72 h exponering.
  2. Placera cellerna i en hypoxi arbetsstation för önskad tid (24, 48, eller 72 timmar, beroende på experimentet).
  3. Ställ arbetsstationen till lämplig physioxia.
    OBS: Till exempel skulle en O2 inställning 3% åtföljas av 5% CO2 och 92% N2.
    OBS: Om syrevariationer inom ett dynamiskt område önskas över en specifik tidsplan, program schemat i instrumentet eller manuellt justera syre inställningar på de önskade intervall.
  4. Ställa in luftfuktigheten till 60%. atmosfär arbetsstation är mycket torr ändå och media kommer märk avdunsta under långa experiment (> 48 h). Håll ett medie reserv i en cellkultur kolv i arbetsstationen (så att medierna jämviktas med atmosfären arbetsstation) för att fylla på media i cellodlings dishes.
    OBS: Varje lösning som kommer att samverka med cellerna före lys (såsom PBS och trypsin-EDTA) bör konditioneras i förväg under 24 timmar före användning i hypoxi arbetsstation så att det upplösta syret jämvikt med atmosfäriskt syre 36.
  5. Håll celler i arbetsstationen tills lys.

5. Förbered Buffertar för Cap-bindningsanalys

  1. Förbereda 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS).
    1. I 800 ml dH 2 O, upplösa 8,76 g NaCl och 6,05 g Tris Base.
    2. Bringa lösningen till ett slutligt pH av 7,4 med användning av 1 M HCl.
    3. Bringa den slutliga volymen till 1 L med användning av dH 2 O.
  2. Framställa icke-denaturerande lyseringsbuffert. Förbereda lys buffert dagen för cap-bindningsanalysen. Gör extra lysbuffert att tvätta tomma agaroskulor och γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10-kopplade kulor (steg 7,9 och 7,13).
    1. I 7 ml dH 2 O, tillsätt 160 pl 5 M Nacl, 160 | il 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 ^ il 200 mM NaF, 40 ^ il 1 M MgCl2 och 40 ^ il 1 mM natriumortovanadat.
    2. Tillsätt 40 | il Igepal till 7 ml lösning. Skär spetsen på pipetten för att hämta Igepal eftersom det är extremt trögflytande.
    3. Blanda genom att pipettera upp och ner, eller virvel, den 7 ml lösning till dess att all Igepal har upplösts.
    4. Höja den slutliga volymen av lösningen till 8 ml och hålla på is.
  3. Förbereda 4x natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE Sample Buffer.
    1. I en bägare, kombinera 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml glycerol och 8 ml ditiotreitol (DTT).
    2. Lägg 3,2 g SDS och 0,16 g bromofenolblått. Tillåta pulver att fullständigt upplösas genom blandning med en magnetisk omrörarstav.
    3. Alikvotera i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.

