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Developmental Biology

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113

Summary

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

Introduction

las redes de genes reguladores (GRNs) y las vías de transducción de señales establecen la expresión espacial y temporal de los genes durante el desarrollo embrionario que se utilizan para construir el plan de adultos cuerpo del animal. Célula a célula de las vías de transducción de señales son componentes esenciales de estas redes reguladoras, que proporcionan el medio por el cual las células se comunican. Estas interacciones celulares establecer y perfeccionar la expresión de genes reguladores y diferenciación en y entre los diversos territorios durante la embriogénesis 1, 2. Las interacciones entre los moduladores secretadas extracelulares (ligandos, antagonistas), receptores y co-receptores controlan las actividades de las vías de transducción de señales. Un surtido de moléculas intracelulares transduce estas entradas que resulta en la expresión alterada de genes, la división y / o la forma de una célula. Si bien muchas de las moléculas clave que se utilizan en los niveles extracelulares e intracelulares en las principales vías sonconocido, es un conocimiento incompleto debido en gran parte a la complejidad de las vías de señalización individuales. Además, las diferentes vías de señalización a menudo interactúan uno con el otro, ya sea positiva o negativamente en el extracelular, intracelular y los niveles de la transcripción 3, 4, 5, 6. Es importante destacar que los componentes centrales de las vías de transducción de señales están altamente conservadas en todas las especies de metazoos, y, notablemente, la mayoría de las principales vías de señalización menudo realizan funciones de desarrollo similares en muchas especies cuando se comparan los organismos de filos estrechamente relacionados, en particular, 7, 8, 9, 10, 11.

El estudio de la señalización durante el desarrollo es una tarea de enormes proporciones en cualquier organismo, y hayson varios retos importantes para el estudio de las vías de señalización en la mayoría de los modelos deuterostome (vertebrados, los cordados invertebrados, hemicordados y equinodermos): 1) En los vertebrados hay un gran número de posibles ligando y las interacciones de receptor / co-moduladores, moléculas de transducción intracelular, así como potenciales interacciones entre diferentes vías de señalización debido a la complejidad del genoma de 12, 13, 14; 2) La morfología compleja y movimientos morfogenéticos en los vertebrados a menudo hacen que sea más difícil la interpretación de las interacciones funcionales en y entre las vías de transducción de señales; 3) Análisis de la mayoría de especies modelo de invertebrados deuterostome no equinodermo están limitados por las ventanas cortas de gravidez con la excepción de algunas especies de tunicados 15, 16.

losembrión de erizo de mar tiene algunas de las limitaciones mencionadas anteriormente y ofrece muchas cualidades únicas para la realización de un análisis detallado de las vías de transducción de señales in vivo. Estos incluyen los siguientes: 1) La relativa simplicidad del genoma del erizo de mar reduce significativamente el número de posibles ligando, receptor / co-receptor y la molécula de transducción intracelular las inter- 17; 2) Los GRNs que controlan la memoria y en los patrones de las capas germinales embrionarias y los principales ejes están bien establecidos en embriones de erizo de mar, ayudar en la comprensión del contexto normativo de la célula / territorio que recibe las señales 18, 19; 3) Muchas vías de transducción de señal pueden ser estudiados entre las etapas de escisión y gástrula primeros cuando los embriones se componen de una sola epitelio estratificado cuya morfología es más fácil de analizar; 4) Las moléculas implicand en las vías de los erizos de mar son fáciles de manipular señalización; 5) Muchos erizos de mar están grávidas de 10 a 11 meses al año (por ejemplo, Strongylocentrotus purpuratus y variegatus Lytechinus).

A continuación, presentamos un método para caracterizar de manera sistemática y eficientemente los componentes de las vías de señalización que especifican y territorios de patrón en embriones de erizo de mar para ilustrar las ventajas que varios sistemas modelo de invertebrados ofrecen en el estudio de los mecanismos moleculares complejas.

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Protocol

1. Rendimiento estrategia de diseño de alta morfolino

  1. Identificar un gen (s) de interés (por ejemplo, enfoque de genes candidatos, el análisis de cis-regulador, RNAseq y pantallas diferenciales / o proteómica).
  2. Utilice genómica, transcriptómica, y los datos de expresión génica disponibles en los sitios web se actualizan con frecuencia (por ejemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 y S. purpuratus genoma Búsqueda http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar que el perfil de expresión espacio-temporal se solapa con el mecanismo de desarrollo en cuestión. Si no hay datos de expresión está disponible, a continuación, generar cebadores qPCR y / o un antisentido en situ sonda para evaluar el patrón de expresión génica.
  3. Después de determinar el patrón de expresión espacial y temporal, obtener la secuencia de ADN de los sitios web genómicos.
    1. Para la generación de oligonucleótidos de morfolino traducción de bloqueo, obtener la secuencia of la 'región traducida por la ONU (5' UTR 5) directamente aguas arriba del codón de iniciación de bases de datos de etiqueta de secuencia expresada (EST) disponibles en SpBase o S. purpuratus Genoma sitios web de búsqueda. Si esta información no está disponible para el gen de interés, a continuación, realizar 5 'RACE.
    2. Para diseñar un empalme morfolino-bloqueo, la búsqueda de la secuencia genómica que incluye los exones e intrones utilizando la herramienta de andamio BLASTN en SpBase o S. purpuratus genoma herramienta de búsqueda.
  4. Utilice el diseño de página web oligonucleótido http://oligodesign.gene-tools.com con el fin de diseñar la secuencia de pares de bases deseada morfolino 25.
    1. Para un morfolino de traslación de bloqueo, utilizar la secuencia de ARNm de 5 'a 3' como la fuente de la secuencia diana de la traducción. Incluir la secuencia 5 'UTR (aproximadamente 70 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de transcripción), además de 25 bases de la región codificadora (aguas abajo del sitio de inicio) con el codón de inicio marcada wiTH paréntesis (ATG).
    2. Para un empalme morfolino-bloqueo, seleccione el exón-intrón o secuencia límites exón-intrón e incluyen 50 bases (25 bases de la secuencia exón y 25 bases de la secuencia del intrón) en torno a las regiones limítrofes. Analiza el genoma con la secuencia de morfolino para verificar que la secuencia es única.

2. La microinyección de morfolino oligonucleótidos

  1. Preparar 3 mM de soluciones madre de los oligonucleótidos de morfolino mediante la adición de 100 l de agua libre de nucleasa en el vial morfolino 300 nmol.
    NOTA: No utilice agua tratada con DEPC para la resuspensión debido pirocarbonato de dietilo puede dañar el morfolino.
  2. Por primera vuelta de la reconstitución por el vial que contiene la solución de oligonucleótido durante 30 s a la velocidad máxima (14.000 - 16.000 xg) y agitar brevemente, el calor a 65 ° C durante 5 a 10 minutos, vórtice brevemente y mantener a la población de morfolino en la sala temperatura durante al menos 1 h. solución de morfolino s se almacenan de -20 ° C a + 4 ° C.
  3. Preparar la solución de inyección que contiene oligonucleótidos de morfolino a la concentración deseada. Esta solución por lo general contiene 20% de glicerol o KCl 125 mM como vehículo y 15% de FITC-dextrano (isotiocianato de fluoresceína dextrano 10.000 MW 2,5 mg solución madre / l). FITC-dextrano y otros conjugados de dextrano fluorescentes se utilizan habitualmente para identificar embriones inyectados por microscopía de epifluorescencia. soluciones de inyección almacenar a -20 ° C.
  4. Calentar la solución morfolino a 65 ° C en un bloque de calor o baño de agua durante por lo menos 2 - 5 min.
  5. Brevemente girar la solución morfolino durante 30 s a la velocidad máxima (14.000 - 16.000 xg) y agitar durante 1 min y centrifugar a toda velocidad (14.000 - 16.000 xg) durante al menos 10 min.
  6. Cargar las agujas de inyección con la solución morfolino. Para un protocolo detallado microinyección consulte Stepicheva y Song, 2014 21 y Saludos y Ettensohn de 2004"> 22.

3. Fijación y en el Protocolo Situ a las 24 h después de la fecundación (HPF) en S. purpuratus embriones

NOTA: Este protocolo se modificó a partir de Arenas-Mena et al. , 2000 23 y Sethi et al. 2014 24.

  1. Fijación
    1. Añadir unas gotas de fijador (véase más adelante) a los pocillos que contenían embriones, mezclar suavemente con la pipeta, y dejar que se asienten. Retire la solución de fijación, y luego mezclar los embriones con dos lavados de 180 mu l adicionales de fijador.
      NOTA: Es importante mezclar bien los embriones durante los lavados por pipeteo suave hacia arriba y abajo varias veces. El no hacerlo puede disminuir la relación señal a ruido.
    2. Dejar los embriones para fijar en el segundo lavado fijador durante 50 min a 1 h a temperatura ambiente (RT) en paraformaldehído al grado microscopía electrónica de 4% que consiste en MOPS 10 mM pH 7,0, 0,1% de Tween-20, y artificial seawater (ASW). Hacer esta solución fresca cada vez para obtener mejores resultados. Además, para la facilidad y practicidad embriones se fijan en placas de 96 pocillos.
      1. Para 20 ml uso fijador 5 ml 16% de paraformaldehído, 15 ml ASW, 200 l 1 M MOPS pH 7.0, y 20 l de Tween-20.
    3. Lavar 5 veces a temperatura ambiente con 180 l de MOPS tampón de lavado que consiste en 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl y 0,1% de Tween-20 durante al menos 5 min o hasta que los embriones de caer al fondo del pozo. Una vez más, es importante para mezclar completamente los embriones en el tampón de lavado pipeteando suavemente arriba y abajo varias veces. tampón de lavado MOPS se puede utilizar durante 2 días si se almacenan a 4 DO.
      1. Por 40 ml de MOPS lavan uso de búferes de 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 32 ml dH2O y 40 l de Tween-20.
      2. Fija los embriones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante 2 días.
        NOTA: Si el almacenamiento de los embriones ya fijos, a continuación, añadir azida de sodio al 0,2% en MOPS tampón de lavado para evitar el crecimiento bacteriano.
  2. Pre-hibridación
    1. Aspirar el MOPS tampón de lavado y añadir 180 l de una proporción de 2: 1 de MOPS tampón de lavado en tampón de hibridación, la mezcla embriones en la solución mediante pipeteado suave varias veces, y se incuba durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. El tampón de hibridación consiste en 70% de formamida, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml de BSA y 0,1% de Tween-20.
      1. Para uso 40 ml de tampón de hibridación 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 4 ml dH2O, 0,04 g de BSA, y 40 l de Tween-20. Mezclar bien por agitación, añadir 28 ml de formamida, y agitar de nuevo.
    2. Retire la proporción 2: 1 de MOPS de lavado y tampones de hibridación y añadir 180 l de una proporción de 1: 2 de MOPS tampón de lavado en tampón de hibridación, la mezcla embriones en la solución, y se incuba durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente.
    3. Antes de la hibridación de la sonda mezclar suavemente los embriones en 100 - 150 ml de tampón de hibridación. Incubar embriones a 50 ° C durante al menos 1marido.
      NOTA: La incubación de los embriones durante la noche es aceptable. Antes de la incubación, sellar los pocillos con una lámina adhesiva con el fin de evitar la evaporación.
  3. Hibridación
    1. En un tubo separado añadir 0,1 - 0,3 ng / l de sonda y 500 mg / ml de ARNt de levadura en un tampón de hibridación, a continuación, vórtice suavemente para crear solución de la sonda. tRNA de levadura se añade a la solución de la sonda para disminuir la unión no específica de la sonda anti-sentido. Precalentar esta solución a 50 ° C, y el tampón de aspirado de la hibridación.
    2. Mezclar embriones pre-hibridado en 100 l de la solución de la sonda, el sello con una lámina adhesiva, y se hibrida a 50 ° C durante 2 a 7 días, dependiendo de la sonda (la sonda foxq2 se puede incubar durante 2 días).
      NOTA: Los tiempos de incubación puede variar en función de la sonda. Algunos genes expresados ​​en niveles bajos requieren hasta una incubación de 7 días. placas de 96 pocillos se pueden colocar en una caja de humedad como un seguro contra la evaporación si los ADHESive hoja no sellar adecuadamente.
    3. Lavar 5 veces a 50 ° C con 180 l de MOPS recién hechos tampón de lavado para un total de 3 h. A continuación, lavar 3 veces (15 min) con 180 l de MOPS de tampón de lavado a temperatura ambiente. Recuerde mezclar embriones en el tampón de lavado cada vez con la pipeta suavemente varias veces.
  4. La incubación de anticuerpos
    1. Aspirar el MOPS tampón de lavado y se mezclan los embriones en 180 l de tampón de bloqueo que consiste en 10% de suero de oveja normal y 5 mg / ml de BSA en MOPS tampón de lavado y se incuba durante al menos 45 minutos a temperatura ambiente o 4 ° C durante la noche.
    2. Eliminar el tampón de bloqueo y luego mezclar embriones en tampón de bloqueo que contiene una dilución 1: 1500 de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina diluido en tampón de bloqueo. Incubar toda la noche a temperatura ambiente en una placa de sellado para evitar la evaporación. NOTA: No deje de anticuerpos en más de una noche.
    3. Lavar los embriones de 6 veces (5 min o hasta que caen embriones) en MOPS tampón de lavado a temperatura ambiente. Los embriones puedenser almacenados durante la noche a 4 ° C.
  5. En desarrollo in situ
    1. Lavar embriones 3 veces (10 min) a temperatura ambiente con tampón de pH 9,5 recién hecho que consiste en 0,1 M Tris pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl 2 mM 50 mM, levamisol 1, y 0,1% de Tween-20.
      1. Por 20 ml pH 9,5 tampón uso 2 ml de Tris 1 M pH 9,5, 400 l de NaCl 5 M, 1 ml 1 M MgCl 2, 20 l de Tween-20, 16,6 ml dH2O, y 0,0048 g levamisol.
    2. Incubar los embriones a 37 ° C en tampón de tinción protegido de la luz. tampón de tinción se compone de 10% dimetil formamida, 4,5 l / mL 4-Nitro cloruro de azul tetrazolio (NBT) y 3,5 l / ml 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) en recién hecho tampón de pH 9,5 .
      1. Para 1 ml de tampón de tinción utilizar 100 l dimetil formamida, 4,5 l NBT y BCIP 3,5 l.
    3. Detener la reacción de la fosfatasa alcalina mediante el lavado de 3 a 5 veces en tampón de lavado MOPS. La reacción wiº la sonda foxq2 normalmente tarda 30 minutos a 1 hora. Algunas sondas pueden necesitar de incubación durante la noche a RT, ya sea o 4 ° C.
    4. Mezclar los embriones en una solución de lavado MOPS 70% y 30% de glicerol. El glicerol proporciona un índice de refracción necesario para microscopía. Los embriones se pueden almacenar en esta solución durante varias semanas. Sellar las placas con parafina de plástico para evitar la evaporación.
  6. Preparación de los portaobjetos y la captura de imágenes
    1. Preparar un portaobjetos mediante la disposición de tres pequeñas tiras de cinta adhesiva de doble cara en un triángulo con pequeños espacios entre las tiras en un portaobjetos.
    2. La transferencia de los embriones en el lavado MOPS 70% y solución de glicerol al 30% hasta el centro del triángulo y cubrir con un cubreobjetos.
    3. Sellar el cubreobjetos mediante la aplicación de una capa de esmalte de uñas alrededor de los bordes del cubreobjetos.
    4. Capturar imágenes utilizando un microscopio de luz compuesto con un objetivo de 20X y una cámara adjunta.

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Representative Results

En el embrión de erizo de mar hemos demostrado que 3 de señalización Wnt diferentes ramas (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, y Wnt / PKC) 4, 25 interactúan para formar una red de señalización Wnt que gobierna anterior-posterior patrón (AP). Una de las consecuencias más importantes de estos eventos de señalización es que el expresado en términos generales neuroectodermo anterior (ANE) GRN inicial se restringe a un pequeño territorio alrededor del polo anterior al comienzo de la gastrulación (24 HPF en S. purpuratus). Estos resultados indican que la señalización / β-catenina Wnt impide la activación de genes ANE en el medio posterior del embrión por la etapa de 32 células. Entonces, esta vía transmite una señal a la vía de señalización Wnt / JNK no canónica que progresivamente regula la ANE GRN en la mitad anterior del embrión entre la etapa de 60 células y la gastrulación temprana. Por último, una tercera pathwa Wnt no canónicay, Wnt / PKC, antagoniza la vía de señalización Wnt / JNK y evita que la eliminación de especificación ANE alrededor del polo anterior (Figura 1A) 4.

Utilizamos la expresión espacio-temporal de foxq2 para ensayar la actividad de cada una de las ramas de señalización Wnt durante AP patrón, ya que es uno de los dos primeros genes activados en el GRN ANE y se considere fácilmente mediante hibridación in situ debido a su robusta expresión 26. Si se perturba cualquier rama de señalización Wnt individual, entonces hay claras fenotipos de expresión que indican qué está implicada la vía: 1) En ausencia de señalización de un amplio mecanismo de regulación de la madre (Figura 1 A) Wnt / β-catenina activa la expresión foxq2 lo largo de todo el embrión (Figura 1Bb); 2) En ausencia de Wnt / JNK foxq2 señalización se expresa en todola mitad anterior del embrión (Figura 1Bc), pero sigue siendo el regulado en la mitad posterior, debido a la actividad de señalización de Wnt / β-catenina (Figura 1); En ausencia de Wnt / PKC expresión foxq2 señalización está completamente regulada por todo el embrión (Figura 1bd), debido a que el / β-catenina vía de señalización Wnt y vías / JNK están regulados hasta 4, 25. Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo que hemos denominado el sistema de lectura de la transcripción foxq2 que, cuando se combina con nuestro flujo de trabajo sistemática (Figura 2), nos permite identificar y probar si un gen de interés está implicado en uno o más de los Wnt eficiente señalización ramas.

Usando el sistema y metodología de lectura foxq2 que aquí se presenta, hemos identificado varios Molec extracelular o intracelular putativoEGLAS probable que participan en la red de Wnt que rige la especificación eje AP, cuatro de los cuales se presentan en la Figura 3. Los embriones inyectados con morfolinos diseñados para derribar la expresión de ya sea el factor de transcripción, ATF2, o el modulador de Wnt extracelular secretada, WIF-1, mostraron una expansión de expresión foxq2 hacia el polo posterior del embrión en las fases gastrulación (Figura 3A - C ). Estos resultados imitan los fenotipos observados cuando los miembros de la vía de señalización / JNK Wnt son derribados 4, 25, sugiriendo que son miembros de esta rama de señalización que es necesario regular a la baja la expresión ANE GRN en la mitad anterior del embrión. En contraste, la expresión foxq2 fue eliminado cuando derribado la expresión del factor de transcripción, NFAT (Figura 3D), y el modulador extracelular secretada, sFRP3 / 4 (Figura 3E),lo que sugiere que estas moléculas están implicadas en la vía Wnt / PKC que es necesaria para antagonizar la regulación a la baja de la ANE GRN por la señalización / JNK Wnt. Sobre la base de estos resultados obtenidos con rapidez ahora estamos en condiciones de realizar análisis más detallados funcionales, permiten colocar estos factores dentro de la red de señalización Wnt en evolución que participan en la GRN que gobierna AP patrón en el embrión de erizo de mar.

Figura 1
Figura 1. El modelo para la especificación de AP y los patrones en el erizo de mar y de la transcripción de sistema de lectura foxq2. (A) La progresiva regulación hacia abajo de la ANE GRN a un territorio alrededor del polo anterior por la red de señalización Wnt se detalla en el texto y en 4, 9. (B) A transcriptional sistema de lectura que muestra la expresión foxq2 en las caídas de la vía Wnt indicados (KO). Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Un Diagrama de Flujo Experimental para el Análisis de Redes eficiente Wnt en el embrión de erizo de mar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. transducción de señales moléculas que participan en la Red de Gobierno Wnt AP Eje especificación y los patrones identificados usando la foxq2 transcripcional de sistema de lectura. Caídas (A, B, C) Morpholino sugieren que un modulador intracelular de señalización, ATF2, y el modulador extracelular secretada, WIF-1, son potenciales jugadores de la vía de señalización / JNK Wnt. (A, D, E) desmontables experimentos indicaron que NFAT, un modulador de la señalización intracelular, y sFRP3 / 4, un modulador de la señalización Wnt secretada, están involucrados en / de señalización 2/7-PKC Fzl1. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La metodología que aquí se presenta es un ejemplo que ilustra el poder de utilizar embriones con menos complejidad genómica y morfológica de los vertebrados para entender las vías de transducción de señales y GRNs que rigen los mecanismos fundamentales del desarrollo .. Muchos laboratorios están usando ensayos similares durante el desarrollo de erizo de mar temprano para diseccionar el vías que participan en otros eventos de especificación del destino celular de señalización (por ejemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β, y la señalización FGF) 27, 28, 29, 30, 31. Estos estudios de erizo de mar han revelado muchos mecanismos de señalización interesante y novedoso, y muchos aspectos de estos mecanismos de señalización que regulan el desarrollo de erizo de mar temprana parecen estar conservadas entre deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. Es importante destacar que la exploración de la biología del desarrollo de embriones metazoos no tradicionales se ha visto un aumento en los últimos años, y muchos de estos comparten características con embriones de erizo de mar durante el desarrollo temprano 9, 15, 16, 33. Por lo tanto, la metodología presentada aquí podría ser ampliamente aplicada al estudio de las vías de transducción de señales en muchos de estos organismos durante el desarrollo temprano.

Todas las técnicas utilizadas para derribar la expresión de genes pueden producir potencialmente fuera del objetivo derribar efectos. Morpholinos han demostrado ser un método muy eficaz de genes perturbación en embriones de erizos de mar en gran parte a que la comunidad lleva a cabo controles rigurosos para aliviar la preocupación de que la desmontables fenotipo no es específica. Estos ensayos de control básicas pueden ser modified y se aplica a otras técnicas desmontables (es decir CAJONES / Cas9). Los controles son: 1) ensayos de respuesta cuidadoso de la dosis se realizan con cada morfolino hasta ≥ 80% de los embriones inyectados muestran fenotipo defectuoso y / o expresión del gen marcador; 2) Morpholinos se descartan si causan retrasos en el desarrollo graves o incluso la muerte en concentraciones moderadas. Estos fenotipos son probablemente debido tóxicos efectos fuera de la meta; 3) Al menos dos morfolinos que están diseñados para dirigirse a diferentes sitios de unión se utilizan para confirmar fenotipos desmontables; 3) se inyectan Missense morfolinos; 4) fenotipos Morpholino son rescatados mediante la introducción de ARNm para el gen diana en embriones de morfolino desmontables; 5) Cuando se utilizan, los ensayos de tinción de anticuerpos enteros de montaje disponibles para demostrar que las caídas de morfolino impiden la traducción del gen de interés. Es importante tener en cuenta que la comunidad de erizo de mar utiliza al menos cuatro especies para estudios funcionales, dependiendo de dónde se encuentran los científicos. en lust casos, hasta donde sabemos, las diversas morfolinos utilizados para derribar los ortólogos han generado fenotipos similares en cada especie (por ejemplo, véase estos estudios funcionales sobre nodal de señalización 34, 35, 36, 37). Estos resultados sostienen convincentemente que nuestros experimentos de control rigurosos seleccionar con vehemencia las morfolinos que producen efectos en el blanco desmontables.

Otro aspecto importante de esta metodología es identificar cuidadosamente los objetivos de la transcripción que tienen más probabilidades directamente activados por la vía de señalización en consideración. El ejemplo que ofrecemos aquí es fortuito, ya que la activación de espacio-temporal de las vías de señalización y la regulación a la baja de un gen que se expresa con firmeza, foxq2, ocurren temprano en el desarrollo y las que rigen GRNs capa germinal y la especificación del eje en el embrión de erizo de mar están bien-establecido. Por lo tanto, una limitación obvia de esta metodología es que en muchos casos puede ser necesario para derribar la actividad de una ruta de señalización en particular durante las etapas posteriores de desarrollo y dentro de los territorios específicos. Existen varias tecnologías ahora disponibles que se pueden utilizar para superar estas limitaciones (por ejemplo, foto-morfolinos, Crisper / Cas9 38, FACseq) incluso en embriones modelo no tradicionales que no son susceptibles a la manipulación genética. En muchos casos puede que no sea posible identificar un gen candidato corriente abajo de una vía de señalización de interés cuya expresión espacio-temporal se evalúa tan fácilmente como foxq2, que tiene una muy alta relación señal-ruido. Es común encontrar genes con relaciones mucho más baja de señal a ruido. Si otro gen no está disponible para un ensayo particular, a continuación, la sonda generado in situ para el gen de interés debe ser el mayor tiempo posible. En general, utilizando sondas de más de 1.000 pares de basess aumenta significativamente la señal y reduce el ruido en colorimétrico y fluorescente en ensayos in situ.

Una vez que el ensayo de transcripción que indica dónde y cuándo se se establece la señalización de la vía de transducción de señales de interés, el siguiente paso es importante para determinar tanto la espacial y la expresión temporal de los factores reguladores putativos que participan en el mecanismo de desarrollo en estudio. datos de pantalla diferencial y / o QPCR son herramientas importantes, pero que pueden ser engañosos. Confirmando con todo el montaje hibridación in situ que el gen de interés se expresa en el territorio en el que la vía de señalización está activo evita una pérdida de tiempo y recursos. Además, estos datos permiten realizar predicciones acerca de la arquitectura de regulación de genes, la cual informará a los análisis más detallados que seguirán una vez que los jugadores involucrados están identificados con este ensayo inicial (Figura 2). Presentamos un simpLe ensayo colorimétrico en este protocolo; sin embargo, la hibridación fluorescente in situ (FISH) también se puede utilizar para visualizar varias sondas fluorescentes a la vez, lo que permite una mayor resolución espacial en el territorio de interés, así como la microscopía confocal 24. Además, el pescado se puede combinar con la tinción de anticuerpos para identificar las modificaciones posteriores a la traducción y / o cuando la vía de señalización de interés es activa 24.

Hay dos pasos críticos en el protocolo que a menudo se pasa por alto. Uno de ellos es la preparación de la solución de morfolino oligonucleótidos. Es importante calentar la solución morfolino a 65 ° C durante 2 min a 5 min y centrifugar a toda velocidad durante al menos 10 min antes de cargar las agujas de inyección. Estos pasos son esenciales cuando la solución morfolino archivo se almacena a -20 ° C, ya que los oligonucleótidos de morfolino pueden precipitar de la solución a baja temperamentoturas y el giro de la solución evita que las agujas de inyección se obstruya por partículas. Otro aspecto fundamental a considerar es que los embriones se deben mezclar a fondo en las diferentes soluciones en cada paso de la fijación y en los protocolos de hibridación in situ. En nuestras manos, la señal se reduce y / o el fondo se incrementa si no se realiza este sencillo paso.

Quizás el aspecto más importante de la metodología que aquí se presenta es que permite a los análisis funcionales eficientes de grandes conjuntos de potenciales moléculas de transducción de señales generadas por la transcriptómica y proteómica de próxima generación. Una vez que estos análisis funcionales iniciales confirman un grupo de factores de regulación están involucrados en una vía de interés, el siguiente reto es el uso de ensayos establecidos (por ejemplo, caídas funcionales; todo el montaje de varios colores detallada in situ; interacciones bioquímicas) para evaluar cómo encajan en la extracellular, intracelular y los niveles de transcripción de las vías de transducción de señales que intervienen en un proceso de desarrollo en particular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

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References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

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Biología del Desarrollo No. 120 erizos de mar neuroectodermo patrón Wnt transducción de señales antero-posterior la evolución Deuterostomia redes reguladoras de genes de alto rendimiento,
El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones
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Range, R. C.,More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

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