Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Summary

تفاصيل هذه المقالة الفيديو مباشرة في منهجية الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لمنهجية وكفاءة تميز مكونات مسارات الإشارات المعقدة وشبكات تنظيمية في العديد من الأجنة اللافقاريات.

Introduction

شبكات الجينات التنظيمية (GRNs) وإشارة مسارات نقل تنشئ التعبير المكاني والزماني للجينات خلال التطور الجنيني التي تستخدم لبناء خطة الكبار جسم الحيوان. خلية الى خلية مسارات نقل الإشارة هي المكونات الأساسية لهذه الشبكات التنظيمية، وتوفير الوسائل التي تتواصل الخلايا. هذه التفاعلات الخلوية إنشاء وصقل التعبير عن الجينات التنظيمية والتمايز في ومن بين المناطق المختلفة خلال مرحلة التطور الجنيني 1 و 2. التفاعلات بين جهري يفرز خارج الخلية (بروابط، الخصوم)، المستقبلات، وشارك في مستقبلات السيطرة على أنشطة مسارات نقل الإشارة. مجموعة متنوعة من الجزيئات داخل الخلايا transduces هذه المدخلات مما أدى إلى التعبير المعدلة وراثيا، وتقسيم، و / أو شكل الخلية. في حين أن العديد من الجزيئات الأساسية المستخدمة على الصعيدين خارج الخلية والخلايا في مسارات رئيسية هيالمعروف، وهو المعرفة غير مكتملة بسبب في جزء كبير منه إلى تعقيد مسارات الإشارات الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، مسارات الإشارات المختلفة غالبا ما تتفاعل مع بعضها البعض إما سلبا أو إيجابا في الخلية، داخل الخلايا، ومستويات النسخي 3، 4، 5، 6. الأهم من ذلك أن المكونات الأساسية لمسارات نقل الإشارة والحفظ جدا في جميع الأنواع metazoan، وبشكل ملحوظ، فإن معظم مسارات الإشارات الرئيسية غالبا ما تؤدي وظائف تنموية مماثلة في العديد من الأنواع عند المقارنة بين الكائنات الحية من من الكائنات الحية ذات صلة وثيقة على وجه الخصوص 7، 8، 9، 10، 11.

دراسة يشير خلال التنمية هي مهمة شاقة في أي كائن حي، وهناكهي عدة تحديات كبيرة لدراسة مسارات إشارات في معظم النماذج ثنائي الفم (الفقاريات، حبليات اللافقارية، نصف حبليات، وشوكيات الجلد): 1) في الفقاريات هناك أعداد كبيرة من الممكن يجند والتفاعلات مستقبلات / المشارك المغير، جزيئات تنبيغ الخلايا، وكذلك التفاعلات المحتملة بين مسارات الإشارات المختلفة نظرا لتعقيد للجينوم 12، 13، 14؛ 2) مورفولوجيا معقدة والحركات التخلق في الفقاريات غالبا ما تجعل الأمر أكثر صعوبة لتفسير التفاعلات الوظيفية في وبين مسارات نقل الإشارة. 3) تحليل في معظم الأنواع اللافقارية نموذج ثنائي الفم غير شوكي-تقتصر من قبل ويندوز قصيرة من الحمول باستثناء بعض الأنواع الغلالة 15 و 16.

القنفذ البحر الجنين لديها عدد قليل من القيود المذكورة أعلاه ويقدم العديد من المزايا الفريدة لإجراء تحليل مفصل لمسارات نقل الإشارة في الجسم الحي. وتتضمن ما يلي: 1) البساطة النسبية للجينوم قنفذ البحر يقلل بشكل ملحوظ من عدد ممكن يجند، مستقبلات / مستقبل مساعد والخلايا جزيء التنبيغ التفاعلات 17؛ 2) GRNs السيطرة على مواصفات والزخرفة من طبقات جرثومية ومحاور الجنينية الرئيسية هي راسخة في الأجنة قنفذ البحر، والمساعدة في فهم السياق التنظيمي للخلية / إقليم تلقي الإشارات 18، 19؛ 3) العديد من مسارات نقل إشارة يمكن دراستها بين مراحل الانقسام والمعيدة في وقت مبكر عندما تتكون الأجنة من ظهارة الطبقات واحدة التي التشكل هو أسهل لتحليل. 4) جزيئات تنطويد في مسارات إشارات في والتلاعب بها بسهولة قنافذ البحر. 5) وحامل العديد من قنافذ البحر لمدة 10 إلى 11 شهرا في السنة (على سبيل المثال Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus).