6. Cell Lysis

  1. Framställa icke-denaturering lysbuffert och hålla på is dagen the cap-bindningsanalysen.
  2. Pre-varm 1x PBS och trypsin i en 37 ° C vattenbad under 30 minuter.
  3. Alikvot 980 | il lysbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för varje lock-bindningsanalys som utförs.
  4. Tillsätt 10 | il av 4- (2-aminoetyl) bensensulfonylfluorid hydroklorid och 10 | il av 100x proteasinhibitorcocktail till de 980 | il lysbuffert. Håll på is.
  5. Kasta media från varje 150 mm skål i en avfallsbehållare i hypoxi arbetsstation.
  6. Tvätta cellerna med 3-4 ml varm 1 x PBS och kasta all vätska.
  7. Tillsätt 1 ml varm 0,05% trypsin-EDTA till varje skål och låt stå i 2 min eller tills cellerna inte längre vidhäftat till plattan.
  8. Med hjälp av en pipett cellerna i en platta till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa efter behov, så att varje platta med celler överförs till ett separat 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  9. Centrifugera 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 6000 xg under 90 sek to pellets cellerna.
  10. Aspirera trypsin med användning av en pipett utan att störa pelleten. Om pelleten är störd, åter centrifugera 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 6000 xg under 90 sek.
  11. Tvätta cellerna med varmt 1x PBS genom att försiktigt pipettera 200 pl av PBS in i röret precis ovanför pelleten. Re-centrifug om pelleten störs.
  12. Aspirera PBS utan att störa pelleten.
  13. Pipettera 500 ul från 1 ml beredd lysbuffert lösning på det första cellulära pelleten. Suspendera pelleten helt genom att pipettera upp och ned.
  14. Kombinera de återsuspenderade cellerna med den andra cellpelleten och återsuspendera den andra pelleten genom att pipettera upp och ned. Upprepa denna process tills alla pellets har kombinerats och återsuspenderades för varje prov.
  15. Kombinera lysatet med de återstående 500 | il lysbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  16. Ta prover från hypoxi arbetsstation.
    OBS: Efter att ha lagt lysbuffert, enll efterföljande steg skall utföras i omgivande luft som hypoxi arbetsstation är inställd på 37 ° C och de följande stegen skall utföras kall (4 ° C eller på is).
  17. Lyserar cellerna med användning av försiktig omrörning genom rotation av proverna vid 4 ° C under 1,5-2 h.
  18. Centrifugera de lyserade cellerna vid 12.000 xg under 15 min vid 4 ° C för att avlägsna cellrester.
  19. Överför lysatet till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och kasta pelleten.
  20. Reservera en del (5-10%) av supernatanten för att användas som ett helt cellysat styringång för framtida western blot-analys.

7. Cap-bindningsanalys

  1. För varje prov, överför 50 | il av den tomma agaroskula styr uppslamning och 50 | il av γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10 bunden pärluppslamningen att separera 1,5 ml mikrocentrifugrör. Använd en sax för att avlägsna spetsen på pipetten för att underlätta insamlingen av pärluppslamningen.
  2. Pellets pärlor by centrifugering av uppslamningen vid 500 xg under 30 sek.
  3. Avlägsna supernatanten försiktigt och resuspendera kulorna i 500 pl TBS.
  4. Upprepa steg 7,2 och 7,3. Pellet pärlorna vid 500 xg under 30 sek och avlägsna supernatanten.
  5. Överför supernatanten innehållande lysatet från steg 6,19 till 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande de tomma agarospärlor.
    OBS: De tomma agarospärlor fungerar som en pre-clearing steg för att avlägsna proteiner från lysatet att icke-specifikt interagerar med vulsten.
  6. Inkubera i 10 min vid 4 ° C under försiktig omrörning.
  7. Pelletering av tomma agaroskulor genom centrifugering vid 500 xg under 30 sek.
  8. Överför lysatet till 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10 bundna pärlor.
  9. Tvätta den tomma agaroskulor genom återsuspendering av pärlorna i 500 | il lysbuffert, pelletering av pärlorna genom centrifugering vid 500 x g under 30 sek, och kassering av supernatant. Upprepa detta fyra gånger för totalt fem tvättar.
  10. Resuspendera tomma agarospärlor i 1x SDS-PAGE-provbuffert, och koka pärlorna under 90 s vid 95 ° C. Förvara vid -20 ° C för framtida western blot-analys för att observera huruvida proteinet av intresse binder icke-specifikt till pärlan.
  11. Inkubera lysatet med γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10-kopplade pärlor med försiktig omrörning under 1 timme vid 4 ° C för att fånga cap-bindande proteiner.
  12. Pellets γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10 bundna pärlorna genom centrifugering vid 500 xg under 30 sek. Kassera supernatanten.
  13. Tvätta γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10-kopplade pärlor genom att upprepa steg 7,9.
  14. Resuspendera kulorna i 600 | il lysbuffert.
  15. Lägg GTP till en slutlig koncentration av 1 mM.
  16. Inkubera γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10 bundna pärlor + 1 mM GTP med försiktig omrörning under 1 timme vid 4 ° C. OBS: Dennakommer ta avstånd proteiner som icke-specifikt interagerar med m 7 GTP (dvs också interagera med icke-metylerad GTP).
  17. Pellets γ-aminofenyl-m 7 GTP agaros C10 bundna pärlorna genom centrifugering vid 500 xg under 30 sek.
  18. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 200 pl av 4x SDS-PAGE-provbuffert (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromfenolblått, och 10% glycerol). Lagra provet GTP kontrollen vid -20 ° C för framtida western blot-analys 37. Tvätta pärlor genom att upprepa steg 7,9.
  19. Resuspendera kulorna i 1x SDS-PAGE-provbuffert (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromfenolblått, och 10% glycerol) och kokar vid 95 ° C under 90 sek. Lagra m 7 GTP-bundna fraktionen vid -20 ° C för framtida western blot-analys 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analys av Cap-bindande Förmåga som svar på Oxygen av eIF4E och eIF4E2 i en m 7 GTP-affinitetskolonn

Figurerna 1 och 2 representerar Western-blottar av typiska m 7 GTP affinitetsrening av två större cap-bindande proteiner som svar på syre fluktuationer i två humana cellinjer: primära humana renala proximala tubulära epitelceller (HRPTEC) i F igure 1 och kolorektalt karcinom ( HCT116) i figur 2. Celler hålls vid den angivna syretillgänglighet under 24 timmar för att säkerställa att det upplösta syret i de flytande medier har bringats i jämvikt med luften i hypoxi arbetsstation. Ingångs lane (IN) representerar 10% av hela cell-lysatet före m 7 GTP-bundna agarospärlor tillsätts för att fånga cap-bindande proteiner. Denna ingång körfält används som en baslinje för att mäta anrikningav ett målprotein i m 7 GTP pulldown. GTP lane är eluatet från de m 7 GTP pärlor som var eluerar med 1 mM GTP. Detta steg gör det möjligt att upptäcka proteiner som också känner igen icke-metylerad GTP. Cap-bindande proteiner eIF4E och eIF4E2 erkänner m 7 GTP specifikt, men deras homolog eIF4E3 (ej visad här) binder också till icke-metylerad GTP. Förmågan hos eIF4E och eIF4E2 att binda 5 'mRNA-cap struktur (m 7 GTP) kan mätas genom att jämföra intensiteten av deras band i m 7 GTP kolumn i förhållande till intensiteten i inmatnings lane (totalt tillgängliga pool).

Denna kvantifiering kan utföras genom mätning av pixelintensiteten av proteinbanden för tre biologiska replikat med ett bildanalysprogram såsom ImageJ. Resultaten uttrycks som relativa medel densitetsenheter (RDU) ± standardfel av medelvärdet. Råvärden före normaliseringfrån både försöks- och kontrollproverna jämfördes genom oparade två-tailed Students t-test. P <0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Detta representativt experiment visar att de två cellinjer har olika sortiment av syre för deras eIF4E och eIF4E2 användning. Figur 1 visar att endast eIF4E i HRPTEC binder starkt till m 7 GTP till 8% O 2 (Figur 1A), som både eIF4E och eIF4E2 är signifikant associerade med m 7 GTP 3-5% O 2 (Figur 1B - C), och att endast eIF4E2 binder starkt till m 7 GTP vid 1% O 2 (figur 1D). I figur 2, i HCT116-celler, är syreberoende användningen av dessa cap-bindande proteiner annorlunda: endast eIF4E binder signifikant till m 7 GTP vid 12% O2 (Figur 2A), båda toppbindande proteiner signifikant bindning till m 7 GTP i 5-8% O2 intervallet(Figur 2B - C), och endast eIF4E2 binder signifikant till m 7 GTP vid 3% O2 (figur 2D). Frånvaron av eluering från m 7 GTP kolonn med GTP visar att eIF4E och eIF4E2 är specifika för m 7 GTP och inte känner igen icke-metylerad GTP. Stapeldiagrammen representerar kvantifiering av tre biologiska replikat med ImageJ. Våra resultat visar att två stora cap-bindande proteiner, eIF4E och eIF4E2, skiljer sig i sin förmåga att binda mRNA m 7 GTP cap struktur i en syreberoende sätt.

Baserat på tidigare litteratur som dessa två proteiner initiera översättning av unika klasser av mRNA, kan detta skifte i Cap-bindande aktivitet resulterar i olika proteom skapas för att anpassa sig till förändringar i syretillgänglighet. Denna teknik kan användas för att karaktärisera nya translationsinitierings- faktorer som interagerar med 5 'mRNA cap(eller med lock-bindande proteiner) genom en riktad western blot metod eller en bred ansats som mass analys av en m 7 GTP eluat spektrometri.

Figur 1
Figur 1: eIF4E och eIF4E2 verksamheter överlappar varandra under physioxia i HRPTEC 3-5% O2. Infångningsanalyser med användning av m 7 GTP pärlor i human renal proximal rörformad epitelcell (HRPTEC) lysat exponerades för (A) 8%, (B) 5%, (C) 3% eller (D) en% O2 i 24 h. GTP, GTP tvätt för att mäta specificitet för m 7 GTP; m 7 GTP proteiner bundna till m 7 GTP pärlor efter GTP tvätt. Representativa Western blöts visas och data från åtminstone tre oberoende experiment kvantifierades genom ImageJ och uttrycks som relativa densitetsenheter (RDU) i förhållande till 10% ingång (IN) hos helt cellysat. * P <0,05 (oparat två-tailed t-test) ansågs vara en betydande förändring när man jämför anrikning av eIF4E eller eIF4E2 i hatten-bundna fraktionen (m 7 GTP) till IN. Data, medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM) av tre oberoende försök. Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. och Uniacke, J. Human celler som odlats under fysiologiska syre utnyttjar två cap-bindande proteiner för att rekrytera distinkta mRNA för översättning. 2016; 291 (20): 10.772-82 24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. eIF4E och eIF4E2 verksamheter överlappar varandra under physioxia i HCT116 5-8% O2. Infångningsanalyser med användning av m 7 GTP pärlor i HCT116 humana kolorektala karcinomceller lysat som exponeras för (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% eller (D) 3% O2 i 24 h. GTP, GTP tvätt för att mäta specificitet för m 7 GTP; m 7 GTP proteiner bundna till m 7 GTP pärlor efter GTP tvätt. Representativa Western blöts visas och data från åtminstone tre oberoende experiment kvantifierades genom ImageJ och uttrycktes som relativa densitetsenheter (RDU) i förhållande till 10% ingång (IN) hos helt cellysat. * P <0,05 (oparat två-tailed t-test) ansågs vara en betydande förändring när man jämför anrikning av eIF4E eller eIF4E2 i hatten-bundna fraktionen (m 7 GTP) till IN. Data, medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM) av tre oberoende försök. Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. och Uniacke, J. Human celler som odlats under fysiologiska syre utnyttjar två cap-bindande proteiner för att rekrytera distinkta mRNA för översättning. 2016; 291 (20): 10.772-82 24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysen av cap-bindande proteiner i humana celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden kan medge identifiering av nya syrereglerade translationsinitierings- faktorer. Affiniteten av dessa faktorer för 5 'cap av mRNA eller andra cap associerade proteiner kan mätas genom styrkan av deras associering till m 7 GTP bunden agaros-pärlor. En varning med denna teknik är att den mäter locket bindande potential av proteiner post-lys, men den utförs under icke-denaturerande förhållanden som behåller protein-protein interaktioner och posttranslationella modifieringar (PTMs). Flera protein-protein interaktioner medierar bindningen av eIF4E familjen till 5 'cap. Den 4E-BP binder och undertrycker eIF4E genom att blockera dess interaktion med eIF4G och förhindra rekryteringen av 43S före initiering komplexa 38. Den eIF4E / 4E-BP-komplexet förblir bunden till den 5 'mRNA cap, blockerar en initiering från detta transkript, och kananvändas som en markör för eIF4E inhibition i m 7 GTP affinitetskolonner. Omvänt kan interaktionen mellan eIF4E med eIF4G på m 7 GTP kolumner vara en markör för aktiv translationsinitiering. PTMs är en annan metod för att reglera aktiviteten hos translationsinitierings- faktorer. Till exempel kan fosforylering av eIF4E av Mnk1 öka dess affinitet för 5 'mRNA cap 39. Proteinet modifierings kodas av interferon stimulerad Gene 15 (ISG15) är en PTM som ökar cap-bindande aktiviteten av eIF4E2 som svar på interferon induktion via patogen infektion 40. Den ISG15 genen innehåller en hypoxi responselement i sin promotor vilket tyder på att detta system skulle kunna reglera eIF4E2 i låg syrehalt. Mycket lite är känt om hur PTMs kan förändra aktiviteten av cap-bindande proteiner under fysiologiskt relevanta syreförhållanden. Denna teknik följt av masspektrometrianalys kan avslöja nya syrereglerade och fysiologiskt relevanta PTMs thpå medierar aktiviteten hos translationsinitierings- faktorer.

En alternativ metod för att fånga med en m 7 GTP cap-analog skulle vara att immunoprecipitera en känd cap-bindande protein såsom eIF4E eller eIF4G och utför masspektrometri för att identifiera associerade proteiner. En begränsning av denna strategi är att cap-bindande proteiner har ofta alternativa cellulära roller som inom stressgranul 41 eller i locket oberoende översättning 1,4. Därför utnyttjar m 7 GTP cap-analoger är den bästa och mest tillförlitliga metoden att isolera cap-bindande proteiner, i synnerhet när man undersöker nya cap-associerade proteiner. En begränsning av användning av en m 7 GTP cap-analogen är att vissa cap-bindande proteiner som renhållare decapping enzymet DCPS inte bara interagerar med m 7 GTP mRNA cap, men också kräva att andra basen för att binda 42. Dessutom decapping enzymer i allmänhet, såsom Dcp1 / Dcp2 komplexa, kan Hydrolyze m 7 GTP och effektivt minska hartskapaciteten. Därför kan vissa cap-bindande proteiner förloras i denna analys. Att kringgå dessa varningar kan enzymatiskt resistenta mRNA cap-analoger användas. Två icke-hydrolyserbara cap analoger, mononukleotid m 7 GpCH2pp eller dinukleotid m 7 GpCH2ppA har visat att fånga DCPS, Dcp1 och Dcp2 43. Dessa mRNA-cap-analoger inte finns tillgängliga kommersiellt, utan måste syntetiseras kemiskt de novo. En annan begränsning av detta protokoll är att endast cap-bindande proteiner eller proteiner interagerar med cap-bindande proteiner via "piggybacking" kommer att fångas. Medan cap-beroende translationsinitiering är viktig form av initiering, cap-oberoende mekanismer är särskilt utbredd under villkor av cellulär stress 1. Men i samband med denna teknik och nya trender inom translationsinitiering 6-8,24, identifiera nya stressinducerade faktorer som participate i Cap-beroende initiering är ett lovande forskningsområde.

En annan faktor att beakta i detta protokoll är syre i media. Odling av celler i ett flytande medium åstadkommer en barriär mellan cellerna och atmosfären. Det har visats att flytande medier kan ta upp till 24 timmar för att uppnå jämvikt med den atmosfäriska gasen kompositionen 36. Därför måste cellerna odlas under 24 h i den önskade syretillgänglighet före lys, eller media kan konditioneras i förväg, om kortare inkubationerna krävs. Förbehandling innebär att bibehålla media i hypoxi arbetsstation för åtminstone 24 timmar i en steril odlingskolv som tillåter gasutbyte. Alla syrelösning introduceras till celler i hypoxi arbetsstation kan snabbt ändra cellulära signaleringsvägar såsom locket beroende translationsinitiering som prövas i detta protokoll. På grund av känsligheten av syrekännande vägar i celler, någon lösning som kommerinteragera med celler före lys såsom PBS och trypsin-EDTA måste även vara pre-konditioneras under minst 24 timmar. Lys och efter lys tvättbuffertar måste användas kall och därför inte i förväg konditionerade i 37 ° C hypoxi arbetsstation. Medan vissa syreberoende modifieringar av proteiner skulle vara aktiv efter lys, är de kalla buffertar som krävs för att minimera enzymatiska aktiviteter och "skyffling" av protein-protein eller protein-RNA-komplex som kan leda till artefakter. En ändring av detta protokoll för att öka stringensen kan vara att förutsättning lys och efter lys tvättbuffertar under 24 timmar och sedan inkubera dem på is i arbetsstationen före användning. Media och buffertar bör inte förvaras i hypoxi arbetsstation för mer än tre dagar, eftersom dessa lösningar kommer att koncentrera på grund av vattenavdunstning. För långtidsstudier (> 3 dagar), det ursprungliga beloppet av celler sådda måste noga övervägas. Som celler delar och ytan av skålen blir trångt,andra påfrestningar såsom media försurning kan påverka aktiviteten av cap-bindande proteiner. På den sista dagen för experimentet, bör celler har en konfluens av 80-90%.

Det finns fyra viktiga steg i detta protokoll: upprätthålla cellerna i hypoxi arbetsstation tills lys, mängden av celler som används, tvättning av pärlorna, och ometylerad GTP kontroll. 1) Det finns flera metoder för att upprätthålla celler i låg syrehalt. De flesta av dessa inkluderar små kammare som rymmer endast cellodlingsskålar, men någon manipulation eller cellys måste utföras utanför kamrarna i luften. Komponenter i syrekännande maskiner såsom hypoxi inducerbara faktorerna aktiveras eller inaktiveras inom loppet av en eller två minuter 35. Därför, såsom tidigare nämnts, lysering av cellerna i en hypoxi arbetsstation är avgörande för att säkerställa aktiviteten hos de cap-bindande proteiner är associerad med respektive syretillgänglighet. 2) Antalet cellerföreslås i detta protokoll (två 150 mm skålar) är tillräckligt stark m 7 GTP Interactmedlemmar såsom eIF4E familj eller medlemmar i eIF4F komplexet (eIF4A och eIF4G). Fler celler, åtminstone fem 150 mm skålar, kan krävas för att detektera proteiner med transienta interaktioner eller som bara förknippar med m 7 GTP mRNA cap genom eIF4F. 3) tvättning av pärlorna efter att inkubera dem med cellysatet kan utföras på ett stringent och mindre stränga sätt. Protokollet som presenteras här erbjuder en stringent alternativ där lyseringsbuffert användes för att tvätta pärlorna fem gånger. Om proteiner med svagare interaktioner cap-bindande proteiner är av intresse, kan man utföra färre tvättar och utnyttja Tris koksaltlösning i stället för lysbuffert. 4) Även om det är viktigt att i förväg klara cellysatet med okonjugerad agaros för att avlägsna proteiner som icke-specifikt interagerar med vulsten kan vissa cap-bindande proteiner inte skilja mellan den sanna mRNA cap struktur, metylerad GTP (m7 GTP), och icke-metylerad GTP. Ett sådant protein är eIF4E homolog eIF4E3 44. Eluering av pärlorna med GTP kommer loss alla protein som också känner igen icke-denaturerad GTP, som kan vara av intresse. Den biologiska betydelsen av proteiner som känner igen både m 7 GTP och GTP har ännu inte helt klarlagd. Detta understryks av de få publikationer som involverar eIF4E3 (som är en bona fide cap-bindande protein med en konserverad cap-bindande domän) i förhållande till de eIF4E och eIF4E2 proteiner, som känner igen m 7 GTP från icke-metylerad GTP.

Denna teknik, som presenteras, kan utföras som en målinriktad metod för att identifiera m 7 GTP interactmedlemmar av intresse eller som en bred ansats genom att analysera m 7 GTP eluatet via masspektrometri. Flera andra tekniker kan följa physioxic exponering (protokoll 4) för att analysera cap-bindande aktivitet, såsom subcellulär fraktionering, immunofluorescens, co-immunoprecipitation, ennd polysom ​​analys. Translationell kontroll framstår som en lika bidragsgivare till genuttryck som transkription. Med användning av denna teknik för att undersöka aktiviteten och sammansättningen av tändhatts bindande komplexen kommer att kasta ljus över hur cap-beroende translationsinitiering regleras som svar på låg syrehalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Tags

Genetik översättning mRNA m syre mössa eIF4E eIF4E2 GTP initiering fysiologisk
Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, … More

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter