Summary
इस वीडियो लेख विवो पद्धति है कि व्यवस्थित ढंग से और कुशलता से कई अकशेरुकी भ्रूण में जटिल संकेत दे रास्ते और विनियामक नेटवर्क के घटकों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एक सीधा विवरण।
Introduction
जीन विनियामक नेटवर्क (GRNs) और संकेत पारगमन मार्ग भ्रूण विकास के दौरान जीन है कि वयस्क जानवर के शरीर योजना का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति की स्थापना। सेल के लिए सेल संकेत पारगमन मार्ग इन विनियामक नेटवर्क का अनिवार्य घटक है, इसका मतलब है जिसके द्वारा कोशिकाओं संवाद प्रदान कर रहे हैं। ये सेलुलर बातचीत की स्थापना और embryogenesis 1, 2 के दौरान में और बीच में विभिन्न प्रदेशों विनियामक और भेदभाव जीनों की अभिव्यक्ति को परिष्कृत करें। स्रावित बाह्य modulators (ligands, विरोधी), रिसेप्टर्स, और सह रिसेप्टर्स के बीच बातचीत संकेत पारगमन मार्ग की गतिविधियों को नियंत्रित करते हैं। intracellular अणुओं के एक वर्गीकरण इन सूचनाओं बदल जीन अभिव्यक्ति, विभाजन, और / या आकार एक सेल का है, जिसके परिणामस्वरूप पारगमन। जबकि प्रमुख रास्ते में बाह्य और intracellular स्तर पर उपयोग में कुंजी अणुओं के कई हैंजाना जाता है, यह अलग-अलग संकेत दे रास्ते की जटिलता के बड़े हिस्से में कारण एक अधूरा ज्ञान है। इसके अलावा, विभिन्न संकेत दे रास्ते अक्सर एक दूसरे के साथ या तो सकारात्मक या नकारात्मक बाह्य, intracellular पर ट्रांसक्रिप्शनल स्तर 3, 4, 5, 6 बातचीत, और। महत्वपूर्ण बात है, संकेत पारगमन मार्ग के मुख्य घटक अत्यधिक सभी metazoan प्रजातियों में संरक्षित कर रहे हैं, और, उल्लेखनीय है, प्रमुख संकेत दे रास्ते के सबसे अक्सर इसी तरह के विकास कार्यों के कई प्रजातियों में प्रदर्शन जब विशेष रूप से निकट से संबंधित संघों से जीवों की तुलना 7, 8, 9, 10, 11।
विकास के दौरान संकेत के अध्ययन के किसी भी जीव में एक चुनौतीपूर्ण काम है, और वहाँ1) रीढ़ में वहाँ संभव ligand और रिसेप्टर / सह न्यूनाधिक बातचीत की बड़ी संख्या, intracellular पारगमन के अणुओं के साथ-साथ हैं: सबसे deuterostome मॉडल (रीढ़, अकशेरुकी Chordates, हेमीकॉर्डेट, और echinoderms) में संकेत दे रास्ते का अध्ययन करने के लिए कई महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं जीनोम 12, 13, 14 की जटिलता के कारण अलग अलग संकेत दे रास्ते के बीच संभावित बातचीत; 2) जटिल आकृति विज्ञान और रीढ़ में morphogenetic आंदोलनों अक्सर इसे और अधिक मुश्किल में है और संकेत पारगमन मार्ग के बीच कार्यात्मक बातचीत व्याख्या करने के लिए बनाने के लिए; 3) सबसे गैर echinoderm अकशेरुकी deuterostome मॉडल प्रजातियों में विश्लेषण कुछ कंचुकित प्रजातियों 15, 16 के अपवाद के साथ gravidity की छोटी खिड़कियों के द्वारा सीमित हैं।
समुद्री साही भ्रूण उपर्युक्त सीमाओं के कुछ है और इन विवो में संकेत पारगमन मार्ग का एक विस्तृत विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए कई अद्वितीय गुण प्रदान करता है। इनमें निम्नलिखित शामिल हैं: 1) समुद्री साही जीनोम के रिश्तेदार सादगी काफी संभव ligand, रिसेप्टर / सह रिसेप्टर और intracellular पारगमन अणु की संख्या कम कर 17 बातचीत; 2) विशिष्टता और रोगाणु परतों और प्रमुख भ्रूण कुल्हाड़ियों की patterning को नियंत्रित करने GRNs अच्छी तरह से समुद्री साही भ्रूण में स्थापित कर रहे हैं, सेल / क्षेत्र के नियामक संदर्भ को समझने में सहायता संकेतों 18, 19 प्राप्त; 3) कई संकेत पारगमन मार्ग जल्दी दरार और गेसट्रुला चरणों के बीच अध्ययन किया जा सकता है जब भ्रूण एक भी स्तरित उपकला जिनकी आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए आसान है से मिलकर बनता है; 4) अणुओं शामिलसमुद्र अर्चिन आसानी से छेड़छाड़ कर रहे हैं में रास्ते के संकेत में घ; 5) कई समुद्र अर्चिन एक साल (जैसे स्ट्रोंगिलोसेंट्रोटस purpuratus और Lytechinus variegatus 10 से 11 महीने) के लिए सगर्भा रहे हैं।
यहाँ, हम एक विधि व्यवस्थित ढंग से और कुशलता से संकेत दे रास्ते कि निर्दिष्ट और समुद्री साही भ्रूण में पैटर्न प्रदेशों लाभ है कि कई अकशेरुकी मॉडल प्रणाली जटिल आणविक तंत्र के अध्ययन में प्रस्ताव को वर्णन करने के घटकों को चिह्नित करने के लिए उपस्थित थे।
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Protocol
1. उच्च Throughput morpholino डिजाइन की रणनीति
- ब्याज की एक जीन (एस) (उदाहरण के उम्मीदवार जीन दृष्टिकोण, सीआईएस नियामक विश्लेषण, RNAseq और / या प्रोटिओमिक अंतर स्क्रीन) को पहचानें।
- अक्सर अद्यतन वेबसाइटों पर जीनोमिक, transcriptomic, और जीन अभिव्यक्ति डेटा उपलब्ध का उपयोग (जैसे SpBase http://www.echinobase.org 20 और एस purpuratus जीनोम खोजें http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) निर्धारित करने के लिए कि spatiotemporal अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल सवाल में विकास तंत्र के साथ overlaps। अगर कोई अभिव्यक्ति डेटा उपलब्ध है, तो qPCR प्राइमरों पैदा करते हैं और / या सीटू जांच में एक antisense जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए।
- स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न का निर्धारण करने के बाद, जीनोमिक वेब साइटों से डीएनए अनुक्रम प्राप्त करते हैं।
- अनुवाद अवरुद्ध morpholino oligonucleotides पैदा करने के लिए, हे अनुक्रम प्राप्तएफ 5 'संयुक्त राष्ट्र के अनुवाद क्षेत्र (5' UTR) सीधे नदी के ऊपर से व्यक्त अनुक्रम टैग (ईएसटी) SpBase या एस purpuratus जीनोम खोजें वेबसाइटों पर उपलब्ध डेटाबेस से दीक्षा कोडोन। यदि यह जानकारी ब्याज की जीन के लिए उपलब्ध नहीं है, तो प्रदर्शन 5 'रेस।
- एक ब्याह अवरुद्ध morpholino डिजाइन करने के लिए, एक्सॉनों और SpBase या एस purpuratus जीनोम खोज उपकरण में पाड़ blastn उपकरण का उपयोग इंट्रोन्स सहित जीनोमिक अनुक्रम के लिए खोज करते हैं।
- क्रम में वांछित 25 आधार जोड़ी morpholino अनुक्रम डिजाइन करने में oligonucleotide डिजाइनिंग वेबसाइट http://oligodesign.gene-tools.com का प्रयोग करें।
- एक translational अवरुद्ध morpholino के लिए, translational लक्ष्य अनुक्रम के स्रोत के रूप में 5 से '3' के लिए mRNA के अनुक्रम का उपयोग करें। 5 'UTR अनुक्रम (प्रतिलेखन शुरू साइट के अपस्ट्रीम लगभग 70 न्यूक्लियोटाइड) प्लस उल्लेखनीय वाई कोडोन शुरुआत के साथ क्षेत्र (शुरू साइट के बहाव) कोडिंग के 25 ठिकानों को शामिल करेंवें कोष्ठक (ATG)।
- एक ब्याह अवरुद्ध morpholino के लिए, Intron-एक्सॉन या एक्सॉन-intron सीमा अनुक्रम का चयन और 50 कुर्सियां (एक्सॉन अनुक्रम के 25 ठिकानों और Intron अनुक्रम के 25 ठिकानों) सीमा क्षेत्रों के आसपास शामिल हैं। सत्यापित करने के लिए कि अनुक्रम अद्वितीय है morpholino अनुक्रम के साथ जीनोम स्कैन करें।
2. morpholino oligonucleotides के microinjection
- 300 nmol morpholino शीशी में nuclease मुक्त पानी के 100 μL जोड़कर morpholino oligonucleotides 3 मिमी स्टॉक समाधान तैयार करें।
नोट: क्योंकि diethyl pyrocarbonate morpholino नुकसान पहुंचा सकता है फिर से निलंबन के लिए DEPC इलाज पानी का प्रयोग न करें। - शेयर oligonucleotide पूरी गति से 30 एस के लिए समाधान युक्त शीशी नीचे पहली पुनर्गठन स्पिन के लिए - 5 से 10 मिनट, संक्षेप में भंवर के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर (14,000 16,000 XG), संक्षेप में भंवर, गर्मी, और कमरे में morpholino स्टॉक रखने कम से कम 1 घंटे के लिए तापमान। Morpholino शेयर समाधान एस 4 डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस से जमा हो जाती है।
- इंजेक्शन वांछित एकाग्रता में morpholino oligonucleotides युक्त समाधान तैयार है। यह समाधान आमतौर पर 20% ग्लिसरॉल या एक कैरियर के रूप में 125 मिमी KCl और 15% FITC-dextran (fluorescein आइसोथियोसाइनेट dextran 10,000 मेगावाट 2.5 मिलीग्राम / μL शेयर समाधान) शामिल हैं। FITC-dextran और अन्य फ्लोरोसेंट dextran conjugates नियमित तौर पर epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा इंजेक्शन भ्रूण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इंजेक्शन समाधान।
- 5 मिनट - एक गर्मी ब्लॉक या कम से कम 2 के लिए पानी के स्नान में 65 डिग्री सेल्सियस पर morpholino समाधान हीट।
- कम से कम 10 मिनट के लिए - (16,000 XG 14,000) पूरी गति से 1 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए - (16,000 XG 14,000), भंवर संक्षिप्त morpholino पूरी गति से 30 एस के लिए समाधान स्पिन।
- morpholino समाधान के साथ इंजेक्शन सुई लोड। एक विस्तृत microinjection प्रोटोकॉल के लिए कृपया Stepicheva और सांग, 2014 21 और चियर्स और Ettensohn, 2004 को देखने के"> 22।
3. फिक्सेशन और सीटू प्रोटोकॉल में एस purpuratus भ्रूण में 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पर
नोट: इस प्रोटोकॉल एरेनास-मेना एट अल से संशोधित किया गया है। 2000 में 23 और सेठी एट अल। , 24 2014।
- फिक्सेशन
- (देखें नीचे) भ्रूण युक्त वेल्स को लगानेवाला की कई बूँदें जोड़ें, pipetting द्वारा धीरे मिश्रण है, और उन्हें व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। लगानेवाला समाधान निकालें, और फिर लगानेवाला की दो अतिरिक्त 180 μL washes के साथ भ्रूण मिला लें।
नोट: यह अच्छी तरह से कोमल pipetting ऊपर और नीचे कई बार से washes के दौरान भ्रूण मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसा करने में विफलता के लिए शोर अनुपात संकेत कम कर सकते हैं। - भ्रूण छोड़ दो 4% इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड पीएच 7.0 10 मिमी MOPS से मिलकर paraformaldehyde में कमरे के तापमान पर 50 मिनट के लिए 1 घंटे के लिए दूसरे लगानेवाला धोने (आरटी) में ठीक करने के लिए, 0.1% बीच 20, और कृत्रिम seawateआर (ASW)। इस समाधान ताजा अच्छे परिणाम के लिए हर समय बनाओ। इसके अलावा, आसानी और व्यावहारिकता भ्रूण के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में तय कर रहे हैं।
- 20 एमएल लगानेवाला उपयोग 5 एमएल 16% paraformaldehyde, 15 एमएल ASW, 200 μL 1 एम MOPS पीएच 7.0, और 20 μL बीच-20 के लिए।
- Mops के 180 μL के साथ आरटी पर 5 बार धोएं 0.1 एम MOPS पीएच 7.0, 0.5 एम NaCl और 0.1% बीच 20 कम से कम 5 मिनट के लिए या जब तक भ्रूण अच्छी तरह से नीचे करने के लिए ड्रॉप से मिलकर बफर धो लें। फिर, यह अच्छी तरह से धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे धो बफर में भ्रूण मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। MOPS धो बफर 2 दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तो 4 में संग्रहीत सी।
- 40 एमएल के लिए MOPS धो बफर उपयोग 4 एमएल 1 एम MOPS पीएच 7.0, 4 एमएल 5 एम NaCl, 32 एमएल DH 2 हे, और 40 μL बीच -20।
- तय भ्रूण 2 दिनों के लिए 4 ओ सी पर संग्रहित किया जा सकता है।
नोट: यदि तय भ्रूण के भंडारण रह गया है, तो mops में 0.2% सोडियम azide जोड़ने के जीवाणु वृद्धि को रोकने के लिए बफर धो लें।
- (देखें नीचे) भ्रूण युक्त वेल्स को लगानेवाला की कई बूँदें जोड़ें, pipetting द्वारा धीरे मिश्रण है, और उन्हें व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। लगानेवाला समाधान निकालें, और फिर लगानेवाला की दो अतिरिक्त 180 μL washes के साथ भ्रूण मिला लें।
- पूर्व संकरण
- MOPS Aspirate धो बफर और एक 2 के 180 μL जोड़ें: mops के 1 के अनुपात, संकरण बफर करने के लिए बफर कोमल pipetting कई बार द्वारा समाधान में भ्रूण मिश्रण है, और आरटी पर कम से कम 20 मिनट के लिए सेते धो लें। संकरण बफर 70% formamide, 0.1 एम MOPS पीएच 7.0, 0.5 एम NaCl के होते हैं, 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए और 0.1% बीच 20।
- 40 एमएल संकरण बफर उपयोग 4 एमएल 1 एम MOPS पीएच 7.0, 4 एमएल 5 एम NaCl, 4 एमएल DH 2 हे, 0.04 छ बीएसए, और 40 μL बीच-20 के लिए। , Vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स फिर से 28 मिलीलीटर formamide, और भंवर जोड़ें।
- 1 के अनुपात के MOPS धोने और संकरण buffers और एक 1 के 180 μL जोड़ें:: 2 हटाये mops के 2 अनुपात, संकरण बफर करने के लिए बफर समाधान में भ्रूण मिश्रण है, और आरटी पर कम से कम 20 मिनट के लिए सेते धो लें।
- संकरण बफर के 150 μL - इससे पहले कि जांच संकरण धीरे 100 में भ्रूण मिला लें। कम से कम 1 के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेतेज।
ध्यान दें: भ्रूण रात भर विकासशील वातावरण स्वीकार्य है। incubating से पहले, आदेश वाष्पीकरण को रोकने के लिए चिपकने वाला एक पत्र के साथ कुओं सील।
- MOPS Aspirate धो बफर और एक 2 के 180 μL जोड़ें: mops के 1 के अनुपात, संकरण बफर करने के लिए बफर कोमल pipetting कई बार द्वारा समाधान में भ्रूण मिश्रण है, और आरटी पर कम से कम 20 मिनट के लिए सेते धो लें। संकरण बफर 70% formamide, 0.1 एम MOPS पीएच 7.0, 0.5 एम NaCl के होते हैं, 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए और 0.1% बीच 20।
- संकरण
- भंवर धीरे जांच समाधान बनाने के लिए संकरण बफर में 0.3 एनजी / μL जांच की और 500 माइक्रोग्राम / एमएल खमीर tRNA, तब - एक अलग ट्यूब में 0.1 जोड़ें। खमीर tRNA गैर विशिष्ट विरोधी भावना जांच के बंधन में कमी की जांच के समाधान के लिए जोड़ा गया है। 50 डिग्री सेल्सियस को यह समाधान है, और महाप्राण संकरण बफर पहले से गरम।
- जांच के समाधान के 100 μL में मिक्स पूर्व संकरित भ्रूण, एक चिपकने वाला पत्र के साथ सील, और जांच के आधार पर 2 से 7 दिनों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर संकरण (foxq2 जांच 2-दिनों के लिए incubated किया जा सकता है)।
नोट: ऊष्मायन बार जांच बंद आधार पर भिन्न होगी। कुछ जीन कम स्तर पर व्यक्त एक 7 दिन ऊष्मायन के लिए ऊपर की आवश्यकता होती है। 96 अच्छी तरह प्लेटें वाष्पीकरण यदि adhes के खिलाफ बीमा के रूप में एक नमी बॉक्स में रखा जा सकता हैIve चादर ठीक से सील करने के लिए विफल रहता है। - ताजा बना mops के 180 μL के साथ 50 डिग्री सेल्सियस पर 5 बार धोएं 3 घंटे की कुल के लिए बफर धो लें। फिर, के साथ 180 mops के μL आरटी पर बफर 3 बार धोने (15 मिनट) धो लें। धोने में भ्रूण धीरे कई बार pipetting द्वारा हर बार बफर मिश्रण करने के लिए याद रखें।
- एंटीबॉडी ऊष्मायन
- MOPS Aspirate धो बफर और बफर अवरुद्ध 10% सामान्य भेड़ सीरम और 5 मिलीग्राम से मिलकर की 180 μL में भ्रूण मिश्रण / MOPS धो बफर और 4 डिग्री सेल्सियस आरटी पर कम से कम 45 मिनट या रात भर के लिए सेते में एमएल बीएसए।
- बफर अवरुद्ध निकालें और फिर एक 1 युक्त बफर अवरुद्ध में भ्रूण मिश्रण: alkaline फॉस्फेट संयुग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी के 1,500 कमजोर पड़ने बफर अवरुद्ध में पतला। एक मोहरबंद थाली में आरटी पर रातोंरात सेते वाष्पीकरण से बचने के लिए। नोट: रात भर से अधिक समय पर एंटीबॉडी मत छोड़ो।
- भ्रूण 6 बार (5 मिनट या जब तक भ्रूण ड्रॉप) धोने mops में आरटी पर बफर धो लें। भ्रूण कर सकते हैं4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहित किया।
- सीटू के विकास में
- भ्रूण और ताजा बना पीएच 9.5 से 0.1 एम Tris पीएच 9.5, 100 मिमी NaCl, 50 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी Levamisole से मिलकर बफर के साथ आरटी पर 3 बार (10 मिनट) धोने, 0.1% बीच 20।
- 20 एमएल पीएच 9.5 बफर उपयोग 2 के लिए एमएल 1 एम Tris पीएच 9.5, 400 μL 5M NaCl, 1 एमएल 1 एम 2 MgCl, 20 μL बीच -20, 16.6 मिलीलीटर DH 2 हे, और 0.0048 जी Levamisole।
- बफर धुंधला प्रकाश से सुरक्षित में 37 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं। बफर धुंधला 10% डाइमिथाइल Formamide के होते हैं, 4.5 μL / एमएल 4-नाइट्रो नीले tetrazolium क्लोराइड (एनबीटी), और 3.5 μL / एमएल ताजा बना पीएच 9.5 बफर में 5-Bromo-4-क्लोरो-3-indolyl-फॉस्फेट (BCIP) ।
- धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर के लिए उपयोग करने के लिए 100 μL डाइमिथाइल formamide, 4.5 μL एनबीटी, और 3.5 μL BCIP।
- Mops में 3 से 5 बार धोने से alkaline फॉस्फेट प्रतिक्रिया बंद बफर धो लें। प्रतिक्रिया वाईवें foxq2 जांच आम तौर पर 1 घंटे के लिए 30 मिनट लगते हैं। कुछ जांच या तो आर टी या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात ऊष्मायन पड़ सकता है।
- 70% MOPS धोने और 30% ग्लिसरॉल का एक समाधान में भ्रूण मिला लें। ग्लिसरॉल एक अपवर्तनांक माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक प्रदान करता है। भ्रूण कई हफ्तों के लिए इस समाधान में संग्रहित किया जा सकता है। वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लास्टिक के तेल के साथ प्लेटें सील।
- भ्रूण और ताजा बना पीएच 9.5 से 0.1 एम Tris पीएच 9.5, 100 मिमी NaCl, 50 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी Levamisole से मिलकर बफर के साथ आरटी पर 3 बार (10 मिनट) धोने, 0.1% बीच 20।
- स्लाइड तैयार करने और छवि पर कब्जा
- एक त्रिकोण एक स्लाइड पर स्ट्रिप्स के बीच छोटे अंतराल के साथ में डबल पक्षीय टेप के तीन छोटे स्ट्रिप्स की व्यवस्था से एक स्लाइड तैयार करें।
- त्रिकोण के केंद्र के लिए 70% MOPS धोने और 30% ग्लिसरॉल समाधान में भ्रूण स्थानांतरण और एक coverslip के साथ कवर।
- coverslip के किनारों के आसपास नेल पॉलिश की एक परत को लागू करने से coverslip सील।
- एक 20x उद्देश्य और एक संलग्न कैमरे के साथ एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा।
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Representative Results
समुद्री साही भ्रूण में हम पता चला है कि 3 अलग WNT सिगनल शाखाओं (Wnt / β-catenin, wnt / JNK, और Wnt / पीकेसी) 4, 25 बातचीत एक WNT सिगनल नेटवर्क है कि नियंत्रित पूर्वकाल पीछे (एपी) patterning के रूप में। इन संकेत घटनाओं का सबसे महत्वपूर्ण परिणामों में से एक है कि प्रारंभिक मोटे तौर पर व्यक्त पूर्वकाल neuroectoderm (ANE) GRN gastrulation की शुरुआत (एस purpuratus में 24 HPF) द्वारा पूर्वकाल पोल के आसपास एक छोटे से क्षेत्र के लिए सीमित हो जाता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि Wnt / β-catenin सिगनल 32 सेल मंच द्वारा भ्रूण के पीछे छमाही में ANE जीन सक्रियण रोकता है। फिर, इस मार्ग गैर विहित Wnt / JNK संकेतन मार्ग कि उत्तरोत्तर नीचे 60 सेल चरण और जल्दी gastrulation के बीच भ्रूण के पूर्वकाल छमाही में ANE GRN को नियंत्रित करने के लिए एक संकेत रिले। अंत में, एक तिहाई गैर विहित Wnt pathwa4 Y, wnt / पीकेसी, wnt / JNK मार्ग संकेत antagonizes और यह (चित्रा 1 ए) पूर्वकाल पोल के आसपास ANE विनिर्देश को नष्ट करने से रोकता है।
हम foxq2 के spatiotemporal अभिव्यक्ति का उपयोग एपी patterning के दौरान WNT सिगनल शाखाओं में से प्रत्येक की गतिविधि के लिए परख करने के लिए है क्योंकि यह ANE GRN में सक्रिय पहले दो जीनों में से एक है और यह आसानी से अपनी मजबूत अभिव्यक्ति की वजह से सीटू संकरण में से मूल्यांकन किया है 26। किसी भी व्यक्ति WNT सिगनल शाखा परेशान है, तो वहाँ स्पष्ट अभिव्यक्ति phenotypes संकेत मिलता है कि जो मार्ग शामिल है: 1) Wnt / β-catenin एक व्यापक मातृ नियामक तंत्र (चित्रा 1 ए) के संकेत के अभाव में पूरे भ्रूण भर foxq2 अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है (चित्रा 1BB); 2) Wnt / JNK संकेत foxq2 के अभाव में भर व्यक्त किया हैभ्रूण (चित्रा 1Bc) के पूर्वकाल आधा है, लेकिन यह अभी भी नीचे पीछे छमाही में Wnt / β-catenin संकेतन (चित्रा 1 ए) की गतिविधि के कारण विनियमित किया जाता है; Wnt / पीकेसी संकेत foxq2 अभिव्यक्ति के अभाव में पूरी तरह से नीचे, भ्रूण (चित्रा 1Bd) भर में विनियमित क्योंकि Wnt / β-catenin और Wnt / JNK रास्ते संकेतन को विनियमित रहे हैं 4, 25 है। इस प्रकार, हम एक परख है कि हम foxq2 ट्रांसक्रिप्शनल readout प्रणाली है, जो जब हमारे व्यवस्थित कार्यप्रवाह (चित्रा 2) के साथ संयुक्त, हमें कुशलता की पहचान करने और परीक्षण ब्याज की एक जीन एक या Wnt के अधिक में शामिल है कि क्या करने के लिए अनुमति देता है करार दिया है विकसित किया है शाखाओं संकेत है।
यहाँ प्रस्तुत पद्धति और foxq2 readout प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम कई ख्यात बाह्य या intracellular molec की पहचान की हैules संभावना गवर्निंग एपी अक्ष विनिर्देश, जिनमें से चार में 3 चित्र में प्रस्तुत कर रहे हैं Wnt नेटवर्क में शामिल किया गया। या तो प्रतिलेखन कारक, ATF2, या स्रावित बाह्य Wnt न्यूनाधिक की अभिव्यक्ति, WIF -1 पछाड़ना के लिए बनाया गया morpholinos के साथ इंजेक्शन भ्रूण, जल्दी gastrulation चरणों में भ्रूण के पीछे ध्रुव की ओर foxq2 अभिव्यक्ति का एक विस्तार से पता चला है (चित्रा 3 ए - सी )। इन परिणामों के phenotypes मनाया जब Wnt / JNK संकेतन मार्ग के सदस्यों के नीचे 4, 25 खटखटाया है नकल, सुझाव है कि वे इस संकेतन शाखा आवश्यक है कि नीचे भ्रूण के पूर्वकाल छमाही में ANE GRN अभिव्यक्ति को विनियमित करने के सदस्य हैं। इसके विपरीत, foxq2 अभिव्यक्ति जब हम प्रतिलेखन कारक, NFAT (चित्रा 3 डी) की अभिव्यक्ति नीचे गिरा समाप्त हो गया था, और स्रावित बाह्य न्यूनाधिक, sFRP3 / 4 (चित्रा 3E),सुझाव है कि इन अणुओं Wnt / पीकेसी मार्ग आवश्यक है कि Wnt / JNK संकेतन द्वारा ANE grn के नीचे विनियमन विरोध करने में शामिल हैं। इन तेजी से प्राप्त परिणामों के आधार पर हम अब और अधिक विस्तृत कार्यात्मक विश्लेषण करती है कि उभरती WNT सिगनल GRN कि समुद्री साही भ्रूण में एपी patterning को नियंत्रित करने में शामिल नेटवर्क के भीतर इन कारकों जगह होगी प्रदर्शन करने में सक्षम हैं।
चित्रा 1. एपी विशिष्टता और समुद्री साही में patterning और foxq2 Transcriptional readout प्रणाली के लिए मॉडल। (ए) प्रगतिशील नीचे WNT सिगनल पाठ, 9 में और 4 में विस्तृत नेटवर्क के द्वारा पूर्वकाल पोल के चारों ओर एक क्षेत्र के लिए ANE grn के विनियमन। (बी) एक transcriptionaएल readout संकेत दिया Wnt मार्ग knockdowns (को) में foxq2 अभिव्यक्ति दिखा प्रणाली। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
समुद्री साही भ्रूण में यह आंकड़ा कुशल Wnt नेटवर्क विश्लेषण के लिए 2. एक प्रायोगिक प्रवाह आरेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. संकेत पारगमन अणु Wnt नेटवर्क शासी एपी एक्सिस विशिष्टता और patterning में शामिल का उपयोग कर पहचाना foxq2 Transcriptional readout प्रणाली। (ए, बी, सी) morpholino knockdowns का सुझाव है कि एक intracellular संकेतन न्यूनाधिक, ATF2, और स्रावित बाह्य न्यूनाधिक, WIF -1, Wnt / JNK संकेतन मार्ग के संभावित खिलाड़ी हैं। (ए, डी, ई) पछाड़ना प्रयोगों संकेत दिया कि NFAT, एक intracellular संकेतन न्यूनाधिक, और sFRP3 / 4, एक स्रावित Wnt संकेत न्यूनाधिक, Fzl1 / 2/7-पीकेसी संकेतन में शामिल रहे हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक उदाहरण है कि रीढ़ की तुलना में कम जीनोमिक और रूपात्मक जटिलता के साथ भ्रूण का उपयोग सिगनल पारगमन मार्ग और GRNs मौलिक विकास तंत्र गवर्निंग समझने के लिए की शक्ति को दिखाता है .. कई प्रयोगशालाओं जल्दी समुद्री साही के विकास के दौरान इसी तरह के assays का उपयोग कर रहे हैं टुकड़े करना सिगनल अन्य सेल भाग्य विनिर्देश की घटनाओं में शामिल रास्ते (जैसे पायदान, हाथी, TGF- β, और FGF संकेतन), 27, 28, 29, 30, 31। ये समुद्री साही के अध्ययन में कई दिलचस्प और उपन्यास संकेतन तंत्र, और ये संकेत तंत्र के कई पहलुओं को जल्दी समुद्री साही विकास शासी दिखाई पता चला है ड्यूटरोस्टोम 9, 27, 30 <बीच संरक्षित करनेsup>, 31, 32। महत्वपूर्ण बात है, गैर पारंपरिक metazoan भ्रूण के विकास जीव विज्ञान की खोज के प्रारंभिक विकास 9, 15, 16, 33 के दौरान हाल के वर्षों में वृद्धि हुई है, और समुद्री साही भ्रूण के साथ इन साझा विशेषताओं के कई देखा है। इस प्रकार, यहाँ प्रस्तुत पद्धति में व्यापक रूप से प्रारंभिक विकास के दौरान इन जीवों के कई में संकेत पारगमन मार्ग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल सभी तकनीकों संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव नीचे दस्तक उत्पादन कर सकते हैं। Morpholinos क्योंकि समुदाय करता है कठोर नियंत्रण चिंता है कि पछाड़ना phenotype गैर विशिष्ट है कम करने के लिए बड़े हिस्से में समुद्री साही भ्रूण में एक उल्लेखनीय प्रभावी जीन गड़बड़ी विधि साबित किया है। इन बुनियादी नियंत्रण assays मीटर हो सकता हैodified और अन्य पछाड़ना तकनीक को लागू किया जाता है (यानी crisper / Cas9)। नियंत्रण कर रहे हैं: 1) सावधान खुराक प्रतिक्रिया assays तक इंजेक्शन भ्रूण की ≥ 80% दोषपूर्ण phenotype और / या मार्कर जीन अभिव्यक्ति दिखाने के प्रत्येक morpholino के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं; 2) Morpholinos खारिज कर दिया है कि अगर वे मध्यम सांद्रता में गंभीर विकासात्मक देरी या यहां तक कि मौत का कारण बन रहे हैं। ये phenotypes विषाक्त बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण होने की संभावना है; 3) कम से कम दो morpholinos कि विभिन्न बाध्यकारी साइटों को लक्षित करने के लिए तैयार कर रहे हैं पछाड़ना phenotypes पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; 3) missense morpholinos इंजेक्ट कर रहे हैं; 4) morpholino phenotypes morpholino पछाड़ना भ्रूण में लक्ष्य जीन के लिए mRNA शुरू करने से बचा लिया जाता है; 5) उपलब्ध है, पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला assays दिखाने के लिए कि morpholino knockdowns ब्याज की जीन का अनुवाद को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है। ऐसा नहीं है कि समुद्री साही समुदाय कार्यात्मक अध्ययन, जहां वैज्ञानिकों स्थित हैं पर निर्भर करता है के लिए कम से कम चार प्रजातियों का उपयोग करता नोट करना महत्वपूर्ण है। मो मेंसेंट मामलों, हमारे ज्ञान, विभिन्न morpholinos orthologs प्रत्येक प्रजातियों में इसी प्रकार के phenotypes उत्पन्न किया है नीचे दस्तक करने के लिए (उदाहरण के लिए संकेत 34, 35, 36, 37 नोडल पर इन कार्यात्मक अध्ययन देखें) का इस्तेमाल किया। इन परिणामों के खांसने का तर्क है कि हमारी कठोर नियंत्रण प्रयोगों दृढ़ता से उन morpholinos कि ऑन-लक्ष्य पछाड़ना प्रभाव उत्पादन के लिए चयन करें।
इस पद्धति का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू को ध्यान से ट्रांसक्रिप्शनल लक्ष्य है कि सबसे अधिक संभावना सीधे विचाराधीन संकेतन मार्ग से सक्रिय कर रहे हैं की पहचान है। उदाहरण है कि हम यहाँ प्रदान आकस्मिक है, क्योंकि संकेत दे रास्ते के spatiotemporal सक्रियण और एक मजबूती के साथ व्यक्त जीन के नीचे विनियमन, foxq2, प्रारंभिक विकास में होते हैं और समुद्री साही भ्रूण में रोगाणु परत और एक्सिस विनिर्देश गवर्निंग GRNs अच्छी तरह से कर रहे हैं-कायम करना। इस प्रकार, इस पद्धति का एक स्पष्ट सीमा कई मामलों में यह विकास के बाद के चरणों के दौरान और विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर एक विशेष संकेतन मार्ग की गतिविधि को पछाड़ना के लिए आवश्यक हो सकता है। वहाँ है कि इन सीमाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अब उपलब्ध कई प्रौद्योगिकियों (जैसे तस्वीर-morpholinos, crisper / Cas9 38, FACseq) गैर-पारंपरिक मॉडल भ्रूण कि आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं में भी। कई मामलों में यह संभव ब्याज की एक संकेतन मार्ग जिसका spatiotemporal अभिव्यक्ति के रूप में आसानी से foxq2 है, जो एक उल्लेखनीय उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के रूप में मूल्यांकन किया है की धारा नीचे एक उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए नहीं हो सकता है। यह बहुत कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ जीन को खोजने के लिए आम है। अगर एक और जीन एक विशेष परख के लिए उपलब्ध नहीं है, तो ब्याज की जीन के लिए उत्पन्न बगल में जांच के रूप में लंबे समय के रूप में संभव होना चाहिए। सामान्य, जांच 1,000 आधार जोड़ी से अधिक समय का उपयोग करते हुएरों काफी संकेत बढ़ जाती है और सीटू assays में वर्णमिति और फ्लोरोसेंट में शोर कम कर देता है।
एक बार जब ट्रांसक्रिप्शनल परख है कि कब और कहाँ हित के संकेत पारगमन मार्ग संकेत है की स्थापना की है, अगले महत्वपूर्ण कदम दोनों स्थानिक और अध्ययन के तहत विकास तंत्र में शामिल ख्यात विनियामक कारकों के अस्थायी अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए है इंगित करता है। विभेदक स्क्रीन और / या qPCR डेटा महत्वपूर्ण उपकरण हैं, लेकिन वे गुमराह किया जा सकता है। सीटू संकरण है कि ब्याज की जीन के इलाके जहां संकेतन मार्ग सक्रिय है के भीतर व्यक्त किया जाता है में पूरे माउंट के साथ की पुष्टि करते समय और संसाधनों की बर्बादी से बचाता है। इसके अलावा, इन आंकड़ों भविष्यवाणियों जीन विनियामक वास्तुकला, जो और अधिक विस्तृत विश्लेषण है कि इसमें शामिल इस प्रारंभिक परख (चित्रा 2) के साथ की पहचान कर रहे खिलाड़ियों को एक बार का पालन करेंगे सूचित करेंगे के बारे में किए जाने के लिए अनुमति देते हैं। हम एक भोला आदमी पेशLe इस प्रोटोकॉल में वर्णमिति परख; हालांकि, सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट भी एक ही समय में कई फ्लोरोसेंट जांच कल्पना करने के लिए, ब्याज के राज्यक्षेत्र के भीतर बढ़ाया स्थानिक संकल्प के साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी 24 के लिए अनुमति का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मछली बाद translational संशोधनों की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी धुंधला के साथ जोड़ा जा सकता है और / या जहां ब्याज की संकेतन मार्ग सक्रिय 24 है।
वहाँ प्रोटोकॉल है कि अक्सर अनदेखी कर रहे हैं में दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। एक morpholino oligonucleotide समाधान की तैयारी है। यह 5 मिनट के लिए 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर morpholino समाधान करने के लिए गर्मी और इंजेक्शन सुई लोड करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए पूरी गति से अपकेंद्रित्र करने के लिए महत्वपूर्ण है। ये कदम जरूरी हैं जब morpholino शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है क्योंकि morpholino oligonucleotides कम आपा पर समाधान से तेज़ कर सकते हैंatures और समाधान की कताई विविक्त से भरा जा रहा से इंजेक्शन सुई से बचाता है। विचार करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू यह है कि भ्रूण को अच्छी तरह से निर्धारण के हर चरण के दौरान और सीटू संकरण प्रोटोकॉल में विभिन्न समाधान में मिलाया जाना चाहिए। हमारे हाथ में, संकेत कम और / या यदि इस सरल कदम नहीं किया जाता है पृष्ठभूमि बढ़ जाती है।
शायद यहाँ प्रस्तुत पद्धति का सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह है कि यह संभावित संकेत पारगमन अगली पीढ़ी transcriptomics और प्रोटिओमिक्स द्वारा उत्पन्न अणुओं के बड़े सेट के कुशल कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। आकलन करने के लिए कि वे कैसे में फिट एक बार इन प्रारंभिक कार्यात्मक विश्लेषण नियामक कारकों के हित के लिए एक मार्ग में शामिल कर रहे हैं के एक समूह की पुष्टि, अगली चुनौती स्थापित assays (; विस्तृत बगल में बहुरंगी पूरे माउंट जैव रासायनिक बातचीत जैसे कार्यात्मक knockdowns) का उपयोग करने के लिए है extracelluLAR, intracellular, और संकेत पारगमन एक विशेष विकास की प्रक्रिया में शामिल रास्ते के transcriptional स्तरों।
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino | Gene Tools LLC | Customized | More information at www.gene-tools.com |
Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Make 25 mg/mL stock solution |
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
Formamide | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
Normal Goat Serum | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody | Roche | 11 093 274 910 | |
Tetramisole hydrochloride (levamisole) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
Tris Base UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate | Roche | 11 383 221 001 | |
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
Dimethyl Formamide | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016-500G |
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