هنا، فإننا نقدم وسيلة لتمييز منهجي وكفاءة مكونات مسارات الإشارات التي تحدد والأقاليم نمط في الأجنة قنفذ البحر لتوضيح المزايا التي توفرها العديد من الأنظمة نموذج اللافقارية في دراسة الآليات الجزيئية المعقدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. استراتيجية تصميم Morpholino إنتاجية عالية

  1. تحديد الجين (ق) من الفائدة (على سبيل المثال نهج الجين مرشح، تحليل رابطة الدول المستقلة التنظيمية، RNAseq و / أو شاشات التفاضلية البروتين).
  2. استخدام الجيني، transcriptomic، وبيانات التعبير الجيني متاح في المواقع التي يتم تحديثها باستمرار (على سبيل المثال SpBase http://www.echinobase.org 20 و S. purpuratus الجينوم البحث المتشعب: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index هتمل) لتحديد أن ملامح التعبير الزمانية المكانية يتداخل مع آلية تنموية في السؤال. إذا لم يكن هناك بيانات التعبير متاح، ثم تولد التمهيدي QPCR و / أو العقاقير في التحقيق الموقع لتقييم نمط التعبير الجيني.
  3. بعد تحديد نمط التعبير المكاني والزماني، يجب الحصول على تسلسل الحمض النووي من المواقع على شبكة الإنترنت الجينوم.
    1. لتوليد أليغنوكليوتيد] morpholino حجب الترجمة، والحصول على تسلسل سو في "المنطقة تترجم الامم المتحدة (5 '5 UTR) المنبع مباشرة من كودون بدء من أعرب تسلسل العلامة (EST) قواعد البيانات المتاحة على SpBase أو S. purpuratus الجينوم مواقع البحث. إذا كانت هذه المعلومات غير متاحة لهذا الجين من الفائدة، ثم نفذ 5 "سباق.
    2. لتصميم morpholino حجب لصق، ابحث عن تسلسل الجيني بما في ذلك الإكسونات وإنترونات باستخدام أداة سقالة blastn في SpBase أو S. purpuratus الجينوم أداة البحث.
  4. استخدام الموقع النوكليوتيد تصميم http://oligodesign.gene-tools.com من أجل تصميم المطلوب 25 قاعدة تسلسل الزوج morpholino.
    1. لmorpholino حجب متعدية، استخدم تسلسل مرنا من 5 'إلى 3' كمصدر للتسلسل الهدف متعدية. تشمل تسلسل 5 'UTR (ما يقرب من 70 النيوكليوتيدات المنبع للموقع بداية النسخ)، بالإضافة إلى 25 قواعد الترميز المنطقة (المصب من موقع بداية) مع بداية كودون واي ملحوظقوسين ال (ATG).
    2. لmorpholino حجب لصق، حدد إنترون-إكسون أو تسلسل الحدود اكسون-إنترون وتشمل 50 قاعدة (25 قواعد تسلسل اكسون و 25 قواعد تسلسل إنترون) حول المناطق الحدودية. مسح الجينوم مع تسلسل morpholino للتحقق من أن تسلسل فريد من نوعه.

2. Microinjection من Morpholino أليغنوكليوتيد]

  1. إعداد 3 الحلول الأسهم ملم من أليغنوكليوتيد] morpholino بإضافة 100 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه في morpholino قارورة 300 نانومول.
    ملاحظة: لا تستخدم DEPC المياه المعالجة لإعادة تعليق لاثيل pyrocarbonate يمكن أن تلحق الضرر morpholino.
  2. لأول تدور إعادة أسفل القارورة التي تحتوي على محلول المخزون النوكليوتيد لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لفترة وجيزة، الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق، دوامة لفترة وجيزة، والحفاظ على المخزون morpholino في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة على الأقل. Morpholino حل الأوراق المالية يتم تخزين الصورة من -20 درجة مئوية إلى +4 درجة مئوية.
  3. يعد حل الحقن التي تحتوي على أليغنوكليوتيد] morpholino في التركيز المطلوب. يحتوي هذا الحل عادة 20٪ الجلسرين أو 125 ملي بوكل باعتبارها الناقل و 15٪ FITC-ديكستران (فلوريسئين ثيوسيانات ديكستران 10000 ميغاواط 2.5 ملغ / ميكرولتر حل الأسهم). تستخدم FITC-ديكستران وغيرها تقارن ديكستران الفلورسنت بشكل روتيني لتحديد الأجنة حقن المجهري epifluorescence. حلول حقن مخزن في -20 درجة مئوية.
  4. الحرارة الحل morpholino عند 65 درجة مئوية في كتلة الحرارة أو حمام مائي لمدة لا تقل عن 2 - 5 دقائق.
  5. تدور لفترة وجيزة الحل morpholino لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة (14،000 - 16،000 x ج) لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  6. تحميل إبر الحقن بمحلول morpholino. لبروتوكول حقن مكروي مفصل يرجى الاطلاع Stepicheva وكلمات 2014 21 وهتاف وEttensohn، 2004"> 22.

3. التثبيت وفي بروتوكول الموضعي في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في س purpuratus الأجنة

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من اريناس-مينا وآخرون. 2000 23 و سيتي وآخرون. 2014 (24).

  1. تثبيت
    1. إضافة عدة قطرات من تثبيتي (انظر أدناه) إلى الآبار التي تحتوي على أجنة، مزيج بلطف قبل pipetting، والسماح لهم لتسوية. إزالة الحل تثبيتي، ثم خلط الأجنة مع اثنين من يغسل 180 ميكرولتر إضافية من تثبيتي.
      ملاحظة: من المهم أن تخلط جيدا الأجنة خلال يغسل طيف من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. يمكن عدم القيام بذلك تقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    2. ترك الأجنة لإصلاح في غسل تثبيتي الثاني لمدة 50 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 4٪ المجهر الإلكتروني الصف امتصاص العرق تتكون من 10 ملي اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.1٪ توين-20، والاصطناعية seawateص (مضادة للغواصات). جعل هذا الحل جديدة في كل مرة حصول على أفضل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، لسهولة والتطبيق العملي الأجنة يتم إصلاحها في لوحات 96-جيدا.
      1. لمدة 20 مل استخدام مثبت 5 مل 16٪ امتصاص العرق، 15 مل مضادة للغواصات، و 200 ميكرولتر 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، و 20 ميكرولتر توين-20.
    3. يغسل 5 مرات في RT مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة مكونة من 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم و 0.1٪ توين-20 لمدة 5 دقائق على الأقل أو حتى الأجنة ينخفض ​​إلى أسفل البئر. مرة أخرى، ومن المهم أن تخلط جيدا الأجنة في غسل العازلة التي pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. غسل العازلة اجتماعات الأطراف يمكن أن تستخدم لمدة 2 أيام إذا تخزينها في 4 ° C.
      1. 40 مل اجتماعات الأطراف غسل استخدام عازلة 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، و 32 مل درهم 2 O، و 40 ميكرولتر توين-20.
      2. ويمكن تخزين الأجنة ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
        ملاحظة: إذا تخزين الأجنة ثابتة لفترة أطول، ثم يضاف 0.2٪ أزيد الصوديوم في اجتماعات الأطراف غسل العازلة لمنع نمو البكتيريا.
  2. قبل التهجين
    1. نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في حل من قبل pipetting لطيف عدة مرات، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. يتكون عازلة تهجين من 70٪ الفورماميد، 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 1 ملغ / مل BSA و 0.1٪ توين-20.
      1. 40 مل استخدام عازلة تهجين 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، 4 مل O 2 درهم، 0.04 ز BSA، و 40 ميكرولتر توين-20. مزيج جيد من قبل vortexing، إضافة 28 مل الفورماميد، ودوامة مرة أخرى.
    2. إزالة نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل ومخازن التهجين وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 1: 2 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في الحل، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT.
    3. قبل التحقيق التهجين المزيج بلطف الأجنة في 100-150 ميكرولتر من العازلة التهجين. احتضان الأجنة عند 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1ح.
      ملاحظة: احتضان الأجنة بين عشية وضحاها غير مقبول. قبل تفرخ، وختم الآبار مع ورقة لاصقة من أجل منع التبخر.
  3. تهجين
    1. في أنبوب منفصل إضافة 0،1-0،3 نانوغرام / ميكرولتر من التحقيق و 500 ميكروغرام / مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال إلى عازلة تهجين، ثم دوامة بلطف لخلق حل التحقيق. يضاف الحمض الريبي النووي النقال الخميرة إلى حل التحقيق لخفض غير محددة ملزمة لجنة التحقيق لمكافحة الشعور. سخن هذا الحل إلى 50 درجة مئوية، والعازلة نضح التهجين.
    2. خلط الأجنة المهجنة مسبقا إلى 100 ميكرولتر من محلول التحقيق، وختم مع ورقة لاصقة، وهجن عند 50 درجة مئوية لمدة 2-7 أيام اعتمادا على التحقيق (التحقيق foxq2 يمكن المحتضنة لمدة 2 أيام).
      ملاحظة: سوف تختلف الأوقات الحضانة القائم قبالة التحقيق. بعض الجينات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة تتطلب تصل إلى الحضانة لمدة 7 أيام. لوحات 96-جيدا يمكن وضعها في صندوق الرطوبة بمثابة تأمين ضد التبخر إذا كان ADHESفشلت ورقة إيف لختم صحيح.
    3. يغسل 5 مرات في 50 درجة مئوية مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف تقدم طازجة غسل عازلة ليصبح المجموع 3 ساعات. ثم، ويغسل 3 مرات (15 دقيقة) مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. تذكر أن مزيج الأجنة في غسل العازلة في كل مرة من قبل pipetting بلطف عدة مرات.
  4. الأجسام المضادة الحضانة
    1. نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وخلط الأجنة في 180 ميكرولتر من عرقلة العازلة التي تتكون من 10٪ مصل الأغنام عادي و 5 ملغ / مل BSA في اجتماعات الأطراف غسل العازلة واحتضان لمدة 45 دقيقة على الأقل في RT أو 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إزالة عازلة تمنع وثم خلط الأجنة في عرقلة العازلة التي تحتوي على التخفيف 1: 1500 من القلوية الأجسام المضادة الفوسفاتيز مترافق مكافحة digoxigenin المخفف في عرقلة العازلة. احتضان بين عشية وضحاها في RT في لوحة مغلقة لتجنب التبخر. ملاحظة: لا تترك الأجسام المضادة لفترة أطول من ليلة وضحاها.
    3. غسل الأجنة 6 مرات (5 دقائق أو حتى إسقاط الأجنة) في اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. يمكن الأجنةخزنها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. وفي تطور الموقعي
    1. غسل الأجنة 3 مرات (10 دقيقة) في RT مع تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 تتألف من 0.1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 2، 1 ملم الليفاميزول، و 0.1٪ توين-20.
      1. لمدة 20 مل درجة الحموضة استخدام 9.5 العازلة 2 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 400 ميكرولتر 5M كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgCl 2 و 20 ميكرولتر توين-20، 16.6 مل درهم 2 O، و0.0048 ز الليفاميزول.
    2. احتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية في المخزن تلطيخ محمية من الضوء. يتكون عازلة تلطيخ من 10٪ ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر / مل 4-نيترو نتروبلو الأزرق كلوريد (NBT)، و 3.5 ميكرولتر / مل 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات (BCIP) في تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 .
      1. ل1 مل من العازلة تلطيخ استخدام 100 ميكرولتر ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر NBT، و 3.5 ميكرولتر BCIP.
    3. وقف رد فعل الفوسفاتيز القلوية عن طريق غسل 3-5 مرات في اجتماعات الأطراف غسل العازلة. واي رد فعلعشر التحقيق foxq2 وعادة ما يستغرق 30 دقيقة إلى 1 ساعة. قد يحتاج بعض تحقيقات الحضانة بين عشية وضحاها في أي RT أو 4 درجات مئوية.
    4. خلط الأجنة في حل 70٪ غسل المماسح و30٪ الجلسرين. يوفر الجلسرين معامل الانكسار اللازمة للفحص المجهري. الأجنة يمكن تخزينها في هذا الحل لعدة أسابيع. ختم لوحات مع البارافين البلاستيك لمنع التبخر.
  6. إعداد الشرائح والتقاط صورة
    1. إعداد الشرائح عن طريق ترتيب ثلاث شرائح صغيرة من الشريط على الوجهين في مثلث مع فجوات صغيرة بين الشرائط على شريحة.
    2. نقل الأجنة في غسل المماسح 70٪ و 30٪ الحل الجلسرين إلى مركز المثلث، وتغطي مع ساترة.
    3. ختم ساترة عن طريق تطبيق طبقة من طلاء الأظافر حول حواف ساترة.
    4. التقاط الصور باستخدام مجهر الضوء مركب مع هدف 20X وكاميرا مثبتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في جنين قنفذ البحر أظهرنا أن 3 إشارات Wnt مختلف فروع (WNT / β-كاتينين، WNT / JNK، وWNT / بي كي سي) 4، 25 تفاعل لتشكيل شبكة الإشارات WNT الذي يحكم الأمامي الخلفي (ا ف ب) الزخرفة. إحدى النتائج الأكثر أهمية في هذه الأحداث يشير هو أن أعرب على نطاق واسع الأمامي الأديم الظاهر العصبي (م ن أ) GRN الأولي يصبح مقصورا على منطقة صغيرة حول القطب الأمامي مع بداية تكون المعيدة (24 HPF في S. purpuratus). وتشير هذه النتائج إلى أن WNT / β-كاتينين إشارات يمنع تنشيط الجين ANE في النصف الخلفي من الجنين قبل مرحلة 32 خلية. ثم، وهذا مسار التبديلات إشارة إلى غير متعارف عليه WNT / JNK الطريق مما يشير الى أن تدريجيا إلى أسفل ينظم ANE GRN في النصف الأمامي من الجنين بين مرحلة 60 خلية وتكون المعيدة في وقت مبكر. وأخيرا، وثلث غير قانونية WNT pathwaذ، WNT / بي كي سي، يعادي WNT / JNK إشارات الطريق ويمنعها من القضاء على مواصفات ANE حول القطب الأمامي (الشكل 1A) 4.

نحن نستخدم التعبير الزمانية المكانية من foxq2 لفحص لنشاط كل من يشير فروع WNT خلال AP الزخرفة لأنها هي واحدة من الجينات الأولين تفعيلها في GRN ANE ويتم تقييم ذلك بسهولة عن طريق التهجين في الموقع بسبب تعبيره القوي 26. إذا كان منزعجا أي فرع من فروع يشير WNT الفردية، ثم هناك الظواهر التعبير واضحة التي تشير إلى مسار ويشارك: 1) في حالة عدم وجود WNT / β-كاتينين يشير إلى آلية تنظيمية الأمهات واسعة (الشكل 1A) ينشط التعبير foxq2 في جميع أنحاء جنين كامل (الشكل 1BB)؛ 2) في حالة عدم وجود WNT / JNK يشير foxq2 يتم التعبير في جميع أنحاءالنصف الأمامي من الجنين (الشكل 1Bc)، إلا أنها لا تزال تخضع لأسفل في النصف الخلفي بسبب نشاط WNT / β-كاتينين إشارات (الشكل 1A)؛ في غياب WNT / بي كي سي التعبير يشير foxq2 تماما وينظم أسفل طوال الجنين (الشكل 1Bd)، لأن WNT / β-كاتينين وWNT / JNK مسارات الإشارات تنظم بنسبة 4، 25. وهكذا، وقد وضعنا مقايسة أننا يسمى foxq2 نظام قراءات النسخي والتي تشكل مجتمعة مع شركائنا في العمل المنهجي (الشكل 2)، تتيح لنا التعرف بكفاءة واختبار ما إذا كان الجين يشارك في واحد أو أكثر من WNT يشير الفروع.

باستخدام نظام منهجية وقراءات foxq2 المعروضة هنا، حددنا عدة المفترضة molec خارج الخلية أو الخلاياules في الغالب متورطة في شبكة WNT تحكم AP مواصفات المحور، أربعة منها ترد في الشكل (3). حقن الأجنة مع morpholinos مصممة لضربة قاضية للتعبير عن أي عامل النسخ، ATF2، أو يفرز المغير WNT خارج الخلية، WIF-1، وأظهرت توسعا في التعبير foxq2 نحو القطب الخلفي للجنين في مراحل تكون المعيدة في وقت مبكر (الشكل 3A - C ). هذه النتائج محاكاة الظواهر احظ عندما طرقت أعضاء WNT / JNK يشير مسار بنسبة 4، 25، مما يدل على أنهم أعضاء في هذا الفرع الإشارات ما هو ضروري لأسفل تنظيم التعبير ANE GRN في النصف الأمامي من الجنين. في المقابل، تم القضاء على التعبير foxq2 عندما كنا ترسيتها التعبير عن عامل النسخ، NFAT (الشكل 3D)، والمغير خارج الخلية يفرز، sFRP3 / 4 (الشكل 3E)،مما يشير إلى أن هذه الجزيئات تشارك في مسار WNT / بي كي سي ما هو ضروري لاستعداء تنظيم أسفل من ANE GRN التي كتبها WNT / JNK الإشارات. وبناء على هذه النتائج التي تم الحصول عليها بسرعة ونحن الآن قادرون على إجراء تحليلات وظيفية أكثر تفصيلا من شأنها أن تضع هذه العوامل في تطور شبكة الإشارات WNT المشاركة في GRN الذي يحكم AP الزخرفة في جنين قنفذ البحر.

شكل 1
الشكل 1. نموذج لمواصفات AP والزخرفة في قنفذ البحر والترانسكربتي نظام قراءات foxq2. (أ) تنظيم التدريجي وصولا لANE GRN إلى الأراضي حول القطب الأمامي من قبل الشبكة إشارات WNT بالتفصيل في النص وفي 4 و 9. (ب) وtranscriptionaل نظام قراءات تظهر التعبير foxq2 في knockdowns مسار WNT أشار (KO). شريط النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تجريبي مخطط تدفق لتحليل الشبكة كفاءة WNT في جنين قنفذ البحر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نقل الإشارة الجزيئات تشارك في شبكة WNT الحكم AP محور مواصفات والزخرفة التي تم تحديدها باستخدام foxq2 الترانسكربتي نظام قراءات. knockdowns (A، B، C) Morpholino تشير إلى أن المغير الخلايا الإشارات، ATF2، ويفرز المغير خارج الخلية، WIF-1، لاعبين المحتمل للWNT / JNK إشارات الطريق. (A، D، E) وتشير التجارب ضربة قاضية أن NFAT، وهو يشير المغير داخل الخلايا، وsFRP3 / 4، ويفرز WNT يشير المغير، وتشارك في Fzl1 / 2/7-بي كي سي الإشارات. شريط النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منهجية المعروضة هنا هي مثال يوضح قوة باستخدام الأجنة مع أقل التعقيد الجيني والصرفي من الفقاريات لفهم مسارات الإشارات تنبيغ وGRNs التي تحكم آليات التنموية الأساسية .. العديد من المعامل تستخدم المقايسات مماثلة خلال تطوير قنفذ البحر في وقت مبكر لتشريح مسارات الإشارات المشاركة في الأحداث مواصفات مصير الخلايا الأخرى (مثل الشق، القنفذ، TGF- β، وجمعية جيل المستقبل مما يشير الى) 27، 28، 29، 30، 31. وقد كشفت هذه الدراسات قنفذ البحر العديد من الآليات للاهتمام والرواية إشارات، وجوانب عديدة من هذه الآليات يشير التي تحكم تطور قنفذ البحر في وقت مبكر يبدو أن يحفظ بين ثنائيات الفم 9، 27، 30 <سوب>، 31، 32. الأهم من ذلك، شهدت استكشاف البيولوجيا التطورية الأجنة metazoan غير تقليدية زيادة في السنوات الأخيرة، وكثير من هذه الخصائص حصة مع الأجنة قنفذ البحر خلال التنمية في وقت مبكر 9، 15، 16، 33. وهكذا، فإن المنهجية المقدمة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع إلى دراسة مسارات نقل الإشارة في العديد من هذه الكائنات خلال التنمية في وقت مبكر.

جميع التقنيات المستخدمة لاسقاط التعبير الجيني يمكن أن يولد بعيدا عن الهدف هدم الآثار. وقد أثبتت Morpholinos أن تكون طريقة اضطراب الجينات فعال بشكل ملحوظ في الأجنة قنفذ البحر في جزء كبير منه بسبب المجتمع يؤدي ضوابط صارمة للتخفيف من حدة المخاوف من أن النمط الظاهري ضربة قاضية هو غير محددة. ويمكن لهذه المقايسات التحكم الأساسية ستكون مodified وتطبيقها على تقنيات ضربة قاضية أخرى (أي هش / Cas9). والضوابط هي: 1) يتم إجراء فحوصات الاستجابة للجرعة دقيق مع كل morpholino حتى ≥ 80٪ من الأجنة المحقونة تظهر النمط الظاهري عيب و / أو التعبير الجيني علامة. 2) يتم تجاهل Morpholinos إذا كانت تسبب تأخر النمو الحاد أو حتى الوفاة بتركيزات معتدلة. من المحتمل بسبب السامة آثار خارج الهدف هذه الظواهر. 3) وتستخدم اثنين على الأقل morpholinos التي تم تصميمها لاستهداف مواقع الربط المختلفة لتأكيد الظواهر ضربة قاضية. 3) يتم حقن مغلطة morpholinos. 4) يتم إنقاذ الظواهر Morpholino عن طريق إدخال مرنا للالجين المستهدف في morpholino ضربة قاضية الأجنة. 5) عند استخدام المتاحة، كلها جبل المقايسات تلوين الأجسام المضادة لإظهار أن knockdowns morpholino تمنع ترجمة الجينات في المصالح. من المهم أن نلاحظ أن يستخدم المجتمع قنفذ البحر لا يقل عن أربعة أنواع للدراسات وظيفية، اعتمادا على مكان وجود العلماء. في شهرالحالات الواحد، على حد علمنا، استخدمت morpholinos مختلفة لنهدم orthologs قد ولدت الظواهر المماثلة في كل الأنواع (انظر على سبيل المثال هذه الدراسات وظيفية على العقدية يشير 34، 35، 36، 37). ويرى هذه النتائج بشكل مقنع أن تجاربنا رقابة صارمة حدد بقوة لتلك morpholinos التي تنتج تأثيرات على الهدف ضربة قاضية.

جانب آخر مهم من هذه المنهجية هو تحديد دقيق لأهداف النسخي التي هي الأكثر احتمالا تفعيلها مباشرة من مسار الإشارات قيد النظر. على سبيل المثال التي نقدمها هنا هو محض الصدفة، لتفعيل الزمانية المكانية للمسارات الإشارات وتنظيم أسفل من الجين أعرب بقوة، foxq2، تحدث في وقت مبكر في التنمية وGRNs تحكم طبقة الجرثومية ومواصفات محور في جنين قنفذ البحر بشكل جيد-أنشئت. وبالتالي، قيود واضحة من هذه المنهجية هو أنه في كثير من الحالات قد يكون من الضروري لضربة قاضية النشاط من مسار الإشارات خاص خلال مراحل لاحقة من التطور وضمن أقاليم محددة. وهناك العديد من التكنولوجيات المتاحة الآن التي يمكن استخدامها للتغلب على هذه القيود (على سبيل المثال الصور morpholinos، هش / Cas9 38، FACseq) حتى في الأجنة نموذج غير التقليدية التي هي غير قابلة للتلاعب الجيني. في كثير من الحالات قد لا يكون من الممكن تحديد الجينات مرشح أسفل تيار من مسار الإشارات من الفائدة التي يتم تقييمها بسهولة كما foxq2، والتي لديها ارتفاع ملحوظ نسبة الإشارة إلى الضوضاء التعبير الزمانية المكانية. ومن الشائع أن تجد الجينات مع نسب أقل من ذلك بكثير الإشارة إلى الضوضاء. إذا جين آخر غير متوفر للفحص معين، ثم في الموقع التحقيق الناتجة عن الجينات في المصالح يجب أن تكون أطول فترة ممكنة. بشكل عام، وذلك باستخدام تحقيقات أطول من 1000 زوج قاعدةالصورة إلى زيادة كبيرة في إشارة ويقلل من الضوضاء في اللونية والفلورية في المقايسات الموقع.

وبمجرد أن فحص النسخي تشير إلى أين ومتى تم تأسيس مسار نقل الإشارة من مصلحة اشارة، فإن الخطوة التالية المهمة هي تحديد حد سواء المكانية والزمانية التعبير من العوامل التنظيمية المفترضة تشارك في آلية التنموية قيد الدراسة. شاشة التفاضلية و / أو QPCR البيانات هي أدوات هامة، ولكنها يمكن أن تكون مضللة. مؤكدا مع جبل بأكمله في الموقع التهجين أن يتم التعبير عن الجينات في المصالح داخل الأراضي حيث مسار الإشارات نشط يمنع مضيعة للوقت والموارد. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه البيانات التوقعات إلى أن تكون حول بنية الجينات التنظيمية، التي ستبلغ تحليلات أكثر تفصيلا التي ستتبع مرة واحدة على اللاعبين المشاركين يتم تحديدها مع هذا الاختبار الأولي (الشكل 2). نقدم المبسطةلو فحص اللونية في هذا البروتوكول. ومع ذلك، فلوري في الموقع التهجين (FISH) يمكن أن تستخدم أيضا لتصور عدة تحقيقات الفلورسنت في نفس الوقت، مما يسمح للقرار المكاني المعزز داخل أراضي الفائدة وكذلك الفحص المجهري متحد البؤر 24. وبالإضافة إلى ذلك، FISH يمكن إرفاقها مع تلوين الأجسام المضادة لتحديد التعديلات بعد متعدية و / أو حيث مسار الإشارات ذات الاهتمام نشط 24.

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي غالبا ما يتم التغاضي. واحد هو إعداد الحل morpholino قليل النوكليوتيد. ومن المهم لتسخين حل morpholino عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة إلى 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي لذلك بأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل تحميل إبر الحقن. هذه الخطوات ضرورية عندما يتم تخزين محلول المخزون morpholino في -20 درجة مئوية لأليغنوكليوتيد] morpholino يمكن أن يعجل من حل في مزاج منخفضatures والغزل من الحل يمنع إبر الحقن من أن انسداد بواسطة الجسيمات. الجانب الحاسم آخر للنظر هو أن الأجنة يجب أن تكون مختلطة بدقة في مختلف الحلول خلال كل خطوة من تثبيت والبروتوكولات التهجين الموضعي. في أيدينا، يتم تقليل إشارة و / أو زادت الخلفية إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة البسيطة.

ولعل أهم جانب من جوانب المنهجية المقدمة هنا هو أنه يتيح للتحليلات وظيفية فعالة لمجموعات كبيرة من الجزيئات نقل الإشارة المحتملة الناتجة عن transcriptomics الجيل القادم والبروتينات. مرة واحدة تؤكد هذه التحليلات الفنية الأولية لمجموعة من العوامل التنظيمية وتشارك في مسار المصالح، فإن التحدي التالي هو استخدام فحوصات إنشاء (على سبيل المثال knockdowns الوظيفية؛ مفصل متعددة الألوان جبل بأكمله في الموقع؛ التفاعلات الكيميائية الحيوية) لتقييم الكيفية التي تنسجم وextracelluلار، داخل الخلايا، ومستويات النسخي من مسارات نقل الإشارة المشاركة في العملية التنموية معينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 120، قنافذ البحر، الأديم الظاهر العصبي الزخرفة، WNT، نقل الإشارة، الأمامية-الخلفي، وتطور ثنائي الفم، وشبكات الجينات التنظيمية، إنتاجية عالية،
قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما<em&gt; في فيفو</em&gt; نماذج التنموية لدراسة مجمع خلية الى خلية اشارة شبكة التفاعلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Range, R. C.,… More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter